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Verfahren zur Gewinnung von Hefe
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destilliertem Wasser zur Beimpfung eines 0, 5 Gew.-% CHgCOONa. 3 H O und 1 5 Gew.-% Agar (bei einem pH-Wert von 6, 8+0, 2) enthaltenden Mediums verwendet und das beimpfte Medium wird dann bei 25 C 3-5 Tage bebrütet. Unter diesen Bedingungen bilden etwa
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Zellen bilden 4-sporige Asci.
Die Vergärbarkeit der verschiedenen Zuckerarten durch die neue Hefe wurde nach dem von E. O. Morris und B. Kirsop im Journ. of the Institute of Brewing, 1953,59, S. 486 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Dabei wurden die folgenden Ergebnisse erhalten :
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<tb>
<tb> Zucker <SEP> Ergebnis <SEP> Zucker <SEP> Ergebnis
<tb> Glucose <SEP> + <SEP> Melibiose <SEP> 0
<tb> Fructose <SEP> + <SEP> Trehalose <SEP> + <SEP>
<tb> (verzögert)
<tb> Mannose <SEP> + <SEP> Raffinose <SEP> + <SEP> (1/3)
<tb> Galactose <SEP> 0 <SEP> Rhamnose <SEP> 0
<tb> Saccharose <SEP> + <SEP> Xylose <SEP> 0
<tb> Maltose <SEP> + <SEP> d-Arabinose <SEP> 0
<tb> Lactose <SEP> 0
<tb>
Die Eignung der neuen Hefe zur Vergärung von Trehalose ist für Saccharomyces cerevisiae wenn auch nicht spezifisch, so doch ungewöhnlich.
Zusätzlich zu den oben angegebenen Kennmerkmalen von Saccharomyces cerevisiae ATCC Nr. 13602 wird die Identifizierung der Hefe auch durch gewisse ihrer Eigenschaften bei der Vermehrung unter den nachstehend angegebenen geregelten Bedingungen erleichtert.
Die Vermehrungen können in Edelstahlbehältern mit einer Arbeitskapazität von 20 1 und einem inneren Durchmesser von 25, 4 cm (10") durchgeführt werden. Die Belüftung erfolgt durch ein nach abwärts gerichtetes Einleitungsrohr, das mit horizontalen, in radialer Richtung verlaufenden Rohren, die insgesamt 248 Löcher mir einem Durchmesser von etwa 1, 19 mm aufweisen, verbunden ist. Die Behälter werden zur Regelung der Temperatur mit einem Wassermantel umgeben. Die dem Medium zugeführte Melasse wurde als wässerige Lösung
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zugesetzt, die Rohrmelasse und Rübenmelasse im Verhältnis von 1 : 9 enthielt.
Vermehrungsbedingungen :
1. Standardbedingungen : Es wurde eine 12stündige Vermehrung im Zulaufverfahren angewendet, bei der in der letzten Stunde die Bedingungen so eingestellt wurden, dass im Medium eine Reifung erfolgte, d. h., die Zufuhr von Melasse wurde unterbrochen und das Ausmass der Be-
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Diammoniumphosphat und 2, 6 g Magnesiumsulfat enthielt, wurde in den Behälter gebracht, worauf die Temperatur auf 300 C eingestellt wurde. Dann wurden 250 g Stellhefe zugesetzt und Luft mit einer Belüftungsgeschwindigkeit von etwa 232 l/min durch das Medium geleitet.
Während dieser Zeit wurden exponentiell 1126 g Melasse zusammen mit 1, 7 g Stickstoff (als wässeriges Ammoniak und Ammoniumsulfat) je 100 g Melasse zugesetzt. Der pH-Wert des Mediums wurde bis zur 5. Stunde der Vermehrung auf etwa 4, 0 gehalten, worauf er während der nächsten Stunde auf etwa 5, 1 eingestellt wurde.
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während der nächsten Stunde auf 5, 5 eingestellt und auf diesem Wert bis zum Ende der Vermehrung belassen. Die Temperatur stieg während der letzten Stunde des Verfahrens auf etwa 33 C an.
