DE2230046C3 - Verfahren zum Herstellen von L-Arginin durch Fermentation - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von L-Arginin (im folgenden als Arginin bezeichnet) durch Fermentation.

Arginin ist eine wichtige Aminosäure, die in der pharmazeutischen und Nahrungsmittel-Industrie in großem Umfang verwendet wird. Es wird in technischem Umfang aus Proteinhydrolysaten mit verhältnismäßig hohen Kosten nach einem umständlichen Isolierungsverfahren gewonnen. Es ist bekannt, daß bestimmte wilde Stämme von Kohlenwasserstoff assimilierenden Corynebacterium und Brevibacterium diese Aminosäure in einer sehr geringen Konzentration zu bilden vermögen (vgl. US-Patentschrift 32 22 258 und 34 40 141).

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen Mikroorganismus zur Verfugung zu stellen, der in einem wäßrigen Medium Arginin in größerer Ausbeute bilden kann.

Die Erfindung ist in den zwei Ansprüchen definiert.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahren wii'd ein Mutantenstamm von Microbacterium verwendet, der sich durch bekannte Mutationsverfahren von einem Urstamm von Microbacterium, welcher kein extrazelluläres Arginin bilden kann, ableiten läßt. Dieser Arginin wirksam produzierende Mutantenstamm ist widerstandsfähig gegen eine das Wachstum des Urstamms hemmende Substanz, wie 2-Thienylserin, D-Serin, Äthionin, 2-Thiazolalanin, a-Amino-/i-hydroxyvalerinsäure, 6-Chlorpurin und Schwefeldrogen (SuI-foguanidin, Sulfomerazin, Sulfisomezol, Sulfisoxazol und dergleichen).

Die für die Zwecke der Erfindung zu verwendenden Kulturmedien sind übliche Medien und enthalten assimilierbare Kohlenstoffquellen, assimilierbare Stickstoffquellen, anorganische Ionen und, falls notwendig, kleinere organische Nährbestandteile. Bei den assimilierbaren Kohlenstoffquellen handelt es sich um Kohlenstoffhydrate wie Glucose, Sucrose, Stärke, Stärkehydrolysate oder Melassearten, organische Säuren wie Essigsäure, Gluconsäurc Bernsteinsäure und Zitronensäure und um Alkohole, wie Äthanol und bei einem bestimmten Stamm um n-Alkane. Assimilierbare Stickstoffquellen enthalten Ammoniumsalze, Nitrate, Aminosäuren, Harnstoff und gasförmiges Ammoniak.

Für eine gute Arginin-Ausbeute wird die Fermentation aerob unter Belüftung und Rühren durchgeführt. Beste Ergebnisse erfordern eine pH-Steuerung im Bereich von 5 bis 9. Der gewünschte pH kann mit Hilfe von gasförmigem oder wäßrigem Ammonaik, Kaliumcarbonat, Alkalihydroxyd, Harnstoff organischen oder anorganischen Säuren aufrechterhalten werden.

Wenn die Fermentation bei 24 bis 37° C durchgeführt wird, wird die maximale Konzentration von Arginin in der Nährbrühe in 2 bis 7 Tagen erreicht.

Das in der Fermentationsbrühe angesammelte Arginin kann auf übliche Weise isoliert werden, z. B. unter Anwendung eines Ionen-Austauscherharzes in Verbindung mit Ausfällen Das Arginin konnte durch seine Ninhydrin-Reaktion auf einem Papierchromatogramm, durch den Rf-Wert auf dem Papierchromatogramm, durch eine positive Sakaguchi-Reaktion und durch Wachstumskurven von Arginin erfordernde Mutanten vn Milchsäurebakterien identifiziert werden. Das Arginin in der Brühe wurde durch Prüfung an lebenden Leuconostoc mesentroiden ATCC 8042 bestimmt.

Beispiel 1

300 ml Anteile eines Mediums welches 10 g/dl Glukose, 0,2 g/dl KH₂PO₄, 1,5 g/dl (NH₄J₂SO₄, 0,04 g/dl MgSO₄ · 7 H₂O, 50 μg/l Biotin, 50 μg/l Thiamin · HCl, 1 mg/dl FeSO₄ · 7 H₂O, 1 mg/dl MnSO₄ · 4 H₂O und 1 ml/dl Sojaprotein-Hydrolysat enthielt und einen pH von 7,5 aufwies, wuren in 1000 ml fassende Fermentationsgefäße gegeben und in der Hitze sterilisiert.

