DE1442207A1 - Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsaeure durch Verwendung von Bakterien - Google Patents

Description

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ASAHI EASSI KOGIO KAJTJSHIKIKAISHA Ko. 25—1» 1—ehome, Do j inta— hamadori, Kita-ku, Osaka City/ JAPAN

Yerfahren zur Herat ellung von L-G-lutaminsäure durch Verwendung" von Bakterien

Die vorliegende Erfindung "betrifft ein Yerfahren zur Herstellung von Ir-Glutaminsäure durch Verwendung von Bakterien und insbesondere betrifft die Verbindung ein Verfahren zur Herstellung von !-Glutaminsäure, das dadurch gekennzeichnet ist, daß Mikroorganismen, die zu spezifischen Wachstumsfaktoren erfordernden Mutantenarten von Mikrobakterium ammoniaphilum gehören, wobei diese Arten aus den Hypoxanthin erfordernden

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Mutantenarten, den Hypoxanthin- und L-Histidin erfordernden Mutantenarten, und den L-Arginin erfordernden Mutantenarten bestehen, in ein Nährkulturmedium, das Kohlenhydrate, Stickst off quellen, anorganisches Material und andere Wachstumsfaktoren enthält, eingeimpft werden und das Medium unter aeroben Bedingungen fermentiert wird, ura die L-G-lutaminsäure darin anzureichern.

Die hauptsächlichste Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, durch Verwendung eines billigen Kohlenhydratmaterials ein neuartiges, wirtschaftliches Verfahren zur Herstellung von L—Glutaminsäure in einem industriellen Produkt!onsmaßstab zu schaffen. Es sind bisher unter Verwendung von Fermentationsmethoden verschiedene Untersuchungen zur Herstellung der L-Glutaminsäure durchgeführt worden, und Mikrobakterien, die zum Mikrobakterium, Corynebakterium, Brevibakterium und Mikrococcus genera gehören, sind als typische L-Glutaminsäure herstellenden Bakterien, die in diesen Fermentationsmethoden verwendet werden, bekannt gewesen. Es muß darauf hingewiesen werden, daß es eine allgemeine Eigenschaft dieser Mikrobakterien ist, daß sie mehr oder weniger Biotin als unentbehrlichen ■'.-. Wachstumsfaktor benötigen. Wenn jedoch die oben genannten Mikrobakterien bei der f ermentativen Herstellung der L- Glut amins au— re benutzt werden, ist eine kritische Kontrolle des Biotin-.

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gehaltes in einem Kulturmedium äußerst wichtig, und ein überschüssiger Gehalt an Biotin wird "bei der Herstellung der L-Glutaminsäure mehr Schaden als Gutes anrichten. Aus diesem Grunde waren in diesen Methoden eine unerläßliche Bedingung, die Konzentration des Biotins im Kulturmedium unter für das maximale Wachstum der angewendeten Bakterien der erforderlichen Menge zu halten·

Weiterhin sind in diesen Verfahren, die den herkömmlichen Typ der !»-Glutaminsäure herstellenden Bakterien verwenden, die meisten Kulturmedien, die rohes Kohlenhydratmaterial, wie z.B. Abfallmelassen, enthalten, wegen des recht höheren Biotingehaltes in diesen Medien selten verwendet worden. Ganz in der jüngsten Zeit sind einige Permentationsmethoden, die diese Eohkohlenhydratmaterialien verwenden mit der Absicht vorgeschlagen worden, antimikrobiologische Mittel zu verwenden oder durch einen weiteren Schritt diese Rohmaterialien zu reinigen. Jedoch sind keine Versuche gemacht worden mit solchen Mikroorganismen, wie sie in dieser Erfindung beschrieben werden, zu fermentieren: die spezifische Wachstumsfaktoren erfordernden Mutantenarten, insbesondere die Hypoxanthin-, L-Histidin- oder L-Arginin erfordernden L-Glutaminsäure erzeugenden Bakteriene Während des Verlaufes der Untersuchungen der physiologischen Eigenschaften der Hypoxanthin- und L-Histidin erfordernden Arten des Mikrobakterium ammoniaphilum,

