DE1417575C - Verfahren zum Herstellen saure resistenter Protease - Google Patents

Description

an. Aus dem Wert 3,15 des -C/iV-Verhältnisses der Kontrolle gemäß Tabelle 1 ergibt sich, daß das Verhältnis W: S des Basismediums 1,8:1,2 oder 3 :2 beträgt und somit dem Verhältnis W: S, wie es beim Verfahren der USA.-Patentschrift angewendet wurde, entspricht.

Bei der Erfindung wird die Ausbeute bei der Kontrolle (Basismedium) als 100% angenommen. Die erhöhte Ausbeute auf Grund des Zusatzes von Ammoniumchlorid oder Natriumnitrat zu dem Basismedium (Kontrolle) oder die Abnahme der Ausbeute bei Zusatz von entfetteten Sojabohnen zu dem Basismedium (Kontrolle) wurde auf die 100%ige Ausbeute bei dem Basismedium (Kontrolle) bezogen. Das Verhältnis von C/N eines Mediums der Zusammensetzung von Weizenkleie zu entfetteten Sojabohnen = 3:2, wie es bei dem Verfahren gemäß der USA.-Patentschrift 2 848 371 vorliegt, entspricht somit einem C/iV-Verhältnis von etwa 3,15.

Gemäß dem Stand der Technik ist also ein Züchtungsmedium bekannt, welches der Kontrolle (Basismedium) gemäß der vorliegenden Erfindung entspricht. Es findet sich jedoch keinerlei Hinweis auf die Verbesserungsmöglichkeit der Ausbeute durch Zusetzen von anorganischen Stickstoffverbindungen zu dem Basismedium (Kontrolle) bei Einsatz von Aspergillus saitoi ATCC 14332.

Die Enzymlösung aus der Submers-Kultur kann wie folgt hergestellt werden: 3 g eines Gemisches von Weizenkleie und entfetteten Sojabohnen gemäß der Erfindung werden mit 10 ml Wasser in einer Schüttelflasche von 500 ml Inhalt versetzt und unter Druck in üblicher Weise sterilisiert. Der Prozentgehalt der zu dem flüssigen Kulturmedium außerdem noch zugesetzten Verbindungen wird in Gramm pro 100 ml angegeben. Das Gemisch wird sodann mit einem Schimmelstamm angeimpft und bei 30° C in einer Schüttelmaschine bebrütet, die mit 140 Schwingungen pro Minute arbeitet. Nach der Fermentation wird das Gemisch filtriert und das Filtrat mit n/L0 Acetat-Puffer (pH 2,7) auf das lOfache des Volumens verdünnt, wobei man die Enzymlösung erhält.

Die Protease-Bestimmung wird bei der erfindungsgemäß erhaltenen Enzymlösung wie folgt ausgeführt: Die die Protease enthaltende Enzymlösung wirkt

ίο auf ein Substrat von 2% Milchkasein (Hammerstein) bei 3O⁰C 10 Minuten lang ein, und zwar nach der veränderten Anson-Methode. Nach Abfiltrieren des durch Zugabe von Trichloressigsäure gebildeten Niederschlags wird dem Filtrat 1 ml Folins Reagenz zugesetzt, und die auftretende Färbung wird kolorimetrisch bei 660 πΐμ unter Verwendung eines Photometers (Hitachi Ltd., EPO-B-Type) in Δ Ο. D. gemessen.

Es liegen wenige Berichte über die Wirksamkeit des Zusatzes anorganischer Stickstoffquellen bei der festen Kultivierung für die Bildung der Säureprotease vor. Lediglich Sakamoto u.a. haben gefunden, daß der Zusatz von Ammoniumsulfat die Bildung des Enzyms im Fall von Penicillium steigert, nämlich um 122% gegenüber der Kontrolle (s. J. Fermentation Technology, 35 [1957]).

Im folgenden wird die Wirkung des Zusatzes verschiedener Arten von stickstoffhaltigen Verbindungen auf die Bildung der Säureprotease gemäß der Erfindung erläutert.

Zur Bildung der Protease nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wurden verschiedene Mengen anorganischer Stickstoffquellen in Form von Ammoniumchlorid oder Natriumnitrat dem obenerwähnten Basismedium zugesetzt. Die Ergebnisse ergeben sich aus der folgenden Tabelle 1.

