DE1767940B2 - Verfahren zur herstellung von l- threonin durch mikroorganismen in einem naehrmedium - Google Patents

Description

20 Tabelle I

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von L-Threonin durch Mikroorganismen in einem Nährmedium.

Aus der US-PS 30 99 604 ist bekannt, daß gewisse Mikroorganismen L-Threonin in einem L-Homoserin enthaltenden Medium als Substrat erzeugen können. Die Schwäche dieses Verfahrens besteht darin, daß die Kosten von L-Homoserin, das als Hauptrohstoff verwendet wird, höher sind als diejenigen von anderen Kohlenstoffquellen. wie Zuckern. Es ist auch bekannt, daß gewisse Mutantenstämme von Escherichia coli, die Diaminopimelinsäure und Methionin für ihr Wachstum erfordern, und gewisse Mutantenstämme von Micrococcus glutamicus, die Methionin und Lysin für ihr Wachstum benötigen, L-Threonin in einem Medium durch Gärung erzeugen können.

Aufgabe der Erfindung ist die Herstellung von Threonin mit niedrigen Kosten aus leicht zur Ver fügung stehenden Rohstoffen. L-Threonin ist eine der essentiellen Aminosäuren für die Ernährung von Tieren. L-Threonin ist bei medizinischen Versuchen als Zwischenprodukt bei der Herteilung von anderen Verbindungen, die wertvoll für biochemische Zwecke und als Zusatzstoff für Nahrungsmittel von Bedeutung sind, verwendet worden.

Es ist gefunden worden, daß gewisse Stämme von der Gattung Brevibacterium und der Gattung Corynebacterium, die gegenüber Ä-Amino-/3-hvdroxyvaleriansäure resistent sind, die Fähigkeit haben, beträchtliche Mengen von L-Threonin in einem einfachen Medium zu erzeugen und anzusammeln.

Das Verfahren gemäß der Erfindung zur Herstellung von L-Threonin durch Mikroorganismen in einem Nährmedium ist dadurch gekennzeichnet, daß man einen Threonin erzeugenden, gegenüber «-Amino-/J-hydroxyvaleriansäure widerstandsfähigen Stamm aus der Gruppe von Brevibacterium flavum ATCC 21 269 und Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 21 270 unter aeroben Bedingungen in einem Medium züchtet, das assimilierbare Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Substanzen und wachstum-Konzentration von
a-Arnino-fMiydroxyvalerinasäure (mg/ml)

Relatives Wachstum

Brevibacterium Brevibacterium flavum flavum

ATCC 21 269 ATCC 14 067

0 100 100
0,5 98 81

1 100 48

2 86 22

3 89 22

4 89 21

5 85 8

Bemerkung:

Die Gärung wurde bei 3O⁰C unter Verwendung von 3 ml des nachstehend angegebenen Mindestmediums mit einem Gehalt von «-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure in den in Tabelle I angegebenen Mengen durchgeführt.

Nach 24 Stunden Gärung wurde jedes Wachstum untersucht.

Mindestmedium:

Glucose 5 g/l

Harnstoff 1,5 g/l

(NH₄)₂SO₄ 1,5 g/l

K₂HPO₄ 3,0 g/l

KH₂PO₄ 1,0 g/l

MgSO₄ 0,1 g/l

CaCl₂ 0,001 g/l

Biotin 30 μ^Ι

Vitamin B₁ 100 pg/l

Spurenelemente*) 1 ml/1

pH 7,0

*) Spurenelemente schließen ein:

Na₁B₄O₇ · 10H₂O 88 mg/1

(NH,).Mo,O„ · 4H.0 37 mg/1

FeCI,-6 H,0 970 mg/1

Z_nSO₄ · 7H₁O' 8800 mg/1

CuSO₄ · 5 H₅O 270 mg/1

MnCl, -4H₈O 72 mg/1

Aus den Ergebnissen in Tabelle I ist ersichtlich, daß das Wachstum von üblichen Mikroorganismen beträchtlich gehemmt wurde, wenn «-Amino-/?-hydroxyvaleriansäure zu einem Medium in einer Menge