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welches als Biotin erforderndes L-Grlutaminsaure erzeugendes Bakterium bekannt ist, haben die Erfinder festgestellt, daß eine größere Menge von !»-Glutaminsäure selbst in einem Kulturmedium,, welches überschüssige Mengen an Biotin enthält, angereichert werden kann, wenn man die Vorsorge getroffen hat, daß die beiden Faktoren Hypoxanthin oder !-Histidin auf einem Niveau gehalten werden, das geringer ist als die für das maximale Wachstum des obenerwähnten Bakteriums in dem Kulturmedium notwendige Menge. Ausgehend von den obengenannten, neuen Entdeckungen haben die Erfinder·ebenfalls nach einem ausgedehnten Studium der Kultivierungsbedingungen bei der !Permentati onsher st ellung von L-Glutaminsäure, wobei solche Mikroorganismen wie die Hypoxanthin erfordernde Art, die L-Histidin erfordernde Art und diese beide Paktoren erfordernde Art verwendet wurden, herausgefunden, daß eine wirksame L-GIutanri.nsäure-3?ermentation durchgeführt werden kann, und daß man die obengenannten Mikroorganismen benutzen kann, ohne daß man durch die Gegenwart von überschüssigen Mengen an Biotin im Kulturmedium beeinflußt wird· Ähnliche Untersuchungen wurden mit der L-Arginin erfordernden Art durchgeführt. Die Erfinder haben festgestellt, daß eine wirksame L-Glutaminsäure-Fermentation in einem Kulturmedium durchgeführt werden kann, das überschüssige Mengen an Biotin enthält, indem man die Mengen des L-Arginins in diesem Medium steuert·

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Die "vorliegende Erfindung wurde auf der Grundlage dieser neuen Entdeckungen gemacht· Jede Mutantenart von MSrobakterium anmoniaphilum, die in dieser Erfindung benutzt wird, hat die gleichen mikrobiologischen Eigenschaften wie die in den bekannten Veröffentlichungen beschriebenen Arten, ζ·Β· das ^panische Patent 315 731 (Anmeldungsveröffentlichung Nr. 34 254/ 1959)f ausgenommen die besonderen Erfordernisse dieser Wachstumsfaktoren.

Das Wesentliche der vorliegenden Erfindung liegt darin, daß die Mikroorganismen, die aus Hypoxanthin, L-Hi s ti din, Hypoxanthin- und !!»-Histidin und L-Arginin erfordernde Arten, die sich vom Mikrobakterium ammonia philum ableiten, bestehen, in Kulturmedien eingeimpft werden, die eine bestimmte Menge eines spezifischen Wachstumsfaktors enthalten, der von der entsprechenden Art erfordert wird, und daß die Medien unter aeroben Bedingungen fermentiert werden, um bemerkenswerte Mengen von L-Glutaminsäure darin anzureichern· In den lallen, in denen eine Hypoxanthin erfordernde Art angewandt wird, muß die Menge des Hypoxanthins im Kulturmedium auf einem niedrigeren Niveau sein, als die für das Wachstum des Bakteriums erforderliche Menge» Ähnlich müssen, wenn eine L-Histidin erfordernde Art verwendet wird, die Mengen des L-Histidin im Kulturmedium geringer sein als die für das maximale Wachstum des Bakteriums erforderlichen Mengen· Im Falle, daß man die Hypoxanthin und die L-Histidin erforderjiArt verwendet, muß

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einer der Faktoren oder beide unter der für das maximale Wachstum der Bakterien erforderlichen Menge liegen. Unter gewöhnliclien Arbeitsbedingungen, wenn die !-Arginin erfordernde Art als Mikroorganismus verwendet wird, liegt die bevorzugte Menge des Arginins in einem Kulturmedium bei etwa 0,1 bis 2,0 mg/ml.