Tabelle 1 ...

Wirkung der Konzentration anorganischer Stickstoffverbindungen im Medium auf die Bildung von Protease unter Verwendung von Aspergillus saitoi ATCC 14 332 (30° C, 87 Stunden, 140 UpM)

Zusatz von
Stickstoffverbindungen

C/N

Ammoniumchlorid
pH Protease

Ausbeute

Natriumnitrat

C/N

PH

Protease

Ausbeute

Kontrolle
0 .;
0,25 .;.

0,5

1,0:...
1,5 ....
2,0

3,15
2,18
1,60
1,07
0,80
0,64

2,70
2,39

4,7
4,7
4,5
4,5
4,6
4,8

3,8
3,6

0,268
0,324
0,372
0,416
0,424
0,412

100
128
139
155
158
154

2,41
1,95
1,42
1,17
0,91

4,3
4,5
4,0
4,6
4,3

0,252
0,322
0,380
0,396
0,378

Entfettete Sojabohnen

0,235
0,229

94
120
142
148
141

Aus dem Versuch ergibt sich, daß eine außerordentlich günstige und maximale Ausbeute gegenüber der Kontrolle erzielt wird, wenn man dem organischen Stickstoff enthaltenden Basismedium 1 % Ammoniumchlorid oder Natriumnitrat zusetzt.

Werden entfettete Sojabohnen, eine der organi-

87,7
85,4

sehen stickstoffhaltigen Quellen, dem Basismedium zugesetzt, so wird die Ausbeute geringer.

Die Bildung der Säureprotease in dem obigen Basismedium, welches zusätzlich mit je 1 % verschiedenen Ammoniumsalzen und Nitraten versetzt ist, wurde in Schüttelkultur 63 und 87 Stunden durchgeführt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Tabelle

Wirkung verschiedener Arten anorganischer Stickstoffverbindungen (1%)

als Zusatz zum Medium bei der Bildung der Säureprotease unter Verwendung von Aspergillus saitoi

ATCC 14332 (30⁰C, 140 UpM)

Stickstoffverbindungen

63 Stunden	pH	Protease	O. D.	Ausbeute	PH	87 Stunden	Ausbeute
	3,5		0,150	100	3,9	Protease	100
C/N	4,3		0,261	174	4,7	O. D.	174
3,15	3,9		0,229	153	4,4	0,181	138
1,07	4,1		0,199	132	4,8	0,334	165
1,22	3,6		0,181	124	4,1	0,275	166
0,87	4,0		0,058	39	3,6	0,328	142
1,65					4,1	0,330	149
1,22					4,0	0,282	132
1,42				3,8	0,269	122
1,55				4,2	0,239	124
1,64	3,8		44	0,244
1,48	4,2		73	0,246
		0,067
		0,018

Kontrolle ...

NH₄Cl

(NHU)₂SO₄ ..
NH₄NO₃ ...
(NH₄)H₂PO₄
(NHJ₂HPO₄
NaNO₃ ....

KNO₃

NH₄-Citrat .
NH₄-Tartrat

Aus dem Versuch ergibt sich, daß der Zusatz von Ammoniumsalz die Bildung der Säureprotease bei der kurzen Kultivierungsdauer von 63 Stunden im allgemeinen steigert und daß der Zusatz der anorganischen Stickstoffquelle nach einer 87stündigen Kultivierung durchweg eine um etwa 40 bis etwa 80% gesteigerte Ausbeute ergibt.

Es wurden bereits viele Untersuchungen zur Regelung des pH-Wertes bei der Kultivierung von Bakterienstämmen vorgenommen. Beispiele hierfür sind die Vergärung von a-Amylase aus Aspergillus niger NRRL-37 (E. H. Le M e η s e et al, J. Bact., 54,149 47), Säure-a-Amylase aus Aspergillus awamori var. fumeus (Minoda, J. of Agr. Chem. Soc. of Japan, 35, S. 479 und 481 [1961]), Protease aus Aspergillus oryzae (M. E. M a χ w e 11, Aust. J. Sei. Res. B 5, 42 [1952]) und Protease aus Aspergillus niger (G. G ο r b a c h und O.G. Koch, Arch, für Mikrobiol., 23, 265 [1955]).

