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Verfahren zur Gewinnung von Hefe
Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Gewinnung von Hefe und insbesondere die Verwendung einer neuen Hybridhefe in diesem Verfahren.
Die Anforderungen an Backhefe, die im Zusammenhang mit der kommerziellen Verwertung eine beträchtliche Bedeutung haben, umfassen die erzielbare Ausbeute an Hefe, bezogen auf die Menge an assimilierbarer Kohlenstoffquelle, z. B.
Melasse, die während der Vermehrung der Hefe dem Medium zugeführt wird ; die Anfangsaktivität der Hefe, wie sie z. B. an Hand des aus einem geeigneten Substrat unter geregelten Bedingungen von frischer Hefe gebildeten Volumens an Kohlendioxyd bestimmt wird ; und deren Haltbarkeitseigenschaft, die z. B. durch das Volumen Kohlendioxyd gemessen wird, das von der Hefe unter ebenfalls geregelten Bedingungen nach einer Lagerung der Hefe von 7 Tagen bei einer bestimmten Temperatur, z. B. bei 21 C, gebildet wird.
Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zu schaffen, bei dem eine Hefe mit verbesserten Eigenschaften erhalten wird, u. zw. wenigstens im Hinblick auf einige der vorstehend angegebenen Eigenschaften.
Beim Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung wird die nachstehend mit Saccharomyces cerevisiae ATCC Nr. 13601 bezeichnete Hefe verwendet und in einem flüssigen Nährmedium unter Belüftung vermehrt. Eine Kultur dieser Hefe ist in der American Type Culture Collection unter der Nr. 13601 hinterlegt worden.
Saccharomyces cerevisiae ATCC Nr. 13601 ist eine Hybridhefe, die durch die nachstehend angegebenen Charakteristika identifiziert werden kann.
EMI1.1
wässerigen Malzextraktlösung sind die Zellen des Saccharomyces cerevisiae nahezu kugelförmig und haben im reifen Zustand eine mittlere Abmessung von 10 p x 9 p.
Nach 72stündigem Wachstum unter ähnlichen Bedingungen besitzen die Zellen sphärische Vakuolenkörner von ausserordentlicher Grösse
EMI1.2
der neuen Hefe werden nach 40stündigem Wachstum in dem oben beschriebenen Medium, Separation und Waschen mit destilliertem Wasser zur
EMI1.3
5 Gew. -% CH3COONa. 3H2O3-5 Tage bebrütet. Unter diesen Bedingungen bilden etwa 75-80% der Zellen des Saccharomyces cerevisiae ATCC Nr. 13601 Sporen und etwa 50% der Zellen bilden 4-sporige Asci.
Die Vergärbarkeit der verschiedenen Zuckerarten durch die neue Hefe wurde nach dem von
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benen Verfahren durchgeführt. Dabei wurden die folgenden Ergebnisse erhalten :
EMI1.5
<tb>
<tb> Zucker <SEP> Ergebnis <SEP> Zucker <SEP> Ergebnis
<tb> Glucose <SEP> + <SEP> Melibiose <SEP> 0
<tb> Fructose <SEP> + <SEP> Trehalose <SEP> + <SEP>
<tb> (verzögert)
<tb> Mannose <SEP> + <SEP> Raffinose <SEP> + <SEP> (-l) <SEP>
<tb> Galactose <SEP> 0 <SEP> Rhamnose <SEP> 0
<tb> Saccharose <SEP> + <SEP> Xylose <SEP> 0
<tb> Maltose <SEP> + <SEP> d-Arabinose <SEP> 0
<tb> Lactose <SEP> 0
<tb>
Die Eignung der neuen Hefe zur Vergärung von Trehalose ist für Saccharomyces cerevisiae wenn auch nicht spezifisch, so doch ungewöhnlich.
Zusätzlich zu den oben angegebenen Kennmerkmalen von Saccharomices cerevisiae ATCC Nr. 13601 wird die Identifizierung der Hefe auch durch gewisse ihrer Eigenschaften bei der Vermehrung unter den nachstehend angegebenen geregelten Bedingungen erleichtert.
