DE1517835C - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von N-Acetylgtutamin - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein biotechnisches Verfahren zur Herstellung von N-Acetylglutamin durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in einem Kohlenhydrate, Stickstoffsubstanzen, Wuchsstoffe und Mineralsalze enthaltenden wäßrigen Nährmedium bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Werten.

Bisher wurde N-Acetylglutamin durch ein Fermentationsverfahren hergestellt, bei welchem Mikroorganismen, die zu den Gattungen Aerobacter, Proteus, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Micrococcus, Microbacterium, Arthrobacter, Streptomyces und Escherichia gehören, unter geeigneten Bedingungen gezüchtet werden und das erwünschte N-Acetylglutamin aus der sich ergebenden Kulturflüssigkeit gewonnen wird (s. japanische Patentschrift 18035/1965). Das in dieser Veröffentlichung beschriebene Verfahren ergibt jedoch einen hohen Anteil an Glutaminsäure im Vergleich zu N-Acetylglutamin, d. h., das N-Acetylglutamin wird als Nebenprodukt fortlaufend neben der Glutaminsäure produziert. Dementsprechend ist die erhaltene Konzentration an N-Acetylglutamin in der Kulturflüssigkeit niedrig und die erzielte Ausbeute an diesem Stoff sehr klein.

In Hakko To Taisha Nr. 7, S. 59 bis 66 [1963] (Zitat aus Chemical Abstracts, 60, 12629 h [1964]) wird die Gewinnung von N-Acetylglutamin durch Fermentation beschrieben, wobei eine auf Glucose bezogene Maximalausbeute von 13 bis 14% erhalten · wird, während die Ausbeuten an Glutaminsäure wesentlich höher liegen als jene des N-Acetylglutamins. Das bekannte Fermentationsverfahren ist daher in erster Linie als ein Verfahren zur Herstellung von Glutaminsäure aufzufassen, bei welchem N-Acetylglutamin als Nebenprodukt auftritt. Ziel der Erfindung war es jedoch, das Verhältnis von N-Acetylglutamin zu Glutaminsäure zugunsten des ersteren durch die Wahl geeigneter Bedingungen einzustellen, so daß N-Acetylglutamin in hoher Ausbeute erhalten werden kann.

Ähnlich verhält sich das in Chemical Abstracts, 63, 17099 b (1965) zitierte Verfahren gegenüber dem Erfindungsziel; auch dort besteht das Hauptprodukt aus Glutaminsäure, ganz abgesehen von einem völlig anders aufgebauten technischen Konzept.

Ziel der Erfindung war .die Entwicklung eines verbesserten Fermentationsverfahrens zur Herstellung von N-Acetylglutamin, das die Nachteile und Mangel der bisherigen Verfahren überwindet, das in einfacher und wirksamer Weise durchführbar ist, das N-Acetylglutamin durch Fermentation in hoher Konzentration und guter Ausbeute herzustellen gestattet und auch in großtechnischem Maßstab mit hoher Produktausbeute durchgeführt'werden kann.

Ausgehend von der biotechnischen Herstellung von N-Acetylglutamin durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in einem Kohlehydrate, Stickstoffsubstanzen-, Wuchsstoffe und Mineralsalze enthaltenden wäßrigen Nährmedium bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Werten ist die Erfindung nun dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Micrococcus glutamicus ATCC 21009, Micrococcus glutamicus ATCC 21010, Micrococcus glutamicus ATCC 21011 oder Brevibacterium ammoniagenes ATCC 21012 einsetzt und das Nährmedium 0,5 bis 0,8 Mol pro Liter Ammoniumionen sowie Chloridionen enthält.

