DE1271062B

DE1271062B - Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von L-Prolin

Info

Publication number: DE1271062B
Application number: DEP1271A
Authority: DE
Inventors: Noboru Katsuya; Shimpachi Konishi; Shinji Okumura; Fumihiro Yoshinaga
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1964-04-20
Filing date: 1965-03-27
Publication date: 1968-06-27

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTS-GftLAND DEUTSCHES ÄlW PATENTAMT Int. α.:

C12d

AUSLEGESCHRIFT

Nummer:
Aktenzeichen:
Anmeldetag:
Auslegetag:

Deutsche Kl.: 6b-16/02

1271062
P 12 71 062.2-41
27. März 1965
27. Juni 1968

Die Erfindung bezieht sich auf ein einfaches biologisches Verfahren, L-Prolin in wirtschaftlich interessanten Mengen mit geringerem Kostenaufwand, als es bei den bislang üblichen konventionellen Methoden der Fall ist, aus leicht zugänglichem Ausgangsmaterial 5 unmittelbar herzustellen.

L-Prolin ist eine der für die Nahrung von Wirbeltieren und Menschen wichtigen Aminosäuren, nach der eine steigende Nachfrage für medizinische Zwecke und als Ergänzung zur Nahrung besteht.

Bislang wurde L-Prolin durch Isolierung aus Proteinhydrolysaten oder auf synthetischem Wege mittels der Methoden der organischen Chemie gewonnen. Eine Methode zur Herstellung von L-Prolin aus L-Glutaminsäure ist in Journal of Agriculural Chemical Society of Japan, No. 34, S. 782 bis 785 und 972 bis 975 (1960), beschrieben.

Es wurde gefunden, daß man L-Prolin im Fermentationsmedium in relativ großer Menge von 0,5 bis 1,5 g/100 cm³ anreichern kann, wenn man Brevibacterium flavum ATCC 15940 in einem L-Isoleucin, Brevibacterium flavum ATCC 15941 in einem L-Ornithin, L-Citrullin oder L-Arginin oder Brevibacterium flavum ATCC 15942 in einem L-Histidin enthaltenden üblichen Nährmedium unter aeroben Bedingungen und pH-Werten von 5,5 bis 8,0 züchtet.

Bei den gemäß Erfindung eingesetzten Mikroorganismen handelt es sich um auxotropeh Mutanten von Brevibacterium flavum ATCC 14067.

Das Medium, in dem die gemäß Erfindung benutzten Auxotrophe kultviert werden, muß Lieferanten für Kohlenstoff, Stickstoff und die üblichen Nährstoffe für das Wachstum der Mikroorganismen enthalten.

Als Lieferanten für fermentative Kohlenstoffverbindungen können Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose, Saccharose, Maltose, Stärke, Stärkehydrolysate, Melassen, organische Säuren, Alkohole usw., verwendet werden. Sie werden gewöhnlich in Konzentrationen von 5 bis 20 Gewichtsprozent auf das Glucoseäquivalent bezogen, eingesetzt.

Als Lieferanten für assimilierbaren Stickstoff, der für die L-Prolinproduktion benötigt wird, werden Ammoniak in wäßriger Lösung oder in Gasform, Harnstoff und Ammoniumsalze, wie Ammoniumphosphat, -nitrat, -acetat und -lactat, Aminosäuren, organische Basen sowie sonstige organischen Materialien, die Stickstoff enthalten, verwendet. Hiervon wird jedoch Ammoniumsulfat der Vorzug gegeben, das damit die besten Resultate erzielt werden.

Bei Verwendung von synthetischen Stickstofflieferanten, wie Ammoniak, Harnstoff oder Ammoniumsalzen muß je nach den eingesetzten erfindungs-Verf ahren zur mikrobiologischen Herstellung
von L-Prolin

Anmelder:

Ajinomoto Kabushiki Kaisha, Tokio

Vertreter:

Dr. W. G. Lotterhos

und Dr.-Ing. H. W. Lotterhos, Patentanwälte,

6000 Frankfurt, Annastr. 19

Als Erfinder benannt:

Shinji Okumura, Yokohama-shi;

Fumihiro Yoshinaga,

Shimpachi Konishi,

Noboru Katsuya,

Kawasaki-shi, Kanagawa-ken (Japan)

Beanspruchte Priorität:

Japan vom 20. April 1964 (22 008)

gemäßen Mutanten eine geeignete Menge an L-Isoleucin, L-Ornithin, L-Citrullin, L-Arginin oder L-Histidin in reiner Form oder in Form von Materialien, die diese Verbindung enthalten, zugesetzt werden.