Die Vermehrungen können in Edelstahlbehältern mit einer Arbeitskapazität von 201 und einem inneren Durchmesser von 25, 4 cm (10") durchgeführt werden. Die Belüftung erfolgt durch ein nach abwärts gerichtetes Einleitungsrohr, das mit horizontalen, in radialer Richtung
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verlaufenden Rohren, die insgesamt 348 Löcher mit einem Durchmesser von etwa 1, 19 mm aufweisen, verbunden ist. Die Behälter werden zur Regelung der Temperatur mit einem Wassermantel umgeben. Bei absatzweisem Arbeiten wurde dem Medium Melasse als wässerige Lösung zugesetzt, die Rohrmelasse und Rübenmelasse in einem Verhältnis von 1 : 9 enthielt, während beim kontinuierlichen Vermehrungsverfahren das Verhältnis 3 : 17 betrug.
1. Absatzweise Vermehrung.
Es wurde eine 12stündige Vermehrung im Zulaufverfahren angewendet, bei der in der letzten Stunde die Bedingungen so eingestellt wurden, dass im Medium eine Reifung erfolgte, d. h. die Zufuhr von Melasse wurde unterbrochen und das Ausmass der Belüftung vermindert. Startwürze" mit einem Volumen von 191, die 124 g Melasse, 13 g Diammoniumphosphat und 2, 6 g Magensiumsulfat enthielt, wurde in den Behälter gebracht, worauf die Temperatur auf 26, 7 C eingestellt wurde. Dann wurden 250 g des Saccharomyces cerevisiae ATCC Nr. 13601 zugesetzt und es wurde Luft durch das Medium geleitet, wobei eine Belüftungsgeschwindigkeit von etwa 2321/ min eingestellt wurde.
Während dieser Zeit wurden exponentiell 1126 g Melasse zusammen mit 1, 7 g Stickstoff (als wässeriges Ammoniak und Ammoniumsulfat) je 100 g Melasse zugesetzt, um einen stündlichen Wachstumszuwachs von 1, 17 einzustellen. Der pH-Wert des Mediums wurde ständig auf 4, 0 gehalten. Dann wurde die Temperatur wenigstens 1 Stunde lang auf 32 C erhöht und die Belüftungsgeschwindigkeit wurde auf 95, 1 l/h vermindert.
2. Kontinuierliches Verfahren unter Verwendung von 3 Vermehrungsbehältern und einer Reifungsstufe.
Dieses Verfahren wurde in zwei oder mehreren Vermehrungsbehältern und in einem Reifungsbehälter vorgenommen, wobei Hefe-enthaltendes Medium vom ersten Vermehrungsbehälter durch den bzw. die nachfolgenden Vermehrungsbehälter und den Reifungsbehälter geführt wird, bevor mit der Gewinnung der Hefe begonnen wird ; Nährstoffe und Wasser werden jedem Vermehrungsbehälter zugeführt und Hefe-enthaltendes Medium wird von jedem Behälter in einem solchen Ausmass abgezogen, dass das Volumen des Mediums und die Konzentration der Zellen in jedem Züchtungsbehälter konstant gehalten und ein Wachstumsmodul im Bereich von 0, 05 bis 0, 20 und vorzugsweise im Bereich von 0, 075 bis 0, 175 aufrechterhalten wird.
Die sich dabei einstellenden stetigen Bedingungen sind nachstehend angegeben :
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<tb>
<tb> a) <SEP> Luft <SEP> 224, <SEP> 9 <SEP> m3/min <SEP> (9 <SEP> Kubikfuss/min) <SEP> (zu <SEP> Behälter <SEP> 1,
<tb> 2 <SEP> und <SEP> 3)
<tb> b) <SEP> Melassezufuhr <SEP> 200 <SEP> g/h <SEP> (nur <SEP> zu <SEP> Behälter <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> und <SEP> 3)
<tb> c) <SEP> Stickstoff <SEP> (wässeriges <SEP> Ammoniak <SEP> und <SEP> Ammoniumsulfat) <SEP> 1, <SEP> 8-Stickstoff/100 <SEP> g <SEP> Melasse <SEP> (nur <SEP> zu <SEP> Behälter <SEP> 1,
<tb> 2 <SEP> und <SEP> 3)
<tb> d) <SEP> Diammoniumphosphat <SEP> 1, <SEP> 1 <SEP> g/100 <SEP> g <SEP> Melasse <SEP> (nur <SEP> zu <SEP> Behälter <SEP> 1)
<tb> e) <SEP> Temperatur <SEP> 29, <SEP> 4 <SEP> C <SEP> (Behälter <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> und <SEP> 3)
<tb> f) <SEP> Wachstumsmodul <SEP> 0, <SEP> 125 <SEP> (Behälter <SEP> 1,
<SEP> 2 <SEP> und <SEP> 3)
<tb> g) <SEP> pH-Wert <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP> (Behälter <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> und <SEP> 3)
<tb> h) <SEP> Überführungsgeschwindigkeit <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> l/h. <SEP>
<tb>
Der Reifungsbehälter enthielt ein solches Volumen des Mediums, dass sich eine Verweilzeit von 1 Stunde ergab. Zu diesem Behälter wurden keine Nährstoffe hinzugefügt und die Belüftung wurde in einem Ausmass von 56, 6 l/min durchgeführt. Die Temperatur betrug in diesem Behälter 26, 7-29, 4 J C.
