DE3688163T2 - Verfahren zur Rückgewinnung von extrazellulären Enzymen aus gesamten Fermentationsbrühen. - Google Patents

Verfahren zur Rückgewinnung von extrazellulären Enzymen aus gesamten Fermentationsbrühen.

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Description

  • Die Erfindung betrifft die Gewinnung extrazellulärer Enzyme aus gesamter Fermentationsbrühe durch Zugabe eines Gemisches aus einem Polymer und einem anorganischen Salz zu der gesamten Brühe.
    • Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik
  • Die Herstellung industrieller Enzyme durch Züchten von Mikroorganismen wie Bakterien, Pilzen und Hefe in wässerigen Nährmedien ist gut bekannt. In Abhängigkeit von der Natur des einzelnen Mikroorganismus kann/können die/das erzeugte/n Enzym/e extrazellulär, intrazellulär oder als ein Gemisch davon erzeugt werden. Wenn die/das erzeugte/n Enzym/e extrazellulärer Natur sind/ist, werden sie im allgemeinen durch erstes Abtrennen des enzymhaltigen Überstands von den Mikroorganismuszellen und anschließendes Gewinnen der/des Enzyms/e aus dem Überstand durch bekannte Verfahren, wie Fällen, Ultrafiltration und Eindampfen erhalten. Wenn das/die erzeugte/n Enzym/e intrazellulärer Natur sind, müssen sie zuerst aus den Zellen freigesetzt werden. Dies kann chemisch und/oder mechanisch geschehen. Die Enzyme werden zunächst in eine Lösung gegeben, sie können jedoch ebenso durch vorstehend erwähnte bekannte Verfahren gewonnen werden.
  • Es ist bekannt, daß extrazelluläre Enzyme Zusammensetzungen und Eigenschaften aufweisen, die sich von intrazellulären Enzymen unterscheiden. Extrazelluläre Enzyme, z. B. weisen im allgemeinen bedeutend niedrigere Molekulargewichte auf als intrazelluläre Enzyme. Die Lösung, die aus den Zellen freigesetzte zelluläre Enzyme enthält, beinhaltet auch bedeutende Mengen anderen intrazellulären Materials, das nicht in einer gesamten Fermentationsbrühe, die extrazelluläre Enzyme enthält, vorliegt. Diese Unterschiede können verschiedene Verfahrensweisen, die zur Gewinnung und Reinigung davon in wässeriger Lösung angewendet werden, bewirken. Ein zur Gewinnung von intrazellulären Enzymen geeignetes Verfahren ist somit nicht automatisch für extrazelluläre Enzyme brauchbar.
  • Um die Wirksamkeit und die Zweckmäßigkeit der Enzymerzeugung und Gewinnung zu verbessern, ist es bekannt, daß Enzyme durch Fermentation eines Mikroorganismus in einem Zweiphasennährmedium erzeugt werden können, das ein Gemisch aus Polyethylenglycol und Dextran enthält. Nach Ablauf der Fermentation wird das extrazelluläre Enzym in der oberen Polyethylenglycolphase konzentriert, während die Zellen und andere Fermentationsprodukte in der unteren Dextranphase angereichert werden. Dies wurde in Enzyme and Microb. Technol. Bd. 7, 333-338 (1985) beschrieben. Der Verteilungskoeffizient für α-Amylase in dem System hatte zum Beispiel ein Maximum von 4.
  • Eine Variante des vorstehenden Verfahrens ist in der US-Patentschrift Nr. 4 508 825 beschrieben, wobei der extrazelluläre enzymhaltige Überstand von den Zellen abgetrennt wird und der zellfreie Überstand mit Polyethylenglycol und einem kationischen Epihalogenhydrin/Polyamincopolymer oder Dextranpolymer unter Bildung von zwei Phasen gemischt wird. Diese Technik kann zum Trennen extrazellulärer Protease und Amylase verwendet werden, wobei die Protease in der Polyethylenglycolphase konzentriert wird und die Amylase sich in der kationischen Copolymer- oder Dextranphase anreichert.
