DE2230039A1

DE2230039A1 - Verfahren zur Herstellung von L-Arginin

Info

Publication number: DE2230039A1
Application number: DE19722230039
Authority: DE
Inventors: Koji Kawasaki Kanagawa; Onoda Takiko Tokio; Karaijo Hirotaka Kawasaki Kanagawa; Yoshinaga Fumihiro Fujisawa Kanagawa; Okumura Shinji Tokio; Kubota (Japan)
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1971-06-21
Filing date: 1972-06-20
Publication date: 1972-12-28
Also published as: GB1382858A; US3801456A; FR2143238B1; JPS5324517B1; FR2143238A1; IT956687B

Description

PATENTANWÄLTE

DR. O. DlTTMANN K. L. SCHIFF DR. A. ν. FÜNBR DIPL. ING. P. STREHL 8 MÜNCHEN 90 MARIAHILFPLATZ 2 & 3

DA-4942

Beschre i b u η g zu der Patentanmeldung

der Firma

AJINOMOTO CO., INC.

No. 7, 1-chome, Takara-cho, Chuo-ku, Tokyo / Japan

betreffend

^Verfahren zur Herstellung von L-Arginin Priorität: 21. Juni 1971, Nr. 44620/1971, Japan

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von L-Arginin (im folgenden als Arginin bezeichnet) durch Fermentation.

Arginin ist eine wichtige Aminosäure, die in der pharmazeutischen und Nahrungsmittel-Industrie in großem Umfang verwendet wird. Sie wird in technischem Maßstab aus Proteinhydrolysaten mit verhältnismäßig hohen Kosten und nach einem komplizierten Isolierungsverfahren hergestellt. Es ist bekannt, daß bestimmte wilde Stämme von Kohlenwasserstoff assimilierenden Corynebacteriurn und Brevibacterium Arginin aus Kohlenwasserstoffen in sehr geringer Konzentration bilden können (vgl. USA-Patentschriften 3 222 258 und 3 440 141).

Es hat sich nun gezeigt, daß bestimmte Mutanten von Mikroorganismen, die zur Art Brevibacterium oder Arthrobacter gehören und n-Alkane assimilieren, nennenswerte Mengen von Arginin in einem wässrigen Medium bilden können, das als Kohlenstoffnuelle n-Alkane enthält.

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Der für das erfindungsgemäße Verfahren zu verwendende Mutantenstamm läßt sich leicht durch bekannte Mutationsverfahren von den Urstäraraen der Arten Brevibacterium und Arthrobacter ableiten, die n-Alkane assimilieren können. Die Urstämme können kein extracellulares Arginin bilden.

Gewöhnlich erweist sich ein Arginin erzeugender Mutantenstamm als widerstandsfähig gegen eine bei dem Urstamm das Wachstum hindernde Substanz wie 2-Thienylserin, D-Serin, Äthionin, 2-Thiazolalanin, a-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure, 6-Chlorpurin und Schwefeldrogen (Sulfoguanidin, SuIfomerazin, SuIfisomezol, Sulfisoxazol und dergleichen). Insbesondere ist ein Mutantenstamm, der auf einem Medium wächst, das mehr als 200 ug/ml Sulfoguanidin oder mehr als 1000 ug/ml 2-Thiazolalanin enthält, der wirksamste. Manchmal verbessert ■ die Zugabe von für das Wachstum erforderlichen Nährbestandteilen zu dem widerstandsfähigen Stamm die Ausbeute an Arginin.

Die am wirksamsten Arginin erzeugenden Mutanten erwiesen sich bisher als Brevibacterium ketoglutamicum AJ-3351 (PERM-P 974) und Arthrobacter paraffineus AJ-3352 (PERM-P 975). Die FERM-P-Nummer ist die Hinterlegungsnummer des Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, of the Ministry of International Trade and Industry; No. 1-8-5, Inagehigashi, Ghiba-shi, Chiba-ken, Japan.

Die für das erfindungsgemäße Verfahren zu verwendenden Kulturmedien sind an sich bekannt; sie enthalten n-Alkane als assimilierbare Kohlenstoffquellen, assimilierbare Stickstoffquellen, anorganische Ionen und, falls notwendig, kleinere Mengen organischer Nährbestandteile. Assimilierbare n-Alkane haben 9 bis 20 Kohlenstoffatome. Die n-Alkane werden dem wässrigen Medium in einer Menge von 1 bis 15 g/dl zugegeben. Assimilierbare Stickstoffquellen enthalten Ammoniumsalze, Nitrate, Aminosäuren, Harnstoff sowie gasförmigen Ammoniak. Für eine

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gute Arginin-Ausbeute wird die Fermentation aerob unter Belüften und Rühren durchgeführt. Beste Ergebnisse erfordern eine pH-Steuerung im Bereich von 5 bis 9. Der gewünschte pH kann mit Hilfe von gasförmigem oder wässrigem Ammoniak, KaI-ciumcarbonat, Alkalihydroxyd, Harnstoff und/oder organischen bzw. anorganischen Säuren aufrechterhalten werden.

