DE2350210A1 - Verfahren zur herstellung von larginin durch fermentierung - Google Patents

Description

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DR. E. WIEGAND DIPL »NC. W. ΝίΕΜΛΝΝ .

DR. M. KÖHLER DIPL-ING. C. GERNHARDT ?lRf)?1 Ω

Mönchen Hamburg

'telefon: 55547ä 8000 m d n c h e n 2,

telegramme: karpatent mathl ldenstrasse 12

¥ 41 783/73 - Ko/DE 5. Oktober 1973

Ajinomoto Co., Inc., Tokyo / Japan

Verfahren zur Herstellung von L-Arginin durch Fermentierung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Arginin, welches nachfolgend lediglich als Alginin bezeichnet wird, durch Fermentierung«,

Gemäß der Erfindung erzeugen Stamme des Genus Brevibacteriuin mit einem ITährstoffbedarf für G-uanin zusammen mit einer" Beständigkeit gegen eine Rücklaufhemmung und/ oder Unterdrückung von Arginin oder Argininanalogen eine große'Menge an L-Arginin in einem Medium bei üblicher Kultivierung. .

Arginin is»t eine wichtige Aminosäure, die in weitem Umfang auf dem medizinischen Gebiet und als Nahrungsmittel verwendet wird; sie wird im technischen Maßstab aus Proteinhydrolysaten mit relativ hohen Kosten unter Anwendung eines komplizierten Isolierungsverfahrens hergestellt. Es ist bekannt, daß bestimmte wilde Stämme von Kohlenwasserstoff assimilierenden Gorynebacterium- und Brevibaeterium Arginin aus Kohlenwasserstoffen in einer sehr niedrigen Konzentration bilden können₉ wie in den US-Patentsehriften 3 222 258 und 3 440 141 angegeben» Es ist ferner bekannt·,

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daß Mutantenstämme von Brevibacterium flavum und Corynebacterium acetoacidophilum relativ hohe Konzentrationen von Arginin aus Kohlehydraten und organischen Säuren, beispielsweise Essigsäure, bilden können (französische Patentschrift 1 278 917). Andererseits ist es aus einer Veröffentlichung bekannt, daß eine geringe Menge an Arginin durch Fermentierung unter Anwendung eines Mutantenstairanes vom Bacillus subtilis mit Beständigkeit gegenüber Argininbydroxamat gebildet werden kann (Applied Microbiology, Band 22, Er. 6, Seite 987-991, 1971).

Es wurde jetzt gefunden, daß Mutantenstämme mit einem Guaninbedarf für ihr Wachstum zusammen mit einer Beständigkeit gegen Rückfuhrhemmung (feedback inhibition) und/ oder Unterdrückung von Arginin oder Argininana logen, falls sie in einem Medium, das eine assimilierbare Quelle für Kohlenstoff, eine assimilierbare Quelle für Stickstoff, anorganische Salze, für das Wachstum erforderliche Substanzen und organische v/a chs turns fördernde Substanzen enthält, kultiviert werden, eine große Menge an Arginin im Medium bilden können und daß das gebildete Arginin leicht aus dem Medium nach an sich bekannten Verfahren gewonnen wird.

Die Mikroorganismen, die Mutantenstärcme darstellen und beim erfindungsgemäßen Verfahren angewandt werden, können leicht durch bekannte Mutationsverfahren aus StaraB-mikroorganismen, die zum Genus Brevibacterium gehören, welche zur extracellularen Herstellung von Arginin unfähig sind, erhalten werden.