  • Zweiphasenenzymgewinnungsverfahren wurden auch auf intrazelluläre Enzyme angewendet. Die US-Patentschrift 4 144 130 beschreibt die Verwendung von (1) einem Gemisch unsubstituierten oder substituierten Polyalkohols, Polyethers, Polyesters, Polyvinylpyrrolidons oder Polysaccharids hohen Molekulargewichts und einem anorganischen Salz oder (2) eines Gemisches von mindestens 2 der vorstehend genannten Polymeren hohen Molekulargewichts zur Gewinnung intrazellulärer, aus Zellen in eine wässerige Lösung freigesetzter Enzyme. Wenn ein Gemisch von Polyethylen und einem anorganischen Salz zum Beispiel verwendet wird, geht das gewünschte intrazelluläre Enzym in die obere Polyethylenglycolschicht über, während die Zelltrümmer und andere Fermentationsprodukte in die untere salzhaltige Schicht übergehen. Der Verteilungskoeffizient für verschiedene in der Glycolschicht gewonnene Enzyme betrug etwa 0,3, wenn die gesamte Fermentationsbrühe behandelt wurde. Der Verteilungskoeffizient wurde auf lediglich etwa 3 erhöht, wenn gefrorene Zellen mit Wasser vermischt werden und zur Freisetzung ihrer Enzyme aufgebrochen wurden.
  • Die Zugabe von Polyethylenglycol bei der Unterstützung anorganischer Salze zur Fällung von Enzymen aus zellfreiem Überstand ist in der US-Patentschrift Nr. 4 016 039 offenbart.
  • Es gibt im Stand der Technik keinen Hinweis darauf, daß Polyethylenglycol und anorganische Salze in einem Zweiphasenverfahren zur Gewinnung extrazellulärer Enzyme mit einem Verteilungskoeffizienten von mindestens 50 aus gesamter Fermentationsbrühe verwendet werden könnten.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Gemäß vorliegender Erfindung wird ein Verfahren zur Gewinnung eines extrazellulären Enzyms aus gesamter Fermentationsbrühe bereitgestellt, umfassend die Zugabe zu der gesamten Fermentationsbrühe, enthaltend Mikroorganismuszellen und ein extrazelluläres Enzym, einer Mischung von 1,5 -5,0% Calciumchlorid-dihydrat, 0,1-1,2% Mononatrium- oder Monokaliumphosphat und 0-0,6% Calciumhydroxid, wobei besagte Prozentangaben auf Gewicht/Volumen-Basis bezogen sind, berechnet auf das Gewicht des Zusatzes zu dem Volumen der Fermentationsbrühe und danach das Zusetzen einer Mischung von (a) einem Polymer, ausgewählt aus der Klasse, bestehend aus Polyethylenglycol, einem Aminderivat von Polyethylenglycol, einem Carboxylatderivat von Polyethylenglycol, Polypropylenglycol, einem Aminderivat von Polypropylenglycol, einem Carboxylatderivat von Polypropylenglycol, Poly(ethylenglycol)ester, Polyethylenimin, Trimethylamino-polyethylenglycol, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon und Mischungen davon und (b) einem anorganischen Salz, das es der gesamten Fermentationsbrühe-Polymer-Salz-Mischung erlaubt, sich in eine enzymreiche Polymerphase und eine enzymarme Salzphase zu scheiden und die Gewinnung eines enzymreichen Produkts daraus.
    • Beschreibung der Erfindung
  • Die extrazelluläre Enzyme enthaltenden gesamten Fermentationsbrühen, die als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren verwendbar sind, sind im Stand der Technik bekannt. Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis und Mucor miehei, zum Beispiel sind dafür bekannt, daß sie extrazelluläre Enzyme erzeugen wie Protease, Amylase und mikrobielles Lab, wenn sie in einem geeigneten Nährmedium wachsen. Das erhaltene Gemisch von Zelltrümmern, extrazellulären löslichen Enzymen und anderen Fermentationsprodukten kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren ohne weitere Abtrennung der Zelltrümmer von den löslichen Enzymen angewandt werden. Der hier verwendete Ausdruck "Zelltrümmer" bedeutet ganze Zellen sowie Zellfragmente.
  • Die gesamte Fermentationsbrühe wird mit einem Polymer und einem anorganischen Salz zur Bildung eines Zweiphasensystems vermischt. Das gewünschte extrazelluläre Enzym wird in der Polymerphase angereichert, während die Zelltrümmer sich in der Salzphase ansammeln.
  • Geeignete Polymere sind Polyethylenglycol, ein Aminderivat von Polyethylenglycol, ein Carboxylatderivat von Polyethylenglycol, Polypropylenglycol, ein Aminderivat von Polypropylenglycol, ein Carboxylatderivat von Polypropylenglycol, Poly(ethylenglycol)ester, Polyethylenimin, Trimethylamino-polyethylenglycol, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon und Gemische davon. Das bevorzugte Polymer ist Polyethylenglycol. Jegliche in der gesamten wässerigen Fermentationsbrühe lösliche Form von Polyethylenglycol ist geeignet. Ein besonders brauchbares Polyethylenglycol weist ein Molekulargewicht von etwa 3350 auf. Es ist bei Umgebungstemperatur fest und kann mühelos im industriellen Maßstab gehandhabt werden.