Entsprechend dem Verfahren der= vorliegenden Erfindung können solche Kulturmedien, die überschüssige Mengen an Biotin und ihnen ähnliche Verbindungen enthalten, insbesondere Medien,· die Rohkohlenhydratmaterialien als Kohlenstoff^uelle enthalten, erfolgreich für eine Produktion von L—Glutaminsäure im Industriemaßstab verwendet werden, ohne daß irgendwelche antibakteriellen Mittel zu dem Kulturmedium zugesetzt werden müssen, oder die rohen Kohlenhydrate gereinigt werden müßten»

Die in der Erfindung verwendeten Mikroorganismen, d.h.· die Hypoxanthin, die !-Histidin, die Hypoxanthin- und L-Histi- . din und die L-Arginin erfordernde Art der Mikrobakterium ammoniaphilum-G-attung können vom Mikrobakteriüm ammoniaphilum als guter Stamm abgeleitet werden, dessen mikrobiologischen Eigenschaften In Einzelheiten in der Beschreibung der japanischen Patentanmeldung, Veröffentlichung 2988/1964· beschrieben sind, in dem eines der üblichen Verfahren benutzt wird, um die Mutantenarten aus der ursprünglichen Art zu erhalten, z»B. können die Mutantenarten durch Bestrahlung der Mikroorganismen

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mit ultravioletten Strahlen, J -Strahlen, oder Röntgenstrahlen erhalten werden oder durch Behandlung mit chemische Mutationen erzeugende Chemikalien, wie z.Bc Stickstofflost, 2-Amminopurin, salpetrige Säure und ähnliche, und durch anschließende Auswahl der erwünschten Arten unter Verwendung von Penicillin.

Wie oben beschrieben, erreicht die vorliegende Erfindung das Ziel, L-Grlutaminsäure selbst in einem Medium, das überschüssige Mengen an Biotin enthält, anzureichern, indem man die spezifische Wachstumsfaktoren erfordernde Mutantenart, die sich vom Mikrobakterium ammoniaphilun ableitet, verwendet, und deshalb ist die Verwendung solcher Mutantenarten, wie die Hypoxanthin, die L-Histidin, die Hypoxanthin und L-Histidin und die !-Arginin erfordernde Art eine unerläßliche Bedingung der vorliegenden Erfindung. Außerdem ist der Gehalt an solchen Wachstumsfaktoren wie Hypoxanthin, L-Histidin und L-Arginin in solchen Kulturmedien ebenfalls sehr wichtig," da eine wirksame L-Glutaminsäure-Fermentation mit solchen Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung in einem solchen Medium durchgeführt werden kann, da man nicht in der lage ist, eine ursprüngliche Art durch Einstellung der Mengen eines jeden Wachstumsfaktors, der im Kulturmedium vorhanden ist, zu benutzen.. Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Kulturmedium besteht für gewöhnlich aus Kohlenstoffquellen, die aus Kohlenhydratmaterialien, Stickstoffquellen, anorganischen Salzen und aus einer geeigneten Menge von Wachstumsfaktoren, die von den verwendeten Mikroorganismen erfordert werden und

ähnlichen beruhen,

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In der Erfindung werden Kohlenhydratmaterialien, wie z.B. Rübenzuckermelassen, Rohrzuckermelassen, ihre Abfallmelässen, Rohrzucker und Stärkehydrolysatflüssigkeiten bevorzugt verwendet, jedoch können auch andere Materialien wie Glucose, Fructose, Maltose und Sucrose ebenfalls "benutzt werden. Obgleich die^wirksamste Konzentration der Kohlenhydratmateria- ■ lien im Kulturmedium "bei 5-7 Gew.$ (berechnet als Glucose) liegt, können ebenfalls höhere Konzentrationen "benutzt werden. Wenn hohe Konzentrationen an Kohlenhydraten verwendet werden, können gute Ergebnisse erzielt werden, wenn man das Kohlenhydrat allmählich'in kleinen Portionen zugibt. Die in dieser Erfindung verwendeten Stickstoffquellen sind anorganische und organische Ammoniumsalze, Harnstoff, Ammoniak, Fleischextrakte, Peptone, Hefeextrakte, kornweiche' Flüssigkeit, verschiedene Proteinhydrolysate und ähnliches. Die Stickstoffquellen können zu dem Kulturmedium zugefügt werden, wenn das Kulturmedium angesetzt wird oder sie können kontinuierlich zugegeben werden. Jedoch erhält man die besten Ergebnisse, wenn man Ammoniak, das als Stickstoffquelle dienen soll, kontinuierlich, zugibt und den pH-Wert des Mediums gleichzeitig steuert. In einem herkömmlichen Verfahren zur Herstellung von !-Glutaminsäure durch" Fermentation, muß der Biotingehalt, wenn man eine natürliche Substanz als Stickst of f quelle verwendet, in einem Kulturmedium sorgfältig gesteuert werden, während eine .solche Steuerung in der vorliegenden Erfindung absolut unnötig ist ο Jedoch muß im Verfahren der Erfindung der Gehalt

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solcher Faktoren wie Hypoxanthin, L-Histidin und L-Arginin sorgfältig entsprechend dem Typus der verwendeten Mutantenart gesteuert werden.