Mutantenstämme mit einer Beständigkeit gegenüber Rückfuhrhemmung und/oder Unterdrückung von Arginin oder Argininanalogen werden leicht nach bekannten Mutationsverfahren, beispielsweise Nitrosoguanidinbehandlung,. und Aussiebverfahren, erhalten. Derartige Mutanten können als beständige Stämme gegenüber der Wachstumshemmung von Substanzen aus der Gruppe von Canavanin, Homoarginin, a-Methyl-

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arginin, 2-Thienylserin, D-Serin, Äthionin, 2-Thiazolalanin, cc-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure, 6-Chlorpurin und Sulfamedikamenten, beispielsweise Sulfaguanidin, SuIfamerazin, Sulfisomezol und Sulfisoxazol ausgesiebt oder erhalten werden. Diese Art von Mutantenstämmen, welche lediglich diese Beständigkeit besitzt, jedoch kein Nährstofferfordernis aufweist, kann gleichfalls Arginin in gewissem Ausmaß bilden. Brevibacterium flavum ATCC 21493 ist ein Beispiel einer derartigen Art einer Mutante.

Jedoch kann die Fähigkeit zur Herstellung von Arginin signifikant durch das zusätzliche Guaninerfordernis des Stammes mit dieser Beständigkeit verbessert werden.

Die Mutantenstämme, die als beständig gegen Rückfuhrhemmung und/oder Unterdrückung von Arginin oder Argininanalogen bezeichnet werden, unterscheiden sich üblicherweise von den Normalstämmen (Stammstämmen) durch den "Vergleich ihrer Fähigkeit zum Wachstum auf einem .Medium, welches Argininanaloge enthH.lt, gegenüber denjenigen der Stammstäinrae. Diese beständigen Stämme können nämlich auf -einem Medium wachsen, welches eine bestimmte Menge eines Argininanalogen enthält, unter dessen Konzentration die Stammstamme nicht wachsen können.

Die wirksamste Arginin bildende Mutante innerhalb des Genus Brevibacterium, soweit sie bisher festgestellt wurde, ist Brevibacterium flavum AJ 3401 (PERM P1639), wobei dieser Stamm ein Guaninerfordernis zusammen mit einer Beständigkeit gegenüber 2-Thiazolalanin und Canavanin besitzt. ■

Die EERM P-Nummer ist die Niederlegungszugangsnummer des Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Nr. 1-8-5, Inagehigashi, Chiba-shi, Chiba-ken, Japan.

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Die beim erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Mikroorganismen können gleichfalls eine Mutante mit anderen biologischen Eigenschaften, beispielsweise anderem Nährstofferfordernis·und/oder Beständigkeit gegenüber anderen Reagenzien zusammen mit dem vorstehend geforderten Erfordernis und der vorstehenden Beständigkeit sein.

Die Stämme gemäß der Erfindung können leicht durch Aussiebung und/oder durch übliche künstliche Mutanteninduzierverfahren erhalten werden und ein Verfahren hierfür ist im einzelnen nachfolgend als Versuch aufgeführt.

Versuch

Der Mutantenstamm Hr. 33038 mit Guaninerfordernis wurde durch V/iederholungsverfahren aus Kolonien isoliert, die in einer vollständigAÄ-garflachplatte auftraten, auf der mikrobielle Zellen, welche durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen von Brevibacterium flavum ATCC 14067 erhalten worden waren, bei 31⁰C während 4 bis 10 Tagen kultiviert wurden.

Der Stamm Nr. 33038 wurde mit 250 mg/ml Nitrosoguanidin bei 3O⁰C während 30 Minuten behandelt und anschließend wurde er auf Agarflachplatten inokuliert, die die nachfolgende Zusammensetzung hatten, und bei 31⁰C während 4 bis 10 Tagen kultiviert.

Zusammensetzung des Mediums:

2 fo Glukose, 0,3 f> Harnstoff, 1 % (NH^)₂SO,, 0,1 fo KHpPO₄, 0,04 f> MgSO. ·7Η₂Ο, 2 ppm Pe++, \ 2 ppm m-, 100/Ug/l Biotin, 200/Ug/l Thiamin-HCl, 0,015 fo Guanin, 5 mg/ml 2-Thiazolalanin, .und 2 fo Agar (p_H 7,0).