EMI2.2
EMI2.3
<tb>
<tb> a) <SEP> Luft <SEP> 224, <SEP> 91/min <SEP>
<tb> b) <SEP> Melassezufuhr....................................... <SEP> 200 <SEP> g/h
<tb> c) <SEP> Stickstoff <SEP> (wässeriges <SEP> Ammoniak <SEP> und <SEP> Ammoniumsulfat)...
<SEP> 1, <SEP> 8 <SEP> g <SEP> Stickstoff/lOOg <SEP> Melasse
<tb> d) <SEP> Diammoniumphosphat <SEP> 1, <SEP> 1 <SEP> g/100 <SEP> g <SEP> Melasse
<tb> e) <SEP> Temperatur <SEP> 29, <SEP> 40 <SEP> C <SEP>
<tb> f) <SEP> pH-Wert <SEP> 4, <SEP> 5 <SEP>
<tb> g) <SEP> Wachstumsmodul <SEP> 0, <SEP> 125 <SEP>
<tb>
Hefe-enthaltendes Medium wurde kontinuierlich mit einer ausreichenden Geschwindigkeit zugeführt, um die Konzentration an Hefe und das Volumen des Mediums in dem Behälter konstant zu halten. Es scheint keinen wesentlichen Unterschied bei den Ergebnissen im Hinblick auf die erzeugte Hefe zu ergeben, ob eine Reifungstufe vorgesehen ist oder nicht.
Unter der Bezeichnung "Wachstumsmodul" ist das Ausmass an Hefeproduktion je Einheit
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ursprünglich vorhandener Hefe zu verstehen. Die in der Beschreibung verwendeten Einheiten (g/h) beziehen sich auf Gramm Hefe.
Wenn das Wachstum unter den vorstehend angebenen Bedingungen durchgeführt wird, so zeigt Saccharomyces cerevisiae ATCC Nr. 13601 die folgenden Eigenschaften : Tabelle 1 :
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<tb>
<tb> Variation <SEP> bei <SEP> der <SEP>
<tb> Absatzweise <SEP> Kontinuierliches <SEP> Kontinuierliches <SEP> Züchtung <SEP> unter
<tb> Eigenschaft <SEP> Vermehrung <SEP> Verfahren <SEP> Verfahren <SEP> (ein <SEP> den <SEP> angegebenen <SEP>
<tb> (4 <SEP> Behalter) <SEP> einziger <SEP> Behalter) <SEP> Bedingungen
<tb> (angenahert)
<tb> 1. <SEP> Ausbeute <SEP> (Hefe <SEP> mit <SEP> 27% <SEP> Trok- <SEP>
<tb> kensubstanzgehalt) <SEP> als <SEP> Prozentanteil <SEP> der <SEP> verwendeten <SEP> Melasse.. <SEP> 96 <SEP> 100 <SEP> 94 <SEP> 2
<tb> 2.