2. Verfahren bei niedriger Temperatur und niedrigem pH-Wert.
Dieses Verfahren wird in ähnlicher Weise wie das unter Standardbedingungen angegebene mit den folgenden Abänderungen durchgeführt : a) Während der Vermehrung wird eine Temperatur von 27 C aufrechterhalten, b) während der Vermehrung wird ein pH-Wert von 4, 0 aufrechterhalten.
Bestimmte Eigenschaften der Hefe Saccharomyces cerevisiae A Tee Nr. 13602 beim Wachstum unter den definierten Bedingungen sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben.
Tabelle :
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<tb>
<tb> Vermehrungsbedingungen <SEP> Variation <SEP> bei
<tb> der <SEP> Züchtung
<tb> Eigenschaft <SEP> Niedrige <SEP> Tem-unter <SEP> den <SEP> anEingenschaft <SEP> ... <SEP> peratur <SEP> und <SEP> gegebenen <SEP> BeStandard <SEP> niedriger <SEP> dingungen <SEP>
<tb> pH-Wert <SEP> (angenähert)
<tb> 1. <SEP> Ausbeute <SEP> (Hefe <SEP> mit <SEP> 27% <SEP> Trockensubstanzgehalt) <SEP> als <SEP>
<tb> Prozentanteil <SEP> der <SEP> verwendeten <SEP> Melasse............. <SEP> 95 <SEP> 96 <SEP> 2 <SEP>
<tb> 2. <SEP> Anfangsaktivität <SEP> (Fermentometervolumen <SEP> in <SEP> ml <SEP> COJ
<tb> 0, <SEP> 535 <SEP> g <SEP> frischer <SEP> Hefe)
<tb> 45 <SEP> Minuten <SEP> 44 <SEP> 45 <SEP> 3
<tb> 45-90 <SEP> Minuten <SEP> 55 <SEP> 57 <SEP> 3
<tb> Insgesamt... <SEP> 99 <SEP> 102 <SEP> 5 <SEP>
<tb> 3.
<SEP> Haltbarkeitseigenschaften <SEP> (Fermentometervolumen <SEP> in
<tb> ml <SEP> COJ0, <SEP> 535 <SEP> g <SEP> Hefe <SEP> nach <SEP> 7 <SEP> Tagen <SEP> bei <SEP> 21 <SEP> <SEP> C) <SEP>
<tb> 45 <SEP> Minuten..................................... <SEP> 38 <SEP> 21 <SEP> 4 <SEP>
<tb> 45-90 <SEP> Minuten <SEP> 52 <SEP> 40 <SEP> 4
<tb> Insgesamt... <SEP> 90 <SEP> 61 <SEP> 7 <SEP>
<tb> 4. <SEP> Trockensubstanzgehalt........................... <SEP> 27 <SEP> 25 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> 5. <SEP> Gesamtstickstoff <SEP> (% <SEP> Trockensubstanzgehalt).............. <SEP> 8,4 <SEP> 8,6 <SEP> ¯0,3
<tb> 6. <SEP> Gesamtphosphat <SEP> (als <SEP> P2O5, <SEP> % <SEP> Trockensubstanz) <SEP> ... <SEP> 2,2 <SEP> 2,3 <SEP> ¯0,2
<tb> 7. <SEP> Invertaseaktivität................................ <SEP> 5, <SEP> 2 <SEP> 4, <SEP> 5-6, <SEP> 5 <SEP>
<tb> 8.
<SEP> Verhältnis <SEP> des <SEP> Fermentometervolumens <SEP> 45-90 <SEP> Minouten <SEP> zu <SEP> dem <SEP> Fermentometervolumen <SEP> nach <SEP> 45 <SEP> Minuten <SEP> 1, <SEP> 25 <SEP> 1, <SEP> 27 <SEP> 1, <SEP> 25-1, <SEP> 35 <SEP>
<tb>
Der Fermentometertest, auf den in Tabelle 1 Bezug genommen ist, wird gemäss dem im Journal of the Institute of Brewing [65, S. 39 (1959)] von S. Burrows und J. S. Harrison näher beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Das Verhältnis des Fermentometervolumens zwischen der 45. und 90. Minute zum Fermentometervolumen nach 45 Minuten ist ein Mass für die Aktivitätszunahme während des Prüfzeitraumes und dient zur Differenzierung der
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Hefe gemäss der Erfindung von verschiedenen anderen handelsüblichen Hefen.