Das L-Isoleucin, L-Ornithin, L-Citrullin, L-Arginin oder L-Histidin wird zweckmäßig in Mengen angewandt, daß seine Konzentration im Medium etwa 5 bis 30mg/100 ecm beträgt.

Organische Materialien, die das Wachstum der Mikroorganismen fördern und die L-Prolinproduktion beschleunigen, sind für die Erhöhung der Wirtschaftlichkeit des Verfahrens wichtig. Als Nährstoffe oder Wachstumsbeschleuniger werden verschiedene Vitamine, Fettsäuren, Hefeextrakte usw. angewandt.

Ferner werden einige anorganische Materialien für die Fermentation benötigt. Sie sollten Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Mangansulfat, Ferrosulfat usw. bilden.

Der Einfluß der spezifischen Nährstoffe: L-Isoleucin, L-Ornithin, L-Citrullin, L-Arginin oder L-Histidin auf das Verfahren gemäß Erfindung wird durch folgende Versuche veranschaulicht.

809 567/169

Brevibacterium flavum ATCC15940 wurde 63 Stunden bei 31,5°C in einem Schüttelkolben in einem wäßrigen Medium mit einem Gehalt an

Glucose 10%

(NHJ₂SO₄ 5,5%

KH₂PO₄ 0,1%

MgSO₄ · 7 H₂O 0,04%

Fe⁺+ 2 ppm

Mn⁺+ 2 ppm

Biotin 300 γ/1

Vitamin B₁ · HCl 200y/l

CaCO₃ (gefällt) 5%

das einen pH-Wert von 7 aufwies, in verschiedenen Ansätzen mit den in Tabelle 1 angegebenen Konzentrationen an L-Isoleucin kultiviert. Die Korrelation zwischen der Größe des Isoleucinzusatzes zum Medium nach der Fermentation wurde durch Bioversuch des Mediums mit Leuconostoc citrovorum ermittelt. Die Ergebnisse sind Tabelle 1 zu entnehmen.

Tabelle 1 zeigt, daß die L-Isoleucin-Konzentration im Kulturmedium im Bereich von etwa 5 bis 30 mg/ 100 ecm gehalten wird.

Die Beziehung zwischen initialer Ammoniumsulfatkonzentration und L-Prolinausbeute ist Tabelle 2 zu entnehmen.

	Tabelle	1	Konzentration an
	Konzentration an		L-Prolin
Nr.	L-Isoleucin		(g/100 ecm)
	(mg/100 ecm)		0,38
1	5		0,72
2	10		1,08
3	15		0,74
4	20		0,56
5	25		0,40
6	30

Eine analoge Konzentrationsspitze für das L-Prolin wird im Kulturmedium bei Verwendung der anderen spezifischen Nährstoffe mit Brevibacterium flavum ATCC 15941 oder ATCC 15942 in Konzentration zwischen 5 und 30 mg/100 cm³ erhalten. L-Ornithin, L-Citrullin, L-Arginin oder L-Histidin sind somit in etwa den gleichen Mengen anzuwenden, wie das für das L-Isoleucin gezeigt ist.

Die erhaltene L-Prolinausbeute hängt auch von der Menge des vorhandenen Ammoniumsulfats ab.

