DE60012079T2

DE60012079T2 - Verfahren zur Herstellung von Arabitol durch kontinuierliche Gärung

Info

Publication number: DE60012079T2
Application number: DE60012079T
Authority: DE
Inventors: Pierrick Duflot; Pierre Lanos; Fabrice Machu; Laurent Segueilha
Original assignee: Roquette Freres SA
Current assignee: Roquette Freres SA
Priority date: 1999-05-11
Filing date: 2000-05-05
Publication date: 2005-09-01
Anticipated expiration: 2020-05-06
Also published as: DK1052289T3; DE60012079D1; ES2222160T3; FR2793498B1; EP1052289A1; ATE271133T1; EP1052289B1; US6268190B1; FR2793498A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Arabit durch fortlaufendes Fermentieren von wenigstens einem Zucker durch Mikroorganismen, die Arabit herstellen.
Sie hat insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von Arabit durch fortlaufendes Fermentieren von wenigstens einem Zucker durch Mikroorganismen zum Gegenstand, die Arabit herstellen, wobei das Verfahren wenigstens zwei miteinander verbundene Fermentationszonen einsetzt.
Präziser besteht das erfindungsgemäße Verfahren aus dem Ausführen der Herstellung von Arabit in einer ersten Fermentationszone, wobei der Verbrauch eines Teils des in das Fermentationsmedium eingebrachten Zuckers gefördert wird, das den Teil enthält, dann aus dem Übertragen eines Teils des Fermentationsmediums in eine zweite Fermentationszone, alles wobei das Volumen der ersten Zone durch Hinzufügen von Zucker konstant gehalten und wobei die Herstellung von Arabit in der zweiten Fermentationszone auf die Weise fortgesetzt wird, dass der zurückgebliebene Zucker verbraucht wird.
Man fährt sodann in der zweiten Fermentationszone mit der fortlaufenden Trennung des auf diese Weise erhaltenen Fermentationsmediums mit niedrigem zurückgebliebenem Zuckergehalt in eine Fraktion, in der Mikroorganismen konzentriert sind, und eine andere lösliche Fraktion, die mit Arabit angereichert ist, und gegebenenfalls unter Rückführung der Mikroorganismen an den Eingang der ersten Fermentationszone fort.
Die industrielle Herstellung von Arabit verläßt sich hauptsächlich auf Fermentationsverfahren.
Auf allgemeine Weise können die mikrobiologischen Herstellungsverfahren von Arabit zwei verschiedene Fermentationsmodi einsetzen: den nichtfortlaufenden Modus und den fortlaufenden Modus.
Im nichtfortlaufenden Modus werden klassischerweise zwei Techniken verwendet: die eigentlich nichtfortlaufende Fermentationstechnik (oder "batch") genannte Technik und die nichtfortlaufende Beschickungs-Fermentationstechnik (oder "fed batch").
In der eigentlich nichtfortlaufenden Fermentationstechnik genannten Technik werden alle für die Ernährung der Mikroorganismen notwendigen Substrate am Anfang der Fermentation eingebracht, und das hergestellte Arabit wird am Ende der Fermentation entnommen.
Unter "Substrat" versteht man die Gesamtheit der Nährstoffe, die man in das Fermentationsmedium einführt. Im Sinne der Erfindung sind die Substrate hauptsächlich Kohlenstoffquellen (darin eingeschlossen Zucker) und Stickstoffquellen, die direkt durch die Arabit herstellenden Mikroorganismen assimilierbar sind.
Diese nichtfortlaufende Fermentation weist dennoch den Nachteil auf, eine lange Fermentationszeit zu benötigen, um den vollständigen Verbrauch des in das Fermentationsmedium eingeführten Zuckers zu erlauben, und den Einsatz großer Volumina von Fermentationsmedium notwendig zu machen, und folglich von großen Fermentern, um Erträge mit zufriedenstellender Umwandlung zu erhalten. Dies läßt sich mit einer mittelmäßigen Volumenproduktivität übersetzen.
Außerdem passiert es, dass die Veränderung der Konzentration von einem der Bestandteile des Fermentationsmediums die Erträge oder die Produktivität an Arabit beeinflußt.