  • Das anorganische Salz kann von Verbindungen stammen, worin die Kationen Natrium, Kalium, Magnesium und Ammonium und die Anionen Sulfate, Carbonate, Citrate, Chloride, Phosphate und Gemische davon sind. Bevorzugte Salze sind Natriumchlorid und Natriumsulfat.
  • Das Polymer und das anorganische Salz werden zusammen zu der gesamten Fermentationsbrühe in Mengen unter Bildung eines Gesamtgemisches gegeben, das 64-90% gesamte Fermentationsbrühe, 1-15% Polymer und 8-35% anorganisches Salz enthält, wobei die prozentualen Angaben auf das Gewicht bezogen sind, auf der Basis des Gesamtgewichtes des Gemisches. Es ist bevorzugt, daß das gesamte Gemisch 73-79% gesamte Fermentationsbrühe, 3-4% Polymer und 15-24% anorganisches Salz enthält.
  • Nach Zugabe des Polymers und des Salzes bilden sich zwei Phasen. Die Polymerphase befindet sich gewöhnlich oberhalb der Salzphase. Die zwei Phasen können sich durch Absetzenlassen bilden, wobei das Gemisch für etwa 5 Stunden ungestört stehengelassen wird. Die enzymhaltige Polymerphase kann dann durch ein übliches flüssig/flüssig Trennverfahren, wie Hebern und Dekantieren unter Gewinnung des Enzyms getrennt werden. Es ist jedoch bevorzugt, Zentrifugieren zum Trennen der Phasen zu verwenden. Eine brauchbare Trenneinrichtung ist eine kontinuierliche Festkesselzentrifuge. Um eine gewünschte Konzentration des Enzyms in der letztlich abgetrennten Polymerphase zu erreichen, ist es bevorzugt, daß das Volumenverhältnis der enzymreichen Polymerphase zur enzymarmen Salzphase 0,12-0,15 beträgt.
  • Zur wirksamsten Gewinnung des extrazellulären Enzyms sollte die Zentrifuge so betrieben werden, daß nichts von der Polymerphase mit der zu verwerfenden Salzphase fortgerissen wird. Die erhaltene gesammelte Polymerphase kann etwas mitgerissene Salzphase vermischt darin enthalten. Das Gemisch wird dann einer zweiten Zentrifugaltrennung unterzogen, wobei die Zentrifuge so betrieben wird, das nichts der Polymerphase mit der Salzphase mitgerissen wird und nur ein geringer Anteil der Salzphase mit der Polymerphase mitgerissen wird.
  • Die so gesammelte enzymreiche Polymerphase kann direkt als Enzymquelle verwendet werden. Eine in einer Polyethylenglycolphase isolierte alkalische Protease ist zum Beispiel für Enzymwaschmittelformulierungen geeignet. Das Glycol ist als Stabilisator für das Enzym geeignet. Falls erwünscht, kann das Enzym aus dem Polymer durch an sich bekannte Verfahren wie Fällung, Ultrafiltration oder Eindampfen unter Herstellung eines im wesentlichen polymerfreien Enzymprodukts abgetrennt werden.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die gesamte Fermentationsbrühe mit einem Gemisch von 1,5-5,0% Calciumchlorid-dihydrat, 0,1-1,2% Mononatrium- oder Monokaliumphosphat und 0-0,6% Calciumhydroxid vorbehandelt, wobei die prozentualen Anteile auf einer Gewichts/Volumenbasis auf dem Gewicht von Additiv zu Volumen der Fermentationsbrühe berechnet wurde. Dieser Vorbehandlungsschritt unterstützt das Ausflocken der Zelltrümmer und verbessert die Abtrennung des Enzyms von den Zelltrümmern, wenn das Polymer und das anorganische Salz nacheinander zugegeben werden. Vorzugsweise sollte der Vorbehandlungsschritt, wenn eine Protease gewonnen wird, 1,5-5,0% Calciumchlorid-dihydrat und 0,2-1,2% Mononatrium- oder Monokaliumphosphat zur Anwendung bringen. Wenn eine Amylase isoliert werden soll, so sollte der Vorbehandlungsschritt 1,5-5,0% Calciumchlorid-dihydrat, 0,1- 1,2% Mononatrium- oder Monokaliumphosphat und 0,1-0,6% Calciumhydroxid zur Anwendung bringen.
