DE3885438T2

DE3885438T2 - Verfahren zur Herstellung von mikrobieller Cellulose.

Info

Publication number: DE3885438T2
Application number: DE88311686T
Authority: DE
Inventors: David Byrom
Original assignee: Zeneca Ltd
Current assignee: Syngenta Ltd
Priority date: 1988-01-06
Filing date: 1988-12-09
Publication date: 1994-04-28
Anticipated expiration: 2008-12-10
Also published as: CA1327536C; AU2700588A; DE3885438D1; GB8800183D0; AU620362B2; EP0323717A3; EP0323717A2; JPH01273599A; ATE96843T1; EP0323717B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung mikrobieller Cellulose.
Eine Anzahl von Bakterien, insbesondere Stämme der Gattung Acetobacter, kann zum Zwecke der Herstellung von mikrobieller Cellulose gezüchtet werden. Die mikrobielle Cellulose wird extracellulär in Form einer der Bakterienzelle anhängenden Fibrille erzeugt. Fibrillen aus verschiedenen Zellen vernetzen sich zu Häutchen, die Mischungen aus Cellulose und Zellen sind.
Anfänglich wurde mikrobielle Cellulose unter Benutzung statischer Züchtung erzeugt, etwa nach dem in GB 2 131701 beschriebenen Verfahren. Bei diesem Verfahren werden die mikrobiellen Cellulosehäutchen auf der Oberfläche der statischen Kultur gebildet, die üblicherweise in flachen Schalen enthalten ist.
Kürzlich haben wir jedoch in unserer veröffentlichten europäischen Patentanmeldung Nr. 279506 ein Verfahren zur Herstellung mikrobieller Cellulose mit den folgenden Stufen vorgeschlagen:
(a) einer Wachstumsstufe, in der ein geeigneter Bakterienstamm in einer gerührten Chargenkultur gezüchtet wird, bis im wesentlichen die gesamte anwesende Kohlenstoffquelle verbraucht wurde und die Kultur kohlenstofflimitiert ist;
(b) einer Akkumulierungsstufe, in der die Kohlenstoffquelle kontinuierlich der kohlenstofflimitierten Kultur mit einer ausreichenden Geschwindigkeit zugeführt wird, um sie in Kohlenstofflimitierung zu halten und bei gerührter Züchtung zu befähigen, mikrobielle Cellulose anzusammeln;
(c) einer Entfernungsstufe, in der Bakterienzellen und angesammelte mikrobielle Cellulose am Ende der Akkumulierungsstufe aus der Kultur entfernt werden; und
(d) einer Trennstufe, in der mikrobielle Cellulose von den Zellen abgetrennt wird.
Mikrobielle Cellulosehäutchen haben ausgezeichnete Flüssigkeitsabsorptionseigenschaften und können auf sehr verschiedenen medizinischen Anwendungsgebieten eingesetzt werden, z.B. für absorbierende Tampons, wie in GB 2131701 beschrieben ist. Für diese medizinischen Anwendungen können die in der statischen Kultur erzeugten Häutchen direkt verwendet werden. Es gibt jedoch andere nichtmedizinische Verwendungen für mikrobielle Cellulose, bei denen es im allgemeinen nötig ist, die Häutchen in kleinere Stücke zu brechen.
Mikrobielle Cellulose kann als ein extracelluläres Polysaccharid betrachtet werden. Wenn diese Polysaccharide durch chargenweise oder kontinuierliche Züchtungsverfahren hergestellt werden, erfolgt die Herstellung normalerweise bei einem in dem Medium vorliegenden wesentlichen Überschuß der Kohlenstoffquelle unter Bedingungen der Limitierung durch einen anderen Nährstoff, wie etwa Stickstoff oder Phosphor. Oft liegt die Kohlenstoffquelle in sehr beträchtlichem Überschuß vor, beispielsweise bei Verfahren zur Herstellung von Xanthangummi.
Es wurde berichtet, daß eine Anzahl von Bakterienstämmen extracelluläre mikrobielle Cellulose produzieren können, darunter z.B. Stämme der Gattung Acetobacter xylinum, wie der Stamm ATCC 23769, und Stämme von Acetobacter aceti, wie etwa subsp. orleanensis Stamm NCIB 8747. Wenn jedoch mikrobielle Cellulose erfolgreich im technischen Maßstab produziert werden soll, ist es wichtig, daß Bakterienstämme mit verbessertem Züchtungsvermögen zur Erzeugung mikrobieller Cellulose entwickelt werden.