Eine Lösung besteht aus dem Einsatz der zweiten nichtfortlaufenden Fermentationstechnik, die nichtfortlaufende Beschickungs-Fermentation genannt wird.
Diese Technik besteht besonders aus dem schrittweisen Einführen der Substrate in das Fermentationsmedium.
Der Vorteil dieser Technik ist nun nicht nur, die Substratkonzentrationen des Fermentationsmediums kontrollieren zu können, sondern ebenfalls den vollständigen Verbrauch des eingeführten Zuckers erlaubt.
Die nichtfortlaufende Beschickungs-Fermentationstechnik erlaubt nun, die Probleme zu lösen, die verbunden sind mit den möglichen Wirkungen von gewissen Bestandteilen der Fermentationssubstrate als Inhibitoren gegenüber dem Wachstum von Mikroorganismen oder der Herstellung von Arabit, oder zum Beispiel einer feineren Regelung der Belüftung, die die Herstellung von Arabit entscheidend beeinflusst.
Dennoch ist es notwendig, erhöhte Substratkonzentrationen einzusetzen, um zufriedenstellende Erträge und Produktivitäten zu erhalten. Die Fermentationsdauern sind besonders lang, und es muss eine schwerfällige und langweilige Kontrolle der verschiedenen Schritte der Fermentation sichergestellt werden.
Also erlaubt das durch ESCALANTE et al. (in Journal of Fermentation and Bioengineering, 70–4, 228–231, 1990) beschriebene Verfahren zur Herstellung von Arabit durch Hansenula durch nichtfortlaufende Beschickungs-Fermentation nicht, einen industriell interessanten Ertrag und eine industriell interessante Produktivität zu erreichen.
Selbst wenn das Arabit selektiv hergestellt wird, und wenn es das nichtfortlaufende Beschickungs-Fermentationsverfahren erlaubt, den Verbrauch der gesamten in das Fermentationsmedium eingeführten Glukose sicherzustellen, wird Arabit tatsächlich nur mit einem Ertrag in der Größenordnung von 14 % erhalten.
Der zweite Fermentationsmodus, der klassischerweise für die Herstellung von Arabit über einen biologischen Weg eingesetzt wird, ist der fortlaufende Modus, wie zum Beispiel durch JAKOBUS van ZYL und PRIOR in Appl. Microbiol. Biotechnol. (1990), 33, 12–17 beschrieben.
Im fortlaufenden Modus werden die Fermentationssubstrate auf fortlaufende Weise dem Fermenter hinzugefügt, und die Fraktionen des Fermentationsmediums werden mit demselben Durchfluss wie der Beitrag an Substrat auf die Weise entnommen, um mit einem konstanten Volumen zu arbeiten.
Dieser Fermentationsmodus erlaubt einen beachtlichen Gewinn an Ertrag und Produktivität, aber er erlaubt nicht, ein Produkt mit hoher Reinheit zu erhalten, da doch das gewonnene Produkt zwangsläufig mit Substraten kontaminiert ist, die im Gange der Fermentation wieder eingeführt werden.
Infolgedessen ist der hauptsächliche Nachteil der Fermentationsverfahren im fortlaufenden Modus die Notwendigkeit, das Arabit zu reinigen. Außerdem erlauben die Reinigungstechniken nur schwer, das Arabit von zurückbleibendem nicht von den Mikroorganismen assimiliertem Zucker zu trennen.
Damit findet man klassischerweise komplexe, schwerfällige und teure Anlagen, die mit diesen Fermentationsverfahren verbunden sind.
Alle Anstrengungen von Fermentationsspezialisten tragen also zur Erforschung der operativen Bedingungen bei, die zu einer Übereinstimmung von besserem Ertrag und Produktivität von Arabit mit einem geringen Gehalt an zurückbleibendem Zucker führen, die ein billige und leichte Reinigung des hergestellten Arabits ermöglichen.
Die vorliegende Erfindung hat daher zum Zweck, die Probleme bei der Herstellung von Arabit mit zufriedenstellender Reinheit mit ausgezeichnetem Ertrag und Produktivität durch Verwenden einer Fermentationstechnik insbesondere im fortlaufenden Modus zu lösen.
Das durch die anmeldende Gesellschaft entwickelte Herstellungsverfahren von Arabit besteht aus dem Ausführen der Fermentation von wenigstens einem Zucker durch Arabit herstellende Mikroorganismen in zwei Fermentationszonen.
Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf ein Verfahren zur Herstellung von Arabit durch fortlaufende Fermentation von wenigstens einem Zucker durch Arabit herstellende Mikroorganismen, gekennzeichnet durch die Schritte, dass man:

a) die Produktion von Arabit in einer ersten Fermentationszone umfassend wenigstens einen Fermenter auf die Weise führt, dass ein Teil des Zuckers, der in das Fermentationsmedium eingebracht wird, durch die Mikroorganismen verbraucht wird,
b) einen auf diese Weise erhaltenen Teil des Fermentationsmediums in eine zweite Fermentationszone umfassend wenigstens einen Fermenter überträgt, unter Konstanthalten des Volumens in der ersten Fermentationszone durch Hinzufügen von Zucker,
c) die Produktion von Arabit in der zweiten Fermentationszone auf die Weise fortsetzt, dass der Zucker verbraucht wird, der im Fermentationsmedium zurückgeblieben ist,
d) das auf diese Weise erhaltene Fermentationsmedium der zweiten Fermentationszone kontinuierlich in eine Fraktion trennt, in der Mikroorganismen konzentriert sind, und in eine andere lösliche Fraktion, die mit Arabit angereichert ist.
e) das auf diese Weise hergestellte Arabit sammelt.

Der erste erfindungsgemäße Schritt besteht aus Durchführen der Herstellung von Arabit in einer ersten Fermentationszone, umfassend wenigstens einen Fermenter, auf die Weise, dass ein Teil des in das Fermentationsmedium eingebrachten Zuckers durch die Mikroorganismen verbraucht wird.
Man wählt vorteilhafterweise die Mikroorganismen aus osmotoleranten natürlichen oder modifizierten Hefen, die Arabit aus Zucker als direkt assimilierbarer Kohlenstoffquelle herstellen.
Unter "osmotoleranten Hefen" versteht man Hefen, die fähig sind, erhebliche osmotische Drücke auszuhalten und die zu den Gattungen Yamadazyma, Debaromyces, Hansenula, Candida, Zygosaccharomyces und Saccharomyces... gehören, wobei diese Liste nicht beschränkend sein soll.
Unter "natürlichen osmotoleranten Hefen" versteht man osmotolerante Hefen, die aus ihrer Umwelt aufgrund ihrer natürlichen Fähigkeiten isoliert wurden, ein gegebenes Metabolit herzustellen, hier Arabit.
Unter "modifizierten osmotoleranten Hefen" versteht man osmotolerante Hefen, deren natürliche Fähigkeiten, ein gegebenes Metabolit herzustellen, hier Arabit, durch Einsetzen von Mutagenesetechniken (zufällig oder gerichtet) oder molekularbiologischen Techniken optimiert wurde.
Unter "Zucker" versteht man in der vorliegenden Erfindung alle Kohlenstoffquellen, die durch die Arabit herstellenden Mikroorganismen direkt assimilierbar sind.
Ein derartiger Zucker wird zum Beispiel aus der Gruppe ausgewählt, die aus Glukose, Galaktose, Saccharose, Arabinose, Glycerin, Fruktose, Maltose, Xylulose, Ribulose, Mannit, Myoinosit, Ethanol, Stärke und Maltose, allein oder Mischungen davon gebildet wird.
Die erste Fermentationszone wird auf die Weise eingesetzt, um eine erhöhte Herstellung von Arabit sicherzustellen, wobei der Verbrauch eines Teils des in das Fermentationsmedium eingeführten Zuckers gefördert wird.
Man versteht unter "einem Teil des Zuckers" im Sinne der Erfindung eine Menge des Zuckers von wenigstens 50 Gew.-%, vorzugsweise von wenigstens 80 Gew.-% und auf noch stärker bevorzugte Weise wenigstens 90 Gew.-%.
In einer ersten bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Herstellung von Arabit in der ersten Fermentationszone im nichtfortlaufenden Modus initiiert, wobei alle Fermentationssubstrate, mit einbegriffen der Zucker, und die Mikroorganismen gleichzeitig eingeführt werden.
