DE2803245C3 - Polysaccharid und Verfahren zu dessen Herstellung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Polysaccharid mit nützlichen Fließ- und Gelbildungseigenschaften, sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung.

Polysaccharide aus mikrobiologischen Quellen haben bei verschiedenen industriellen Anwendungen steigende Bedeutung erlangt, bei denen spezielle Fließeigenschaften gefordert werden. Mikrobiologische Exopolysaccharide können besondere Eigenschaften aufweisen und können außerdem leichter und einheitlicher hergestellt werden als pflanzliche oder auf Algen aufgebaute Polysaccharide.

Polysaccharide, wie Johannisbrotbaumhar?. und Alginate, werden industriell in großem MaOe als Emulgatoren, Stabilisatoren und Verdickungsmittel angewnendet. In der Nahrungsmittelindustrie werden sie als Emulsionsstabilisatoren für Eiscreme verwendet, als Gelierungsmittel für Milchpuddings, als Verdickungsmittel für Soßen und als Schaumstabilisatoren für Bier. Sie werden auch bei der Herstellung von Papier und Textilien und zum Verdicken von Bohrschlämmen bei Ölbohrungen verwendet. Xanthanharze finden auch in einem weiten Anwendungsbereich Verwendung.

Es wurde nun ein Polysaccharid gefunden, daß im wäßrigen System pseudoplastischc Fließ- und Scher-Verdünnungseigensrhiifien aufweist, die bemerkenswert ähnlich denen von Xanthencn und Alginaten sind, so daß sie für ähnliche Anwendungen geeignet erscheinen. Dieses Polysaccharid wird hergestellt, indem man einen polysaccharidbildenden Stamm von Pseudomonas sp, der unter der Nummer NCIB 11264 bei der National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station, 135 Abby Road, Aberdeen, hinterlegt worden ist, auf einem Nährmedium züchtet

Pseudomonas sp NCIB 11264 wurde aus kohlehydratreichen Industrieabwässern isoliert Seine Morphologie und Physiologie kann wie folgt umschrieben werden, wobei alle Temperaturangaben in ° C angegeben sind:

Morphologie
Oxoid CM3 Nährmittel Agar 2VC

Gram-negativ, mittelkJeine, parallele Stäbchen, die in kurze Stäbchen und manchmal in Coccobazillen übergehen.

Beweglich. Gciselposition: einzeln, polar (elektronenmikrofotografisch).

ι Kolonien (6 Tage): 2 mm, weichlich, opak (durchsichtiges zusammenfließendes Wachstum), kreisförmig, vollständig, niedrig konvex, glatt, weicht leicht dispergiert, keine Variationen.

Physiologie 30⁰C
Catalase
Kovacs' Oxidase
Wachstum bei 37⁰C

Wachstum bei Temperaturen

oberhalt 40⁰C

anaerobes Wachstum,

Glucoseagar

Hug & Leifson Glucose

Pepton, wäßrige Zucker,

Andrade's Indikator

Glucose, Lactose, Fructose

Saccharose, Maltose, Mannit

Glyzerin, Stärke

Kosers¹ Citrat

Stärkehydrolyse

Kingetal.A&B

Arginin, Meilers

Gelatinhydrolyse

Caseinhydrolyse

NH3ausTrypton

NO'₃bisNO'₂oderN₂

+ (Kolonien-Wachstumsge schwindigkeit bei 37° C ist annähernd gleich der Geschwindigkeit bei 25° C)

sehr wenig

- (wenig) oxidativ

keine Säure

Chnstensen's Urease	alkalisch
	Tage
DNAse	_
Eidotter-Plattenreaktion	_
Voges- Proskauertest	—
Methylrot	-
Indol	_
Polypectatabbau	-

