DE1767940B2 - Verfahren zur herstellung von l- threonin durch mikroorganismen in einem naehrmedium - Google Patents
Verfahren zur herstellung von l- threonin durch mikroorganismen in einem naehrmediumInfo
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Description
20 Tabelle I
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von L-Threonin durch Mikroorganismen
in einem Nährmedium.
Aus der US-PS 30 99 604 ist bekannt, daß gewisse Mikroorganismen L-Threonin in einem L-Homoserin
enthaltenden Medium als Substrat erzeugen können. Die Schwäche dieses Verfahrens besteht darin, daß die
Kosten von L-Homoserin, das als Hauptrohstoff verwendet wird, höher sind als diejenigen von anderen
Kohlenstoffquellen. wie Zuckern. Es ist auch bekannt, daß gewisse Mutantenstämme von Escherichia coli,
die Diaminopimelinsäure und Methionin für ihr Wachstum erfordern, und gewisse Mutantenstämme
von Micrococcus glutamicus, die Methionin und Lysin für ihr Wachstum benötigen, L-Threonin in
einem Medium durch Gärung erzeugen können.
Aufgabe der Erfindung ist die Herstellung von Threonin mit niedrigen Kosten aus leicht zur Ver
fügung stehenden Rohstoffen. L-Threonin ist eine der essentiellen Aminosäuren für die Ernährung von
Tieren. L-Threonin ist bei medizinischen Versuchen als Zwischenprodukt bei der Herteilung von anderen
Verbindungen, die wertvoll für biochemische Zwecke und als Zusatzstoff für Nahrungsmittel von Bedeutung
sind, verwendet worden.
Es ist gefunden worden, daß gewisse Stämme von der Gattung Brevibacterium und der Gattung Corynebacterium,
die gegenüber Ä-Amino-/3-hvdroxyvaleriansäure
resistent sind, die Fähigkeit haben, beträchtliche Mengen von L-Threonin in einem einfachen Medium
zu erzeugen und anzusammeln.
Das Verfahren gemäß der Erfindung zur Herstellung von L-Threonin durch Mikroorganismen in einem
Nährmedium ist dadurch gekennzeichnet, daß man einen Threonin erzeugenden, gegenüber «-Amino-/J-hydroxyvaleriansäure
widerstandsfähigen Stamm aus der Gruppe von Brevibacterium flavum ATCC 21 269 und Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 21 270
unter aeroben Bedingungen in einem Medium züchtet, das assimilierbare Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen,
anorganische Substanzen und wachstum-Konzentration von
a-Arnino-fMiydroxyvalerinasäure (mg/ml)
a-Arnino-fMiydroxyvalerinasäure (mg/ml)
Relatives Wachstum
Brevibacterium Brevibacterium flavum flavum
ATCC 21 269 ATCC 14 067
0 100 100
0,5 98 81
0,5 98 81
1 100 48
2 86 22
3 89 22
4 89 21
5 85 8
Bemerkung:
Die Gärung wurde bei 3O0C unter Verwendung
von 3 ml des nachstehend angegebenen Mindestmediums mit einem Gehalt von «-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure
in den in Tabelle I angegebenen Mengen durchgeführt.
Nach 24 Stunden Gärung wurde jedes Wachstum untersucht.