In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Herstellung von Arabit in der ersten Fermentationszone im nichtfortlaufenden Beschickungsmodus initiiert, wobei die Beschickung der Arabit herstellenden Mikroorganismen mit Zucker auf fortschreitende Weise durchgeführt wird.
Ein nichtfortlaufender Beschickungsmodus wird vorteilhafterweise zur Beschickung gewählt, um die Fermentation im erfindungsgemäßen Verfahren zu starten.
Dieser nichtfortlaufende Beschickungsmodus erlaubt es, die fortschreitende Füllung der ersten Fermentationszone mit Substraten sicherzustellen, auf die Weise, um einen erhöhten Wachstumsgrad der Mikroorganismen, eine gute Umwandlung von Zucker in Arabit und eine Konzentration von Zucker im Fermentationsmedium auf einen Wert aufrechtzuerhalten, der von dem betrachteten Arabit herstellenden Mikroorganismus toleriert wird.
Unter "Konzentration von Zucker, der durch den Mikroorganismus toleriert wird" versteht man eine minimale Zuckerkonzentration, die weder das Wachstum des Mikroorganismus', noch dessen Herstellung von Arabit hemmt.
Auf allgemeine Weise werden die für alle Arabit herstellenden Mikroorganismen eingesetzten Bedingungen auf eine Weise geregelt, um den vollständigen Verbrauch des Zuckers zu vermeiden.
Die erhöhte Herstellung von Arabit in der ersten Fermentationszone führt im allgemeinen zur Aufrechterhaltung von Mengen an zurückbleibendem nichtverbrauchtem Zucker, die ebenfalls relativ erhöht sind, deren Bedeutung das Funktionieren der betrachteten Mikroorganismen ist. Auf allgemeine Weise beträgt der Grad an zurückbleibendem Zucker wenigstens gleich 2,5 Gew.-%.
Der zweite Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht nun aus dem Übertragen eines auf diese Weise erhaltenen Teils des Fermentationsmediums in eine zweite Fermentationszone umfassend wenigstens einen Fermenter, ganz unter Konstanthalten des Volumens in der ersten Fermentationszone durch Hinzufügen von Zucker.
Man führt also die Übertragung eines Teils des Fermentationsmediums der ersten Fermentationszone in die zweite aus, wenn das Fermentationsmedium mit Arabit angereichert ist, aber dennoch überdies zurückbleibenden nichtverbrauchten Zucker in einer derartigen Menge enthält, die die Reinigung des hergestellten Arabits schwerfällig und komplex macht.
Diese Übertragung wird von einer fortlaufenden Beschickung mit Zucker in der ersten Fermentationszone begleitet, dieses nicht um allein das Volumen konstant zu halten, sondern um besonders die Herstellung von Arabit mit einer Produktivität und einem Ertrag der Umwandlung von wenigstens gleich den Werten fortzusetzen, die während der oben beschriebenen Initiationsphase der Herstellung von Arabit erhalten wurden.
Man wählt vorteilhafterweise, die erste Fermentationszone fortlaufend mit den Substraten zu beschicken, vielmehr als sie einzig mit Zucker zu beschicken, wie nachstehend veranschaulicht wird.
Der dritte Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht aus dem Fortsetzen der Produktion von Arabit in der zweiten Fermentationszone auf die Weise, dass der zurückgebliebene Zucker aus dem Teil des Fermentationsmediums verbraucht wird, der aus der ersten Fermentationszone kommt.
Die zweite Fermentationszone wird folglich zugleich eingesetzt, um die Produktion von Arabit fortzusetzen, aber besonders um den Verbrauch von Zucker zu beenden, der den Teil des Fermentationsmediums kontaminiert, der aus der ersten Fermentationszone in die zweite übertragen wurde, auf die Weise, dass nur ein geringer Grad an zurückbleibendem Zucker belassen wird.
Unter einem geringen Gehalt an zurückbleibendem Zucker versteht man vorteilhafterweise eine Zuckerkonzentration im Fermentationsmedium von höchstens gleich 2 Gew.-% und vorzugsweise höchstens gleich 1 Gew.-% In einem bevorzugten Modus des erfindungsgemäßen Verfahrens führt man nun diesen Schritt durch Einsatz von Fermentern unterschiedlicher Größe durch, wobei der Fermenter der zweiten Fermentationszone ein Volumen unterhalb desjenigen der ersten Fermentationszone aufweist.