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Der Stamm Hr. 112, welcher X-Histidin produzieren kann, wurde durch Aussiebung aus Kolonien erhalten, die auf den -vorstehend aufgeführten Kulturplatten erschienen.

Der Stamm Nr. 112 wurde weiterhin mit 250/u/ml ITitrosoguanidin behandelt und anschließend auf Agarflachplatten inokuliert, die die gleiche Zusammensetzung aufwiesen, wobei'jedoch 10 mg/ml 2-Thiazolalanin anstelle von 5 mg/ml hiervon zugesetzt wurden, und wurden unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend kultiviert.

Die auf der Kiilturplatte auftretenden Stämme waren sämtliche Mutantenstämme mit Beständigkeit gegenüber 2-Thiazolalanin und Argininanalogen und waren zur Herstellung von L-Arginin geeignet. Der beste Argininbilder war der Stamm AJ 3401, welcher einen Guaninbedarf zusammen mit einer Beständigkeit gegenüber 2-^fIhiazolalanin und Canavanin (ein Argininanaloges) besaß.

Das gemäß der Erfindung eingesetzte Kulturmedium ist üblich und enthält eine oder mehrere assimilierbare Kohlenstoffquellen, eine oder mehrere assimilierbare Stickstoffquellen, anorganische Ionen, anorganische Salze, für das Wachstum erforderliche Substanzen und erforderlichenfalls kleinere Mengen organischer Nährstoffe. Beispiele für assimilierbare Kohlenstoffquellen umfassen Kohlehydrate wie G-lucose, Saccharose j Stärke, Stärkehydrolysate oder Melassen, organische Säuren wie Essigsäure, Propionsäure,, Gluconsäure, Bernsteinsäure und Citronensäure₉ Alkohole wie Äthanol₉ organische Verbindungen wie Benzoesäure und bei bestimmten Stämmen n-Alkane* Beispiele für assimilierbare Stickstoffquellen umfassen Ammoniumsalze_s Nitratsalse, Aminosäuren, Harnstoff und gasförmiges Ammoniak.

Um eine gute Ausbeute an Arginin au erhalten₉ wird die Fermentierung vorzugsweise aerob unter Belüftung und Rühren durchgeführt» Beste Ergebnisse erfordern eine pH-Einstellung innerhalb des Bereiches von 5 bis 9* Der gewünschte pH-Wert

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kann mittels gasförmigem oder wässrigem Ammoniak, Calciumcarbonat, Alkalihydroxiden, Harnstoff oder organischen oder anorganischen Säuren beibehalten werden.

Falls die Fermentierung bei einer· Temperatur im Bereich von 24 bis 37⁰C ausgeführt wird, wird die maximale Konzentration an Arginin in der Flüssigkeit üblicherweise innerhalb 2 bis 7 Tagen erreicht .JlÜas in der Fermentierflüssigkeit angesammelte Arginin kann nach üblichen Verfahren, beispielsweise unter Anwendung eines lonenaustauschharzes in Kombination mit Ausfällung, gewonnen werden. Das Arginin wurde mittels seiner Ninhydrinreaktion auf einem Papierchromatogramm, des Rf-Wertes auf dem Papierchromato-•gramm, der positiven Sakaguchireaktion und der Wachstumskurven von Arginin erfordernden Mutanten von Milchsäurebakterien identifiziert. Das Arginin in der Flüssigkeit wurde durch das colorimetrische Bestimmungsverfahren unter Anwendung der Yoges-Proskauer-Reaktion bestimmt.