Das niedrige Fermentometervolumen nach 45 Minuten und zwischen der 45.-90. Minute, das die Hefe gemäss der Erfindung beim Wachstum unter Bedingungen niedriger Temperatur und niedrigen pH-Wertes nach einer Lagerung während 7 Tagen bei 21 C liefert, dient insbesondere dazu, um Saccharomyces cerevisiae ATCC Nr. 13602 von der Hefe Saccharomyces cerevisiae ATCC Nr. 13601 zu unterscheiden.
Die in der Tabelle angegebene InvertaseAktivität wird an Hand der nachstehenden Formel errechnet :
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lösung bei 380 C bis zu einer optischen Drehung von 0 erforderlich ist, wobei die Drehung bei 20 C gemessen wird.
Die neue Hefe ergibt bei der Prüfung auf einem Zymotacbigraph, wie er in Modern Cereal Chemistry" von Kent-Jones und Amos, 5. Aufl. Northern Publishing Co. Ltd., Liverpool, auf den Seiten358-361 beschrieben ist, ein im wesentlichen lineares Ansteigen der Gasbildungsgeschwindigkeit in einem Zeitraum zwischen 1 und 3 Stunden vom Beginn der Versuche an.
Beim Versuch wurde gewöhnliches Bäckermehl verwendet und zum Anmachwasser wurden 0, 3 Gew.-% Ammonsulfat zugesetzt, um zu gewährleisten, dass genügend assimilierbarer Stickstoff vorhanden ist. Die neue Hefe hat auch gewisse Ernährungscharakteristika, die ebenfalls deren Identifizierung unterstützen.
Diese können wie folgt festgesetzt werden :
Spezielle Ernährungscharakteristika von Saccharomyces cerevisiae ATCC Nr. 13602 :
1 ml einer Suspension von Saccharomyces cerevisiae ATCC Nr. 13602 der 0, 1 mg feuchte Hefe enthielt, wurde aseptisch zu 9 ml des folgenden, in einem zugestopften konischen 50-mlKolben enthaltenden sterilen Mediums gegeben :
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<tb>
<tb> Medium <SEP> 1 <SEP> (Grundmedium) <SEP> :
<SEP>
<tb> Vitaminfreie <SEP> Glukose......... <SEP> 20 <SEP> g
<tb> (NH4) <SEP> 2S04................... <SEP> 1, <SEP> 7 <SEP> g
<tb> KH2P04..................... <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Konzentrierte <SEP> Milchsäure...... <SEP> 1, <SEP> 7 <SEP> ml
<tb> MgSO4.7 <SEP> H2O <SEP> .......... <SEP> 0,5 <SEP> g
<tb> Cal,. <SEP> 6 <SEP> H20...... <SEP> """"... <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> g <SEP>
<tb> FeCl3....................... <SEP> 1 <SEP> mg
<tb> ZnS04. <SEP> 7HaO................ <SEP> l <SEP> mg <SEP>
<tb> MnCl2.4 <SEP> H2O <SEP> ............... <SEP> 1 <SEP> mg
<tb> Aneurin <SEP> 2 <SEP> mg
<tb> Pyridoxin <SEP> 2 <SEP> mg
<tb> i-Inosit...................... <SEP> 20 <SEP> mg
<tb> Nicotinsäureamid <SEP> 5 <SEP> mg
<tb> Kalzium-d-pantothenat......... <SEP> 4 <SEP> mg
<tb> d-Biotin...................... <SEP> 5 <SEP> Mikrogramm
<tb> 2n-Ammoniumhydroxyd.......
<SEP> bis <SEP> pil <SEP> 5
<tb> Destilliertes <SEP> Wasser <SEP> bis <SEP> 900 <SEP> ml.