Das Gefäß wurde mit Microbacterium ammoniaphi-Ium AJ 3353 (FERM-P 976) geimpft, die vorher in schräg gehaltenen Reagenzglaskulturen auf bouillon agar kultiviert waren. Das so geimpfte Gefäß wurde unter Lüften und 48 Stunden langem Rühren bei 31 °C gehalten, wobei der pH mit gasförmigem Ammoniak bei 7,5 eingestellt wurde. Die gebildete Brühe enthielt 0,41 g/dl Arginin. 21 dieser Brühe wurden zur Entfernung von Zellen zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde durch eine Säule geschickt, die mit einem lonen-Austauscherharz, Amberlite C-50; NH₄-Typ, beschickt war. Das Arginin wurde mit 2-n NH₂OH eluiert. Das Eluat wurde zum Ausfällen von rohem kristallinen Arginin konzentriert. Dabei wurden 4,9 g Kristalle erhalten.

Beispiel 2

In ein 1000 ml fassendes Fermentationsgefäß wurden 300 ml Proben eines Mediums gegeben, das 0,3 g/dl Ammoniumacetat 0,4 g/dl Kaliumacetat, 0,1 g/dl KH₂PO₄, 0,04 g/dl MgSO₄ · 7 H₂O, 1 mg/dl FeSO₄ · 7 H₂O, 1 mg/dl MnSO₄ · 4 H₂O, 2 ml/dl Sojaprotein-Hydrolysat, 50 μg/l Biotin, 50 μg/l Thiamin. HCl, 0,5 ml/dl Maisbrühe und 0,3 g/dl Harnstoff enthielt und sich bei einem pH von 7,2 befand. Anschließend wurde in der Hitze sterilisiert.

In das Fermentationsgefäß wurden Microbacterium ammoniaphilum AJ 3353 (FERM-P 976) auf einem Medium gegeben, das 0,5 g/dl Glukose, 1 g/dl Hefeextrakt und 1 g/dl Pepton enthielt; es wurde zusammen mit 15 ml der gebildeten Brühe in das Fermentationsgefäß gegeben. Die Fermentation wurde unter Rühren mit 1200 μίτι bei 31,5°C durchgeführt, wobei 300 ml/min Luft in das Gefäß eingeleitet wurden. Während der Fermentation wurde der pH des Mediums auf 7,0 bis 7,7 gehalten durch Zugeben von 60%iger Essigsäure oder gasförmigem Ammoniak. Nach 48 Stunden waren 36,6 g Essigsäure verbraucht und es hatten sich 0,24 g/dl Arginin in der Brühe gebildet.

Beispiel 3

In ein 1000 ml fassendes Fermentationsgefäß wurden 300 ml Proben eines Mediums gegeben, das 1,5 g/dl Äthanol, 0,5 g/dl (NH₄J₂SO₄, 0,1 g/dl KH₂SO₄, 0,04 g/dl MgSO₄ · 7 H₂O, 1 mg/dl FeSO₄ ■ 7 H₂O, 2 ml/dl Soja-

3 4

protein-Hydrolysat, 100μg/dl Biotin, 50 μg/l Thiamin. 300 ml/min durchgeführt Während der Fermentation

HCl und 0,5 ml/dl Maisbrühe enthielt Die Flüssigkeit wurde der pH des Mediums durch Zuführen von

wurde bei einem pH von 7,2 gehalten und in der Wärme gasförmigem Ammoniak auf 7,0 bis 7,5 gehalten. Die

sterilisiert 15 ml des gleichen Impfmaterials wie in Äthanol-Konzentration wurde gaschromatographisch

Beispiel 2 von Microbacterium ammoniaphilum AJ 3353 5 bestimmt und bei etwa 0,1 g/dl gehallen. Nach 48

(FERM-P 976) wurden in das Fermentationsgefäß Stunden hatten sich 0,22 g/dl Arginin in der Fermenta-

gegeben. Die Fermentation wurde unter Rühren bei tionsbrühe gebildet (Die Ausbeute an Arginin bezogen

1500 upm bei 30⁰C und bei einer Luftzufuhr von auf zugegebenen Äthylalkohol betrug 2,0%.)

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von L-Arginin, dadurch gekennzeichnet, daß man Microbacterium ammoniaphilum AJ 3353 (FERM-P 976) in einem wäßrigen Medium kultiviert und das angereicherte L-Arginin aus der Kulturbrühe isoliert.

Z Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein wäßriges Medium verwendet, das eine oder mehrere Kohlenstoffquellen, insbesondere Glucose, Saccharose, Essigsäure und/oder Äthanol, enthält.