Wenn Melassen als Kohlenstoffquelle verwendet werden, ist es fast unnötig, irgendwelche anorganische Salze, außer Kaliumphosphat im Medium zu ergänzen* Jedoch wird im allgemeinen vorgezogen, zu dem Medium der vorliegenden Erfindung verschiedene anorganische Salze zuzugehen, um solche Ionen, wie ζ·Β· Phosphor-, Kalium-, Magnesium-, Eisen-, Mangan- und Kalziumionen darin zu erhalten.

Wie man hei den herkömmlichen L-Glutaminsäure-Fermentationsverfahren sieht, müssen solche Kulturmedien unter aerohen Bedingungen fermentiert werden. Der pH-Wert ist ein wichtiger Faktor während des Verlaufes der Fermentation und "besonders "bei einem industriellen Maßstab der Herstellung kann vorgezogen werden, den pH-Wert in einem Bereich zwischen 6,8 und 8,5 zu halten, um die Ausheute an Produkt zu verbessern. Was die beim Verfahren dieser Erfindung angewandte Temperatur betrifft, so kann ein ähnlicher Bereich wie die der herkömmlichen Verfahren zufriedenstellend und vorzugsweise benutzt werden· Das Kulturmedium muß weiterhin durch ein Nährmaterial, z.B. Hypoxanthin, L-Histidin, L-Arginin,' ihre entsprechenden Derivate und natürlich vorkommenden Substanzen, die diese ent-

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sprechend dem Typus der verwendeten Mikroorganismenart enthält, ergänzt werden, da die Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung für ihr Wachstum' eine dieser Materialien erfordern. Zum Beispiel muß im lalle der Hypoxanthin erfordernden Art zu dem Kulturmedium Hypoxanthin zugesetzt werden, um das Wachstum der Bakterien zu sichern, jedoch kann das Hypoxanthin durch Xanthin, Guanin oder einer Mischung davon, falls erwünscht, ersetzt werden_o

Da rohes Kohlenhydratmaterial kaum irgendwelche feststellbaren Mengen an Wachstumsfaktoren enthält, muß das Medium mit bestimmten Mengen eines passenden Wachstumsfaktors ergänzt werden, um so in einem maximalen Ausmaß die !»-Glutaminsäure anzureichern.

In diesen Fällen hat die verwendete Menge solcher Zusätze wie Hypoxanthin, !-Histidin, L-Arginin, einen großen Einfluß auf die Fermentationsausbeute der !-Glutaminsäure, und deshalb müssen ihre Mengen sorgfältig in den folgenden Bereichen gesteuert werden: wenn Hypoxanthin erfordernde Arten oder !-Histidin erfordernde Arten als Fermentations-Mikroorganismus verwendet werden, sollten die Mengen an Hypoxanthin oder an !-Histidin in einem Kulturmedium auf einem Niveau sein, das niedriger ist· als das, welches für das maximale Wachstum eines jeden Mikroorganismus erforderlich ist. Die Mengen

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können abhängig vom Typus der einzelnen Arten mehr oder weniger verändert werden, jedoch sollte fUr gewöhnlich weniger als 150^g/ml "betragen. Die besten Ergebnisse erhält man mit einer Menge, die zwischen etwa 50 und lOOl-im/ml liegt. Werden die Hypoxanthin und L-Histidin erfordernden Arten verwendet, dann dann mußj wie oben beschrieben, fast dieselbe Menge an Wachstumsfaktor zu dem Kulturmedium zugefügt werden. Im Falle der Verwendung der L-Arginin erfordernden Art ist es bekannt, daß die vorhandenen Bakterienmengen in einem Kulturmedium nach der Fermentation in Gegenwart einer höheren Konzentration von L-Arginin eher abnehmen als zunehmen. Deshalb sind im Verfahren dieser Erfindung die Mengen des L-Arginins im Kulturmedium auf etwa eine Menge begrenzt, die für das maximale Wachstum der Bakterien notwendig ist. So liegt die optimale Konzentration von L-Arginin in einem Kulturmedium "bei etwa 0,1-2,0 mg/ml.