Der Einfluß der Ammoniumsulfatkonzentration im Kulturmedium auf die L-Prolinausbeute im Verfahren gemäß Erfindung wird in folgenden Versuchen gezeigt:

Brevibacterium flavum ATCC15940 wurde 72 Stunden bei 31,5°C in Schüttelkolben in wäßrigen Kulturmedien mit einem Gehalt an

Glucose 10%

KH₂PO₄ 0,1%

MgSO₄-7H₂O 0,04%

Fe⁺+ 2 ppm

Mn⁺+ 2 ppm

Biotin 300 y/1

Vitamin B₁ · HCl 200y/l

L-Isoleucin 15 mg/cm³

CaCO₃ (geföüt) 5%

das einen pH-Wert von 7 aufwies, in verschiedenen Einzelansätzen, die sich nur in der Ammoniumsulfatkonzentration unterschieden, der Fermentation unterworfen.

5	Nr.	Tabelle	2	gebildetes L-Prolin
		Ammoniumsulfat konzentration		(g/100 cm³)
	1	(%>		0,75
IO	2	2,0		0,85
	3	2,5		0,91
	4	3,0		1,01
	5	3,5		1,03
	6	4		1,12
15	7	5,0		1,20
	8	5,5		1,16
	9	6		0,95
	10	7,0		0,81
	11	7,5		0,70
ao	8,0

Tabelle 2 zeigt, daß es zweckmäßig ist, die Ammomumsulfatkonzentration im Kulturmedium im Bereich von etwa 2,0 bis 8,0% zu halten, um gute L-Prolinausbeuten zu erzielen. Bei den üblichen Fermentationsverfahren beträgt die Ammomumsulfatkonzentration etwa 2%> bei dem Verfahren gemäß Erfindung ist es jedoch zweckmäßig, das Ammoniumsulfat dem Kulturmedium in höheren Konzentrationen zuzusetzen.

Die pH-Regelung während der Fermentation ist beim Verfahren gemäß Erfindung sehr wichtig, da der pH-Wert einen großen Einfluß auf die Geschwindigkeit der Bildung des L-Prolins und dessen Ausbeute hat. Der pH-Wert sollte innerhalb des Bereichs von 5,8 bis 8,0 mit einem geeigneten Neutralisationsmittel, wie wäßrigem oder flüssigem Ammoniak (Ammoniak in allen Formen), Harnstoff, Calciumcarbonat oder kaustischem Alkali (Natrium- oder Kaliumhydroxyd), zur Erzielung einer guten Ausbeute gehalten werden. Die Fermentation wird unter aeroben Bedingungen, z. B. in einer Schüttelkolbenkultur, submerser Kultur unter Benutzung eines mit Vorrichtungen zur Belüftung und zum Rühren ausgerüsteten Tieftanks durchgeführt.

Die Temperatur sollte zum Erzielen einer guten

Ausbeute im Bereich von 24 bis 37° C gehalten werden.

Die Fermentationszeit beträgt gewöhnlich 2 bis

4 Tage, bis sich eine beträchtliche L-Prolinmenge im Medium angereichert hat.

Zur Bestimmung des L-Prolins des gemäß Erfindung erhaltenen Produktes, können die konventionellen Vergleichsteste, wie Rf-Werte, die Farbe bei der Papierchromatographie sowie die Methode des Bio-Versuchs, angewandt werden. Das Produkt gemäß Erfindung kann in einfacher Weise mittels des gelben Flecks bei der Papierchromatographie

(BuOH: CH₃COOH: H₂O = 4:1:2)

bestimmt werden, der bei dem Punkt Rf = 0,42 erscheint, oder mittels des Bioversuchs unter Verwendung von Leuconostoc citrovorum.

Zur Isolierung des L-Prolins aus dem Fermentationsmedium können nach Entfernung der Bakterienzellen eine oder mehrere der allgemein bekannten Methoden, wie die Ionenaustauschermethode, Fällungsmethode usw., angewandt werden.

Durch die folgenden Beispiele wird das Verfahren der Erfindung erläutert.

Beispiel 1

Für die Fermentation eingesetzter Mikroorganismus: Brevibacterium flavum ATCC 15940 (Auxotroph mit L-Isoleucin-Bedarf).