Nach der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung extracellulärer mikrobieller Cellulose geschaffen, bei dem ein zur Herstellung extracellulärer mikrobieller Cellulose befähigter Bakterienstamm aerobisch in einem wässrigen Züchtungsmedium gezüchtet wird, das eine Kohlenstoffquelle und andere notwendige Nährstoffe enthält, wobei der Bakterienstamm Acetobacter sp Stamm NCIB 12548 oder eine davon abgeleitete Variante oder Mutante ist.
Ebenfalls nach der Erfindung wird eine biologisch reine Kultur von Acetobacter sp Stamm NCIB 12548 oder eine davon abgeleitete Variante oder Mutante geschaffen.
Acetobacter sp Stamm NCIB 12548 (von uns auch als Stamm 99 bezeichnet) ist eingegangen bei und wurde am 24. September 1987 zur Niederlegung angenommen von den National Collections of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB), Postfach Nr. 31, 135 Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, Schottland, UK, unter den Bestimmungen des Budapester Vertrages über die internationale Kennzeichnung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke ihrer Patentierung.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist die Kohlenstoffquelle zweckmäßig eine Kohlenstoffquelle für das Wachstum, jedoch ist dies nicht zwingend notwendig. Ein weiter Bereich von Kohlenstoffquellen kann verwendet werden, darunter Lactat, Äthanol, Glycerin, Melassen und andere Zucker, wie Fructose und insbesondere Glucose.
Zweckmäßig kann mikrobielle Cellulose durch Wachsen von Acetobacter sp NCIB 12548 nach dem Verfahren unserer veröffentlichten europäischen Patentschrift Nr. 279506 mit den oben beschriebenen Stufen (a) bis (d) erzeugt werden. Bei diesem Verfahren enthält das Züchtungsmedium für die Wachstumsstufe anfänglich die Kohlenstoffquelle in einer Konzentration in dem Bereich von 2 bis 20 g/l. Während der Akkumulierungsstufe wird die Kohlenstoffquelle vorzugsweise der Kultur mit einer Konzentration in dem Bereich von 1 bis 10 g/l je Stunde zugeführt. Ein geeignetes Kulturmedium für die Wachstumsstufe und die Akkumulierungsstufe hat die folgende Zusammensetzung
Pepton ("Oxoid") 5,0 g/l
Hefeextrakt ("Oxoid") 5,0 g/l
Na&sub2;HPO&sub4; 2,7 g/l
Zitronensäure 1,15 g/l
Glucose 20 g/l
ergänzt auf pH 6,0
Der Angangs-pH, bei dem die Wachstumsstufe und die Akkumulierungsstufe durchgeführt werden, liegt zweckmäßigerweise in dem Bereich von 4 bis 6,5, wobei ein pH-Wert von etwa 5 bevorzugt wird.
Zweckmäßigerweise werden die Wachstumsstufe und die Akkumulierungsstufe bei einer Temperatur in dem Bereich von 15ºC bis 35ºC, vorzugsweise in dem Bereich von 20ºC bis 28ºC durchgeführt.
Während der Akkumulierungsstufe wird die Kultur mit der Kohlenstoffquelle in einer solchen Geschwindigkeit versorgt, daß der Gehalt dieser Quelle in der überstehenden Flüssigkeit in dem Bereich von 0 bis 0,5 g/l gehalten wird. Die Konzentrationen der anderen Nährstoffe in der Kultur nehmen allmählich ab, bis der Vorrat an einem oder mehreren der anderen Nährstoffe in der Kultur erschöpft ist. Die Akkumulierungsstufe kann an diesem Punkt beendet werden, oder es können weitere Vorräte an den anderen Nährstoffen zugesetzt werden. Im letzteren Falle kann die Züchtung fortgesetzt werden, bis die Kultur für eine zufriedenstellende Belüftung zu viskos wird. Während der Akkumulierungsstufe wird die extrazelluläre mikrobielle Cellulose in Form von Flocken gebildet anstelle der großen Häutchen, die bei der statischen Züchtung gebildet werden.
