DE2452720A1

DE2452720A1 - Verfahren zur kontinuierlichen kultivierung von hefe

Info

Publication number: DE2452720A1
Application number: DE19742452720
Authority: DE
Inventors: Shimane Gotsu; Nobuo Moritani; Takeshi Oguma; Shunji Shiba; Yoichi Takeuchi
Original assignee: Sanyo Kokusaku Pulp Co Ltd
Current assignee: Sanyo Kokusaku Pulp Co Ltd
Priority date: 1973-11-06
Filing date: 1974-11-06
Publication date: 1975-05-07
Also published as: CA1035712A; US3933590A; JPS5138790B2; SE7407490L; NO742103L; NO143948C; NO143948B; SE419976B; JPS5071880A

Description

von Hefe

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur kontinuierlichen Kultivierung von Hefe unter Verwendung des Dampfkondensats von Sulfitablauge als Kohlenstoffquelle und insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von Hefe, wie Candida Pichia oder Hansenula unter Verwendung der organischen Verbindungen im Dampfkondensat, welches durch Verdampfen der in Sulfitzellstoffwerken anfallenden Sulfitablauge erhalten wird. Ferner setzt man weitere Nährstoffe zu, wie Stickstoff, Kalium und Phosphat. Die kontinuierliche Kultivierung der Hefe wird derart geführt, daß der pH des Dampfkondensats von 3,00 -4,5 eingestellt wird und daß die Gesamtkonzentration der im Dampfkondensat enthaltenen schwefligen Säure bei der kontinuierlichen Kultivierung ohne Sterilisierung auf 0,02 bis 0,20 1° eingestellt wird.

In herkömmlichen Anlagen zur Herstellung von Torula-Hefe verwendet man als Kohlenstoffquelle in der Hauptsache Xylose. Diese Xylose wird aus Sulfitablauge gewonnen. Ferner verwendet man Saccharide zur Herstellung von Melasse-Hefe, wie Bäcker-Hefe. Diese Saccharide bestehen in der Hauptsache aus Rohrzucker. Zur Herstellung von Petroleum-Hefe verwendet man Kohlenwasserstoffe-, und zwar in der Hauptsache η-Paraffin. Ferner ist es bekannt, Hefe mit Methanol oder Essigsäure als Kohlenstoffquelle zu kultivieren.

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Es ist andererseits äußerst wichtig, Hefe in großen Mengen herzustellen, da diese als Protein-Quelle dient. Zu diesem Zweck muß Hefe im industriellen Maßstab hergestellt werden. Die "beschriebenen Kohlenstoffquellen können jedoch leicht zu Verschmutzungen aufgrund des Restkohlenstoffs bei deren Herstellung führen. Aus diesem Grunde wurde die Hefeproduktion erheblich gesenkt.

Es scheint z. Zt. unmöglich, die Herstellung von Torula-Hefe aus Sulfitablauge fortzusetzen, da es schwierig ist, ' die von verschiedenen Regierungen gemachten Auflagen zu erfüllen. Ferner erscheint es schwierig, die Kultivierung von Hefe aus Melasse fortzusetzen, und zwar aufgrund erheblicher Preisfluktuationen. Andererseits ist der Preis von n-Paraffin äußerst instabil, so daß die daraus hergestellte Hefe relativ teuer wird. Ferner muß darauf aufmerksam gemacht werden, daß die Reinigung von Ablauge nicht leicht ist und zusätzliche Kosten verursacht.

Es wurde daher versucht, Methanol oder Essigsäure zur Kultivierung von Hefe heranzuziehen. Im Laboratoriums-Maßstab gelingt dies. Es ist jedoch nicht möglich, auf diese Weise Hefe im industriellen Maßstab herzustellen, da diese Kohlenstoffquellen zu teuer sind.

Somit ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur kontinuierlichen Kultivierung von Hefe unter Verwendung des Dampfkondensats eines Sulfitzellstoffwerks zu schaffen, welches nicht wesentlich zu Umweltverschmutzungen führt.