3 4

von mehr als 0,5 mg/ml zugegeben wurde, daß jedoch Beispiel 1

das Wachstum der Mutanten mit der Widerstands- Es wurde ein Kulturmedium der folgenden Zu-

fähigkeit gegenüber «-Amino-ZJ-hydroxyvaleriansaure sammensetzung hergestellt;

durch den Zusatz einer solchen Menge von a-Amino- Kohlenstoffauelle

/ϊ-hydroxyvaleriansäure nicht herabgesetzt wurde. 5 (_siehe Tabelle II) 10 V

Das bei der Herstellung von L-Threonin gemäß dem Ammoniumsulf at WWWW. 4%

Verfahren nach der Erfindung verwendete Nähr- oder Kaliumdihydrogenphosphat 0,3%

Kulturmedium kann ein völlig übliches sein. Es muß Magnesiumsulfat ........ 0,04%

eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine assimilier- Biotin 300 iigJl

bare Stickstoffquelle und die üblichen Nährstoffe in xo Vitamin B 200 ug/1

geringen Mengen enthalten. Die Kohlenstoffquellen, pe+⁺ * 2 Teile/Million

die zur Verwendung bei dem Verfahren gemäß der Mn⁺+ 2 Teile/Million

Erfindung geeignet sind, sind Glucose, Maltose, Sojabohnenproteinhydrolysat

Fructose, Stärkehydrolysat und Melassen. Organische (Gesamtstickstoff 2,2 g/dl) .. 0,2 ml/dl

Sauren, wie Essigsaure und Citronensäure, Alkohole x₅ Cakiumcarbonat

und Kohlenwasserstoffe, werden auch als Kohlenstoff- (getrennt sterilisiert) 5 °/

quellen verwendet. Eine Stickstoffquelle kann durch

Ammoniumsalze von anorganischen Säuren wie 20-ml-Mengen des obengenannten Mediums wurden

Ammoniumsulfat und Ammoniumchlorid oder durch ⁱⁿ 500-.nl-Schüttelflaschen eingebracht und durch

Ammoniak in wäßriger Lösung oder in gasförmigem ao Wasserdampf in den Flaschen bei 110⁰C 5 Minuten

Zustand vorgesehen sein. Organische Verbindungen sterilisiert. Brevibacterium ftavum ATCC 21269

wie Aminosäuren, Harnstoff oder Proteinhydrolysat ^{wurde in diese} Gärungsmedien eingeimpft und unter

können auch verwendet werden. Die anorganische aeroben Bedingungen bei 3O⁰C 48 Stunden lang

Substanz kann aus einem Phosphat, einem Calcium- gezüchtet. Die Menge an angesammeltem L-Threonin

salz, einem Magnesiumsalz, einem Eisensalz, einem a₅ injeder gezüchteten Brühe ist aus Tabelle II ersichtlich.

Mangansalz od. dgl., wie dies üblich ist, bestehen. Tabelle II

Nährstoffe und andere Substanzen die für das TTT, ä—7< Z '■ i

,„ . . , .. . , uuuiuiiKii, UiC lur u«i:> Kohlenstoffquelle Konzentration angesammeltes

Wachstum der Mutanten notwendig sind, sollen in L-Threonin g/l)

dem Kulturmedium vorhanden sein. Die Wachstums-

fördernden Mittel und anderen Nährstoffe, welche die 30 ^Gluc°se ¹⁰% 6,4

Ausbeute und das Ausmaß bzw. die Geschwindigkeit Maltose 10% 5,5

der Erzeugung von L-Threonin verbessern, sind z. B. Saccharose 10% 4,4

Aminosäuren, verschiedene Vitamine, Sojabohnen- Fructose 10% 3 8

C^eCaSS"at":r'■ ¹^"-""-- "*■ „ Z„c_kToh_T,_aSS„ !0-/I

Die Gärung oder Fermentation wird zwischen ^{( Ulucose)}

20 und 4O⁰C während etwa 24 bis 72 Stunden unter Die Zellen wurden von der Garbrühe mit einem

aeroben Bedingungen unter Schütteln oder Belüftung Gehalt von 6,4 g/l L-Threonin durch Zentrifugieren

und Rühren ausgeführt, wobei der pH-Wert des abgetrennt, und die Flüssigkeit wurde durch eine Säule

Mediums zwischen 5 und 9 eingestellt wird. Wenn der 40 von Kationenaustauscherharz (Η-Type) nach Ent-

pH-Wert des Mediums unter 5,0 zu fallen sucht, wird fernung don Ammoniak und Kohlensäure geführt,

er vorzugsweise durch Verwendung von Neutrali- 4,6 g des reinen L-Threonins in kristalliner Form

sierungsmitteln, wie Cakiumcarbonat und wäßrigem wurden aus 1 Liter der Brühe erhalten.