Mindestmedium:
Glucose 5 g/l
Harnstoff 1,5 g/l
(NH4)2SO4 1,5 g/l
K2HPO4 3,0 g/l
KH2PO4 1,0 g/l
MgSO4 0,1 g/l
CaCl2 0,001 g/l
Biotin 30 μ^Ι
Vitamin B1 100 pg/l
Spurenelemente*) 1 ml/1
pH 7,0
*) Spurenelemente schließen ein:
Na1B4O7 · 10H2O 88 mg/1
(NH,).Mo,O„ · 4H.0 37 mg/1
FeCI,-6 H,0 970 mg/1
ZnSO4 · 7H1O' 8800 mg/1
CuSO4 · 5 H5O 270 mg/1
MnCl, -4H8O 72 mg/1
Aus den Ergebnissen in Tabelle I ist ersichtlich, daß das Wachstum von üblichen Mikroorganismen
beträchtlich gehemmt wurde, wenn «-Amino-/?-hydroxyvaleriansäure
zu einem Medium in einer Menge
3 4
von mehr als 0,5 mg/ml zugegeben wurde, daß jedoch Beispiel 1
das Wachstum der Mutanten mit der Widerstands- Es wurde ein Kulturmedium der folgenden Zu-
fähigkeit gegenüber «-Amino-ZJ-hydroxyvaleriansaure sammensetzung hergestellt;
durch den Zusatz einer solchen Menge von a-Amino- Kohlenstoffauelle
/ϊ-hydroxyvaleriansäure nicht herabgesetzt wurde. 5 (siehe Tabelle II) 10 V
Das bei der Herstellung von L-Threonin gemäß dem Ammoniumsulf at WWWW. 4%
Verfahren nach der Erfindung verwendete Nähr- oder Kaliumdihydrogenphosphat 0,3%
Kulturmedium kann ein völlig übliches sein. Es muß Magnesiumsulfat ........ 0,04%
eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine assimilier- Biotin 300 iigJl
bare Stickstoffquelle und die üblichen Nährstoffe in xo Vitamin B 200 ug/1
geringen Mengen enthalten. Die Kohlenstoffquellen, pe++ *
2 Teile/Million
die zur Verwendung bei dem Verfahren gemäß der Mn++
2 Teile/Million
Erfindung geeignet sind, sind Glucose, Maltose, Sojabohnenproteinhydrolysat
Fructose, Stärkehydrolysat und Melassen. Organische (Gesamtstickstoff 2,2 g/dl) .. 0,2 ml/dl
Sauren, wie Essigsaure und Citronensäure, Alkohole x5 Cakiumcarbonat
und Kohlenwasserstoffe, werden auch als Kohlenstoff- (getrennt sterilisiert) 5 °/
quellen verwendet. Eine Stickstoffquelle kann durch
Ammoniumsalze von anorganischen Säuren wie 20-ml-Mengen des obengenannten Mediums wurden
Ammoniumsulfat und Ammoniumchlorid oder durch in 500-.nl-Schüttelflaschen eingebracht und durch
Ammoniak in wäßriger Lösung oder in gasförmigem ao Wasserdampf in den Flaschen bei 1100C 5 Minuten
Zustand vorgesehen sein. Organische Verbindungen sterilisiert. Brevibacterium ftavum ATCC 21269
wie Aminosäuren, Harnstoff oder Proteinhydrolysat wurde in diese Gärungsmedien eingeimpft und unter
können auch verwendet werden. Die anorganische aeroben Bedingungen bei 3O0C 48 Stunden lang
Substanz kann aus einem Phosphat, einem Calcium- gezüchtet. Die Menge an angesammeltem L-Threonin
salz, einem Magnesiumsalz, einem Eisensalz, einem a5 injeder gezüchteten Brühe ist aus Tabelle II ersichtlich.
Mangansalz od. dgl., wie dies üblich ist, bestehen. Tabelle II
Nährstoffe und andere Substanzen die für das TTT, ä—7< Z '■ i
,„ . . , .. . , uuuiuiiKii, UiC lur u«i:>
Kohlenstoffquelle Konzentration angesammeltes
Wachstum der Mutanten notwendig sind, sollen in L-Threonin g/l)
dem Kulturmedium vorhanden sein. Die Wachstums-
fördernden Mittel und anderen Nährstoffe, welche die 30 Gluc°se 10% 6,4
Ausbeute und das Ausmaß bzw. die Geschwindigkeit Maltose 10% 5,5
der Erzeugung von L-Threonin verbessern, sind z. B. Saccharose 10% 4,4
Aminosäuren, verschiedene Vitamine, Sojabohnen- Fructose 10% 3 8
CeCaSS"at":r'■ 1^"-""-- "*■ „ Z„ckTohT,aSS„ !0-/I
Die Gärung oder Fermentation wird zwischen ( Ulucose)
20 und 4O0C während etwa 24 bis 72 Stunden unter Die Zellen wurden von der Garbrühe mit einem
aeroben Bedingungen unter Schütteln oder Belüftung Gehalt von 6,4 g/l L-Threonin durch Zentrifugieren
und Rühren ausgeführt, wobei der pH-Wert des abgetrennt, und die Flüssigkeit wurde durch eine Säule
Mediums zwischen 5 und 9 eingestellt wird. Wenn der 40 von Kationenaustauscherharz (Η-Type) nach Ent-
pH-Wert des Mediums unter 5,0 zu fallen sucht, wird fernung don Ammoniak und Kohlensäure geführt,
er vorzugsweise durch Verwendung von Neutrali- 4,6 g des reinen L-Threonins in kristalliner Form
sierungsmitteln, wie Cakiumcarbonat und wäßrigem wurden aus 1 Liter der Brühe erhalten.