Beim Sulfitaufschluß wird das zu Hackschnitzeln verarbeitete Holz im Kocher mit einer Lösung der Kochchemikalien gekocht. Danach werden die festen und flüssigen Komponenten getrennt. Die Feststoffe werden einer Bleichanlage zugeführt. Die flüssigen Komponenten werden als Sulfitablauge bezeichnet. Da diese Ablauge einen relativ hohen Gehalt an organischen Verbindungen aufweist, ist der chemische Sauerstoffverbrauch

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und der "biologische Sauerstoffverbrauch sehr groß. Insbesondere enthält diese Flüssigkeit Ligninsulfonsäure und Saccharide. Es ist daher nicht möglich, diese Ablauge in öffentliche Gewässer laufen zu lassen. Derzeit wird die Ablauge eingedampft und dann im nassen Zustand verbrannt. Ferner eignet sich diese Ablauge zur Herstellung verschiedener Lignin-Produkte und auch zur Herstellung von Torula-Hefe.

Das Dampfkondensat enthält jedoch noch eine größere Menge niedermolekularer organischer Verbindungen, welche aus den Holzkomponenten stammen, sowie mitgerissene Ligninsulfonsäure oder schweflige Verbindungen. Daher zeigt auch das Dampfkondensat noch einen größeren chemischen Sauerstoffbedarf und biologischen Sauerstoffbedarf. '.

Das Dampfkondensat enthält etwa die folgenden niedermolekularen organischen Verbindungen: 0,8"- 1,8 % Essigsäure, 0,05 - 0,20 i= Ameisensäure, 0,03 - 0,10 % Furfural und 0,02 - 0,07 1° Methanol. Das Dampfkondensat weist einen chemischen Sauerstoffgehalt von etwa 2000 - 5000 ppm auf. Der pH liegt bei etwa 2 und somit wirkt dies es Dampf kondensat als Inhibitor für die Kultivierung von Hefe. Es hat'sich jedoch herausgestellt, daß Hefe auch in dem Dampfkondensat kultiviert werden kann, wenn man bestimmte Bedingungen wählt.- Ferner hat sich herausgestellt, daß der biologische Sauerstoffbedarf und der chemische Sauerstoffbedarf des nach der Kultivierung von der Hefe abgetrennten Abwassers stark herabgesetzt ist. Somit eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren hervorragend zur Behandlung von Abwässern aus Sulfitzellstoffwerken.

Im allgemeinen eignen sich für die Kultivierung die folgenden Hefen: Candida, Torulopsis, Pichia oder Hansenula. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diese Hefearten beschränkt.

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Da jedoch das Dampfkondensat einen Inhibitor für die Kultivierung enthält, ist es erforderlich, die Hefe resistent in Bezug auf den Inhibitor des Dampfkondensate zu machen. In "Biochemical Engineering", 15. Dezember 1963, Seiten 239 "bis 240 des Institute of Applied Microbiology der Universität von Tokyo wurde ein Verfahren besehrieben, mit dem Bakterien gegen Glutaminsäure resistent gemacht werden können. Erfindungsgemäß wird ein ähnliches Verfahren angewandt, um die Hefe gegenüber dem Dampfkondensat resistent zu machen. Zunächst wird das Dampfkondensat mit Wasser auf die Hälfte der ursprünglichen Konzentration verdünnt und die Konzentration der Essigsäure wird auf etwa 1,5 % (mit Essigsäure) eingestellt, worauf das Ganze mit Agar, Nahrmedium und chemischen Reagenzien versetzt wird. Sodann erfolgt eine Plattenkultur bei 30 ⁰C. Die darauf wachsenden Kolonien werden sodann wiederum auf dem gleichen Medium kultiviert. Die dabei wachsende Hefe wird wiederum durch Plattenkultur unter Verwendung eines nicht-verdünnten Dampfkondensats kultiviert. Schließlich werden die darauf gewachsenen Kolonien als reine Kolonien ausgewählt.

Zur Kultivierung von Hefe eignet sich am besten ein Waldhof-Gärbottich; Als Stickstoffquelle verwendet man vorzugsweise Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid oder Harnstoff. Als Phosphorquelle setzt man vorzugsweise Calciumsuperphosphat oder Ammoniumphosphat zu. Als Kaliumquelle setzt man vorzugsweise Kaliumchlorid oder Kaliumsulfat zu. Ferner kann man Chemikalien einsetzen, welche sowohl Kalium und Phosphor enthalten, wie Kaliumphosphat oder Dikaliumphosphat. Zusätzlich kann man eine kleine Menge Melasse und/öder eine kleine Menge Maisquellflüssigkeit als Spurenelemente zusetzen.