Die folgenden Beispiele dienen zur v/eiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

20 ml-Ansätze eines Mediums, welche 10 /^ Glucose, 6 $ (UH₄)₂SO₄, 0,1 # KH₂PO₄, 0,04 Io MgSO₄-7H₂O, 2 ppm Mn-Ionen, 2 ppm Fe-Ionen, 50 /ug/l Biotin, 20 /Ug/l Thiamin-HGl, 1 $> Sojaproteinhydrolysat (Gesamtstickstoff 2,4 °/°), 0,005 $> Guanin und 5 % Calciumcarbonat (getrennt sterilisiert) enthielten und einen pH-Wert von 7,0 hatten, wurden in einzelne 500 ml-Schüttelkolben gegeben und durch V7ärme sterilisiert.

Das'vorher auf Bouillon-Agarschnitten kultivierte Brevibacterium flavum AJ 3401 (FERM P 1639) wurde in die Kolben eingebracht und bei 31⁰C unter Belüftung und Rühren während 72 Stunden kultiviert. Die Kulturbrühe enthielt 2j5 g/dl Arginin. 1 1 der überstehenden Flüssigkeit, welche

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von der Kulturbrühe nach der Zentrifugierung erhalten worden war, wurde durch eine mit einem Ionenaustauschharz Amberlite C-50 (IiH₄ ⁺-TyP) gepackte Kolonne geführt und das Arginin mit 2 n-KH₄0H eluiert. Das Eluat wurde konzentriert, um das rohe kristalline Arginin auszufällen. 16,2 g kristallines Arginin wurden erhalten.

Beispiel 2

Brevibacterium flavum AJ 3401 wurde auf einem Impfkulturmedium, dessen Zusammensetzung die folgende war, bei 31⁰G während 18 Stunden unter Belüftung und Rühren kultiviert:

Impfkulturmedium:

Medium mit einem Gehalt von 1,5 % Gkucose, 0,3 % Ammoniumacetat, 0,1 $ KH₂PO₄, 0,04 i° MgSO₄^H₂O, 2 ppm Fe⁺⁺, 2 ppm Mn⁺⁺, 50y0ig/l Biotin, 200/ug/l Thiamin-HCl, 1,5 $ Sojaproteinhydrolysat (Gesamtstickstoff 7 i°) und 0,015 i° Guanin, pH 7,0.

300 ml-Ansätze des folgenden Hauptkulturmediums wurden in einzelne Glasbehälterfermentätoren von 11 Inhalt gebracht und durch Erhitzen sterilisiert.

15 ml der Impfkulturbrühe wurden zur Inokulierung des nachfolgend angegebenen Hauptkulturmediums eingeführt und die Kultivierung bei 31⁰C unter Rühren begonnen, wobei ein gleiches Volumen an luft je Minute eingeführt wurde.

Hauptkulturmedium:

Medium mit einem Gehalt von.3 $ Glucose, 0,5 # Ammoniumacetat, 0,2 % Harnstoff, 2 $ (lOLjpSO-, 0,1 $> KH₂PO₄, 0,04 % MgSo₄.7H₂O, 2 ppm Fe⁺ , 2 ppm Mn*⁺, 50/ug/1 Biotin, 50/ug/1 Thiamin-HCl, 2,5 i° Sojaproteinhydrolysat (Gesamtstickstoff 7 $>) und 0,015 io Guanin, pH 7.5.

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Die Kultivierung wurde bei 31 bis 33⁰C während 55 Stunden fortgeführt und während der Kultivierung wurde der pH-Wert des Mediums zwischen 7,2 und 8,0 durch Zuführung einer Mischlösung von Essigsäure und Ammoniumacetat gehalten, welche 0,25 Mol Ammoniumacetat je Mol Essigsäure enthielt und deren Essigsäurekonzentration 60 $ betrug.

Nach der Kultivierung während 55 Stunden wurden 3»03 g/dl an L-Arginin in der Kulturbrühe aufgefunden, wobei die Gesamtmenge der in das Medium zugesetzten und verbrauchten Essigsäure 20 $, bezogen auf das Anfangsvolumen des Mediums, betrug.

6|5 g cristallines Arginin wurden aus 300 ml der Kulturbrühe in der gleichen V/eise wie in Beispiel 1 erhalten.

