DE658764C - Verfahren zur Zuechtung von fuer die Butylalkohol-Aceton-Gaerung geeigneten Bakterien - Google Patents

Description

• Verfahren zur Züchtung von für die Butylalkohol-Aceton-Gärung geeigneten Bakterien Die zur Herstellungvon Butanol und Aceton benutzten Bakterienkulturen zeichnen sich allgemein dadurch aus, daß sie -einen bestimmten Wachstumszyklus durchmachen, währenddessen sie unter Veränderung ihrer Formen über den anfänglichen Abbau der vorgelegten Kohlehydrate zu Butter- und Essigsäure zur Reduktion dieser Stoffe (zum Teil bereits" im Zeitpunkt des Entstehens) zu Butanol und Aceton übergehen.
• Bei der Weiterzüchtung dieser Kulturen, zu denen z. B. Clostridium acetobutylicum und andere morphologisch gleichartige Butanolbildner gehören, treten nun häufig Erscheinungen auf, die z. B. von B e r n h a u e r (Biochem. Zeitschr. 28o, S.383, 1935) mit verminderter Säureresistenz und Reduktionsvermögen bezeichnet werden und die typische Degenerationserscheinungen darstellen. Diese Erscheinungen sind dadurch gekennzeichnet, daß im Falle einer normalen Gärung unter gleichzeitiger Clostridien- und Sporenbildung der Bakterien eine Säureabnahme und starke Bildung von Butanol einsetzt, während im Falle einer degenerierten Kultur ein unaufhörlicher Säureanstieg festzustellen ist bei fehlender Clostridien- und Sporenbildung, der den weiteren Zuckerabbau vollkommen hemmt und dessen Wirkung auch durch Neutralisation der gebildeten Säuren mit Laugen oder Kalk im Gegensatz zu den Befunden von F. B. Fred, W. H. Peters-en und M.Mulv a n i a (Journ. Bact. I I, -S. 323) nicht behoben werden kann.
• Im folgenden ist ein kurzes Beispiel zweier Butanolgärungen gegeben, die über Verwen-Jung von Kulturen derselben Generationsstufe und denselben Nährböden (Kartoffelmaischen von 6" Balling) folgende Zahlen ergeben:

  i. Normaler Verlauf 2. Fehlgärung

  Zeit in 'Säure ccm n/r- Zeit in Säure ccm n; i-

  NaOH/aoccm NaOH/zoccm

  Stunden Maischefiltrat Stunden

  Maischefiltrat

  O i O,Ig O I O,22

  6 0,38 4 o,26

  12 0,83 8 0,28

  24

  0,97 12 0,74

  29 j 0,84 I6 o,86

  48 0,49 20 1,04

  72 i 0,49 24 1,48

  96 3,34

  Der Gehalt an Lösungsmitteln, wie Butanol, Aoeton und Äthylalkohol, betrug bei normal verlaufender Gärung 2,55 Volumprozent, bei der Kultur mit Fehlgärung o,64 Volumprozent. Solche Fehlgärungen und Degenerationserscheinungen sind neben dem Auftreten in den Züchtungskulturen auch beim überimpfen in gröl:)ere Maischemengen zu beobachten, wo sie sich bereits makroskopisch in dem Fehlen der sonst normalen Trubdelkken- und Bakterienhautbildung äußern. Ähiiliche Erscheinungen wurden auch an anderen Stellen schon beschrieben, so gibt z. B. A. 3i. W y n n e an (Journ. Bacteriol. 22, S. 237), daß bei Zusatz von Butter- und Essigsäure bis zu einem pii von 3,65 bis 3,75 die Butanol-Aceton-Gärung vollständig gehemmt wird: Diese Erscheinung der Degeneration ist festzustellen,-wenn Laboratoriumskulturen unter aeroben oder anaeroben Bedingungen fortlaufend auf gleichen oder auch verschiedenen Kulturnährböden weitergezüchtet werden. Sie ist auch zu beobachten, wenn an sich normale Kulturen; aber bereits durch solche Züchtungsmethoden geschwächt, auf größere Maischemengen zur Herstellung von Butanol übertragen werden.
• Da dadurch die Ausbeute und der gleichbleibende Verlauf der Gärung, insbesondere im technischen Betrieb, wesentlich heeinträchtigt wird, hat es nicht an Vorschlägen gefehlt, solche Erscheinungen zu verhindern.
• Zur Vermeidung solcher Fehlgärungen wurde schon durch . die Verwendung von Schlempe zur Impfung von Maischen gefordert, da man annahm, daß infolge der vorherigen Erhitzung die vegetativen Formen abgetötet werden und ausschließlich Sporen in der Maische enthalten sind, welche eine normal verlaufende Gärung allein bewirken könnten. Es ist auch bekannt, daß die bei derartigen Gärungen verwendeten Bakterienstämme Degenerationserscheinungen zeigen: Diese Degenerationserscheinungen wären in dem Verlust der diastatischen Fähigkeiten begründet, der bei einem ganz bestimmten Bakterium Bacillus Butylicus Boinot-Firmiii nicht auftrete und das infolgedessen selbst bei kontinuierlicher Weiterzüchtung keine Fehlgärungen ergebe.
• Eine an sich allgemein bekannte Arbeitsweise der Bakteriologie-besteht darin, durch Erhitzen von Bakteriengemischen eine Trennung in hitzebeständige Sporen und hitzeempfindliche Formen durchzuführen. So würde bereits eine solche Her- und Unizüchtung von Bakterien mit der Absicht vorgeschlagen, dadurch an sich höhere Ausbeuten garantierende Bakterienstämme zu erhalten. Hier müssen jedoch, wie bekannt, bestimmte Bedingungen eingehalten werden, da bei einem Erhitzen von Butylobacterarten auf i oo` C eine Schwächung der Kulturen erfolgt. Ein weiterer, noch nicht bekannter Vorschlag geht dahin, das Erhitzen der Kulturen auf alkalischem Nährboden zur Vermeidung von Degcnerationserscheinungen vorzunehmen.
• Es wurde nun gefunden, daß für die sichere Vermeidung voll Fehlgärungen eine ganz bestimmte Reihenfolge und Durchführüngsart der bereits erwähnten und erkannten Kulturbehandlungsmethoden notwendig ist. Es hat sich nämlich gezeigt, daß weder Erhitzen allein, noch die Umzüchtung auf alkalische Nährböden absolut leistungsfähige Kulturen ergibt. Insbesondere hat sich ergeben, daß die notwendige Erhitzung der Kulturen zur Abtrennung von Sporen und vegetativen Formen nicht in alkalischem Medium vorgenommen werden darf, sondern erst in einer weiteren dazwischen geschalteten normalen Kulturstufe. Im alkalischen Medium sind die Sporen viel weniger widerstandsfähig gegen Erhitzen, und es werden damit nicht nur die vegetativen Formen (Kurz- und Langstäbchen) getötet, sondern auch die Sporen geschwächt, was statt zu einer Verbesserung zu einer Schwächung der Gesamtkultur führt.- Ebenso soll die Kalkgabe so bemessen werden, daß während der. ganzen Entwicklungsdauer eine alkalische Reaktion vorliegt. a Der Vorteil dieses Züchtungsverfahrens liegt darin, daß umständliche Malinahmen, wie Schlempeverwendung zur Beimpfüng der Maischen, umständliche Gärführung zur Vermeidung von Fehlgärung nicht mehr notwendig sind, sondern daß in kleinem Laboratoriumsmaßstab Kulturen auf einfache Weise herangezüchtet werden können, die auch bei mehrmaliger Überimpfung in große Maischemengen noch ein sehr starkes Reduktions- bzw. Sporulierungsvermögen haben, so daß ein normaler Gärverlauf gesichert ist. Der Vorteil gegenüber ähnlichen Verfahren besteht darin, daß die Erhitzung der Kulturen zeitlich so durchgeführt wird, daß die Sporen weder durch zu langes Erhitzen noch durch Erhitzen im alkalischen Nährmedium geschwächt werden. Beispiel i 3 bis 5 ccm einer Kulter von Clostridium acetobutylicum werden in einem Impfröhrchen befüllt mit 15 ccm einer 6° Balling-Kartöffelmaische und mit Paraffin (Erweichungspunkt 6o bis 65° C) anaerob abgeschlossen. Das beimpfte Röhrchen wird nur 2 Minuten im siedenden Wasserbad erhitzt. Diese Erhitzungsdauer hat sich als die beste erwiesen. Nach dem Erhitzen wird das Röhrchen rasch abgekühlt, nach der Festigung des Paraffinstopfens gut - durchgeschüttelt und sodann 2 'Page bei 37;5° C bebrütet. Nach dieser Behandlung zeigen sich nach 48 Stunden Entwickltingsdauer noch vor@@@icgcncl Kurzätälr chen. Von dein Röhrchen wird nun auf ein zweites Röhrchen übergeimpft, dein noch ei" Zusatz voll 0,2; g Ca (.'0.i zugegeben War, so daß das hti Während der ganzen Dauer ül)cr ,-,1 lag, und ebenfalls .1S Stunden bebrütet. Es zeigen sich dann ausschlieL)lich Lang- und Kurzstäbchen. Nun erfolgt ein zweiter Wechsel auf ein normales Kulturröhrchen ohne Kalkgabe mit Erhitzen, wobei bereits nach .18 Stunden ein charakteristischer Unterschied in dem Hervortreten von Clostridien zu erkennen ist. Setzt man diese intermittierende Züchtungsart (Erhitzen auf normalem Kulturboden und Überimpfen auf einen kalkhaltigen Boden) ein drittes und viertes 1M1 fort, so ergeben sich zunehmende Clostridien und Sporenmengen bereits nach .13stündiger Entwicklungszeit. Mit einer derartig herangezüchteten Kultur konnte noch nach der 23. Generation eine normale Durchgärung erzielt werden, die folgendermaßen durchgeführt wurde.-5 1 einer 6° Bailing-Maische wurden mit einer Kultur Clostridium acetobutylicum, die in der eben beschriebenen Weise herangezüclitet und dann über normaler Weiterentwicklung bereits die , 24.. Generationsstufe (Überimpfungsstufe) erreicht hatte, beimpft und 72 Stunden bei 37,5° C gehalten. Die Untersuchung der Maische vor und nach der Gärung gab folgendes Bild: .