Das erfindungsgemäß eingesetzte Dampfkondensat enthält schweflige Säure. Die schweflige Saure ist ein typsicher Inhibitor des Dampfkondensats. Daher wurde die Beziehung zwischen der Konzentration der schwefligen Säure und dem Wachstum der Hefe studiert. Es wurde' gefunden, daß eine normale Kultivierung

nicht durchgeführt werden kann, wenn nicht die Konzentration der schwefligen Säure im Dampfkondensat im Bereich von 0,02 - 0,20 % liegt. Wenn die Konzentration der schwefligen Säure unterhalb 0,02 ^ liegt und eine kontinuierliche Kultivierung ohne Sterilisation durchgeführt wird, so wachsen auch andere Mikroorganismen, wie Schimmel und Bakterien. Wenn andererseits die Konzentration der schwefligen Säure oberhalb 0,20 % liegt, so kann die Hefe aufgrund der hohen Konzentration an schwefliger Säure in diesem Medium nicht normal wachsen. Zur Senkung der Konzentration an schwefliger Säure im'Dampfkondensat, welches eine Konzentration an schwefliger Säure von mehr als 0,20 $ enthält, setzt man das Dampfkondensat der Luft aus. Diese sogenannte Belüftung führt zu einer Senkung des Gehaltes an schwefliger Säure.

Um die Konzentration der schwefligen Säure zu erhöhen, kann man schweflige Säure in das Dampfkondensat einleiten. Auf diese Weise kann in jedem Falle die Konzentration auf .einen Wert innerhalb des beschriebenen Bereichs eingestellt werden.

Im folgenden soll die kontinuierliche Kultivierung erläutert werden. Zunächst wird die Konzentration der schwefligen Säure im Dampfkondensat eingestellt. Dann wird ein Gärbottich mit dem Dampf kondensat und Nährstoffen gefüllt und dann wird im Hinblick auf die Kultivierung im nicht-sterilisierten Zustand · der pH des Nährmediums auf 4,5 ~ 5,5 je nach Art der Hefe eingestellt. Sodann wird das Kulturmedium mit zuvor kultivierter Hefe geimpft. Wenn bei der Kultivierung der pH zur alkalischen Seite hin verschoben wird, so setzt man eine Mineralsäure, wie Salzsäure oder Schwefelsäure oder eine organische Säure, wie Essigsäure, zu, um den pH wiederum richtig einzustellen. Wenn andererseits der pH zur sauren Seite hin.neigt, so setzt man ein alkalisches Mittel zu, wie Natriumhydroxid oder Ammoniak. Die Temperatur liegt vorzugsweise bei 25-35 C. Unter diesen Bedingungen erfolgt zunächst die Kultivierung im Chargenbetrieb. Wenn die Hefe in diesem Chargenbetrieb die angestrebte Konzentration erreicht hat, beginnt man mit

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der kontinuierlichen Kultivierung. Das Kultivierungsergebnis wird bei der kontinuierlichen Kultivierung nicht durch die Art und Weise der Zugabe der Nährstoffe beeinflusst. Diese können dem Dampf kondensat vor der Einführung in den Gärbottich beigemischt werden oder separat in den Gärbottich eingeführt werden. Bei der kontinuierlichen Kultivierung ist es wichtig, den pH.des zugeführten Dampfkondensats auf 3,0 - 4,5 zu halten. Im allgemeinen wird der pH des Fährmediums erhöht, wenn man die Hefe kontinuierlich im Dampfkondensat kultiviert. Man kann selbstverständlich die pH-Regelung mit Hilfe einer üblichen Säure durchführen. Es ist jedoch vom industriellen Standpunkt bevorzugt, die pH-Regelung mittels des Dampfkondensate vorzunehmen, da der pH des Dampfkondensats etwa 2 beträgt und dieses die Kohlenstoffquelle für die Kultivierung enthält. Das Dampfkondensat wirkt somit sowohl als Kohlenstoffquelle als auch als pH-Regler. Wenn jedoch Dampfkondensat bei einem pH unterhalb 3,0 eingesetzt wird, so muß man eine größere Menge Alkali zusetzen, um den pH auf 4,5 - 5,5 zu halten. Wenn andererseits der pH des zugesetzten Dampfkondensate oberhalb 4,5 liegt, so muß man Säure zusetzen, um den pH auf 4,5 — 5,5 zu halten. Es ist somit erforderlich, das Wachstum der Hefe und den pH der zugeführten Flüssigkeit im ausgewogenen Verhältnis zu halten, um den pH-Wert des Kulturmediums bei dem kontinuierlichen Kulturverfahren auf 4,5 - 5,5 zu halten. Eine eingehende Untersuchung zeigt, daß man am besten ein Dampfkondensat mit einem pH-Wert von 3,0 - 4,5 wählt. Dies hat die folgenden Gründe:

(1) Das Wachstum der Hefe wird natürlich durch die Wachstumseigenschaften der Hefe selbst beeinflusst. Aber der pH-Wert des zugeführten Dampfkondensats sollte im Bereich von 3,0 4,5 gehalten v/erden, und zwar entsprechend der jeweils zugeführten Menge an Flüssigkeit.