Beispiel 3

Brevibacterium flavum AJ 3401 wurde auf einem Impfkulturmedium, dessen Zusammensetzung die folgende war, bei 31⁰C während 18 Stunden unter Belüftung und Rühren kultiviert.

Impfkulturmedium:

Medium mit einem Gehalt von 1,5 % Glucose, 0,3 $ Harnstoff, 0,1 °/o KH₂PO., 0,04 # MgSO,«7H₂O, 2 ppm Pe⁺⁺, 2 ppm Mn⁺*, 50/ug/l Biotin, 200 /ug/l Thiamin-HCl, 1,5 i° Sojaproteinhydrolysat (Gesamtstickstoff 7 #) und 0,015 °/° Guanin, pH 7,5.

300 ml des folgenden Hauptkulturmediums wurden in einzeihe Glasbehälterfermentatoren von 1 1 Inhalt gebracht und durch Erhitzen sterilisiert.

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15 ml der Impfkulturbrühe wurden zur Inokulierung zu dem folgenden HauptkulturmediuiB zugesetzt und die Kultivierung bei 31⁰C unter Rühren begonnen, während ein gleiches Volumen an Luft je Volumen des Mediums je Minute eingeführt wurde.

Hauptkulturmedium: ·

Medium mit einem Gehalt von 1 $ Glucose, 1 $ Äthylalkohol, 0,5 1° (.FH₄)₂SO₄, 0,2 % Harnstoff,- 0,1 # EH₂PO₄, 0,04 1o MgSO₄.7H₂O, 2 ppm Pe⁺⁺, 2 ppm Mn⁺⁺, 50/ug/l Biotin, 50/ug/l Thiamin-HClj 2,5 % Sojaproteinhydrolysat (Gesamtstickstoff 7 $) und 0,015 #- Guanin, pH 7,5·

Während der Eermentierung wurde der pH-Wert des Mediums zwischen 7>2 und 7»8 durch Einführung von gasförmigem Ammoniak in das Medium gehalten. Die Menge des verbliebenen Äthanols wurde durch Gas Chromatographie bestimmt und das Äthanol zu dem Medium .zugeführt, wenn die Menge an verbliebenem Äthanol auf etwa 0,3 % abgefallen war.

Kach einer Kultivierung von 48 Stunden bei 31 bis 33⁰C fanden sich 1,84 g/dl an !-Arginin in der Kulturbrühe, wobei die Gesamtmenge an verbrauchtem Äthanol 16 ^, bezogen auf das Anfangs volumen des Mediums;, war.

3,4 g kristallines Arginin wurden aus 300 ml.der Kulturbrühe nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 isoliert. . ■ ■ ""■■-■■'■

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Claims (5)

Pa tentana prüche

1. Verfahren zur Herstellung von L-Arginin, dadurch gekennzeichnet, daß

a) ein Bacterium des Genus Brevibacterium mit der Fähigkeit zur Herstellung von L-Arginin in einem wässrigen Medium, welches eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine assimilierbare Stickstoff quelle, anorganische Salze, wachsturnserforderliche Substanzen und wachs turnsfördernde organische Substanzen enthält, kultiviert wird, bis sich das L-Arginin in dem Medium ansammelt, wobei dieses Bacterium ein Nährstofferfordernis für Guanin zusammen mit einer Beständigkeit zur Rücklaufhemmung und/oder Unterdrückung von Arginin oder Argininanalogen besitzt, und

b) das angesammelte L-Arginin aus dem Medium gewonnen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als assimilierbare Kohlenstoffquelle ein Kohlehydrat verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als assimilierbare Kohlenstoffquelle Essigsäure und/ oder Ammoniumacetat verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als assimilierbare Kohlenstoffquelle Äthanol verwendet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Bacterium Brevibacterium flavum I¹ERM P 1639 verwendet wird.

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