Wie schon oben erwähnt, besteht ein enger Zusammenhang zwischen der angewandten Menge an Bakterienwachstumsfaktor und der Ausbeute an L-GrIutaminsäure. Ein dies zum Ausdruck bringendes Beispiel wird' unten gezeigt, um solch einen Zusammenhang im einzelnen zu erklären.

Hypoxanthin erfordernde Art ASB-1743 Hy.

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Hypoxanthin Zusatzmengen ( g/ml)	0 0.15	20	50	100 5.80	200 - — 6.80
Wachstumsgrad (optische Dichte, 610 m )		0.84	3.20	18.2	9.4
L-GIutaminsäure Anreicherung (mg/ml)	2.8	11.4

Kulturmedium:
Glukose

Harnstoff
Ammoniumsulfat

MnSO

FeSO
L-Cystin
Biotin
(pH 6.8)

4 ' ^7H2°

5$

0.3/0 .1.296 0.15$ 0.05$ 0.001$

0.001$ 0.005$

30 Hg/1

Wenn solche Rohkohlenhydratmaterialien wie Abfallmelassen, welche typische, billige Kohlenstoffquellen sind, zu dem Kulturmedium als hauptsächliche Kohlenstoffquelle zugesetzt werden, dann können so· hergestellte Medien vergleichsweise eine höhere Konzentration an Biotin enthalten. Demzufolge wurden solche Medien, die Abfallmelasse enthalten, kaum für die Herstellung der D-Glutaminsäure mit einer herkömmlichen Art der L-GIutaminsäure erzeugenden Bakterien verwendet.

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Werden Abfallmelassen verwendet, so erfordert die herkömmliche Methode andere Verfahrensschritte, wie z.B. die Reinigung des HohkohlenhyÄratmaterials und ähnliches. Die vorliegende Erfindung erfordert im Gegenteil keine dieser schwierigen Verfahrensschritte UBÄ die einfache Zugabe einer kleinen Menge einer spe-* zifisohen Verbindung, die durch die verwendeten Bakterien erfordert wird, macht es möglich, solche Medien zu verwenden, um die erwünschte !-Glutaminsäure in einer höheren Menge darin anzureichern, ohne daß die Übe rschußmengen an Biotin im Medium "beachtet werden müssen. Nimmt man die L-Histidin erfordernde Art als Beispiel, dann wird der Zusammenhang zwischen dem Biotingehalt und der Anreicherung an !-Glutaminsäure in dem folgenden Kulturmedium unten in der Tabelle aufgezeigt:

	Mutterart (Μ· JHmBO1Ti a-n^^ T"™^	I Angerei cherte L- Glutamin- säure (mg/ml)	L-Histidin erfordernden Arten (ASB-1743Hy.)	Angerei cherte L- Glutamin- saure (mg/ml)	L-Histidin	0.005$
		6.8	L-Histidin 0.01$	10.0	Wachstums grad (optische Dichte bei 610 Βΐμ)	Angerei cherte L- Glutamin- ; säure ! (mg/ml)
Biotin ziusatz- oiengen	Waohstums- grad (optische Dichte bei 610 ιαμ)	16.7	Wachstums·» grad (optische Dichte bei 610 ιαμ)	4.7	2.5	13.0
2	• 2.5	2.0	2.7	13.7	I 2.5	4.5
4	6.3	—	2.6	17.3	3.8	11.8
10	10.4	—	4.3	16.5	4.9	15.7
20	9.6	5.4	5.3	15.0
30	10.0	5.0

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Kulturmedium:	5/
Glukose	' 0.3/
KH2PO4	1.2/
Harnstoff	0.1/
Ammoniumsulfat	0.05/
MgSO4 . 7H2O	• 0.001/
MnSO. * 4Ho0 4 c.	0.001/
FeSO4 · 7H2O	0.01/ oder 0.05/
L-Histidin	0.005/ -
Ii-Gystim	in der Tabelle)
Biotin (angeführt
(pH 6.8)