Der Mikroorganismus kann unter aeroben Bedingungen in einem geeigneten Medium, in dem es wächst und ^h> exozellulares Polysaccharid bildet, kultiviert werden. Typische Medien schließen ein Komplexbrühen, z. B. eine 1%ige Nährbrühe oder ein chemisch definiertes Medium, wie das von Gray et al. in Biochimica et

Biophysica Acta, 117, 22-32, 1966, beschriebene, mit einer ergänzenden Kohlenstoffquelle von beispielsweise Glucose oder Saccharose. Eine Ergänzung von etwa 2% Gewicht/Volumen im Medium ist wünschenswert

Ein definiertes Medium (das glucoseergänzte Gray et aL-Medium) zur Verwendung bei der Kultivierung von Pseudomonas sp NCIB 11264 hat folgende Zusammensetzung:

Glucose 20 g/l

NH4CI 2,66 g/l

KH₂PO₄ 5,44 g/l

NaOH bis pH 7 annähernd 1,5

g/l Lösung von Spurenelementen*) 6 ml/1

*) Eine Lösung, enthaltend

MgSO<-7H2O 10g

MnCb · 4 H2O 1 g

FeSO4 ■ 7 H2O 0,4 g

CaCb · 2 H2O 0,1 g

destilliertes Wasser bis zu 1 I.

Die Kultivierung kann ansatzweise oder kontinuier-Hch durchgeführt werden, und zwar nach üblichen Verfahren. Kontinuierliche Kultivierung wird vorzugsweise unter stickstoffbegrenzenden Bedingungen vorgenommen, beispielsweise von etwa 0,5 g NH4CI/I. Bei einem durch Glucose ergänzten Medium beträgt die Glucoseumwandlung etwa 30% bei absatzweisen Kulturen und bis zu 75% bei kontinuie, riehen Kulturen.

Eine Temperatur von 25 bis 35° C ist ausreichend, wobei eine Temperatur von etwa 30° C l ptimal ist.

Im allgemeinen stellt man fest, daß die Polysaccharid- -H bildung beschleunigt wird, wenn ein Überschuß an einer Kohlenstoffquelle vorhanden ist und unter stickstoffbegrenzenden Bedingungen. Vorzugsweise soll der pH des Mediums nicht unter 6 fallen, und er liegt am besten bei 6,5 bis 8,0. -to

Das exozellulare Polysaccharid kann aus der über dem Kulturmedium stehenden Flüssigkeit (von Zellen frei) durch Ausfällen mit einem organischen, wassermischbaren Lösungsmittel, wie Isopropanol, isoliert werden und dann, beispielsweise durch eine übliche *5 Entsalzung unter Anwendung einer Dialyse, entionisiert werden. Nicht gewünschte Zellsubstanz kann durch Digerieren mit Trypsin entfernt werden, beispielsweise, indem man eine wäßrige Lösung des Polysaccharids, gepuffert auf pH 7 bis 8, beispielsweise unter Verwendung von 0,2 m HEPES-Puffer bei etwa 30°C in Gegenwart eines Bakteriostatikums, wie Mercurichlorid, digeriert. So kann man beispielsweise 3,61 der Lösung, gepuffer auf pH 7 bis 8 mit 0,2 m HEPES, mit 20 g dec Enzyms und Mercurichlorid (1,5 ml einer gesättigten alkoholischen Lösung) 5 Tage bei 30° C behandeln.

Nach der Dialyse kann das isolierte Material gefriergetrocknet werden, wobei man das gereinigte trockene Exopoiysaccharid erhält. «>

Die Analyse zeigt, daß das gereinigte Polysaccharid ein Polysaccharid ist, welches wiederkehrende Einheiten der folgenden Bestandteile hat:

7 D-Glucoeinheiten aus einer Einheit einer 6-substituierten Glucose, zwei Einheiten einer 4-substituierten *>'> Glucose, zwei Einheiten einer 3-substituierten Glucose und zwei Einheiten einer 4,6-disubstituierten Glucose; 1 D-Glactoeinheit aus 3-substituierten Galactosen; eine Acetateinheit und eine Pyruvateinheit, wobei die vorgenannten Komponenten einen 4,6-disubstituierten Glucoseverzweigungspunkt und eine Seitenkette einschließen, die durch eine 4,6,-o-(l-Carboxyät!hyliden)-D-glucoseeinheit abgeschlossen ist

Das gereinigte Polysaccharid zeigt eine optische Drehung [«J22=-15° (CQ,68hp)> was anzeigt daß alle Zucker in der J3-D-Konfiguration verknüpft sind.