In einem noch stärker bevorzugten Modus des erfindungsgemäßen Verfahrens wählt man die Verwendung von nur einem Fermenter pro Fermentationszone.
Der vierte Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht aus dem kontinuierlichen Trennen des auf diese Weise erhaltenen Fermentationsmediums mit geringem Gehalt an zurückbleibendem Zucker in eine Fraktion, in der Mikroorganismen konzentriert sind, und in eine andere lösliche Fraktion, die mit Arabit angereichert ist.
Man verwirklicht die kontinuierliche Trennung zwischen den Mikroorganismen und der Fraktion, die mit Arabit angereichert ist, durch beliebige Mittel, die dem Fachmann außerdem bekannt sind, zum Beispiel durch Mikrofiltration, wobei Membranen verwendet werden, deren Porendurchmesser an die Größe der betrachteten Mikroorganismen angepaßt ist, oder durch Zentrifugation in einem Intervall von 1.000 bis 10.000 G, und auf bevorzugte Weise durch Mikrofiltration, wie nachstehend veranschaulicht wird.
Die geklärte mit Arabit angereicherte Lösung, die am Ende dieses Trennungsschrittes erhalten wird, bildet das hergestellte Arabit.
Es wurde ebenfalls durch die anmeldende Gesellschaft bewiesen, dass es vorteilhaft sein kann, dass man die mit Mikroorganismen angereicherte Fraktion an den Eingang der ersten Fermentationszone rückführt.
Der Vorteil dieses Rückführungsschrittes von Mikroorganismen ist es, eine Biomasse wieder einzuführen, deren Fermentationsfähigkeiten ungeschmälert sind, und durch dieselbe eine Verzögerung der Umsetzung zu vermeiden, den die Herstellung einer neuen Kultur von Arabit herstellenden Mikroorganismen verursachen würde.
Die Gewinnung des hergestellten Arabits wird zum Beispiel durch Konzentrieren auf einen Wert in der Größenordnung von 20 % und mehr ausgeführt, und kann von einem Kristallisationsschritt durch ein beliebiges Verfahren gefolgt werden, das dem Fachmann an sich bekannt ist.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung erscheinen bei der Lektüre der unten beschriebenen nichtbeschränkenden Beispiele.
Beispiel 1
Die beiden eingesetzten Fermentationszonen umfassen jede einen Fermenter, aber mit verschiedener Größe. Der erste Fermenter der Marke CHEMAP^® weist ein Volumen von 20 l (17 l nutzbar) auf, und der zweite derselben Marke ein Volumen von 5 l (4 l nutzbar).
Eine Vorkultur von Mikroorganismen Yamadazyma ohmeri, Stamm ATCC 20209 wird in einem anderen Fermenter mit 20 l zunächst ausgeführt.
Das Vorkulturmedium besteht aus 50 g/l Glukose, 8 g/l in Wasser eingeweichtem Mais ("liqueur de corn steep"), 2 g/l KH₂PO₄ und 1 g/l MgSO₄. Die Vorkultur wird bei 30°C unter Rühren bei 600 rpm, einer Belüftung von 1 vvm für 12 Stunden und der Regulierung des pH auf 4,5 mit 20%igem NH₄OH ausgeführt.
Der Fermenter der ersten Fermentationszone wird mit 1 l dieser Vorkultur angeimpft. Man füllt auf 6 l mit einem Medium auf, welches 50 g/l Glukose, 8 g/l in Wasser eingeweichten Mais, 2,5 g/l KH₂PO₄, 1 g/l MgSO₄ und 0,05 g/l FeSO₄ enthält.
Die Temperatur wird auf 30 °C festgesetzt. Der pH wird auf 4,5 bis 35 h mit Hilfe von 20 %igem NH₄OH reguliert, dann wird die Regulation auf 3 mit Hilfe von 5 N KOH festgesetzt.
Das Hinzufügen von Glukose wird sichergestellt, wie in der folgenden Tabelle I angezeigt wird. Die Biomasse wird durch die Messung der Absorption (optische Dichte oder OD) des Mediums bei 620 nm berechnet.
Für Yamadazyma ohmeri ist eine Absorptionseinheit bei 600 nm einer Biomasse in der Größenordnung von 0,2 g/l äquivalent.
