DE1442244C - Verfahren zur Herstellung von L-Glutamin durch aerobe Züchtung von Mikroorganismen - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von L-Glutamin durch aerobe Züchtung von MikroorganismenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiologischen Erzeugung von L-Glutamin.
Ein Verfahren zur wirtschaftlichen Erzeugung von L-Glutamin wird benötigt, da L-Glutamin ein sehr
wertvolles Heilmittel insbesondere zur Prophylaxe und Heilung von Magengeschwüren ist.
Es sind bereits mikrobiologische Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure bekannt, bei denen
aerob L-Glutaminsäure erzeugende Mikroorganismen . in Nährmedien, die Kohlehydrate, stickstoffhaltige
Substanzen und anorganische Salze enthalten, bei pH-Werten zwischen 6 und 9 und bei Temperaturen
zwischen 10 und 370C gezüchtet werden, wobei das
Nährmedium wenigstens 5 Gewichtsteile assimilierbaren Stickstoff pro 100 Gewichtsteile assimilierbaren
Kohlenstoff enthält (s. die USA.-Patentschriften 2 978 383, 2 987 384, 3 028 309 und 3 002 889). Auch
die Erfinder haben bereits früher Mikroorganismen entdeckt, die Glutaminsäure in hoher Ausbeute in
einem Nährmedium erzeugen, das ein Saccharoid und »o
Stickstoff quellen enthält; sie haben auch ein industrielles Verfahren zur Herstellung von Glutaminsäure
unter Verwendung dieser Mikroorganismen entwickelt (vgl. USA.-Patentschrift 3 003 925).
Es wurde nun gefunden, daß bestimmte Mikro-Organismen, nämlich Micrococcus glutamicus ATCC
14751 und ATCC 14752, L-Glutamin in bemerkenswerter Menge in dem bekannten Nährmedium für die
L-Glutaminsäureerzeugung mit wenigstens 5 Gewichtsteilen assimilierbaren Stickstoff pro 100 Gewichtsteile
assimilierbaren Kohlenstoff bilden.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von L-Glutamin durch aerobe Züchtung von Mikroorganismen
in einem Kohlenhydrate, Stickstoffsubstanzen und anorganische Salze enthaltenden Nährmedium
bei üblichen pH-Werten und Temperaturen, wobei im Nährmedium auf 100 Gewichtsteile assimilierbaren
Kohlenstoffs wenigstens 5 Gewichtsteile assimilierbaren Stickstoffs vorhanden ist, ist nun dadurch
gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismen Micrococcus glutamicus ATCC14751 oder ATCC
14752 verwendet. .
Bei der Durchführung des erfiaduogsgemäßen Verfahrens
werden die verschiedensten stärkehaltigen Materialien, wie Kartoffeln, Bataten, Weizen, Mais
u. dgl., die aus ihnen erhaltene Stärke, ihr verzuckerter Liquor, Rohrzucker, Glucose, Lactose, Melassen u. dgl.,
als Saccharoid eingesetzt. Als Stickstoffquellen können die verschiedensten anorganischen Stickstoffverbindungen,
wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat,
Ammoniumtartrat, Ammoniumacetat, Ammoniumhydroxyd, gasförmiges Ammoniak, aber auch organische Stickstoffverbindungen, wie Harnstoff
u. dgl., benutzt werden. Mit anderen Worten", es kann jede dieser Verbindungen benutzt werden, wenn
sie für den verwendeten Stamm verwertbar ist.
Die Fermentation wird unter aeroben Bedingungen z. B. unter Schütteln oder Rühren und Belüften durchgeführt.
Der geeignete Temperaturbereich für die Züchtung liegt zwischen 24 und 37°C, vorzugsweise
zwischen 28 und 330C.