<SEP> Anfangsaktivität <SEP> (Fermentometervolumen <SEP> in <SEP> ml <SEP> CO2/0, <SEP> 535 <SEP> g
<tb> frischer <SEP> Hefe)
<tb> 45 <SEP> min <SEP> 43 <SEP> 42 <SEP> 43 <SEP> 3
<tb> 45-90 <SEP> min <SEP> ...................... <SEP> 56 <SEP> 55 <SEP> 53 <SEP> ¯3
<tb> Insgesamt... <SEP> 99 <SEP> 97 <SEP> 96 <SEP> 5
<tb> 3. <SEP> Haltbarkeitseigenschaften <SEP> (Fermentometervolumen <SEP> in <SEP> ml <SEP> CO2/
<tb> 0, <SEP> 535 <SEP> g <SEP> Hefe <SEP> nach <SEP> 7 <SEP> Tagen <SEP> bei
<tb> 21 <SEP> C) <SEP>
<tb> 45 <SEP> min <SEP> 31 <SEP> 30 <SEP> 29 <SEP> 4
<tb> 45-90min.................. <SEP> 49 <SEP> 44 <SEP> 44 <SEP> A4
<tb> Insgesamt... <SEP> 80 <SEP> 74 <SEP> 73 <SEP> 5 <SEP>
<tb> Trockensubstanzgehalt <SEP> 27 <SEP> 28 <SEP> 27 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Gesamtstickstoff <SEP> (% <SEP> Trockensubstanzgehalt) <SEP> ..................
<SEP> 7,8 <SEP> 7,8 <SEP> 8,0 <SEP> ¯0,3
<tb> Gesamtphosphat <SEP> (als <SEP> P2O5, <SEP> % <SEP> Trokkensubstanz) <SEP> ............... <SEP> 2,3 <SEP> 2, <SEP> 1 <SEP> 2, <SEP> 4 <SEP> ¯0,2
<tb>
Der Fermentometertest, auf den in Tabelle 1 Bezug genommen ist, wird gemäss dem im Journal of the Institute of Brewing [65, S. 39 (1959)] von S. Burrows und J. S. Harrison näher beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Die neue Hefe ergibt bei der Prüfung auf einem Zymotachigraph, wie er in Modern Cereal Chemistry"von Kent-Jones und Amos, 5. Aufl. Northern Publishing Co. Ltd., Liverpool auf den Seiten 358-361 beschrieben ist, ein im wesentlichen lineares Ansteigen der Gasbildungsgeschwindigkeit in einem Zeitraum zwischen 1 und 3 Stunden vom Beginn der Versuche an.
Beim Versuch wurde gewöhnliches Bäckermehl verwendet und zum Anmachwasser wurden 0, 3 Gew.-% Ammonsulfat zugesetzt, um zu gewährleisten, dass genügend assimilierbarer Stickstoff vorhanden ist. Wie nachstehend angegeben, hat die neue Hefe auch gewisse spezielle Ernährungscharakteristika, die ebenfalls zur Unterstützung bei der Identifizierung der Hefe herangezogen werden können.
Spezielle Ernährungscharakteristika von Saccharomyces cerevisiae ATCC Nr. 13601 :
1 ml einer Suspension von Saccharomyces cerevisiae ATCC Nr. 13601 der 0, 1 mg feuchte Hefe enthielt, wurde aseptisch zu 9 ml des folgenden in einem zugestopften konischen 50 mlKolben enthaltenden sterilen Mediums gegeben :
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<tb>
<tb> Medium <SEP> 1 <SEP> (Grundmedium) <SEP> :
<SEP>
<tb> Vitaminfreie <SEP> Glukose..... <SEP> 20 <SEP> g
<tb> (NH,), <SEP> SO <SEP> .............. <SEP> 1, <SEP> 7 <SEP> g
<tb> KH, <SEP> PO <SEP> ................ <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Konzentrierte <SEP> Milchsäure. <SEP> 1, <SEP> 7 <SEP> ml
<tb> MgS04. <SEP> 7 <SEP> H20.......... <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> CaClz. <SEP> 6 <SEP> H20............ <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Fell3 <SEP> l <SEP> mg
<tb> ZnS04. <SEP> 7 <SEP> H20........... <SEP> 1 <SEP> mg
<tb> MnCl,. <SEP> 4H2O............ <SEP> 1 <SEP> mg
<tb> Aneurin <SEP> 2 <SEP> mg
<tb> Pyridoxin <SEP> 2 <SEP> mg
<tb> i-Inosit................. <SEP> 20 <SEP> mg
<tb> Nicotinsäureamid......... <SEP> 5 <SEP> mg
<tb> Kalzium-d-pantothenat.... <SEP> 4 <SEP> mg
<tb> d-Biotin................. <SEP> 5 <SEP> Mikrogramm
<tb> 2n-Ammoniumhydroxyd.. <SEP> bis <SEP> pH <SEP> 5
<tb> Destilliertes <SEP> Wasser......