Wenn die genannten Mikroorganismen gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren gezüchtet werden, liegt die hergestellte Menge an N-Acetylglutamin, die in dem Kulturmedium erhalten wird, im Bereich von etwa 30 bis 40 mg/ml. Dies entspricht einer Ausbeute von etwa 30% im Hinblick auf die verwendete Zuckermenge als Ausgangs-Kohlenstoffquelle. Außerdem ist festzustellen, daß als Nebenprodukte nur geringe Mengen an Glutaminsäure und Glutamin gebildet werden. Das Verhältnis von erhaltenem N-Acetylglutamin zu Glutaminsäure und Glutamin beträgt weniger als 3 bis 5:1, bezogen auf das Gewicht. Dies stellt eine besonders bemerkenswerte Wirkung dar. ♦ Um einige der Vorteile der vorliegenden Erfindung aufzuzeigen, ist nachstehend aus den Tabellen 1, 2 und 3 die Beziehung zwischen der Konzentration der Ammoniumionen und derjenigen der Chlöridionen, die angewendet wurde, in bezug auf die gebildete Menge an N-Acetylglutamin ersichtlich. Bei diesen Versuchen wurde Micrococcus glutamicus ATCC 21009 verwendet. Die Züchtung wurde durchgeführt unter aerobem Schütteln der Kultur in Kolben während eines Zeitraums von 72 Stunden. Die Zusammensetzung des verwendeten Nährmediums war folgende, wobei die Prozentangaben Gewichts/Volumprozent sind:

12,0% Glucose,
0,05% KH₂PO₄,
0,05% K,HPO₄,
0,05% MgSO₄-7H₂O,

0,002% MnSO₄-4H₂O, 0,002% FeSO₄-7H₂O, 0,5% Harnstoff, 4 bis 6 γβ Biotin.

Tabelle

(NH1J2SO4	NaCl	NH4 +	er .	N-AGM	Hergestellte Menge	Glutamin
%	% ■	(Mol/l)	(Mol/l)	30,2	Glutaminsäure	6,2
3,78	3,69	0,561	0,561	26,2	3,6	6,3
3,78	4,92	0,561	0,748	37,2	2,1	6,2
5,04	3,69	0.748	0,561	36,2	2,1	6,3
5,04	4,92	0,748	0,748	0,5

i O i / ODD

3 4

Es wurde bei den in Tabelle 1 aufgezeigten Versuchen Ammoniumsulfat als Quelle für die Ammoniumionen und Natriumchlorid als Quelle für die Chloridionen verwendet. Bei einer Konzentration der beiden Ionen in einer Menge von 0,5 bis 0,8 Mol pro Liter wird fast nur N-Acetylglutamin gebildet, wobei sich hohe Konzentrationen an N-Acetylglutamin in der Kulturflüssigkeit und dementsprechend eine hohe Ausbeute an dieser Verbindung, bezogen auf die Menge des verwendeten Zuckers, ergeben.

Tabelle 2

Menge an hinzugefügter Chloridionen enthaltender Verbindung

N-AGM

Hergestellte Menge (mg/ml)

Glutaminsäure Glutamin

3,78
3,78
3,78

KCl 4,0
CaCl₂ 3,0 4,0

27,2
23,3
28,6

4,1
4,0
2,9

4,8
5,4
6,2

Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse von Versuchen, bei denen das in Tabelle 1 aufgeführte Natriumchlorid durch Kaliumchlorid bzw. Calciumchlorid — als Quellen für Chloridionen — ersetzt wurde. Sonst wurden die Versuche in der gleichen Weise wie diejenigen der Tabelle 1 durchgeführt. Aus Tabelle 2 geht eindeutig hervor, daß die Ergebnisse in etwa die gleichen waren als im Falle der Verwendung von Natriumchlorid als Quelle für die Chloridionen.

Tabelle 3

NH₄Cl

3,0
4,0

NH₄ ⁺ , Cl"

(jeweils in
Mol/l)

0,561
0,748

Hergestellte Menge (mg/ml)

N-AGM

22,8

36,2

Glutaminsäure

3,9
1,2

3,6
4,8

Die in Tabelle 3 aufgeführten Versuche wurden ausgeführt unter Verwendung von Ammoniumchlorid sowohl als Quelle für die Ammonium- als auch für die Chloridionen. Sonst wurden die Versuche in der gleichen Weise wie diejenigen gemäß den Tabellen 1 und 2 durchgeführt. Aus Tabelle 3 geht klar hervor, daß neben der gebildeten großen Menge an N-Acetylglutamin nur wenig Nebenprodukt-Aminosäure gebildet wird.