Bezüglich der Wirkung des pH-Wertes auf die erfindungsgemäße Bildung der Säureprotease mit einem optimalen pH von 2,7 wurde folgendes gefunden: Die erfindungsgemäß hergestellte Protease mit einer Widerstandsfähigkeit gegenüber Säuren ist innerhalb eines breiten pH-Bereichs von 2,5 bis 6,0 stabil, wenn ein Substrat vorhanden ist (vgl. F. Yoshida und M. Nagasawa, Bull, Agr. Chem. Soc. Japan, 20, S. 257 [1956]). Die Änderungen des pH-Wertes in Abhängigkeit von der Zeit bei der erfindungsgemäßen Kultivierung von Aspergillus saitoi ATCC 14 332 wurde untersucht. Es wurde festgestellt, daß der pH-Wert im allgemeinen nach etwa 40 Stunden auf 3,0 bis 4,0 abnimmt und dann allmählich auf 5,0 ansteigt. Im Fall eines Zusatzes von Nitrat verzögert sich die Abnahme des pH-Wertes bis zu 40 Stunden. Ein Medium zeigt bei Zusatz eines physiologisch sauren, anorganischen und Stickstoff enthaltenden Salzes zur Säure und bei Zusatz eines entsprechenden physiologisch alkalischen Salzes zum Alkali hin. Es zeigt sich jedoch kein bemerkenswerter Wechsel in der erfindungsgemäßen Bildung der Säureprotease in einem Medium mit hochkonzentriertem Stickstoff unter Zusatz verschiedener Arten von anorganischen und Stickstoff enthaltenden Salzen.

Der pH-Wert bei der erfindungsgemäßen Bildung der Säureprotease ist so einzustellen, daß der AusgangspH-Wert etwa 6,0 beträgt. Der unterste pH-Wert wird etwa nach 40 Stunden erreicht und so gesteuert,. daß er nicht unter 2,5 absinkt. Die Kultivierung wird nach etwa 40 Stunden innerhalb des pH-Bereiches von 2,5 bis 6,0 ausgeführt. In diesem pH-Bereich ist die Säureprotease des Aspergillus saitoi ATCC 14 332 stabil.

Die Erfindung wird nun an Hand des folgenden technischen Ausführungsbeispiels weiter erläutert:

Beispiell

Die Enzymgewinnung wurde wie folgt durchgeführt: Zu 100 1 Wasser wurden 1,8 kg Weizenkleie und 1,2 kg entfettete Sojabohnen zugegeben. Das Gemisch wurde als Kontrollmedium verwendet. Das gleiche Gemisch wurde mit 1 kg NH₄Cl angereichert und als Testmedium verwendet. Kontroll- und Testmedien wurden einer herkömmlichen Sterilisierung unter Druck ausgesetzt und anschließend abgekühlt. Die abgekühlten Gemische wurden mit Aspergillus saitoi ATCC 14 332 geimpft und unter Belüftung und Rühren 80 Stunden lang bei 3O⁰C im Brutschrank gehalten. Nach der Kultivierung wurde die erzielte Kultur filtriert und das Filtrat auf geeignete Weise vermittels ausgesäuerten Wassers mit einem pH-Wert von 2,7 verdünnt. 1 cm³ der verdünnten Lösung wurde mit 1 cm³ 2%iger Kaseinlösung mit einem pH-Wert von 2,7 vermischt, und das Gemisch ließ man 10 Minuten lang bei 30° C ruhen. Dem Gemisch wurden 2 cm³ einer 0,4-m-Trichloressigsäure zugesetzt, um die Reak-

tionen im Gemisch abzustoppen, und anschließend wurde das Gemisch abfiltriert. Zu 1 cm³ des Filtrats wurden 5 cm³ 0,4molarer Natriumcarbonatlösung und anschließend 1 cm³ Folins Reagenz (5fache Verdünnung) zugesetzt. Das Gemisch ließ man 20 Minuten lang bei 30⁰C stehen. Die Protease-Aktivität des Gemisches wurde als optischer Adsorptionswert bei 660 ηΐμ unter Verwendung eines EPO-B-Photometers der Fa. Hitachi Ltd. gemessen.