Die Fermentation ist innerhalb einer Zeit von 30-60 Stunden beendet, manchmal erfordert si· eine längere Zeit, jedoch kann in dem Verfahren der Erfindung keine Zersetzung der erzeugten L-Glutaminsäure beobachtet werden. Nachdem über bestimmte Zeiträume fermentiert wird, wird die Fermentationsbrühe filtriert oder zentrifugiert, um die Bakterienzellen zu entfernen. Das Filtrat oder die überstehende Flüssigkeit wird konzentriert, mit einer Säure wird der pH-Wert auf 3*2 eingestellt, und man läßt die entstehende Flüssigkeit in einem Kühlschrank stehen, damit daraus die L-Glutaminsäure ausfällt. Andere bekannte 7erfahren_s wie z.B. die Tonenaustausch-Haramethode _t können ebenfalls für die Abbrennung der L-G-Iubaminsäure aus dem FiI-brafe verwendet //ercien. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird in den folgenden Beispielen erklärt.

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Beiapiel 1

Das IPermentationsmedium, das aus. der folgenden Zusammensetzung "bestand, wurde in diesem Beispiel verwendet:

G-lukose	5 g/dl
EH2PO4	0.3 g/dl
Harnstoff	1.2 g/dl
Ammoniumsulfat	0.1 g/dl
MgSO4 . 7H2O	0.05 g/dl
MnSO4 · 4H2O	0.001 g/dl
FeSO4 · 7H2O	0.001 g/dl
L-Cystin	5 mg/dl
Biotin	30 μ g/l
Hypoxanthin	100 μ g/ml

Mikrobakterium ammoniaphilum ASB-148O Hy. (Hypoxanthin erfordernde Art) wurde 20 Stunden lang in einem gewöhnlichen Bouillon-Medium, das 1 Gew.$ Glucose enhielt, vorgezüchtet und die entstehenden Bakterienzellen wurden mit sterilem Wasser gewaschen. Eine Serie von 500 ml Sakaguohi-Kolben, von denen jeder 100 ml des oben, erhaltenen Fermentationsmedium enthielt, wurden auf einen pH-Wert von 6,7 eingestellt, sterilisiert und dann mit den oben erhaltenen, gewaschenen Zellen beimpft, so daß aie 5 x 10' Zellen/ml enthielten. Die Medien wurden unter Schütteln bei 30⁰C fermentiert. 68 Stunden nach Beginn der Fermentation erreichten die angereicherten Mengen an !-Glutaminsäure im Medium eine Konzentration von 22,3 mg/ml. Die kombinierte Permen-

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tationsbrühe wurde dann filtriert, um die Bakterienzellen zu entfernen und 5oo ml des Filtrates wurden auf 75 ml eingeengt.

Durch Zugabe von Salzsäure wurde der pH-Wert der eingeengten

sie Filtrate auf 3»2 eingestellt und man ließ/über Nacht in einem Eisschrank stehen, um daraus die' L-GIutaminsäurekristalle ausfallen zu lassen. Die Niederschläge wurden abgetrennt, getrocknet und'ergaben 9»8 g rohe L-GIutaminsäurekristalle.

Beispiel 2:

Die Keimkulturen und das Fermentationsmedium, die folgende Zusammensetzung hatten, wurden in diesem Beispiel verwendet!

Keimkulturmedium Fermentations-

medium

Abfall Melasse ( 52$ Zuckerkonzentration)	8	g/eil	13 g/dl
Harnstoff	0	.8 g/dl	1.4 g/dl
KH2PO4	0	.2 g/dl	0.2 g/dl
MgSO4- 7H2O ■	0	.05 g/dl	.0.05 g/dl
(KHj0SO. 4 2 4		-	0.1 g/dl
Hypoxanthin	5	mg/dl	5 mg/dl

Mikrobakterium ammoniaphiIum ASB-1918 Hy. (Hypoxanthin erfordernde Art), aufgewachsen auf einer Bouillon-Agar-Schräge, wurde in das obige Keimkulturmedium, das einen pH-Wert von 6|8 hat, eingeimpft, und 24 Stunden lang unter Schütteln bei 30⁰C kultiviert. Eine Serie von 5Ό0 ml Sakaguchi-Kolben, von denen jeder 75 ml des obigen ]?_ermentationsmediums, das einen

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pH-Wert von 7»Ο hat, enthielt, wurde 5 Minuten lang bei 12o°C sterilisiert und dann mit 1,5 ml der oben beschriebenen Keimkultur beimpft. Dieses Medium wurde unter Schütteln bei 3O⁰C fermentiert. 72 Stunden nach Beginn der Fermentation erreichten die Mengen der angereicherten Glutaminsäure 3125 g/dl.