Ammoniak eingestellt. Wenn andererseits organische . .
Säuren als Kohlenstoffquellen verwendet werden, 45 B e 1 s ρ 1 e 1 2
neigt der pH-Wert des Mediums zum Steigen, und Es wurde ein Kulturmedium der folgenden Zu-
vorzugsweise wird er dann innerhalb des genannten sammensetzung hergestellt:
Bereichs durch die Verwendung der organischen Glucose 10°/
Säuren und eines Neutralisierungsmittels, wie Salzsäure Ammnnium«'iifat
W
0^eSn^^LßT^i„ausderZüchtungs-5° S«" JS»
brühe kann nach bekannten Verfahren erfolgen. Die Magnesiumsulfat 0,04 /
Bakterienzellen können durch Filtrieren oder Zentri- Vitamin B
300 uf/l
fugieren entfernt werden, und L-Threonin kann durch Fe++ 2 Teile/Million
Anwendung von kationischem Austauschharz der 55 Mn+*
2 Teile/Million
ätör:
τ»· t>
Γ? j ■ j η «1 , Calciumcarbonat
Die Bestimmung des in der Brühe angesammelten ieetrennt sterilisiert) 5°/
L-Threonins wurde durch Mikrobioversuch der An- 60 ^eirenni sieriiisienj 3/0
wendung von Streptococcus faecalis ATCC 8043 aus- Mengen von 20 ml des obengenannten Mediums
geführt. Das Produkt gemäß der Erfindung wurde als wurden in 500-ml-Schüttelflaschen eingebracht und
L-Threonin durch Beweglichkeit bei Elektrophorese, durch Wasserdampf bei 110° C 5 Minuten sterilisiert,
biologische Aktivität im Mikrobioversuch und Rf- Das Medium wurde mit Corynebacterium acetoacido-Wert-Bestimmung
bei Papierchromatographie identi- 65 philüm ATCC 21 270 geimpft, und die Gärung wurde
fiziert. unter aeroben Bedingungen bei 3O0C 64 Stunden
Die Erfindung wird anhand der nachstehenden ausgeführt. Die Menge an in der Gärungsbrühe
Reisniele näher erläutert. angesammeltem L-Threonin betrug 3,6 g/l.
Claims (2)
1. Verfahren zur Herstellung von L-Threonin durch Mikroorganismen in einem Nährmedium,
dadurch gekennzeichnet, daß man einen Threonin erzeugenden, gegenüber jt-Amino-/?-hydroxyvaleriansäure
widerstandsfähigen Stamm aus der Gruppe von Brevibacterium flavum ATCC
21269 und Corynebacterium acetoacidophilum i»
ATCC 21270 unter aeroben Bedingungen in einem Medium züchtet, das assimilierbare Kohlenstoffquellen,
Stickstoffquellen, anorganische Substanzen und wachstumfördernde Substanzen enthält
und auf einem pH-Wert in dem Bereich von 5 bis 9 gehalten wird, und das erzeugte L-Threonin
gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die assimilierbare Kohlenstoffquelle
aus Kohlenhydraten und organischen Säuren gewählt ist und daß der assimilierbare Stickstoff
aus wäßriger Ammoniaklösung oder gasförmigem Ammoniak, Ammoniumsalzen oder Harnstoff
besteht.
25 fördernde Substanzen enthält und auf einem pH-Wert
in dem Bereich von 5 bis 9 gehalten wird, und das erzeugte L-Threonin gewinnt.
Von den bei dem Verfahren gemäß der Erfindung zur Anwendung gelangenden Mikroorganismen kann
Brevibacterium flavum ATCC 21269 aus Brevibacterium flavum ATCC 14 067 durch künstliche
Mutation ernalten werden, und Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 21270 kann aus Corynebacterium
acetoacidophilum ATCC 13 870 durch künstliche Mutation hergestellt werden.
Tabelle I zeigt die Änderung des Wachstums gemäß den verschiedenen Konzentrationen von
a-Amino-/?-hydroxyvaleriansäure in dem auf Brevibacterium
flavum ATCC 21269 geprüften Kulturmedium als Beispiel dieser widerstandsfähigen Stämme
und ihres Elternstammes Brevibacterium flavum ATCC14 067 ais Beispiel von empfindlichen Stämmen.
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Also Published As
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