Es ergaben sich folgende Daten:

5 '	Kontrollkultur	Testkultur	Zuwachs in %
Protease-Aktivität des Gesamt mediums	7,680 xlO5	13,368 xlO5	74

309 633/2

Claims (1)

1 2 . .

Im Rahmen der Erfindung wurde nun gefunden,

■ . daß bei Einsatz von Aspergillus saitoi ATCC 14 332

Patentanspruch: bei dem obigen Verfahren der USA.-Patentschrift

2 848 371 durch Zugabe von entfetteten Sojabohnen

Verfahren zum Herstellen säureresistenter Pro- 5 zu dem Medium, das Weizenkleie und entfettete

tease mit einem optimalen pH-Wert von etwa 2,7 Sojabohnen als Basisstoffe in einem solchen Verhältnis

durch aerobes Züchten eines Stammes von Asper- enthält, daß der C/N-Quotient etwa 3,2 beträgt, zwar

gillus saitoi in einem flüssigen Nährmedium, eine Verminderung des C/TV-Verhältnisses, aber keine

welches als Basisstoffe Weizenkleie und entfettete Vermehrung der Protease-Ausbeute erzielt werden

Sojabohnen enthält, dadurch gekenn- io kann (vgl. Tabelle 1). Züchtet man diesen Stamm hin-

zeichnet, daß man Aspergillus saitoi ATCC gegen in einem Nährmedium, das diese Basisstoffe

14 332 in einem Nährmedium, das diese Basisstoffe in einem Verhältnis entsprechend einem C/iV-Quotien-

in einem Verhältnis entsprechend einem CjN- ten von unter 3,2 enthält und dem weitere 0,25 bis

Quotienten von unter 3,2 enthält und dem weitere 3% anorganische Stickstoffverbindungen zugesetzt

0,25 bis 3,0% anorganischer Stickstoffverbindun- 15 wurden, so tritt überraschenderweise eine merkliche

gen zugesetzt werden, einsetzt. Verbesserung der Protease-Ausbeute ein (vgl. Tabelle 1).
Demgemäß besteht die vorliegende Erfindung in

einem Verfahren zum Herstellen säureresistenter Pro-

20 tease mit einem optimalen pH-Wert von etwa 2,7 durch aerobes Züchten eines Stammes von Aspergillus