Was die Zusammensetzung des anzuwendenden Nährmediums anbetrifft, so ist sowohl ein synthetisches als auch ein natürliches Nährmedium geeignet, solange es die für das Wachstum des verwendeten Mikroorganismus wesentlichen Nährstoffe enthält. Derartige Nährstoffe sind bekannt und enthalten in angemessenen Mengen Substanzen, wie beispielsweise eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen u. dgl, die von den Mikroorganismen ausgenutzt werden können. Als Kohlenstoffquelle seien beispielsweise erwähnt: Zucker, wie Glucose, Saccharose, Fructose, Mannose, Galactose, Maltose, Lactose, Xylose, Arabinose usw. sowie Stärke, verzuckerte Stärkelösungen u. dgl. Es kann eine einzelne Kohlenstoffquelle oder ein Gemisch aus zwei oder mehreren verwendet werden. Um eine Ammoniumionenkonzentration von 0,5 bis 0,8 Mol pro Liter zu erhalten, können verschiedene organische und anorganische Stickstoffverbindungen verwendet werden, wie beispielsweise Ammonium, Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumeitrat, Harnstoff u. dgl. Es können Chloride, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid usw., verwendet werden,· um die angegebene Menge an Chloridionen in dem Medium zu liefern. Wie jedoch aus Tabelle 3 hervorgeht, ist es vorzuziehen und hat sich speziell vom wirtschaftlichen Standpunkt aus als wirksam erwiesen, Ammoniumchlorid sowohl als Quelle für die Ammonium- als auch für die Chloridionen einzuset-

25- zen. Verschiedene natürliche Stickstoff enthaltende Substanzen können ebenfalls als Stickstoffquelle verwendet werden; hierzu gehören natürliche Stickstoffquellen, wie Pepton, Fleischextrakt, Maisquellwasser, Hefeextrakt, Caseinhydrolysate u. dgl. Es können auch Gemische aus verschiedenen derartigen Quellen

verwendet werden. -

Glutamin Außer den vorstehend genannten Nährstoffquellen

können auch anorganische Verbindungen der Phosphorsäure, wie Kaliumdihydrogenphosphat und Kaliummonohydrogenphosphat, sowie andere anorga-. nische Salze des Kaliums, Magnesiums, Mangans usw. verwendet werden. Als Beispiele hierfür seien genannt: Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat, Mangansulfat u. dgl. Es können auch Substanzen, die mindestens einen Teil der Nährstoffe, wie z. B. Biotin, Thiamin, Cobalamin usw., enthalten^ vorteilhaft und wirksam dem Züchtungsmedium hinzugefügt werden. Es*ist jedoch darauf hinzuweisen, daß der Zusatz von Zinkverbindungen zum Züchtungsmedium die Tendenz hervorruft, die Produktion von Glutamin zu beschleunigen und die Menge des hergestellten N-Ace-• tylglutamins wesentlich herabzusetzen. Daher sollte der Zusatz von Substanzen, die Zink enthalten, zum Nährmedium vorzugsweise.vermieden werden.

Die Züchtung gemäß vorliegender Erfindung wird ausgeführt unter aeroben Bedingungen, beispielsweise unter aerobem Schütteln oder unter Rühren bei einer Temperatur von etwa 24 bis 37° C, vorzugsweise 28 bis 33° C. Zu Beginn oder während der Züchtung ist es erwünscht, den pH-Wert des Mediums zwischen 5 und 9 und vorzugsweise nahe dem Neutralpunkt einzustellen. Es wurde gefunden, daß nach zwei- bis viertägiger Züchtung unter diesen Bedingungen sich N-Acetylglutamin in dem Fermentationsmediüm an-

60. gereichert hatte.