  • Der Verteilungskoeffizient ist auf dem technischen Gebiet als Maß für die Wirksamkeit der Trennung bekannt. Er wird ausgedrückt als Enzymaktivitätskonzentration im Oberen der Polymerphase geteilt durch die Enzymaktivitätskonzentration am Boden oder in der anorganischen Salzphase. Die Enzymaktivität jeder Phase kann durch bekannte Verfahren gemessen werden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann Verteilungskoeffizienten von mindestens 50 erreichen, die einen bedeutenden Fortschritt gegenüber dem Stand der Technik darstellen.
  • Die Erfindung wird weiter im einzelnen in den nachstehenden Beispielen beschrieben.
    • Beispiel 1
  • Ein Nährmedium, geeignet zur Herstellung von alkalischer Protease wird durch Zugabe der nachstehenden Bestandteile zu einem 6000 Gallon (22712 l)-Fermenter hergestellt:
  • Weizengluten 1500 lb (681 kg)
  • Natriumcitrat 165 lb (74,9 kg)
  • Calciumchlorid-dihydrat 165 lb (74,9 kg)
  • Mais stärke 5000 lb (2270 kg)
  • Sojamehl 2500 lb (1135 kg)
  • hitzestabile α-Amylase 5 lb (2,27 kg)
  • Mononatriumphosphat 400 lb (181,6 kg)
  • Dinatriumphosphat 400 lb (181,6 kg)
  • Antischäumungsmittel 16,5 gal (62,5 l)
  • Wasser bis 6000 gal (22712 l)
  • Das Medium wurde dann mit lebenden Zellen von Bacillus licheniformis beimpft und für 36 Stunden bei 36ºC fermentiert. Zu der sich ergebenden gesamten Fermentationsbrühe wurden 214 gal (811 l) einer 70%-igen (Gew./Vol.) wässerigen Calciumchlorid-dihydratlösung und 300 lb (136 kg) Mononatriumphosphat gegeben. Dies ergibt ein Gemisch, das 2,5% (Gew./Vol.) Calciumchlorid-dihydrat und 0,6% (Gew./Vol.) Mononatriumphosphat enthält, bezogen auf das Gewicht jeden Additivs und das Volumen der Fermentationsbrühe. Der pH-Wert des Gemisches wurde während des Zumischens der Additive durch Zugabe von Natriumhydroxid auf 6,8 bis 7,6 gehalten. Nachdem das Mischen abgeschlossen war, wurde der pH-Wert auf 7,4 bis 7,6 durch Zugabe von Natriumhydroxid eingestellt, um das Ausflocken zu vervollständigen. Der pH-Wert wurde dann durch Zugabe von 50 Gew.-% wässeriger Essigsäurelösung auf 6,4 bis 6,6 eingestellt. Zu dem erhaltenen Gemisch wurden 11600 lb (5269 kg) Natriumchlorid bei 25-27ºC zugegeben und das Gemisch wurde für eine Stunde gerührt, um das gesamte Natriumchlorid zu lösen. Dann wurden 3100 lb (1400 kg) Polyethylenglycol mit einem Molekulargewicht von 3350 lb und 4250 lb (1930 kg) Natriumsulfat zugegeben und die gesamte Brühe auf eine Temperatur von 30 bis 32ºC erhitzt. Der pH-Wert der gesamten Brühe wurde auf 6,0 bis 6,2 durch Zugabe von Essigsäurelösung eingestellt und das gesamte Gemisch wurde zwei Stunden gerührt. Das gesamte Gemisch enthielt 15% (Gew./Gew.) Natriumchlorid, 4% (Gew. /Gew.) Polyethylenglycol, 5,5% (Gew. /Gew.) Natriumsulfat und 75,5% (Gew./Gew.) Gesamtfermentationsbrühe. Die prozentualen Anteile wurden auf das Gewicht des Additivs zu dem Gewicht des gesamten Gemisches der Fermentationsbrühe und der Additive berechnet. Nach dem Vermischen trennte sich die gesamte Mischung in eine obere Polyethylenglycolphase und eine untere