<tb>
Medium 2 : Dieses besteht aus dem vorstehend angegebenen Grundmedium, jedoch ohne Zugabe von i-Inosit.
Medium 3 : Dieses besteht aus dem Grundmedium gemäss Medium 1, jedoch ohne Aneurin und Pyridoxin.
Medium 4 : Es enthält das gleiche Grundmedium wie Medium 1, jedoch mit einem Zusatz von Uracil in einer Menge von 20 mg/l.
Medium 5 : Grundmedium wie bei Medium 1, dem eine wässerige etwa 5 g entwässertes Kaseinhydrolysat (vitaminfrei) enthaltende Lösung zugegeben worden ist, die auf PH 5 eingestellt und, falls notwendig, mit Aktivkohle entfärbt wird. Diese Kaseinhydrolysatlösung wird zugesetzt, bevor das Volumen des Mediums auf 900 ml gebracht wird.
Medium 6 : Es handelt sich dabei um das Medium 5, jedoch ohne Aneurin- und Pyridoxinzusatz.
Die Kolben werden doppelt angesetzt und nach aseptischer Zugabe der Hefe werden sie bei 30 C unter Schütteln (120-140 Ausschläge/ min) 17, 5 Stunden bebrütet. Am Ende dieses Zeitabschnittes wird 1 Tropfen einer 10%igen wässerigen Natriumazidlösung zugesetzt, worauf das Volumen der Hefesuspension im Kolben mit Leitungswasser auf 50 ml aufgefüllt wird.
Die Menge der in jeder Suspension enthaltenen Hefe wird in einem Spekker-Absorptionsmeter unter Vergleich mit einer Eichkurve ermittelt und im Falle der Medien 2,3 und 4 als Prozentsatz des im Medium 1 (Grundmedium) erfolgenden Wachstums ausgedrückt, während das Wachstum im Medium 6 als Prozentsatz des im Medium 5 vor sich gehenden Wachstums zum Ausdruck gebracht wird.
Bei einer Reihe von drei Experimenten wurden die in der folgenden Tabelle angegebenen Werte erhalten :
Tabelle 2 :
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<tb>
<tb> Wachstum <SEP> in <SEP> % <SEP> des'Wachstum <SEP> in <SEP> % <SEP> des
<tb> Medium <SEP> Wachstums <SEP> im <SEP> Wachstums <SEP> im
<tb> Medium <SEP> 1 <SEP> Medium <SEP> 5
<tb> 2 <SEP> 33-48-
<tb> 3 <SEP> 7-10-
<tb> 4 <SEP> 84-94-
<tb> 6 <SEP> - <SEP> 16-32
<tb>
Das Ausmass des Wachstums im Medium 2, zeigt eine verminderte Beanspruchung von Inosit an, verglichen mit der Hefe Saccharomyces cerevisiae ATCC Nr. 13601.
Die Vermehrung von Saccharomyces cerevisiae ATCC Nr. 13602 kann zweckmässig auch in zwei oder mehreren Vermehrungsbehältern und in einem Reifungsbehälter vorgenommen werden, wobei Hefe-enthaltendes Medium vom 1. Vermehrungsbehälter durch die nachfolgenden Vermehrungsbehälter und den Reifungsbehälter geführt wird, bevor die Gewinnung erfolgt. Nährstoffe und Wasser werden jedem Vermehrungs-:
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behälter zugeführt und Hefe-enthaltendes Medium wird von jedem Behälter in einem solchen Ausmass abgezogen, dass das Volumen des Mediums und die Konzentration der Zellen in jedem Züchtungsbehälter konstant gehalten und ein Wachstumsmodul im Bereich von 0, 05 bis 0, 20 und vorzugsweise im Bereich von 0, 075 bis 0, 175 aufrechterhalten wird.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Gewinnung von Hefe, dadurch gekennzeichnet, dass man Hybridhefe des Stammes Saccharomyces cerevisiae ATCC Nr. 13602 in einem wässerigen, vergärbare Zucker enthaltenden Kulturmedium unter Belüftung vermehrt und aus dem Kulturmedium abtrennt.