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen saitoi in einem flüssigen Nährmedium, welches als säureresistenter Protease mit einem optimalen pH- Basisstoffe Weizenkleie und entfettete Sojabohnen Wert von etwa 2,7 durch aerobes Züchten eines Stam- enthält, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man mes von Aspergillus saitoi in einem flüssigen Nähr- 25 Aspergillus saitoi ATCC 14 332 in einem Nährmedium, medium, welches als Basisstoffe Weizenkleie und ent- das diese Basisstoffe in einem Verhältnis entsprechend fettete Sojabohnen enthält. · einem C/iV-Quotienten von unter 3,2 enthält und dem Es wurden bereits zahlreiche Untersuchungen über weitere 0,25 bis 3,0% anorganischer Stickstoffverbindie Bildung von Protease unter Verwendung von düngen zugesetzt werden, einsetzt.
Schimmel-Aspergillus vorgenommen, deren Aktivität ₃₀ Wie bereits dargelegt, ergibt sich aus der Tabelle 1, im neutralen bis alkalischen Bereich liegt. Bei der daß sich die Ausbeute nicht verbessern läßt, wenn Bildung von Protease, deren Aktivität und optimaler man das C/N-Verhältnis durch Zugeben von entpH-Wert bei annähernd 3,0 liegt und die gegenüber fetteten Sojabohnen als Stickstoffquelle zu dem Grund-Säuren widerstandsfähig ist, erhält man jedoch nur eine medium (Kontrolle) herabsetzt; tatsächlich tritt vielgeringe Ausbeute, und außerdem ist die Anzahl der 35 mehr eine Verminderung der Ausbeute ein. Setzt hierfür brauchbaren Aspergillus-Arten begrenzt. Es man dagegen das C/N-Verhältnis des Basismediums ist bekannt, daß einige Arten des schwarzen Asper- durch Zugeben einer anorganischen Stickstoffverbingillus Proteasen erzeugen, die annähernd eine säure- dung herab, so tritt eine beträchtliche Verbesserung resistente Protease mit einem optimalen pH-Wert der Ausbeute ein. Beispielsweise läßt sich eine Ausvon etwa 2,7 (2,5 bis 3,0) enthalten, und daß die säure- 40 beute von 128% erzielen, wenn man 0,25% Ammoresistente Protease durch ein bestimmtes Reinigungs- niumchlorid zu dem Basismedium (Kontrolle) (Taverfahren isolierbar ist (vgl. USA.-Patentschrift belle 1) zugibt. Hierdurch unterscheidet sich die Er-2848 371; F. Yoshida, BuI. Agr. Chem. Soc, Japan findung von dem Stand der Technik. Die Erfindung 20, 253 [1956]). beruht also nicht auf einer herkömmlichen Uber-Es gibt bis heute wenig systematische Untersuchun- 45 legung, derzufolge die Rohmaterialkosten durch Vergen über die Bildung der Protease mit dem optimalen wendung anorganischer Stickstoffverbindungen an pH-Wert von annähernd 3,0 und einer Säurewider- Stelle von entfetteten Sojabohnen gesenkt werden ' Standsfähigkeit mit Ausnahme dessen, daß G ο r b a c h sollen, sondern auf der überraschenden Tatsache, daß u. a. über die Bildung einer Protease durch Kultivie- durch Zusetzen einer anorganischen Verbindung zu rung von Aspergillus niger mit einem optimalen pH- 50 dem Basismedium (Kontrolle) eine Verbesserung der Wert von etwa 4,9 in Flüssigkeit berichtet haben Ausbeute eintritt; im Gegensatz hierzu tritt bei der (s. G. G ο r b ac h und O. G. Ko ch, Arch, für Mikro- bekannten Verwendung von entfetteten Sojabohnen biologie, 23, 265 und 284 [1955]). als Zusatz für das Basismedium eine Verringerung der

In der genannten USA.-Patentschrift 2 848 371 ist Ausbeute ein.

ein Verfahren zum Herstellen eines neuen proteoly- 55 Die Beziehung zwischen dem Verhältnis von Weizentischen Enzyms mit Hilfe von Aspergillus saitoi, kleie zu entfetteten Sojabohnen (als W: S bezeichnet) Aspergillus usamii und anderer schwarzer Aspergilli und das Verhältnis von C/N in dem Basismedium beschrieben. Dieses Enzym besitzt einen optimalen ergibt sich wie folgt:
pH-Wert von etwa 2,5 bis 3,0 und wird in einem W-S CIN

flüssigen Kulturmedium mit einem Gehalt von 3% 60 η <c τ ^ „7 · ΊΛ' V.,~ 1 <

«r ·' 11 · j in/ j * i-.-t.t- 0,6:2,4 entspricht etwa 1,5

Weizenkleie und von 2% entfetteten Sojabohnen er- , - _Λ - „.. * ■ _Ut . .,„ . ~_n

j. j ,-./»r 1; i_"n. · ^ ^ ο i_ ,. -· * τ-.· ■ 1,5:1,5 entspricht etwa 2,7

zeugt, dessen C/N-Verhältnis etwa 3,2 betragt. Die 18 · 12 entspricht etwa 3 15

damit erhaltenen Ergebnisse sind jedoch wegen der ^ \ J_{6 ents}£_{richt etwa} " ;■";;;;:;; _5>'_Ο

geringen Enzymausbeute noch unbefriedigend. ^r

Der vorliegenden Erfindung liegt deshalb die Auf- 65 Das C/N-Verhältnis der Kontrolle (Basismedium) gäbe zugrunde, eine Verbesserung des · genannten in den Tabellen gemäß der vorliegenden Beschreibung Verfahrens nach dieser USA.-Patentschrift zu er- gibt demzufolge auch die entsprechende Zusammenreichen, setzung des Basismediums, also das Verhältnis W: S,