Natriumchlorid-Natriumsulfat-Zelltrümmerphase. Das Phasenverhältnis oberen Phasenvolumen zu unterem Phasenvolumen betrug 0,15. Die Konzentration der Proteaseaktivität in der oberen Phase geteilt durch die Proteaseaktivität in der unteren Phase ergibt einen Verteilungskoeffizienten von 60 bis 80. Eine kontinuierliche Festkesselzentrifuge wurde dann zur Trennung der zwei Phasen verwendet. Die Zentrifuge wurde für die erste Trennung eingestellt, wobei keine Polyethylenglycolphase mit der Salzphase, die verworfen wurde, mitgerissen wurde. Die Glycolphase enthielt 90 bis 92% der gesamten Enzymaktivität der Fermentationsbrühe. Diese Glycolphase enthielt auch etwa 5 bis 20 Vol.-% mitgerissener Salzphase. Die wie vorstehend gesammelte Glycolphase wurde dann einer zweiten Trennung unter Verwendung der gleichen Vorrichtung unterzogen, wobei die Betriebsparameter so eingestellt wurden, daß weniger als 2 Vol.-% mitgerissener Salzphase in der Glycolphase zugelassen wurden. Die Salzphase wurde verworfen und sie enthielt keine Glycolphase mehr. Die Glycolphase wurde wie vorstehend gesammelt und dann in einen gekühlten Tank bei 10ºC gegeben, um Restmengen von Natriumsulfat zu entfernen. Eine kleine Menge von Natriumsulfatkristallen wurde zugegeben, um das Wachstum der Natriumsulfatkristalle auszulösen. Nach 2 Stunden unter leichtem Rühren bei 10ºC wurde die natriumsulfatfreie Glycolphase abgezogen. Sie wurde dann mit Aktivkohle und Filtrierhilfe vermischt und dann unter Verwendung einer Filterpresse filtriert. Die erhaltene Glycollösung, die reich an alkalischer Protease ist, kann direkt in flüssigen Enzymwaschmittelformulierungen verwendet werden.
    • Beispiel 2
  • Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt bis zu der Stufe der Zugabe von Calciumchlorid-dihydrat und Mononatriumphosphat. Das erhaltene Gesamtfermentationsbrühe-Additivgemisch wurde dann mit 2130 lb (970 kg) Polyethylenglycol mit einem Molekulargewicht von 3350 und 10660 lb (4850 kg) Natriumsulfat vermischt und die Temperatur der gesamten Brühe wuchs auf 30-32ºC an. Das gesamte Gemisch, das 3% (Gew./Gew.) Polyethylenglycol, 15% (Gew./Gew.) Natriumsulfat und 82% (Gew./Gew.) gesamte Fermentationsbrühe enthielt, wurde für 1 Stunde gerührt. Nach dem Mischen trennte sich das gesamte Gemisch in eine obere Polyethylenglycolphase und eine untere Natriumsulfat-Zelltrümmerphase. Das Phasenverhältnis des oberen Phasenvolumens zum unteren Phasenvolumen betrug 0,12. Die Konzentration der Proteaseaktivität der oberen Phase geteilt durch die Konzentration der Proteaseaktivität der unteren Phase ergab einen Verteilungskoeffizienten von 60 bis 80. Die alkalische Protease in der Glycolphase lag als amorpher Feststoff vor. Die zwei Phasen wurden dann mit einer Zentrifuge, wie in Beispiel 1 beschrieben, unter Herstellung einer Glycolphase getrennt, die die amorphe feste Protease und weniger als 2 Vol.-% mitgerissener Salzphase enthielt. Die Feststoffe wurden dann durch Zentrifugieren gewonnen und sie können dann als gekörnte Protease in gekörnten Enzymwaschmittelprodukten verwendet werden.