Um L-Glutamin in hoher Ausbeute zu erhalten, wird vorzugsweise der pH-Wert des Nährmediums
durch Zusatz eines Neutralisierungsmittels zu Beginn oder während der Züchtung auf einen Wert zwischen
5,5 und 8,5 eingestellt. Als Neutralisierungsmittel kann gasförmiges oder wäßriges Ammoniak, ein Alkalihydroxyd
(Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd usw.), Ammoniumcarbonat, Calciumcarbonat, Calciumhydroxyd
usw., benutzt werden. Der Zusatz von Harnstoff zwecks Zuführung von Ammoniak und gleichzeitiger
Einstellung des pH-Wertes ist für die Erzeugung
von Glutamin besonders wirksam.
Nach einer Züchtungsperiode von 2 bis 3 Tagen hat sich in dem Fermentationsmedium als Hauptprodukt L-Glutamin angereichert. Die Brühe wird
filtriert, das im Filtrat enthaltene L-Glutamin an ein Ionenaustauscherharz adsorbiert und dann eluiert.
Anschließend wird das Eluat, während man es beinahe neutral hält, konzentriert, mit einem Alkohol versetzt
und gekühlt, wobei das Glutamin auskristallisiert; es wird dann durch Zentrifugieren abgetrennt und durch
Umkristallisieren weitergereinigt, um zu reinem Glutamin zu gelangen.
Die Ergebnisse von Versuchen, die die Beziehung zwischen der Menge des zugesetzten Ammoniumsalzes
und der Bildung von L-Glutamin und der von L-Glutaminsäure beim Einsatz eines der erfindungsgemäß zur
Verwendung gelangenden Mikroorganismenstämme, nämlich Micrococcus glutamicus ATCC 14751, aufzeigen,
sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.
| Zugesetztes | L-Glutamin | L-Glutaminsäure | Zellgewicht |
| Ammonium- | |||
| sulfat | mg/cetn | mg/cem | mg/cem |
| °/o | 2,0 | 20 | 10,0 |
| 1,0 | 5,4 | 11,0 | 11,0 |
| 2,0 | 7,0 | 8,0 | 11,0 |
| 3,0 | 10,0 | 3,0 | 10,0 |
| 4,0 | 12,0 | 2,0 | 12,0 |
| 5,0 | 13,0 | 1,0 | 11,3 |
| 6,0* | 14,0 | 2,0 | 11,4 |
| 7,0* | 13,0 | 1,0 | 11,4 |
| 8,0* | 16,0 | 3,0 | 10,0 |
| 9,0* | 15,0 | 2,0 | 10,0 |
| 10,0* | |||
*) Ammoniumsulfat wird nach dem Wachstum der Zellen
zugefügt
Bei diesen Versuchen wurde ein Medium der folgenden Zusammensetzung verwendet und 70 Stunden bei
300C geschüttelt.
Glucose 10,00/0
KH2PO1 0,05%
K2HPO4 0,05%
MgSO4 ·7Η,0 0,05%
MnSO4 · 4H,0 0,002%
FeSO4 · 7HaO 0,002%
Harnstoff 0,5%
Biotin 2,5 γ/1
(NH4)jSO4 in der Tabelle
Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, wird mit den erfindungsgemäß einzusetzenden Mikroorganismenstämmen
in einem Nährmedium, das wenigstens 5 Gewichtsteile assimilierbaren Stickstoff pro 100 Gewichtsteile
assimilierbaren Kohlenstoff enthält, hauptsächlich L-Glutamin gebildet.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren ist der Zusatz der überschüssigen Stickstoffmenge sowohl zu Beginn
der Züchtung oder auch nach Fortschreiten des Zellwachstums wirksam. Bei Anwendung einer besonders
hohen Konzentration von z. B. Ammoniumsulfat ist der Zusatz nach dem Fortschreiten des Zellwachstums
vorteilhafter. Wie bei der L-Glutaminsäureerzeugung
kann auch im vorliegenden Fall Biotin dem Nährmedium zugesetzt werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
B e i s ρ i e 1 1
Micrococcus glutamicus ATCC14751 wird in ein Nährmedium eingeimpft, das 2,0 °/0 Glucose, 1,0 %
Pepton, 0,5 % Fleischextrakt und 0,25 % NaCl enthält, und 24 Stunden unter Schütteln gezüchtet. Die erhaltenen
300 ecm Impfkultur werden zum Animpfen von 3 Litern Nährmedium der folgenden Zusammensetzung
in einem 5 Liter fassenden Fermentationsgefäß benutzt.