Die Behandlung der Fermentationsbrühe nach derselben Art und Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, ergab rohe L-Glutaminsäurekristalle.

Beispiel 3

In diesem Beispiel wurde ein Fermentationsmedium benutzt, das dieselbe Zusammensetzung wie in Beispiel 1 hat, jedoch wurde das Hypoxanthin durch L-Histidin ersetzt. Mikrobakterium ammoniaphilum ASB 6731 Hi. (Histidin erfordernde Art) wurde in eine Serie der Fermentationsmedien eingeimpft und in derselben Art wie unter Beispiel 1 beschrieben, fermentiert. Nach 67 stiindiger Fermentation erreichten die Mengen der in den Medien angereicherten !-Glutaminsäure 20,7 mg/ml.

Die Behandlung der Fermentationnbrühe in derselben Art und Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, ergab rohe L-Glutaminsäurekristalle.

Beispiel 4

In diesem Beispiel wurde ein Fermentationsmedium benutzt, das folgende Zusammensetzung hatte:

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Stärkeversuckerte Lösung

(als Glukose "berechnet) . 7 g/dl

Harnstoff 1.2. g/dl

Amiaoniumsulfat 0.1 g/dl

MgSO₄. 7H₂O 50 mg/dl

MnSO₄. 4H₂O 1 mg/dl

FeSO.. 7H₂O 1 mg/dl

L-Cystin 5 mg/dl

Biotin 30μg/l

!-Histidin TO mg/dl

(vor dem Sterilisieren pH mit Natriumhydroxyd auf 7,0 eingestellt).

Mikrobakterium ammoniaphilum ASB 6913 Hi.(Histidin erfordernde Art) wurde in einem, gewöhnlichen Bouillon-Medium, das 1 Glucose enthält, 6 Stunden lang unter Schütteln bei 3O⁰C keimkultiviert. Eine Serie von 500 ml Sakaguchi-Kolben, von denen jeder 75 ml des obigen Mediums enthielt, wurden 5 Minuten lang bei 120 G sterilisiert, mit 1,5 ml der wie oben beschriebenen Keimkultur beimpft und die Medien wurden unter Schütteln bei 30⁰C fermentiert. 68 Stunden nach Beginn der Fermentation erreichten die im Medium angereicherten Mengen an L-Glutaminsäure 3,17 g/dl.

Die Behandlung der Fermenationsbrühe in derselben Art und Weise wie unter Beispiel Ί beschrieben, ergab rohe L-Glutaminsäurekrisballe.

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In diesem Beispiel wurde ein Fermentationsmedium» das folgende Zusammensetzung hatte verwendet: '

Glukose 5 g/dl

Harnstoff 1.2 g/dl

Anrnioniumsulfat 0.1 g/dl

MgSO₄ . 7H₂O 50 mg/dl

MnSO₄ .4H₂O 1 mg/dl

FeSO₄ .7H₂O 1 mg/dl

L-Cystin 5 mg/dl

Biotin 3Qxg/l

L-Arginin 120 mg/dl

Mikrobakterium ammoniaphilum ASB-3941 Ar.(L-Arginin erfordernde Art) wurde in einem gewöhnlichen Bouillon-Medium, das 1 Gew.$ Glukose enthält, 20 Stunden lang bei 30⁰G keimkultiviert. Eine Serie von 500 ml Sakaguchi-KoIben, von denen jeder 75 ml des oben erwähnten Mediums mit einem pH-Wert von 7,0 enthielt, wurden bei 120⁰C 5 Minuten lang unter Druck sterilisiert. Die Medien wurden dann mit 1,5 Liter der, wie oben beschrieben, hergestellten Keimkultur beimpft und unter Schütteln bei einer Temperatur von 30⁰C fermentiert. 68 Stunden nach Beginn der Fermentation erreichten die im Medium angereicherten Mengen an L-GIutaminsäure 2,08 g/dl.