    • Beispiel 3
  • Ein Nährmedium, das zur Herstellung von hitzestabiler α-Amylase geeignet ist, wurde durch Zugabe der nachstehenden Bestandteile zu einem 6000 Gallon (22712 l) Fermenter hergestellt:
  • Calciumchlorid-dihydrat 22,5 lb (10,2 kg)
  • Monokaliumphosphat 300 lb (136,2 kg)
  • Dikaliumphosphat 700 lb (317,8 kg)
  • Ammoniumsulfat 250 lb (113,5 kg)
  • Natriumcitrat 100 lb (45,4 kg)
  • Maisquellwasser 1000 lb (454 kg)
  • Lactose 7000 lb (3178 kg)
  • Baumwollsamenmehl 1500 lb (681 kg)
  • Sojamehl 2000 lb (908 kg)
  • Antischäumungsmittel 165 gal (625 l)
  • Wasser bis 6000 gal (22712 l)
  • Das Medium wurde dann mit lebenden Zellen vom Bacillus licheniformis beimpft und für 108-110 Stunden bei 42ºC fermentiert, während der pH-Wert auf 7,5 bis 7,15 durch periodische Zugabe von Natriumhydroxid gehalten wurde. Zu der erhaltenen gesamten Fermentationsbrühe wurden 343 gal (1300 l) 70%-iger (Gew./Vol.) wässeriger Calciumchloriddihydratlösung oder 240 gal (908 l) 10% (Gew./Vol.) wässeriger Calciumhydroxidlösung und 60 lb (27 kg) Monokaliumphosphat gegeben. Dies ergibt ein Gemisch, das 4% (Gew./Vol.) Calciumchlorid-dihydrat, 0,4% (Gew./Vol.) Calciumhydroxid und 0,12% (Gew./Vol.) Monokaliumphosphat enthält, bezogen auf das Gewicht jeden Additivs und das Volumen der Fermentationsbrühe. Der pH-Wert des Gemisches wurde auf 7,6-8,4 während des Zumischens der Additive durch Zugabe von Natriumhydroxid gehalten. Nach Ablauf des Vermischens wurde der pH- Wert auf 8,4 bis 8,6 durch Zugabe von Natriumhydroxid eingestellt. Zu dem erhaltenen Gemisch wurde 2600 lb (1180 kg) Polyethylenglycol mit einem Molekulargewicht von 3350 und 7420 lb (3370 kg) Natriumchlorid bei 25 bis 27ºC gegeben und das Gemisch wurde für mindestens 1 Stunde bewegt. Natriumsulfat wurde dann in einer Menge von 5940 lb (2700 kg) zugegeben und das Fermentationsbrühengemisch wurde auf 30 bis 32ºC erhitzt. Der pH-Wert wurde auf 7,9 bis 8,1 durch Zugabe von Natriumhydroxid eingestellt und das gesamte Gemisch wurde für mindestens 2 Stunden gerührt. Das gesamte Gemisch enthielt 3,5% (Gew./Gew.) Polyethylenglycol, 10% (Gew./Gew.) Natriumchlorid, 8% (Gew./Gew.) Natriumsulfat und 78,5% (Gew./Gew.) gesamte Fermentationsbrühe. Nach dem Vermischen trennte sich das gesamte Gemisch in eine obere Polyethylenglycolphase und eine untere Natriumsulfat-Zelltrümmerphase. Das Phasenverhältnis des oberen Phasenvolumens zum unteren Phasenvolumen betrug 0,12. Die Konzentration der Amylaseaktivität der oberen Phase geteilt durch die Konzentration der Amylaseaktivität der unteren Phase ergab einen Verteilungskoeffizienten von 50 bis 70. Eine kontinuierliche Festkesselzentrifuge wurde wie in Beispiel 1 beschrieben zur Isolierung der amylasereichen Glycolphase verwendet, die dann wie in Beispiel 1 beschrieben zu einem amylasereichen Glycolprodukt gereinigt wurde.
    • Beispiel 4
  • Ein Nährmedium, das zur Herstellung von hitzestabiler α-Amylase geeignet ist, wurde durch Zugabe der nachstehenden Bestandteile zu einem 6000 Gallon (22712 l) Fermenter hergestellt:
  • Calciumcarbonat 530 lb (240,6 kg)
  • Fischmehl 750 lb (340,5 kg)
  • Sojamehlschrot 2800 lb (1271 kg)
  • Maisquellwasser 1500 lb (681 kg)
  • Lactose 7000 lb (3178 kg)
  • Diammoniumphosphat 130 lb (59 kg)
  • Antischäumungsmittel 40 gal (151,4 l)
  • Wasser bis 6000 gal (22712 l)
  • Das Medium wurde dann mit lebenden Zellen vom Bacillus amyloliquefaciens beimpft und für 60 Stunden bei 34ºC fermentiert, während der pH-Wert durch periodische Zugabe von Natriumhydroxid auf 7,05 bis 7,15 gehalten wurde. Zu der erhaltenen gesamten Fermentationsbrühe wurden 257 gal (973 l) 70% (Gew./Vol.) wässeriger Calciumchlorid-dihydratlösung, 180 gal (681 l) 10% (Gew./Vol.) wässeriger Calciumhydroxidlösung und 300 lb (136 kg) Monokaliumphosphat gegeben. Dies ergibt ein Gemisch, das 3% (Gew./Vol.) Calciumchlorid-dihydrat, 0,3% (Gew./Vol.) Calciumhydroxid und 0,6% (Gew./Vol.) Monokaliumphosphat enthält, bezogen auf das Gewicht jeden Additivs und das Volumen