Tabelle I
Nach 40 h Fermentation ist das nutzbare Volumen des Fermenters der ersten Fermentationszone erreicht; und die Konzentration der zurückbleibenden Glukose beträgt 29 g/l.
4 l des Fermentationsmediums dieses ersten Fermenters werden nun in den Fermenter der zweiten Fermentationszone übertragen, und 800 g Glukose werden nun in einem Volumen von 2 l zum ersten Fermenter hinzugefügt. Die Temperatur der zweiten Fermentationszone wird auf 38 °C festgesetzt, und der pH wird auf 3,5 mit Hilfe von 5 N KOH reguliert.
Die Fermenter entwickeln sich sodann bis 46 h getrennt, die Stunden von derjenigen an gerechnet, wo man die erste Entnahme von Arabit aus dem zweiten Fermenter ausführt.
Von 46 h ab wird der Fermenter der ersten Fermentationszone mit 250 g/l Glukose mit einem Durchfluss in der Größenordnung von 0,4 l/h und 50 g/l in Wasser eingeweichtem Mais mit einem Durchfluss in der Größenordnung von 10 ml/h beschickt.
Das Medium zirkuliert von der ersten Fermentationszone in die zweite mit Hilfe einer Pumpe PCM^®, dann von der zweiten Fermentationszone in ein Tangentialfiltermodul MEMBRALOX^®, das die Gewinnung eines Filtrates erlaubt, das reich an Arabit ist und eines Filterkuchens, der reich an Mikroorganismen ist.
Der Filterkuchen wird nun an den Eingang der ersten Fermentationszone rückgeführt.
Um die Spiegel in den beiden Fermentern aufrechtzuerhalten, ist der Durchfluss des auslaufenden Filtrates gleich dem Durchfluss der Beschickung mit Glukose.
Dieser Durchfluss entwickelt sich im Laufe der Zeit als Funktion der Verbrauchsgeschwindigkeit der Glukose durch die Mikroorganismen in den Fermentern. Nach 200 h wird die Fermentation gestoppt, und der Fermenter der zweiten Fermentationszone wird geleert.
Man lässt die Fermentation im Fermenter der ersten Fermentationszone während 10 zusätzlicher Stunden beenden, bevor das Medium auf einem Tangentialfiltermodul behandelt wird.
Die folgende Tabelle II stellt die ausgeführten Messungen nach Übertragen des Fermentationsmediums aus der ersten Fermentationszone in die zweite dar.
Tabelle II
Insgesamt werden 8,8 kg Arabit aus 18,7 kg eingesetzter Glukose gewonnen, dies ist ein Ertrag von 47 % und eine Produktivität von 2,2 g/l/h.
Bei der nichtfortlaufenden Fermentation, die unter denselben Bedingungen des Produktionsmediums mit demselben Beitrag an Glukose ausgeführt wird, beträgt der Ertrag 40 %, und die Produktivität beträgt nur 1,5 g/l/h.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt also, einen sehr viel besseren Ertrag und eine sehr viel bessere Produktivität sicherzustellen.
Außerdem erlaubt der niedrige Grad an zurückbleibender Glukose, ein Arabit zu gewinnen, das eine ganz und gar zufriedenstellende Reinheit aufweist.
Beispiel 2
Man führt eine Präparation von Arabit unter Fermentationsbedingungen aus, die identisch zu denjenigen aus Beispiel 1 sind, aber man verwendet einen Mikroorganismus Yamadazyma ohmeri Stamm ATCC 20209, der durch die klassische Zufallsmutagenesetechnik mit Ultraviolett modifiziert wurde (wobei wenigstens ein Mutagenesezyklus mit Ultraviolett mit Anreicherung durch Nystatin eingesetzt wird), wobei der Stamm durch seine Fähigkeit zur Herstellung von Arabit mit einem Ertrag von 8 bis 10 Punkten oberhalb der des Mutterstammes selektioniert wird.
Nachdem eine Vorkultur aus dem modifizierten Stamm erhalten wurde und in die erste Fermentationszone, wie in Beispiel 1 angezeigt, übertragen wurde, wurde das Hinzufügen von Glukose sichergestellt, wie in der folgenden Tabelle III gezeigt wird.