Glucose 10,0%
(NH4)2SO4 4,0%
KH2PO4 0,05%
K2HPO4 0,05%
MgSO4-7H2O 0,05%
MnSO4-4HaO 0,002%
FeSO4- 7HaO 0,002%
Harnstoff 0,5%
Biotin 2,5 y/1
CaCO3 2,0%
Das beimpfte Medium wird dann bei 30° C gehalten, wobei mit 600 Umdrehungen je Minute gerührt wird
und Luft durch das Medium mit einer Geschwindigkeit von etwa 3 Liter/Minute geleitet wird. In dem
Medium steigt der L-Glutamingehalt nach etwa 38 Stunden erheblich an und erreicht seinen Höchstwert,
nämlich 15 mg/ccm, nach 70 Stunden. Die zu dieser Zeit erzeugte Menge L-Glutaminsäure beträgt
7,0 mg/ccm. Das Fermentationsmedium wird dann filtriert, unter verringertem Druck bei neutraler
Reaktion konzentriert und durch Zusatz einer Säure auf einen pH-Wert von 3 bis 4 eingestellt, wodurch
L-Glutaminsäure aus der Brühe auskristallisiert. Nach Entfernung der Säure wird das L-Glutamin in der
Fermentationsflüssigkeit an einem Ionenaustauscherharz adsorbiert und dann eluiert. Das Eluat wird
konzentriert, mit Äthylalkohol versetzt und abgekühlt, wodurch 35 g L-Glutamin in Form roher Kristalle
anfallen.
Ein Nährmedium der folgenden Zusammensetzung in einem 2000-ccm-Erlenmeyerkolben wird mit Micrococcus
glutamicus ATCC14752 beimpft und unter Schütteln bei 30°C gezüchtet.
Glucose 10,0%
NH4Cl 4,0%
KH2PO4 0,05%
K2HPO4 0,05%
MgSO4-7H2O 0,05%
MnSO4-4H2O 0,002%
FeSO4 · 7H2O 0,002%
Harnstoff 0,5%
Biotin 1,0 y/1
Thiamin 1 mg/1
CaCO3 2,0%
Nach 72stündiger Züchtung macht die Menge des erzeugten L-Glutamins 23 mg/ccm aus. Bei der Behandlung
des Fermentationsmediums, wie im Beispiel 1 beschrieben, werden 5,0 g L-Glutamin erhalten.
Be i sp i el 3
»ο Die Züchtung nach Beispiel 1 wird wiederholt, nur
wird in dem Nährmedium eine Ammoniumsulfatkonzentration von 0,5 % gewählt, und das Ammoniumsulfat
wird dem Medium nach der Fortpflanzung der Zellen (20 Stunden nach Beginn der Züchtung) zugesetzt,
um die Konzentration auf 6% zu bringen. Nach 3tägiger Züchtung sind 18 mg/ccm L-Glutamin erzeugt
worden.
B e i spi el 4
Unter Verwendung von 4,0 °/o NH4Cl an Stelle von
(NH4)2SO4 in dem Medium des Beispiels 1 wird eine
Züchtung wie im Beispiel 1 durchgeführt, wobei der pH-Wert im Fermentationsmedium durch Zusatz von
Harnstoff oder Ammoniakgas geregelt wird. Nach 72stündiger Züchtung ist L-Glutamin in einer Menge
von 25 mg/ccm erzeugt worden.
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur Herstellung von L-Glutamin durch aerobe Züchtung von Mikroorganismen in einem Kohlehydrate, Stickstoffsubstanzen und anorganische Salze enthaltenden Nährmedium bei üblichen pH- und Temperaturverhältnissen, wobei im Nährmedium auf 100 Gewichtsteile assimilierbaren Kohlenstoffs wenigstens 5 Gewichtsteile assimilierbaren Stickstoffs vorhanden sind, d adurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismen Micrococcus glutamicus ATCC 14751 oder ATCC 14752 verwendet.
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