JPH01273599A - 微生物セルロースの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野： 本発明は微生物セルロースの製造方法に関する。

従来の技術： 多くの細菌、殊にアセトバクタ＝（Ａ　ｃｅｔｏｂａｃ
ｔｅｒ）属の菌株を培養して微生物セルロースを製造す
ることができる。微生物セルロースは、細菌細胞ｌ＼結
合したフィブリルの形で菌体外に産生される。

異なる細胞からのフィブリルは絡み会って、セルロース
と細胞との混合物である：１膜状物を与える。

初期には、英国特許第２１３１７０３号明細書記載の方
法の如く静置培養法を用いて微生物セルロースは製ｊユ
された。そのような培養法では、微生物セルロースの薄
膜性物は、通常浅いトレイに含まれている静置培養液の
表面上に形成される。　しかし、最近、公告欧州特許第
２７９５０６号明細書において、我々は下記の工程（ａ
）〜（ｄ）からなる微生物セルロースの製造方法を提案
した。

（ａ）　　存在する実質上すべての炭素源が用いられて
、培養液が炭素制限状態となるまで、適宜な細菌株を撹
拌回分培養液中で培養する増殖工程；（ｂ）　　撹拌培
獲中に炭素制限状態の培養液と炭素制限状態に維持し、
かつ微生物セルロースを蓄積可能とするに足る速度で炭
素源を、炭素制限状態の培養液に対して連続的に供給す
る蓄積工程；（ｃ）　　細菌細胞及び蓄積された微生物
セルロースを、上記蓄積工程の終了時に培養液から除去
する除去工程、及び （ｄ）細菌セルロースと細菌細胞から分離する分離工程
。

微生物セルロースＪｙＡはすぐれた液体吸収性を有し、
広範囲多様な医療用途において（例えば英国特許第２１
３１７０１号明細書に記載される如き吸収用パッドにお
いて）使用できる９そのような医療用途のためには、静
置培養で作られる細菌セルロース１膜は直接に使用でき
る。しかし、微生物セルロースについてはその他の非医
療用途もあり、このような非医療用途については、−ａ
に１膜はより小さな片へ破壊される必要がある。

微生物セルロースは、菌体外多糖類とみなすことができ
る。そのような多糖類は、回分式または連続式培養法で
産生される場りには、通常、窒素または燐源のような別
の栄養による制限の条件下で、培地中に実質的に余剰の
炭素源を存在させて産生される。多くの場合に、炭素源
は極めて過剰に存在する（例えばキサンタン・ガムを産
生させるプロセスにおいて）。

解決すべき問題点： 菌体外の微生物セルロースを産生しつる多数の細菌株が
報告されており、例えばアセトバクターキシリヌム（Ａ
ｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　　ｘｙｌｉｎｕｍ）種の菌株（
例えば菌株Ａ、　Ｔ　ＣＣ２３７６９）、及びアセトバ
クター・アセチ（Ａ　、　ａｃｅｔｉ）の菌株［例えば
サブスプ・オルレア本ンシス（ｓｕｂｓｐ、　ｏｒｌｅ
ａｎｅｎｓｉｓ）菌株ＮＣＩＢ８７４７］がある。しか
しながら、微生１勿セルロースが商業的規模で成功裡に
製造されるには、培養されて微生物セルロースを産生ず
る改善された能力を有する細菌株を開発することが重要
である。

問題点を解決するための技術的手段： 本発明によれば、炭素源及びその他の必須栄養を含む水
性培地中で、菌体外の微生物セルロースを産生しうる細
菌株を好気培養することからなる菌体外微生物セルロー
スの製造方法であって、その細菌株がアセトバクターｓ
ｐ菌株Ｎ　ＣＩ　Ｂ　１２５４８またはそれから誘導さ
れた変異もしくは突然変異菌株であることを特徴とする
方法が提供される。

また本発明によれば、アセトバクターｓｐ菌株ＮＣｔＢ
　１２５４８またはそれから誘導された変異らしくは突
然変異菌体の微生物学的に純粋な培養１勿も提供される
。

発明の作用： アセトバクターｓｐ菌株ＮＣＩ　Ｂ　１２５４８（我々
は［菌株９９」と指定することもある）は、特許手続の
ための微生物の寄託に関するブタベスト条約の下に、英
国連邦スコツトランド　アバーディーンＡＢ’）８ＤＧ
、アビイ　ロード１３５．ＰＯＢｏｘ　　Ｎｏ。

３１所在のナショナル　コレクシコンズ　オアインダス
トリアル・アンド・マリン　バクテリア（ＮＣＩＭＢ）
によって、１９８７年９月２４０付けで寄託のため受領
寄託された。

本発明の方法において、炭素源は生長（増殖）のための
炭素源であるのが適当であるが、これは必ずしも必須で
はない。広範囲の炭素源を使用することができ、例えば
ＹＬ酸塩、エタノール、グリセロール、Ｎ蜜及びその他
の糖類（ｒ！Ａ：フルクトース及び殊にグルコース）が
ある。