  Vor der Nach der

  Gärung Gärung

  Konzentration (° Balling) . . 6,o 1,25

  Säuregrad der Maische (in .

  ccm n/1-NaOH/2o ccm) o,1o 0,36

  PH ..................... 5,92 4,75

  Gesamtlösungsmittel in der

  vergorenen Maische .... - 2,05

  Volum-

  ' Prozent

  Beispiel 2 .-Als Vergleich für die Auswirkung der Züchtungsmethode wurde. dieselbe Maischemenge und -art (6° Balling-Katoffelmaische ) mit einer Impfkultur vergoren, welche lediglich 7m;il durch Wechsel auf kartoffelmaischehaltigen Impfröhrchen ohne Erhitzung und ohne Impfung auf alkalische Substrate fortgezüchtet war. 1:s ergab sich dabei folgendes Resultat: 51 derselben 6" Balling-Kartoffclmaische wurden mit einer unbehandelten 7mal weitergezüchteten Kultur desselben Stammes von Clostridiuni acetobutylicum beimpft und 72 Stunden bei 37,5° C gehalten. .

  Vor der Nach der

  Gärung Gärung

  Konzentration (° Balling) . . 6,o 2,90

  Säuregrad der 'Maische (in

  ccm n/n-NaOH/2o ccm) o,2o 1,40

  PH ..................... 6,11 3,80

  Gesamtlösungsmittel...... - o,64

  Volum-

  - Prozent

  Das Verfahren ist nicht nur dazu geeignet, die Degenerierung der Bakterienkulturen zu verhindern, sondern ist in gleicher Weise dazu geeignet, degenerierte Kulturen wieder in normale Kulturen zurückzuführen und damit die Ausbeute an Gärungserzeugnissen wieder auf die ursprüngliche Höhe zurückzubringen.

Claims (2)

1. PATENTANSPRÜCf1E: i. Verfahren zur Züchtung von für die Butvlalkohol - Aceton - Gärung geeigneten Bakterien, die vorher einer Hitzebehandlung unterworfen wurden, dadurch gekennzeichnet, daß anschließend an diese Hitzebehandlung in normalen Nährböden die Weiterzüchtung der Bakterien auf N @ährböden mit alkalischer Reaktion, deren pH-Wert durch Zusatz von Alkali über 7,1 liegt, ohne Erhitzen erfolgt und gegebenenfalls beide Züchtungsarten mehrere Male wiederholt werden.
2. 2. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß die vorhergehende Hitzebehandlung durch nur 2 Minuten langes Erhitzen im siedenden Wasser erfolgt, wonach sofort auf Bruttemperatur abgekühlt wird. -