jeder Fermentationsbrühe. Der pH-Wert des Gemisches wurde während der Zugabe der Additive durch Zugabe von Natriumhydroxid auf 6,8 bis 7,6 gehalten. Nach Ablauf des Vermischens wurde der pH-Wert auf 7,4 bis 7,6 durch Zugabe von Natriumhydroxid eingestellt. Zu dem erhaltenen Gemisch wurden 2510 lb (1140 kg) Polyethylenglycol mit einem Molekulargewicht von 3350 und 7960 lb (3600 kg) Natriumchlorid bei 25-27ºC gegeben und das Gemisch wurde für mindestens 1 Stunde bewegt. Natriumsulfat in einer Menge von 10700 lb (4870 kg) wurde dann zugegeben und das Fermentationsbrühengemisch wurde auf 30 bis 32ºC erhitzt. Der pH-Wert wurde auf 7,4 bis 7,6 durch Zugabe von Natriumhydroxid eingestellt und das Gesamtgemisch wurde für mindestens 2 Stunden gerührt. Das Gesamtgemisch enthielt 3,15% (Gew./Gew.) Polyethylenglycol, 10% (Gew./Gew.) Natriumchlorid, 13,5% (Gew./Gew.) Natriumsulfat und 73,35% (Gew./Gew.) Fermentationsbrühe. Nach dem Vermischen trennte sich das gesamte Gemisch in zwei Phasen, wie in Beispiel 3 beschrieben, mit einem Phasenverhältnis von 0,12 und einem Verteilungskoeffizienten von 50 bis 70. Die Phasen wurden dann wie hier beschrieben unter Herstellung eines amylasereichen Glycolprodukts behandelt.

Claims (11)

1. Verfahren zur Gewinnung eines extrazellulären Enzyms aus gesamter. Fermentationsbrühe, beinhaltend die Zugabe zu der gesamten Fermentationsbrühe, enthaltend Mikroorganismenzellen und ein eztrazelluläres Enzym, eine; Mischung von 1,5-5,0% Calciumchlorid-dihydrat, 0,1-1,2% Mononatrium- oder Monokaliumphosphatu und 0- 0,6% Calciumhydroxid, wobei besagte Prozentangaben auf Gewicht/Volumen-Basis bezogen sind, berechnet auf das Gewicht des Zusatzes zu dem Volumen der Fermentationsbrühe und danach das Zusetzen einer Mischung von (a) einem Polymer, ausgewählt aus der Klasse, bestehend aus Polyethylenglykol, einem Aminderivat von Polyethylenglykol, einem Carboxylatderivat von Polyethylenglykol, Polypropylenglykol, einem Aminderivat von Polypropylenglykol, einem Carboxylatderivat von Polypropylenglykol, Poly(ethylenglykol)ester, Polyethylenimin, Trimethylamino-polyethylenglykol, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon und Mischungen davon und (b) einem anorganischen Salz, das es der gesamten Fermentationsbrühe-Polymer-Salz-Mischung erlaubt, sich in eine enzymreiche Polymerphase und eine enzymarme Salzphase zu scheiden und die Gewinnung eines enzymreichen Produkts daraus.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das anorganische Salz aus der Klasse von Verbindungen ausgewählt ist, worin die Kationen Natrium, Kalium, Magnesium und Ammonium sind und die Anionen Sulfate, Carbonate, Zitrate, Chloride, Phosphate und Mischungen daraus sind.
3. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 oder 2, worin die gesamte Mischung aus gesamter Fermentationsbrühe, Polymer und anorganischem Salz 64-90, bevorzugt 73-79% gesamte Fermentationsbrühe, 1-15, bevorzugt 3-4% Polymer und 8-35, bevorzugt 15-24% anorganisches Salz enthält, wobei besagte Prozentangaben in Gewicht bezogen auf das Gesamtgewicht der Mischung sind.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Polymer Polyethylenglykol ist und das anorganische Salz eine Mischung aus Natriumchlorid und Natriumsulfat oder nur Natriumsulfat ist.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die gesamte Fermentationsbrühe mit einer Mischung aus 1,5- 5,0% Calciumchlorid-dihydrat und 0,2-1,2% Mononatriumphosphat oder Monokaliumphosphat in Kontakt gebracht wird, vor der Zugabe des Polymers und der anorganischen Salzmischung.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die gesamte Fermentationsbrühe mit einer Mischung aus 1,5- 5,0% Calciumchlorid-dihydrat, 0,1-0,6% Calciumhydroxid und 0,1-1,0% Mononatrium- oder Monokaliumphosphat in Kontakt gebracht wird, vor der Zugabe des Polymers und der anorganischen Salzmischung.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das Volumenverhältnis von enzymreicher Polymerphase zu enzymarmer Salzphase 0,12-0,15 beträgt.