適当には、微生物セルロースは、前述の（ａ）〜（ｄ）
の工程を有する我々の公告済の欧州特許第２７９５０６
最明Ｍ書に記載の方法によって、アセ１〜バクターｓｐ
Ｎ　ＣＩ　Ｂ　＋２５４８を増殖く培ｒｃ）することに
より作ることができる。この方法において、増殖工程の
ための培地は初期に炭素源を２〜２０ｇ／ｌの範囲内の
濃度で含むのが適当である。蓄積工程中に、炭素源は１
〜１０ｇ／ｌ／時の範囲内の濃度で培養液に供給される
のが好ましい。培養工程及び蓄積工程のための適当な培
地は下記の組成を有する。

ヘフトン（’０ｘｏｉｄ」：商標）　　　　　５．（ｈ
／１イーストエキス（’０ｘｏｉｄ」：商Ｂ）５．０ｇ
／ｌＮａ２ＨＰ　Ｏ＋　　　　　　　　　　　　２．７
ｇ＃クエン酸　　　　　　　　　　　　１．１５ｇ／Ｖ
グルコース　　　　　　　　　　　２０９／１（ｐｔ（
６，０に調整） 増殖及び蓄積工程を実施する初期ｐ　Ｈ値は４〜６．５
の範囲内であるのが適当であり、約５のｐＨ値が好まし
い。増殖及び蓄積工程は、適当には１５〜３５℃の範囲
内、好ましくは２０〜２８℃の範囲内の温度で実施する
。

蓄積工程中、培養液には、上澄液中の炭素源の濃度が０
〜０．５ｇ／ｌの範囲内に維持されるような速度（量〉
で炭素源が供給される。培養液中のその池の栄養の濃度
は、培養液中のそれらの栄養のうちの一つまたはそれ以
上が用い尽されるまで次第に低減される。蓄積工程は、
この時点で終結してよく、あるいは炭素源以外のその他
の栄養がさらに供給添加されてもよい。？炎者の場きに
、培養は、培Ｎ液が満足ずべき空気導入（曝気）のため
には高過ぎる粘度となるまで継続されうる。蓄積工程中
に、菌体外の微生物セルロースはく静止培養中に生成さ
れる大きな薄膜ではなく）、フロック（凝集体）の形で
生成される。

蓄積工程の完了後、細胞及び蓄積した微生物セルロース
からなるマスを、除去工程において適宜な方法によって
培養液から除去する。好ましくは、この除去は濾過によ
ってなされる０次いで分離工程において、セルロースを
細胞から分離する。この分離は、セルロースに影響を与
えることなく細胞な溶解させる試薬、例えばアルカリ性
試薬によって、セルロースと細胞とのマスを処理するこ
とにより行なうが適当て゛あり、このようにすると次い
でセルロースを分離することができる。

細胞を溶解させそしてセルロースを分離するための好ま
しい方法は、細胞／セルロース・マスを種水酸化ナトリ
ウム溶液、例えば０．１〜５．０％（好ましくは０．３
〜３％）の水酸化ナトリウノ、′１８液で処理すること
である。

本発明方法念公告欧州特許第２７９５０６最明ａｌ書記
載の方式で実施する場きに、増殖及び蓄積工程は同一の
培養槽中で好まし〈実施することができる。

しかし、それらの両工程を別々の培養槽で実施して、培
養工程で得られた培養液を培養工程培養槽から第２の培
養槽へ移行し、その第２の培養槽へ炭素源を制御された
旦で連続的に供給することらできる。この移行は、増殖
工程が完了する前に、そして炭素制限下での増殖が開始
する前に、行なうことができる。使用培養槽はｉ械撹拌
式であってよく、あるいは、培養槽中へ酸素含有ガスを
吹き込むことにより撹拌が行なわれる「エヤ　リフト」
式であってもよい。

適当な「エヤ・リフト」式培養槽（発酵槽）の例は、我
々の英国特許第１３５３００８号、第１４１７４８６号
及び第１４１７４８７号明細書に記載の如きものがある
。

本発明方法は、静置培養または連続培π法で実施するこ
ともできる。静置培養においては、初期ｐＨ４〜６．５
（好ましくは約５）及び温度１５〜３５”Ｃ（最も好ま
しくは２０〜２８℃）で、ｌα体栄養培地中で培養する
のが適当である。（ち手当用品（はう帯）またはその他
の医療用途のなめに有用な一体的ゲル状物質を得るため
には、増殖期間中に培地が実質的に動かないままでいる
ことが重要であり、その増殖時間は０．１ｍｍの厚さの
３膜についての数時間から、１５Ｉ＃ｍまたはそれ以上
の厚さの膜についての数日もしくは数週間である。静置
培養では、細菌は栄養培地の表面で培養されて、一体と
なった膜を形成する。この膜は、栄養培地から除去され
、水酸１ヒナトリウノ、またはその他の薬剤で処理して
細菌を除き、中和し、そして水洗して微生物セルロース
の水含有３念得る。このＪ：うにして（％られな膜は、
所望の寸法に切断され、熱または照射によって滅菌され
、そして例えば、やけどやその他の皮ふ傷のための手当
材として使用することができる。別の用途においては、
水をグリセロールまたはその池の生理学的相容性液体で
置換することがでさ、及び／または滅菌及び使用の前に
医薬剤念導入することもできる。液体含有膜は、長期保
存のため無菌、水不透過性容器に包装される。