(2) Es ist erforderlich, dem Dampfkondensat bei der kontinuierlichen Kultivierung der Hefe Nährmedium zuzusetzen.

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Wenn jedoch Ammoniaklösung in einer für das Wachstum der Hefe erforderlichen Menge als Stickstoffquelle zugesetzt wird, so erhöht sich der pH-Wert des Mediums. Da die Regelung des pH-Wertes bei der kontinuierlichen Kultivierung schwierig ist, ■ sollte dieser im Bereich von 3,5 - 4,5 gehalten werden, d. h. daß bei Zufuhr einer Flüssigkeit mit einem pH-Wert im Bereich von 3,0 - 4,5 die erforderliche Menge Ammoniak ohne übermäßige Erhöhung des pH-Wertes des Kulturmediums zugesetzt werden kann. Dabei verläuft die Hefekültivierung unter den günstigsten Bedingungen.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Beispiel 1

Es wird ein Dampfkondensat mit einem pH-Wert von 1., 9 und einer Schwefligsäure-Konzentration von 0,23 ί° eingesetzt. Dieses Dampfkondensat wird während verschieden langen Zeitspannen belüftet, so ddaS die Konzentration der schwefligen Säure auf etwa 0,23 ^cß> oder etwa 0,2 ^ oder etwa 0,1 fi oder etwa 0,02 % oder-etwa 0,01 $ eingestellt wird. 1,6 g Ammoniurasulfat, 1,1 g Kaliumchlorid und 1 g Kaliumphosphat werden zu jeweils 1 1 des jeweiligen Dampfkondensate gegeben und dieses Medium wird mit liatriumhydroxidlösung auf pH 5,0 eingestellt. Sodann wird Hefe im Chargenbetrieb kultiviert, wobei ein V/aldhof-Gärbottich (Volumen 1m) eingesetzt wird. Das Medium wird nicht sterilisiert.

Zum Impfen verwendet man Candida rugosa IFO 0750. Diese Hefe ist gegenüber dem Dampfkondensat resistent. Zunächst erfolgt die Kultivierung im Chargenbetrieb. Sobald der Trockengehalt an Hefe in der Kulturbrühe 0,4 i° erreicht,, schaltet man vom Chargenbetrieb auf kontinuierlichen Betrieb um. Die beschriebenen Nährstoffe werden intern zugeführten Dampfkondensat zuvor aufgelöst und der pH-Wert der zugeführten Flüssigkeit liegt im Bereich von 3,3 - 3,3 und hat einen Durchschnittswert von 3,5,

Die Einstellung des pH-Wertes erfolgt dadurch, daß man das Dampfkdndensat durch KaITt fließen läßt. Diese kontinuierliche Kultivierung wird während 20 Tagen durchgeführt. Der Trockengehalt an Hefe im stationären Zustand, die Dauer des Kultivierurigszyklus und die Kontaminierung mit anderen Mikroorganismen zu dieser Zeit sind in nachstehender Tabelle zusammengestellt. . ' . ; '." ;

Tabelle

	A-	23	-B-	20	-C	,10	.D-..	02 ·	E-	012
Konzentration d.schwefligen . Säure '(■#)	0,	3	o,	8	0	,5	o,	5	0,	5 '■'■■■ ■·"■■'·
Dauer des * Zyklus (h)	5,	28	2,	55	2	,57	2,	53	2',	43
Trockenkonzen—- tration der Hefe ■ ■(#.)	o,	.°»	0	o,	0,

Kontamin i erung
mit anderen
Mikroorganismeii .(nach 20 Tagen)

keine- keine keine keine Schimmel nach 1 Woche;