Tabelle III
Nach 40 h Fermentation ist das nutzbare Volumen des Fermenters der ersten Fermentationszone erreicht, und die Konzentration der zurückbleibenden Glukose beträgt 28 g/l.
4 l des Fermentationsmediums dieses ersten Fermenters werden nun in den Fermenter der zweiten Fermentationszone übertragen, und 800 g Glukose werden nun in einem Volumen von 2 l zum ersten Fermenter hinzugefügt.
Die Temperatur der zweiten Fermentationszone wird auf 38 °C festgesetzt, und der pH wird auf 3,5 mit Hilfe von 5 N KOH reguliert.
Die Fermenter entwickeln sich sodann bis 46 h getrennt, die Stunden von derjenigen an gerechnet, wo man die erste Entnahme von Arabit aus dem zweiten Fermenter ausführt.
Von 46 h ab wird der Fermenter der ersten Fermentationszone mit 250 g/l Glukose mit einem Durchfluss in der Größenordnung von 0,4 l/h und 50 g/l in Wasser eingeweichtem Mais mit einem Durchfluss in der Größenordnung von 10 ml/h beschickt.
Die folgende Tabelle IV stellt die ausgeführten Messungen nach Übertragen des Fermentationsmediums aus der ersten Fermentationszone in die zweite dar.
Tabelle IV
Insgesamt werden 12 kg Arabit aus 19 kg eingesetzter Glukose gewonnen, dies ist ein Ertrag von 63 % und eine Produktivität von 4 g/l/h.
Bei der nichtfortlaufenden Fermentation, die unter denselben Bedingungen des Produktionsmediums mit demselben Beitrag an Glukose ausgeführt wird, beträgt der Ertrag 55 %, und die Produktivität beträgt nur 2,5 g/l/h.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt also, einen sehr viel besseren Ertrag und eine sehr viel bessere Produktivität sicherzustellen.
Außerdem erlaubt der niedrige Grad an zurückbleibender Glukose, immer ein Arabit zu gewinnen, das eine ganz und gar zufriedenstellende Reinheit aufweist.
Beispiel 3
Die beiden Fermentationszonen werden wie in Beispiel 1 eingesetzt.
Eine Vorkultur des Mikroorganismus Candida polymorpha, natürlicher Stamm ATCC 20213, wird zunächst in einem Fermenter CHEMAP^® von 20 l unter denselben Bedingungen wie für den Stamm Y. ohmeri aus Beispiel 1 ausgeführt.
Der Fermenter der ersten Fermentationszone wird mit 1 l dieser Vorkultur angeimpft.
Man füllt auf 6 l mit einem Medium auf, welches 50 g/l Glukose, 3 g/l Hefeextrakt, 2 g/l KH₂PO₄, und 1 g/l MgSO₄ enthält.
Die Temperatur wird auf 30 °C festgesetzt. Der pH wird auf 4,5 bis 30 h mit Hilfe von 20 %igem NH₄OH reguliert, dann mit Hilfe von 5 N KOH.
Das Hinzufügen von Glukose wird kontrolliert, wie in der folgenden Tabelle III angezeigt wird.
Die Biomasse wird durch die Messung der Absorption (optische Dichte) des Mediums bei 620 nm berechnet.
Für Candida polymorpha ist eine Absorptionseinheit bei 600 nm einer Biomasse in der Größenordnung von 0,22 g/l äquivalent.
Tabelle V
Nach 40 h Fermentation ist das nutzbare Volumen des Fermenters der ersten Fermentationszone erreicht, und die Konzentration der zurückbleibenden Glukose beträgt 30 g/l.
4 l des Fermentationsmediums dieses ersten Fermenters werden nun in den Fermenter der zweiten Fermentationszone übertragen, und 800 g Glukose werden nun in einem Volumen von 2 l zum ersten Fermenter hinzugefügt.
Die Temperatur der zweiten Fermentationszone wird auf 37 °C festgesetzt, und der pH wird auf 4,5 durch 5 N KOH reguliert.
Die Fermenter entwickeln sich sodann bis 46 h getrennt, die Stunden von derjenigen an gerechnet, wo man die erste Entnahme von Arabit aus dem zweiten Fermenter ausführt.