Nach vollständiger Fermentation kann das erhaltene N-Acetylglutamin aus der Fermentationsflüssigkeit abgetrennt werden, und zwar durch die üblichen Maßnahmen, wie z. B. Behandlung mit Ionenaustauscherharzen, Lösungsmittelextraktion, Ausfällen mit Metallsalzen, Chromatographie u. dgl. Als wirksames und vorteilhaftes Beispiel hierfür werden die Mikroorganismenzellen von der Fermentationsflüssig-

keit entfernt, und das Filtrat wird durch eine basische Anionenaustauscherharz-Säule gegeben. Es wird dann hieraus mit verdünntem Alkali oder einer verdünnten Säure eluiert. Das Eluat wird dann durch eine stark saure Ionenaustauscherharzsäule. geschickt, um sowohl das N-Acetylglutamin als auch irgendwelche Nebenproduktaminosäuren zu adsorbieren. Dann wird das physikalisch adsorbierte N-Acetylglutamin mittels Wasser herausgelöst. Die N-Acetylglutamin-Eluatfraktion wird unter vermindertem Druck konzentriert, um diese zu kristallisieren und auf diese Weise rohe Kristalle von N-Acetylglutamin zu erhalten.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern. Wenn nicht anders angegeben, handelt es sich bei den Prozentangaben um Gewichts/Volumprozent.

B e i s ρ i e 1 1

Ein Produktionsmedium von 181, das die folgenden Bestandteile enthält, wird hergestellt:

13,0% Glucose,
0,05% MgSO₄-7H₂O,
0,05% KH₂PO₄,
0,05% K₂HPO₄,
0,002% FeSO₄-7H₂O,
0,002% MnSO₄-4H₂O,
.' 5,0 y/1 Biotin,
1 mg/1 Thiaminhydrochlorid,
4,0% NH₄Cl,
0,3% Harnstoff.

Das NH₄Cl und der Harnstoff werden getrennt sterilisiert (distilled?).

Dieses Produktionsmedium wird in einen 30-1-Fermenter gegeben, und 2 1 Micrococcus glutamicus ATCC 21009 enthaltendes Impfkulturmedium wird hinzugefügt. Die Züchtung wird dann unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 30° C durchgeführt mit einem Belüftungsdurchsatz von 10 1 pro Minute und einer Rührgeschwindigkeit von 400 UpM. Der pH-Wert wird mit einer 18%igen wäßrigen Ammoniaklösung bis 16 Stunden nach Beginn der Züchtung auf 6,8 und sodann auf 6,5 eingestellt.

Die Konzentration des N-Acetylglutamins in der Fermentationsflüssigkeit nach 72stündiger Züchtung wird zu 33,8 mg/ml gefunden. Die gleichzeitig produzierte Menge an Nebenprodukt-Glutaminsäure beträgt 1,2 mg/ml und die des Nebenprodukt-Glutamins 0,3 mg/ml.'

Nach dem Filtrieren des Fermentationsmediums wird das Filtrat durch eine stark basische Anionenaustauscherharzsäule laufen gelassen. Das Filtrat wird dann mit 0,5n-H₂SO₄ eluiert, und das erhaltene Eluat wird durch eine stark saure Kationenaustauscherharzsäule geschickt. Daraus wird das N-Acetylglutamin mit Wasser herausgelöst. Die erhaltene N-Acetylglutaminfraktion wird konzentriert und unter vermindertem Druck kristallisiert, wobei 528 g roher Kristalle von N-Acetylglutamin erhalten werden. Diese Kristalle werden in heißem Wasser aufgelöst und mit Aktivkohle behandelt. Dann wird das Filtrat nochmals unter vermindertem Druck konzentriert und kristallisiert, wobei sich 423 g farbloser kristalliner Nadeln von N-Acetylglutamin ergeben.