Ammoniak eingestellt. Wenn andererseits organische . .

Säuren als Kohlenstoffquellen verwendet werden, 45 B e 1 s ρ 1 e 1 2

neigt der pH-Wert des Mediums zum Steigen, und Es wurde ein Kulturmedium der folgenden Zu-

vorzugsweise wird er dann innerhalb des genannten sammensetzung hergestellt:

Bereichs durch die Verwendung der organischen Glucose 10°/

Säuren und eines Neutralisierungsmittels, wie Salzsäure Ammnnium«'iifat W

⁰^eSn^^L^ßT^i„ausderZüchtun_gs-⁵° S«" JS» brühe kann nach bekannten Verfahren erfolgen. Die Magnesiumsulfat 0,04 /

Bakterienzellen können durch Filtrieren oder Zentri- Vitamin B 300 uf/l

fugieren entfernt werden, und L-Threonin kann durch _Fe++ 2 Teile/Million

Anwendung von kationischem Austauschharz der 55 Mn⁺* 2 Teile/Million

ätör:

τ»· t> Γ? j ■ j η «1 , Calciumcarbonat Die Bestimmung des in der Brühe angesammelten i_eetrennt sterilisiert) 5°/

L-Threonins wurde durch Mikrobioversuch der An- 60 ^eirenni sieriiisienj 3/₀

wendung von Streptococcus faecalis ATCC 8043 aus- Mengen von 20 ml des obengenannten Mediums

geführt. Das Produkt gemäß der Erfindung wurde als wurden in 500-ml-Schüttelflaschen eingebracht und

L-Threonin durch Beweglichkeit bei Elektrophorese, durch Wasserdampf bei 110° C 5 Minuten sterilisiert,

biologische Aktivität im Mikrobioversuch und Rf- Das Medium wurde mit Corynebacterium acetoacido-Wert-Bestimmung bei Papierchromatographie identi- 65 philüm ATCC 21 270 geimpft, und die Gärung wurde

fiziert. unter aeroben Bedingungen bei 3O⁰C 64 Stunden

Die Erfindung wird anhand der nachstehenden ausgeführt. Die Menge an in der Gärungsbrühe

Reisniele näher erläutert. angesammeltem L-Threonin betrug 3,6 g/l.

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von L-Threonin durch Mikroorganismen in einem Nährmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Threonin erzeugenden, gegenüber jt-Amino-/?-hydroxyvaleriansäure widerstandsfähigen Stamm aus der Gruppe von Brevibacterium flavum ATCC 21269 und Corynebacterium acetoacidophilum i» ATCC 21270 unter aeroben Bedingungen in einem Medium züchtet, das assimilierbare Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Substanzen und wachstumfördernde Substanzen enthält und auf einem pH-Wert in dem Bereich von 5 bis 9 gehalten wird, und das erzeugte L-Threonin gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die assimilierbare Kohlenstoffquelle aus Kohlenhydraten und organischen Säuren gewählt ist und daß der assimilierbare Stickstoff aus wäßriger Ammoniaklösung oder gasförmigem Ammoniak, Ammoniumsalzen oder Harnstoff besteht.

25 fördernde Substanzen enthält und auf einem pH-Wert in dem Bereich von 5 bis 9 gehalten wird, und das erzeugte L-Threonin gewinnt.

Von den bei dem Verfahren gemäß der Erfindung zur Anwendung gelangenden Mikroorganismen kann Brevibacterium flavum ATCC 21269 aus Brevibacterium flavum ATCC 14 067 durch künstliche Mutation ernalten werden, und Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 21270 kann aus Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13 870 durch künstliche Mutation hergestellt werden.

Tabelle I zeigt die Änderung des Wachstums gemäß den verschiedenen Konzentrationen von a-Amino-/?-hydroxyvaleriansäure in dem auf Brevibacterium flavum ATCC 21269 geprüften Kulturmedium als Beispiel dieser widerstandsfähigen Stämme und ihres Elternstammes Brevibacterium flavum ATCC14 067 ais Beispiel von empfindlichen Stämmen.