７ｉ７７記（、）〜（ｄ＞の工程を有する方法（殊に本
発明の方法）で得られる微生物セルロースは、静置培養
法により薄膜の形に作られた微生物セルロースよりも、
食品における嵩高剤（増量剤）として、またはタブレッ
ト化助剤として一層容易に使用できる。

本発明を以下の実力色間で説明する。

Ｘ１涯 振どうフラスコに菌株ＮＣＩ　Ｂ　１２５４８（菌株９
９と称されることもある）を接種し、これを２・１時間
増殖させ、その時間後、得られたセルロースの純度を評
定した。この培養物を、炭素源グツ［コースを１０１．
／ｌ含む培地を入れた培養器に移した。グルコース濃度
を、培養物の増殖中にモニターし、その濃度が０．！５
ｇ／ｌにまで降下したときに、培養器へのグルコースの
供給を開始し、６４時間継続した。細胞乾燥型！（ｙ／
ｌ）、セルロース乾燥重量（ｉ／ｌ＞及びグルコース吸
収！　（ｙ／　ｌ）を一定時間間隙で測定した。その結
果を下表に示す。これは、セルロースの最適酸）ｖ（す
なわちセルロース３／グルコースｇ）は４１時間後に達
成されたことな示している。その後には、グルコースは
細胞乾燥重量を増加させるために約７時間にわたって（
セルロースをさらに生成させることなく）消費され続け
る。

表 培養９２．　燥ＭＪ　　　セルロース　　　　　グルゴ
ース　　　セルロース収率時間　胞重旦　屹燥重旦　吸
収量　（七ルσ−ス＋９７（ｔｒ、）　　　＜ｇ／ｌ）
　　　　　（ｙ／ｉ’）　　　　　　＜ｇ／ｌ＞　　　
　　グルコースｇ）１６．５　１．３８　　０．２９　
　　１１．１５　　０．０２６２３．０　　４．８　　
１．５４　　　　＋、３．６２　　０．１１３４１．０
　　６．３　　４．５０　　　２３．８０　　０．１８
９４８．０　　９．３　　４．４０　　　２８．９５　
　０．１５２６４．０　　９．２　　４．５０　　　３
７．８２　　０．１１９（外４名）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、炭素源及びその他の必須栄養を含む水性培地中で、
   菌体外の微生物セルロースを産生しうる細菌株を好気培
   養することからなる菌体外微生物セルロースの製造方法
   において、その細菌株がアセトバクターｓｐ菌株ＮＣＩ
   Ｂ１２５４８またはそれから誘導された変異もしくは突
   然変異菌株であることを特徴とする上記製造方法。 ２、炭素源が増殖のための炭素源である請求項１記載の
   方法。 ３、炭素源がグルコースである請求項１または２記載の
   方法。 ４、（ａ）存在する実質上すべての炭素源が利用されて
   、培養液が炭素制限状態となるまで、適宜な細菌株を撹
   拌回分培養液中で培養する増殖工程； （ｂ）撹拌培養中に炭素制限状態の培養液を炭素制限状
   態に維持し、かつ微生物セルロースを蓄積可能とするの
   に足る速度で炭素源を、炭素制限状態の培養液に対して
   連続的に供給する蓄積工程； （ｃ）細菌細胞及び蓄積された微生物セルロースを、上
   記蓄積工程の終了時に培養液から除去する除去工程；及
   び （ｄ）微生物セルロースを細菌細胞から分離する分離工
   程； を含む請求項１〜３のいずれかに記載の方法。 ５、増殖及び蓄積両工程を実施する初期ｐＨは４〜６．
   ５の範囲内である請求項４記載の方法。 ６、増殖及び蓄積両工程を２０〜２８℃の範囲内の温度
   で実施する請求項４または５記載の方法。 ７、蓄積工程中に培養液に対して、上澄液中の炭素源の
   濃度が０〜０．５ｇ／ｌの範囲内に保持されるような速
   度で炭素源を供給する請求項４〜６のいずれかに記載の
   方法。 ８、蓄積工程中に培養液中の炭素源以外の栄養の濃度を
   、培養液中の炭素源以外の栄養のうちの一つのものの供
   給物が用い尽されるまで、低減させる請求項４〜７のい
   ずれかに記載の方法。 ９、４〜６．５の範囲内の初期ｐＨ及び１５〜３５℃の
   範囲内の温度において静止培養で実施する請求項１〜３
   のいずれかに記載の方法。 １０、アセトバクターｓｐ菌株ＮＣＩＢ１２５４８また
   はそれから誘導された変異もしくは突然変異体、の微生
   物学的に純粋な培養物。