Nach Beendigung der Akkumulierungsstufe wird die Masse der Zellen und die angesammelte mikrobielle Cellulose in der Entfernungsstufe durch irgendeine geeignete Methode aus der Kultur entfernt. Vorzugsweise erfolgt dies durch Filtration. Die Cellulose wird danach in der Trennstufe von den Zellen getrennt. Die Trennung erfolgt zweckmäßigerweise durch Behandlung der Masse aus Cellulose und Zellen mit einem Reagenz, z.B. einem alkalischen Reagenz, das die Zellen ohne Beeinträchtigung der Cellulose auflöst, die dann abgetrennt werden kann. Eine bevorzugte Methode zur Auflösung der Zellen und Abtrennung der Cellulose besteht darin, die Zellen/Cellulose-Masse mit einer verdünnten Natriumhydroxidlösung, z.B. einer 0,1-0,5 %igen (vorzugsweise 0,3-3 %- igen) Natriumhydroxidlösung zu behandeln. Nach der Trennung kann die mikrobielle Cellulose weiterbehandelt werden, z.B. durch Trocknen.
Wenn das erfindungsgemäße Verfahren in der in der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung Nr. 279506 beschriebenen Weise durchgeführt wird, können die Wachstumsstufe und die Akkumulierungsstufe vorzugsweise in demselben Fermenteur durchgeführt werden. Sie können jedoch auch in getrennten Fermenteuren durchgeführt werden, wobei die in der Wachstumsstufe erzeugte Kultur aus dem Fermenteur, in dem sie erzeugt wurde, in einen zweiten Fermenteur überführt wird, dem die Kohlenstoffquelle kontinuierlich zugeführt wird. Diese Überführung kann durchgeführt werden, bevor die Wachstumsstufe beendet ist und das Wachstum unter Kohlenstofflimitierung begonnen hat. Die benutzten Fermenteure können mechanisch gerührt werden oder dem Belüftungstyp angehören, bei dem die Rührung dadurch erfolgt, daß ein Sauerstoff enthaltendes Gas in den Fermenteur eingeblasen wird.
Beispiele geeigneter Belüftungsfermenteure sind jene, die in unseren Patentschriften Nr. GB 1353008, 1417486 und 1417487 beschrieben sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch in statischen oder kontinuierlichen Kulturen durchgeführt werden. Bei der statischen Kultur wird das Bakterium zweckmäßigerweise in einem flüssigen Nährmedium bei einem Anfangs-pH-Wert in dem Bereich von 4 bis 6,5 (vorzugsweise etwa 5) und bei einer Temperatur in dem Bereich von 15º bis 35ºC, insbesondere 20º bis 28ºC, gezüchtet. Um ein zusammenhängendes gelartiges Material zu erhalten, das für das Verbinden von Wunden oder andere medizinische Anwendungen geeignet ist, ist es wichtig, daß das Züchtungsmedium während der Züchtungsperiode im wesentlichen bewegungslos bleibt, was eine Sache von wenigen Stunden für eine dünne Membran von 0,1 mm Dicke bis zu mehreren Tagen oder Wochen für eine Haut mit einer Dicke von 15 mm oder mehr sein kann. In der statischen Kultur wird das Bakterium an der Oberfläche eines Nährmediums gezüchtet, um eine zusammenhängende Haut zu bilden. Diese Haut wird von dem Nährstoff entfernt, zur Entfernung des Bakteriums mit Natriumhydroxid oder einem anderen Mittel behandelt, neutralisiert und mit Wasser gewaschen, um eine mit Wasser beladene Haut aus mikrobieller Cellulose zu erhalten. Die so gebildete Haut kann in irgendeine gewünschte Größe geschnitten, durch Wärme oder Bestrahlung sterilisiert und beispielsweise als Verband für Verbrennungen oder andere Hautverletzungen eingesetzt werden. Bei einer anderen Verwendung kann das Wasser mit Glycerin oder einer anderen physiologisch verträglichen Flüssigkeit ausgetauscht werden und/oder es können vor der Sterilisierung und Verwendung Medikamente eingebracht werden. Das mit Flüssigkeit beladene Häutchen kann zur langfristigen Lagerung in einen sterilen, feuchtigkeitsundurchlässigen Behälter verpackt werden.
Die durch ein Verfahren mit den obigen Stufen (a) bis (d) (insbesondere unter Benutzung des erfindungsgemäßen Verfahrens) erzeugte mikrobielle Cellulose ist als Füllmittel in Nahrungsmitteln oder als Tablettierhilfe leichter verwendbar als die durch statische Züchtungsverfahren in Häutchenform erzeugte mikrobielle Cellulose.
Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel erläutert.