<SEP> bis <SEP> 900 <SEP> ml
<tb>
Medium 2 : Dieses besteht aus dem vorstehend angegebenen Grundmedium, jedoch ohne Zugabe von i-Inosit.
Medium 3 : Dieses besteht aus dem Grundmedium gemäss Medium 1, jedoch ohne Aneurin und Pyridoxin.
Medium 4 : Es enthält das gleiche Grundmedium wie Medium 1, jedoch mit einem Zusatz von Uracil in einer Menge von 20 mg/l.
Medium 5 : Das Grundmedium wie bei Medium 1, zu dem eine wässerige, etwa 5 g entwässertes Kaseinhydrolysat (vitaminfrei) enthaltende Lösung zugegeben worden ist, die auf PH 5 eingestellt wird und, falls notwendig, mit Aktivkohle entfärbt wird. Diese Kaseinhydrolysatlösung wird zugesetzt, bevor das Volumen des Mediums auf 900 ml gebracht wird.
Medium 6 : Es handelt sich dabei um das Medium 5, jedoch ohne Aneurin- und Pyridoxinzusatz.
Die Kolben werden doppelt angesetzt und nach aseptischer Zugabe der Hefe werden sie bei 30 C unter Schütteln (120-140 Ausschläge je Minute) 17, 5 Stunden bebrütet. Am Ende dieses Zeitabschnittes wird 1 Tropfen einer 10% igen wässerigen Natriumazidlösung zugesetzt, worauf das Volumen der Hefesuspension im Kolben mit Leitungswasser auf 50 ml aufgefüllt wird.
Die Menge der in jeder Suspension enthaltenen Hefe wird in einem Spekker-Absorptiometer unter Vergleich mit der Standardkurve ermittelt und im Falle der Medien 2,3 und 4 als Prozentsatz des im Medium 1 (Grundmedium) erfolgenden Wachstums ausgedrückt, während das im Medium 6 erfolgende Wachstum als Prozentsatz des im Medium 5 erfolgenden Wachstums zum Ausdruck gebracht wird.
Bei einer Reihe von drei Experimenten wurden die in der folgenden Tabelle angegebenen Werte erhalten : Tabelle 2 :
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<tb>
<tb> Wachstum <SEP> in <SEP> % <SEP> des <SEP> Wachstum <SEP> in <SEP> % <SEP> des
<tb> Medium <SEP> Wachstums <SEP> im <SEP> Wachstums <SEP> im <SEP>
<tb> Medium <SEP> 1 <SEP> Medium <SEP> 5
<tb> 2 <SEP> 19-27-
<tb> 3 <SEP> 3-8-
<tb> 4 <SEP> 89-102-
<tb> 6 <SEP> 14-22
<tb>
Es wurde gefunden, dass der neue Stamm Saccharomyces cerevisiae ATCC Nr. 13601 gegenüber Temperaturänderungen und Änderungen des pH-Wertes des Mediums weniger empfindlich ist als bisher verfügbare Hefen mit ähnlicher Anfangsaktivität und Haltbarkeitseigenschaften. Auf Grund dieser Eigenschaften ist der neue Stamm der Hefe insbesondere zur Verwendung in einem kontinuierlichen Verfahren, z.
B. in einem mit einem einzigen Behälter oder mit mehreren Behältern arbeitenden Prozess geeignet, da der oder die Vermehrungsbehälter bei niedrigem pH-Wert und niedriger Temperatur gehalten werden können und so die Gefahr einer Infektion durch Hemmung des Wachstums der Bakterien vermindert wird.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Gewinnung von Hefe, dadurch gekennzeichnet, dass man Hybridhefe des Stammes Saccharomyces cerevisiae ATCC Nr. 13601 in einem wässerigen, vergärbaren Zucker enthaltenden Kulturmedium unter Belüftung vermehrt und aus dem Kulturmedium abtrennt.