Die Viskositäts- und Fließeigenschaften des Polysaccharids gemäß der Erfindung können durch den Konsistenzindex Ar und den Fließverhaltensindex η gezeigt werden, wie dies von Krümel und Sarkar in »Flow Properties of Gums useful in the Food Industry«, in Food Technology, April 1975, Seiten 36 bis 44, Band 29 (4), vorgeschlagen wird.

Die scheinbare Viskosität (η) in Centipoise wurde gemessen unter Verwendung eines konischen Plattenviskosimeters (cone and plate viscosimeter) bei verschiedenen Schergeschwindigkeiten (D) in Sek.-'. Zeichnet man Log η gegen Log D für eine lgew.-%ige Lösung des Polysaccharids gemäß der Erfindung bei 25° C auf, so erhält man eine gerade Linie, welche einen Ar-Wert (η extrapoliert für eine Schergeschwindigkeit von 1 Sek.-') von 4600 Centipoise und einen n-Wert (die Neigung der grafischeis Darstellung plus 1) von 0,22 zeigt Eine im Handel erhältliche Probe eines Xanthanharzes für Eßzwecke, das unter dem Handelsnamen Keltrol von Kelco, San Diego, Kalifornien, verkauft wird, ergab unter den gleichen Bedingungen Werte von k und n von 5000 bzw. 0,23.

Die folgenden Beispiele beschreiben die Erfindung.

Beispiel 1
101 absatzweise Fermentation

Exopolysaccharidherstellung durch Pseudomonas sp NCIB 11264 wurde durchgeführt in einem 10-l-Fermentationsansatz ohne pH-Kontrolle während 50 Stunden bei 30°C mit einer Volumen/Volumen-Belüftung und einer Rührgeschwindigkeit von 350 UpM. Die Verdoppelungszeit des Organismus betrug unter diesen Bedingungen 140 Minuten.

Das logarithmische Wachstum hielt ungefähr 18 Stunden an und zu diesem Zeitpunkt (E₅₂₀ 6,0) waren alle Nährmittel offensichtlich im Überschuß vorhanden, obwohl die Sauerstoffspannungen nicht bestimmt wurden. Es ist jedoch bekannt, daß die Exopolysaccharidherstellung bei einem Maxima verläuft, wenn die Sauerstoffspannung nicht begrenzt ist. Zu diesem Zeitpunkt konnte das Polysaccharid durch Ausfällen mit Isopropanol nachgewiesen werden, obwohl das Exopolymere in zunehmenden Mengen in den über der Kultur stehendem während 12 bis 13 Stunden nach der Inokulierung unter Anwendung einer empfindlicheren Viskosimetereinrichtung nachgewiesen werden konnte. Obwohl die Exopolysaccharidbildung offensichtlich während der spaten exponentialen Wachstumsphase verlief, wurde die Bildung maximal weitere 20 Stunden während der stationären Wachstumsphase ablaufen gelassen, bis die Menge der Produktion allmählich nachließ. Diese Art der Fermentation ist typisch für einen zweiten Metaboliten.

Von der eingesetzten Glucose wurden nur 30% in das Exopoiysaccharid umgewandelt, während die anderen 70% metabolisiert wurden und in der Kultur verblieben.