...." --■.-. ■ . -.- ^; Kultivierung ,umöglich

Aus obiger Tabelle ergibt sich klar, daß die Kultivierung bei eine'r Konzentration der schwefligen Säure von 0,02 - 0,20 günstig "verläuft. Es wurde gefunden, daß d ei: chemische Sauerstoffbedarf der Flüssigkeit nach Abtrennung von dem"'Hefe-" mycel 500 bis 1000 ppffi^vbeträgt. Somit eignet sich das erfinäungsgemäße Verfahren sehr gut zur Senkung'"des chemischen. Sauerstoff bedarf s des' Dämpf kondensate. ■"."■"■"■· " ' , :

Beispiel 2

Mit Hilfe eines 10 in -Waldhof-Gärbotti'chs (in 6,5 m Ii ed ium)

eine kontinuierliche Kultivierung durchgeführt, wobei ein Dampfkondensat mit einer Schwefligsäure-Konzentration

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von 0,08 io gewählt wird. Es werden ähnliche Nährstoffe wie bei Beispiel 1 im Chargenbetrieb eingesetzt. Bei der kontinuierlichen Kultivierung wird der zugeführten Flüssigkeit jedoch kein Ammoniumsulfat zugesetzt. Demgegenüber wird die erforderliche Menge einer 28^-igen wässrigen Ammoniaklösung separat zugesetzt. Als Hefe verwendet man Hansenula anomala IAM 4663. Diese Hefe ist gegenüber dem Dampfkondensat resistent. Der pH des Dampfkondensats wird durch Einstellung mit Natriumhydroxid auf 3,0 - 3,6 gehalten. Die Kultivierung erfolgt während 30 Tagen. Der pH des Kulturmediums beträgt 5,3. Die Trockenkonzentration der Hefe im stationären Zustand beträgt 0,58 io. Die Dauer des Kultivierungszyklus beträgt 2,4 h. Der chemische Sauerstoffbedarf des Dampfkondensats beträgt vor der Kultivierung 3800 ppm und nach der Kultivierung (nach Abtrennung vom dem Hefemycel) 980 ppm.

Beispiel 3 .

Während 65 Tagen wird mit einem 1 m -Waldhof-G-ärbottich eine kontinuierliche Kultivierung durchgeführt, und zwar mit 550 1. Medium. Hierzu wird ein Dampfkondensat mit einer Schwefligsäure-Konzentration von 0,12 /S verwendet. Es wird bei 30 ⁰C und bei einem pH von 5,8 gearbeitet. Das Medium hat die folgende Zusammensetzung:

1,6 g Ammoniumchlorid, 3 g Galciumsuperphosphat (lösliche Phosphorsäure 35 ^) und 1,3 g Kaliumsulfat. Diese Stoffe werden in 1 1 Dampfkondensat aufgelöst. Als Hefe verwendet man Pichia membranaefaciens HUT 7295, welche gegenüber dem Dampfkondensat resistent ist. Die Kultivierung erfolgt durch Zugabe von 30 1 Flüssigkeit mit einer Hefekonzentration von 0,35 1= (in einem 30 1-Gärbottich kultiviert).

Man stellt den pH-Wert des Dampfkondensats der Sulfitablauge auf 4,5 ein, indem man das Dampfkondensat durch eine Kalksteinschicht laufen läßt. Im Durchschnitt führt man etwa 200 1 Flüssigkeit pro Stunde zu. Die Zyklusdauer beträgt 2,7 h.

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Zu dieser Zeit beträgt die Hefekonzentration 0,53 #. Die Kultivierung verläuft stabil und unter guten Bedingungen.

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Claims

- ^u - 24527ZQ

PATENTANSPRÜCHE

' Verfahren zur kontinuierlichen Kultivierung von Hefe, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kulturmedium ein mit einem Neutralisationsmittel und mit Nährstoffen versetztes*· Dampfkondensat einer" Sulfitablauge einsetzt und mit Hefe, wie Candida, Pichia oder Hansenula impft und sodann eine kontinuierliche Kultivierung ohne Sterilisierung des Kulturmediums durchführt und dabei den pH-Wert und die Konzentration der sclwefligen Säure in dem zugeführten Dampfkonden'sat regelt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Konzentration der schwefligen Säure im Dampfkondensat auf 0,02 - 0,20 $ hält, " ^{: ;} ' ' " ' -
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß! man den'pH-Wert des Dampfkondehsats auf 3,0 - 4,5 hält.:
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß? man die Kultivierung bei einer Temperatur von 25 - 35 °C durchführt. ■ "·.--'■■

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BAD ORIGINAL