Die Behandlung der Fermentation3brUhe in derselben Art und Weise wie unter Beispiel 1 beschrieben, ergab rohe L-Gltfcamin-

3äurekristalle.

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Beispiel 6

In diesem Beispiel wurden eine Saatkultur und ein Fermentationsmedium verwendet, die folgende Zusammensetzung hatten:

Keimkultur- Fermentationsmedium medium

Abfallmelasse 4.0 g/dl 7 g/dl

(als Gesamtzucker)

Harnstoff ' 0.8 g/dl 1.4 g/dl

KH₂PO₄ 0.2 g/dl 0.2 g/dl

MgSO₄. 7H₂O 50 mg/dl 5 mg/dl

(WH₄)₂S0₄ -' - 0v1 g/dl

L-Argininhydrochlorid 100 mg/dl 160 mg/dl

Mikrobakterium ammoniaphilum ASB-4670 Ar. (L-Arginin erfordernde Art) wurde in dem obenerwähntem Keimkulturmedium 24 Stunden lang bei 30⁰C kultiviert. Eine Serie von 500 ml Sakaguchi-Kolben, von denen jeder 75 ml des obenerwähnten Fermentationsmedium enthielt, wurden sterilisiert und dann mit 1,5 ml der wie oben beschrieben Keimkultur beimpft, und die Medien wurden unter Schütteln bei einer Temperatur von 30⁰O fermentiert. 50 Stunden nach Beginn der Fermentation erreichten die im Medium angereicherten Mengen an L-GIutaminsäure 3»07 g/dl.

Die Behandlung der Fermentationsbrühe in derselben Art und Weise wie unter Beispiel 1 beschrieben, ergab rohe L-GIutamjLn- * säurekristalle·

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Claims (7)

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von !-Glutaminsäure durch Verwendung von Bakterien, dadurch gekennzeichnet, daß die Bakterien, die zu einer spezifische Wachstumsfaktoren erfordernden Art der Spezies Mikrobakterium ammoniaphilum gehören_t wobei diese Arten zur Hypoxanthin erfordernden Art, zur L-Histidin erfordernden Art, zur Hypoxanthin und L-Histidin erfordernden Art und zur Ir-Arginin erfordernden Art gehören, in das Kulturmedium eingeimpft werden, das Kohlenhydratmaterial eine Stickstoffquelle, anorganische Salze, Biotin und den Wachstumsfaktor der durch diese Bakterien erfordert wird, enthält, wobei die Menge des Biotins größer ist als diejenige, die für das maximale Wachstum der Bakterien erforderlich ist, und die Menge des Wachstumsfaktors geringer ist als diejenige Menge, die für das maximale Wachstum der Bakterien erforderlich ist, und daß das Medium unter aeroben Bedingungen kultiviert wird, um die L-G-Iu taminsäure darin anzureichern.

2· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in ihm die Mikrobakterium ammoniaphilum ASB-14-80 Hy.-Art als einen spezifische Wachstumsfaktor erfordernde Art verwendet wird.

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3· "Verfahren nach. Ansprach 1, dadurch gekennzeichnet, daß in ihm die Mikrobakterium ammoniaphilum ASB-1918 Hy.-Art als einen spezifischen Wachstumsfaktor erfordernde Art verwendet wird.

4. Verfahren nach Ansprach 1, dadurch gekennzeichnet, daß in ihm die Mikrobakterium ammoniaphilum ASB-6731 Hi»-Art als einen spezifischen Wachotumsfaktor erfordernde Art verwendet wird.

5ο Verfahren nach Ansprach 1, dadurch gekennzeichnet, daß in ihm die Mikrobakterium ammoniaphilum ASB-6913 Hi.-Art als einen spezifischen Wachstumsfaktor erfordernde Art verwendet wird·

6β Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in ihm die Mikrobakterium ammoniaphilum ASB-3941 Ar„-Art als einen spezifischen Wachstumsfaktor erfordernde Art verwendet wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1_S dadurch gekennzeichnet, daß in ihm die Mikrobakterium ammoniaphilum ASB-4670 Ar_o-Art als einen spezifischen Wachstumsfaktor erfordernde Art verwendet wirdo

8ο Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß in ihm Abfallmelasse als Kohlenhydratmaterial verwendet werden_e

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