Von 46 h ab wird der Fermenter der ersten Fermentationszone mit 250 g/l Glukose mit einem Durchfluss in der Größenordnung von 0,4 l/h und 50 g/l in Wasser eingeweichtem Mais mit einem Durchfluss in der Größenordnung von 10 ml/h beschickt.
Die folgende Tabelle IV stellt die ausgeführten Messungen nach Übertragen des Fermentationsmediums aus der ersten Fermentationszone in die zweite dar.
Tabelle VI
Insgesamt werden 4,1 kg Arabit aus 17,4 kg eingesetzter Glukose gewonnen, dies ist ein Ertrag von 23,6 % und eine Produktivität von 1 g/l/h.
Bei der nichtfortlaufenden Fermentation, die unter denselben Bedingungen des Produktionsmediums mit demselben Beitrag an Glukose ausgeführt wird, beträgt der Ertrag 16,5 %, und die Produktivität beträgt nur 0,6 g/l/h.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt für einen betrachteten Stamm also, einen sehr viel besseren Ertrag und eine sehr viel bessere Produktivität sicherzustellen, als die klassischerweise eingesetzten Verfahren.
Außerdem erlaubt der niedrige Grad an zurückbleibender Glukose, ein Arabit zu gewinnen, das hier überdies eine ganz und gar zufriedenstellende Reinheit aufweist.

Claims

Verfahren zur Herstellung von Arabit durch fortlaufendes Fermentieren von wenigstens einem Zucker durch Arabit herstellende Mikroorganismen, gekennzeichnet durch die Schritte, dass man: a) die Produktion von Arabit in einer ersten Fermentationszone umfassend wenigstens einen Fermenter auf die Weise führt, dass ein Teil des Zuckers, der in das Fermentationsmedium eingebracht wird, durch die Mikroorganismen verbraucht wird, b) einen auf diese Weise erhaltenen Teil des Fermentationsmediums in eine zweite Fermentationszone umfassend wenigstens einen Fermenter überträgt, ganz unter Konstanthalten des Volumens in der ersten Fermentationszone durch Hinzufügen von Zucker, c) die Produktion von Arabit in der zweiten Fermentationszone auf die Weise fortsetzt, dass der Zucker verbraucht wird, der im Fermentationsmedium zurückgeblieben ist, d) das auf diese Weise erhaltene Fermentationsmedium der zweiten Fermentationszone kontinuierlich in eine Fraktion trennt, in der Mikroorganismen konzentriert sind, und in eine andere lösliche Fraktion, die mit Arabit angereichert ist. e) das auf diese Weise erhaltene Arabit sammelt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch den Schritt, dass man die Fraktion, in der Mikroorganismen konzentriert sind, an den Eingang der ersten Fermentationszone rückführt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 und 2, gekennzeichnet durch den Schritt, dass der Teil des Zuckers, der durch die Arabit herstellenden Mikroorganismen in der ersten Fermentationszone verbraucht wird, wenigstens 50 Gew.-%, vorzugsweise wenigstens 80 Gew.-%, stärker bevorzugt außerdem wenigstens 90 Gew.-% des Zuckers beträgt, der in das Fermentationsmedium eingebracht wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 und 3, gekennzeichnet durch den Schritt, dass der in der zweiten Fermentationszone zurückbleibende Zuckergehalt höchstens 2 Gew.-%, vorzugsweise höchstens 1 Gew.-% beträgt.
Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet durch den Schritt, dass die Fermenter der zweiten Fermentationszone ein kleineres Volumen als das der Fermenter der ersten Zone aufweisen.
Verfahren gemäß Anspruch 5, gekennzeichnet durch den Schritt, dass die erste und die zweite Fermentationszone jeweils einen einzigen Fermenter umfassen.
Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6, gekennzeichnet durch den Schritt, dass die Arabit herstellenden Mikroorganismen aus der Gruppe bestehend aus natürlichen oder modifizierten osmotoleranten Hefen der Gattung Yamadazyma, Debaromyces, Hansenula, Candida, Zygosaccharomyces und Saccharomyces ausgewählt werden.
Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 7, gekennzeichnet durch den Schritt, dass der Zucker aus von Arabit herstellenden Mikroorganismen direkt assimilierbaren Kohlenstoffquellen ausgewählt wird und vorzugsweise Glukose ist.