BEISPIEL

Ein Schüttelkolben wurde mit dem Stamm NCIB 12548 (auch als Stanm 99 bekannt) beimpft, der 24 Stunden dem Wachstum überlassen wurde, worauf die Reinheit der entstandenen Cellulose geprüft wurde. Diese Kultur wurde dann in einen Fermenteur überführt, der ein Medium enthielt, in dem Glucose als Kohlenstoffquelle in einer Konzentration von 10 g/l vorlag. Die Glucosekonzentration wurde während des Wachstums der Kultur überwacht. Als sie nach Feststellung auf 0,5 g/l gefallen war, wurde die Glucosezufuhr zu dem Fermenteur begonnen und 64 Stunden fortgesetzt. Die Messungen des Zellentrockengewichts (g/l), Cellulosetrockengewichts (g/l) und der Glucoseaufnahme (g/l) wurden in Intervallen vorgenonmen, und die Ergebnisse sind in der Tabelle angegeben. Sie zeigt, daß die optimale Ausbeute an Cellulose (d.h. g Cellulose je g Glucose) nach 41 Stunden erreicht wurde. Danach wurde Glucose etwa weitere 7 Stunden fortgesetzt zur Erzeugung eines erhöhten Cellentrockengewichts verbraucht, ohne daß weitere Cellulose produziert wurde. Tabelle Fermentationszeit (h) Zellentrockengewicht (g/l) Cellulosegewicht, trocken (g/l) Glucoseaufnahme (g/l) Celluloseausbeute (g Zellen/g Glucose)

Claims

1. Verfahren zur Erzeugung extracellulärer mikrobieller Cellulose, bei dem ein zur Herstellung extracellulärer mikrobieller Cellulose befähigter Bakterienstamm aerobisch in einem wässrigen, eine Kohlenstoffquelle und andere notwendige Nährstoffe enthaltenden Kulturmedium gezüchtet wird, wobei der bakterielle Stamm Acetobacter sp Stamm NCIB 12548 oder ein davon abgeleiteter Varianten- oder Mutantenstamm ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Kohlenstoffquelle eine Kohlenstoffquelle für das Wachstum ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, bei den die Kohlenstoffquelle Glucose ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 mit den folgenden Stufen:

(a) einer Wachstumsstufe, in der ein geeigneter Bakterienstamm in einer gerührten Chargenkultur gezüchtet wird, bis im wesentlichen die gesamte anwesende Kohlenstoffquelle verbraucht wurde und die Kultur kohlenstofflimitiert ist;

(b) einer Akkumulierungsstufe, in der die Kohlenstoffquelle kontinuierlich der kohlenstofflimitierten Kultur mit einer ausreichenden Geschwindigkeit zugeführt wird, um sie in Kohlenstofflimitierung zu halten und bei gerührter Züchtung zu befähigen, mikrobielle Cellulose anzusammeln;

(c) einer Entfernungsstufe, in der Bakterienzellen und angesammelte mikrobielle Cellulose am Ende der Akkumulierungsstufe aus der Kultur entfernt werden; und

(d) einer Trennstufe, in der mikrobielle Cellulose von den Zellen abgetrennt wird.

5. Verfahren näch Anspruch 4, bei den der Anfangs-pH, bei den die Wachstumsstufe und die Akkumulierungsstufe durchgeführt werden, in dem Bereich von 4 bis 6,5 liegt.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, bei dem die Wachstumsstufe und die Akkumulierungsstufe bei einer Temperatur in dem Bereich von 20ºC bis 28ºC durchgeführt werden.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, bei dem während der Akkumulierungsstufe die Kultur mit einer solchen Geschwindigkeit mit der Kohlenstoffquelle versorgt wird, daß der Gehalt dieser Quelle in der überstehenden Flüssigkeit in dem Bereich von 0 bis 0,5 g/l gehalten wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, bei dem während der Akkumulierungsstufe die Konzentrationen der anderen Nährstoffe als Kohlenstoff in der Kultur verringert werden, bis der Vorrat eines dieser anderen Nährstoffe in der Kultur erschöpft ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das in einer statischen Kultur bei einem Anfangs-pH in dem Bereich von 4 bis 6,5 und bei einer Temperatur in dem Bereich von 15º bis 35ºC durchgeführt wird.

10. Biologisch reine Kultur von Acetobacter sp Stamm NCIB 12548 oder einer davon abgeleiteten Variante oder Mutante.