Zusammensetzung des wäßrigen Fermentationsmediums:

Glucose (bei der Schwefelsäure-Hydrolyse von Tapioca erhalten) ... 10 %

(NH₄)₂SO₄ 5,5%

KH₂PO₄ 0,1%

MgSO₄ · 7 H₂O 0,04%

Fe⁺+ 2 ppm

Mn⁺⁺ 2 ppm

L-Isoleucin 15,0 mg/

100 cm³

Biotin 450y/l

Vitamin B₁ · HCl 500y/l

pH 7

20-cm³-Ansätze des Mediums wurden getrennt in 500-cm³-Schüttelkolben 3 Minuten bei 110⁰C im Autoklav sterilisiert, danach 5% CaCO₃ zugesetzt, das getrennt durch Trockenerhitzen sterilisiert worden war, und das Medium mit den oben angegebenen Bakterien beimpft, die zuvor auf einer Bouillon-Agar-Schrägschnitte 24 Stunden bei 31° C kultiviert worden war.

Die Fermentation führte man 72 Stunden bei 31° C unter aeroben Bedingungen durch. Der Endgehalt an L-Prolin im fermentierten Medium betrug 1,51 g/100 cm³, wie die Bestimmung durch Bioversuch mit Leuconostoc citrovorum ergab.

Danach filtrierte man die Bakterienzellen vom fermentierten Medium ab und führte 11 des erhaltenen Filtrats durch eine mit einem starken Kationenaustauscherharz des Η-Typs gepackte Kolonne und eluierte das L-Prolin aus der Kolonne mit Salzsäure. Das Eluat führt man dann durch eine mit einem Anionenaustauscherharz gepackte Kolonne und dampfte das Eluat, das keine Salzsäure mehr enthielt, zur Trockene ein.

Das erhaltene getrocknete Material wurde mit Methanol extrahiert und aus der Methanollösung rohes kristallines L-Prolin mit Isopropanol ausgefällt.

Auf diese Weise wurden etwa 11,3 g rohes kristallines L-Prolin erhalten.

Beispiel 2

Für die Fermentation eingesetztes Mikroorganismus: Brevibacterium flavum ATCC 15941 (Auxotroph mit L-Ornithin-Bedarf).

Zusammensetzung des wäßrigen Fermentationsmediums:

Glucose (bei der Schwefelsäure-Hydrolyse von Tapioca erhalten) 10%

(NH₄)₂SO₄ 5,5%

KH₂PO₄ 0,1%

MgSO₄ · 7 H₂O 0,04%

Fe⁺+ 2 ppm

Mn⁺⁺ 2 ppm

L-Arginin 15,4 mg/

100 cm³

Biotin 300 γ/1

Vitamin B₁ · HCl 200y/l

pH 7

Die Fermentation wurde unter Verwendung des

oben angegebenen Mikroorganismus in der im Beispiel 1 angegebenen Weise durchgeführt. Nach Stunden Fermentation betrug die L-Prolinkonzentration im Medium nahezu 0,75 g/100 cm³.

Beispiel 3

Brevibacterium flavum ATCC 15942 wurde in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise auf einem wäßrigen Kulturmedium mit einem Gehalt an

Glucose (bei der Schwefelsäure-Hydrolyse von Tapioca erhalten) 10%

(NHJ₂SO₄ 5,5%

KH₂PO₄ 0,1%

MgSO₄ · 7 H₂O 0,04%

Fe⁺+ 2 ppm

Mn⁺+ 2 ppm

L-Histidin 8,3 mg/

100 cm³

Biotin 300 γ/1

Vitamin B₁ - HCl 200y/l

der Fermentation unterworfen.

Nach 72 Stunden Fermentation enthielt das Fermentationsmedium, wie gefunden wurde, L-Prolin in einer Konzentration von nahezu 0,54 g/100 cm³.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von L-Prolin, dadurch gekennzeichnet, daß man Brevibacterium flavum ATCC15940 in einem L-Isojeucin, Brevibacterium flavum ATCC

15941 in einem L-Ornithin, L-Citrullin oder L-Arginin oder Brevibacterium flavum ATCC

15942 in einem L-Histidin enthaltenden üblichen Nährmedium unter aeroben Bedingungen und pH-Werten von 5,5 bis 8,0 züchtet.