B e i s ρ i e 1 2

Ein Produktionsmedium von 18 1, das aus den folgenden Bestandteilen besteht, wird in einen 30-1-Fermenter eingebracht:

13,0% Glucose,

0,05% :MgS.OV^;'7H₂O, i'

0,05%'KH₂PO₄,

0,05% K₂HPO₄,
ό 0,002% FeSO₄-7H₂O,

0,002% MnSO₄-4H₂O,

5,5 y/1 Biotin,

1 mg/1 Thiaminhydrochlorid,

4,0% (NHJ₂SO₄,
¹S 3,5% Calciumchlorid (CaCl₂),

0,3% Harnstoff.

2 1 des Brevibacterium ammoniagenes ATCC 21012 ' enthaltende Impfkultur werden zu diesem Produktionsmedium hinzugefügt. Die Züchtung wird dann bei' einer Temperatur von 30° C unter aeroben Bedingungen mit einem Belüftungsdurchsatz von 10 1 pro Minute und einer Rührgeschwindigkeit von 350 UpM durchgeführt. 24 Stunden lang nach Züchtungsbeginn wird der pH-Wert des Mediums mit einer 18%igen wäßrigen Ammoniaklösung auf 7,0 und sodann auf 6,4 eingestellt. Die Konzentration des N-Acetylglutämins in der Fermentationsflüssigkeit nach 60stündiger Züchtung beträgt 38,2 mg/ml. Gleichzeitig beträgt die erzeugte Menge an Nebenprodukt-Glutaminsäure 1,8 mg/ml und die des Nebenprodukt-Glutamins 3,6 mg/ml.

Die erhaltene Fermentationsflüssigkeit wird in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 beschrieben behandelt, und es werden daraus 595 g roher Kristalle von N-Acetylglutamin erhalten.

B'e i s ρ i e 1 3

Die Züchtung wird unter den gleichen Bedingungen und unter Verwendung des gleichen Produktionsmediums wie im Beispiel 1 beschrieben durchgeführt ,mit der Abwandlung, daß 2 1 Micrococcus glutamicus ATCC 21010 enthaltende Impfkultur zu dem Produktionsmedium hinzugefügt wurden. Nach Beendigung der Züchtung enthält die Fermentationsflüssigkeit 28,3 mg/ml N-Acetylglutamin, 2,0 mg/ml Glutaminsäure und 6,0 mg/ml Glutamin. Durch Behandlung der Fermentationsflüssigkeit in der . gleichen Weise wie im Beispiel 1 werden 340 g farbloser kristalliner Nadeln von N-Acetylglutamin erhalten.

Beispiel 4

Die Züchtung wird unter den gleichen Bedingungen und mit dem gleichen Produktionsmedium durchgeführt, wie im Beispiel 1 beschrieben, mit der Abwandlung, daß 2 1 Micrococcus glutamicus ATCC 21 011 enthaltende Impfkultur dem Produktionsmedium hinzugefügt werden. Nach beendeter Züchtung enthält die Fermentationsflüssigkeit 30,5 mg/ml N-Acetylglutamin, 2,1 mg/ml Glutaminsäure und 6,2 mg/ml Glutamin. Durch Behandlung der Fermentationsflüssigkeit in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 werden 350 g farbloser kristalliner Nadeln von N-Acetylglutamin erhalten.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur biotechnischen Herstellung von N-Acetylglutamin durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in einem Kohlenhydrate, Stickstoffsubstanzen,-Wuchsstoffe und Mineralsalze enthaltenden wäßrigen Nährmedium bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Werten, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Micrococcus glutamicus ATCC 21 009, Micrococcus glutamicus ATCC 21 010, Micrococcus glutamicus ATCC 21011 oder Brevibacterium ammoniagenes ATCC. 21 012 einsetzt und das 0,5 bis 0,8 Mol pro Liter Ammoniumionen sowie Chloridionen enthält.