8. Verfahren zur Gewinnung von extrazellulärer alkalischer Protease, beinhaltend die Fermentierung eines geeigneten Stammes von Bacillus licheniformis in einem passenden Nährmedium, um eine gesamte Fermentationsbrühe herzustellen, die Bacillus licheniformis Zellen und extrazelluläre alkalische Protease enthält, die Zugabe zu der besagten gesamten Fermentationsbrühe von 2,5% Calciumchlorid-dihydrat und 0,6% Mononatrium- oder Monokaliumphosphat, wobei besagte Prozentangaben auf Gewicht/Volumen-Basis bezogen sind, berechnet auf das Gewicht des Zusatzes zu dem Volumen der Fermentationsbrühe, die Zugabe zu der obengenannten Mischung von 3% Polyethylenglykol und 15% Natriumsulfat, wobei besagte Gewichtsprozentangaben bezogen sind auf das Gewicht der Gesamtmischung der Fermentationsbrühe und der Zusätze, die Bildung einer alkalischen Protease-reichen Polyethylenglycolphase und einer alkalischen Protease-armen Natriumsulfatphase und die Trennung der zwei Phasen, um ein alkalische Protease-reiches Produkt daraus zu gewinnen.
9. Verfahren gemäß Anspruch 8, worin nach dem Hinzufügen des Calciumchlorid-dihydrats und des Mononatrium- oder Monokaliumphosphats die Mischung mit 15% Natriumchlorid, 4% Polyethylenglykol und 5,5% Natriumsulfat in Kontakt gebracht wird, wobei besagte Gewichtsprozentangaben bezogen sind auf das Gewicht der Gesamtmischung der Fermentationsbrühe und der Zusätze.
10. Verfahren zur Gewinnung einer extrazellulären hitzebeständigen alpha-Amylase, beinhaltend die Fermentierung eines geeigneten Stammes von Bacillus licheniformis in einem passenden Nährmedium, um eine gesamte Fermentationsbrühe herzustellen, die Bacilius licheniformis Zellen und extrazelluläre alpha-Amylase enthält, die Zugabe zu der besagten gesamten Fermentationsbrühe von 0,4% Calciumhydroxid, 0,12% Mononatrium- oder Monokaliumphosphat und 4% Calciumchlorid-dihydrat, wobei besagte Prozentangaben auf Gewicht pro Volumen-Basis bezogen sind, berechnet auf das Gewicht eines Zusatzes zu dem Volumen der. Fermentationsbrühe, die Zugabe zu der obengenannten Mischung von 3,5% Polyethylenglykol, 10% Natriumchlorid und 8% Natriumsulfat, wobei besagte Gewichtsprozentangaben bezogen sind auf das Gewicht der Gesamtmischung der Fermentationsbrühe und der Zusätze, die Bildung einer Amylase-reichen Polyethylenglykolphase und einer Amylase-armen Natriumchlorid- Natriumsulfatphase und die Trennung der zwei Phasen, um ein Amylase-reiches Produkt daraus zu gewinnen.
11. Verfahren zur Gewinnung einer extrazellurären alpha- Amylase, beinhaltend die Fermentierung eines geeigneten Stammes von Bacillus amyloliquefaciens in einem passenden Nährmedium, um eine gesamte Fermentationsbrühe herzustellen, die Bacillus amyloliquefaciens Zellen und extrazelluläre alpha-Amylase enthält, die Zugabe zu der besagten gesamten Fermentationsbrühe von 3% Calciumchlorid-dihydrat, 0,3% Calciumhydroxid und 0,6% Mononatrium- oder Monokaliumphosphat, wobei besagte Prozentangaben auf Gewicht pro Volumen-Basis bezogen sind, berechnet auf das Gewicht des Zusatzes zu dem Volumen der Fermentationsbrühe, die Zugabe zu der obengenannten Mischung von 3,15% Polyethylenglykol, 10 % Natriumchlorid und 13,5% Natriumsulfat, wobei besagte Gewichtsprozentangaben bezogen sind auf das Gewicht der Gesamtmischung der Fermentationsbrühe und der Zusätze, die Bildung einer Amylase-reichen Polyethylenglykolphase und einer Amylase-armen Natriumchlorid- Natriumsulfatphase und die Trennung der zwei Phasen, um das Amylase-reiche Produkt daraus herzustellen.
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