Wenn die Fermentation bei 24 bis 37° C durchgeführt wird, erreicht die maximale Arginin-Konzentration ihr Maximum in 2 bis 7 Tagen.

Das in der Fermentationsbr.ühe angesammelte Arginin kann durch übliche Verfahren isoliert werden, z.B. durch Verwendung eines Ionen-Austauscherharzes in Verbindung mit Ausfällen. Das Arginin wurde identifiziert durch Ninhydrin-Reaktion auf einem Papierchrornatogramm, durch den Rf-Wert auf dem Papierchromatogramm, durch eine positive Sakaguchi-Reaktion und durch Wachstumskurven von Arginin erfordernden Mutanten von Milchsäurebakterien. Das Arginin in der Brühe wurde durch Prüfung a.n lebenden Leuconostoc mesentroiden ATCC 8042 bestimmt.

Beisr>iel 1

20 ml Proben eines Mediums, das 10 g/dl n-Alkane (ein Handelsprodukt, enthaltend n-Alkane mit 12 bis 18 C-Atomen), 2 g/dl (NH₄)₂HPO₄, 0,1 g/dl KH₂PO₄, 0,1 g/dl K₂HPO₄, 0,1 g/dl MgSO₄.7H₂O, 1 mg/dl PeSO₄.7H₃O, 1 mg/dl MnSO₄^H₃O, 30 μg/l Biotin, 2 mg/1 Thiamin.HCl, 0,5 ml/dl Sojabohnenprotein-Hydrolysat, 0,1 ml/dl Maisbrühe und 2 g/dl CaCQ, enthielt, wurde bei einem pH von 7,0 in einen 500 ml fassenden Kolben gegeben und in der Hitze sterilisiert. In den Kolben wurde als Impfmaterial Brevibacterium ketoglutamicum AJ 3351 (FERH-P 974) gegeben, die vorher 24 Stunden bei 30° C auf einem Medium kultiviert wurden, das 1 g/dl Pepton, 1 g/dl Hefeextrakt, 0,5 g/dl KaCl und 2 g/dl Agar enthielt; das Ganze wurde unter Schütteln 72 Stunden bei 31° C gehalten. Die gebildete Brühe enthielt 2,4 g/l L-Arginin.

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Ein Liter dieser Brühe wurde zur Entfernung von Zellen zentrifugiert. Die darüber stehende Flüssigkeit wurde durch eine Kolonne mit einem Kationen-Austauscherharz (Amberlite C-üOjNIL· -Form) gegeben und das Arginin mit 2-n ΝΗ,ΟΗ eluiert. Das Eluat wurde konzentriert, so daß rohes kristallines Arginin ausfiel. Es wurden 12 g einer kristallinen Substanz erhalten.

Beispiel 2

Wie bei Beispiel 1 wurde Arthrobacter paraffineus AJ 3352 kultiviert. Man erhielt 1,5 g/l Arginin in dem Medium.

Patentansprüche

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Claims

Patentansprüche

Verfahren zur Herstellung von L-Arginin, dadurch gekennzeichnet, daß man einen L-Arginin erzeugenden Mutantenstamm eines Mikroorganismus, der zur Art Brevibacterium oder Arthrobacter gehört und n-Alkane assi— . milieren kann, in einem wässrigen Medium kultiviert, das n-Alkane als Kohlenstoffquelle, assimilierbare Stickstoffquellem, anorganische Salze und kleinere Mengen organischer Nahrbestandteile, die zum Wachstum des Mutantenstamms notwendig sind, enthält und.das gebildete L-Arginin aus der Brühe isoliert.

2, Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mutantenstamm Brevibacterium ketoglutamicum PERM-P 974 oder Arthrobacter paraffineus PERM-P verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mutanten einen Stamm verwendet, der auf einem Medium wächst, das mehr als 200 ug/ml Sulfoguanidin oder mehr als 1000 ug/ml 2-Thiazolalanin enthält.

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