Beispiel 2
Exopolysaccharidbildung im stationären Zustand

Eine exopolysaccharidbildende Kultur von Pseadomonas sp NCIB 11264 wurde in stationärem Zustand bis zu 500 Stunden gehalten. Das definierte Medium, das auf dem von Gray et al. (1966) beschriebenen aufbaute und mit Glucose (10 mg/ml) ergänzt war, wurde in allen bisher beschriebenen stationären Kulturstadien verwendet

Als Ergebnis dieser Untersuchungen wurde die Anfangskonzentration einiger der Komponenten vermindert und die kontinuierliche Polymerproduktion unter Bedingungen einer Stickstofflimitierung durchgeführt Die Bedingungen wurden bei einem pH von 7,0±0,1 bei einer Wachstumstemperatur von 30±l°C und einer Belüftungsmenge von 500 ml/min optimiert

Nach dem Beimpfen wurde die Kultur in einem Ansatz wachsen gelassen und 24 Stunder: entwickelt, bis die Fließgeschwindigkeit auf 44 ml/h eingestellt wurde.

Die Fermentation wurde dann mit einer Verdünnungsgeschwindig!:eit von 0,08 h"¹ während 500 Stunden durchgeführt Die Rührgeschwindigkeit wurde dabei die ganze Zeit auf 900 ±10 Umdrehungen gehalten. Die Werte für den konstanten Zuband für die gesamte Zelldichte, das Polysaccharidniveau und die Glucoseumwandlung blieben konstant und betrugen nach 100 Stunden 0,26 (E₅₂₀ χ 10-') bzw. 1,6 mg/ml bzw. 40%, während sie nach 500 Stunden 0,26 (E₅₂₀ χ 10-'),

in 1,6 mg/ml und 45% betrugen. Eine Zerstörung der Kultur oder eine Entwicklung von mutierenden Stämmen konnte nicht erkannt werden.

Die analysierten Polysaccharidproben zeigten eine konstante Zusammensetzung und Lösungen aus dem

ι i Polymer (0,1 mg/ml) zeigten eine gleiche relative Viskosität (1,7 ±0,05) bei einer Messung bei 25⁰C in einem modifizierten Zimm-Crothers-Viskosimeter mit rotierendem Zylinder (55 mA), ,vodurch gezeigt wird, daß keine Veränderung des Molc-ku'argewichtes in dem Exopolymeren während der Fermentationsperiode eingetreten ist

Claims (7)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharids durch Kultivierung eines Mikroorganismus unter Bildung eines exozellularen Polysaccharids, dadurch gekennzeichnet, daß man Pseudomonas sp NCIB 11264 kultiviert

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm in einem Medium gemäß Gray et al, ergänzt durch eine zusätzliche Kohlenstoffquelle, kultiviert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium gemäß Gray et al. durch Glucose oder Saccharose ergänzt wird.

4. Verfahren nach den vorhergehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm bei 25 bis 35° C kultiviert wird.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm bei einem pH oberhalb 6 kultiviert wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der pH 6,5 bis 8.0 beträgt

7. Polysaccharid, dadurch gekennzeichnet, daß es durch Pseudomonas sp NCIB 11264 gebildet wird und wiederkehrende Einheiten aufweist aus 7 D-GIucoeinheiten aus einer Einheit einer 6-substituierten Glucose, zwei Einheiten einer 4-substituierten Glucose, zwei Einheiten einer 3-substituierten Glucose und zwei Einheiten einer 4,6-disubstituierten Glucose; 1-D-Galactoeinheit aus 3-substituierter Galactose; einer Acetateinheit und einer Pyrovateiiiheit, wobei die Einheiten einen 4,6-disubstituierten Glucoseverzweigungspunkt und eine Seitenkette, die durch eine 4,6-o-(l-Carboxyäthyliden)-D-glucoseeinheit abgeschlossen wird, umfaßt und das Polysaccharid eine optische Drehung [«}22 von — 15° |t 0,68h*)) aufweist