DE69010256T2 - Verfahren zur Herstellung von L-Ornithin durch Fermentation. - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von L-Ornithin durch Fermentation.Info
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Description
- L-Ornithin ist eine wichtige Komponente von Arzneimitteln zur Anregung der Leberfunktionen, wichtig als eine Komponente der Gesamtaminosäurepräparaten und anderer Arzneimittel. Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von L-Ornithin durch Fermentation.
- Als L-Ornithin produzierende Mikroorganismen des Genus Brevibacterium und des Genus Corynebacterium, sind Citrullin- oder Arginin-Auxotrophe des Genus Brevibacterium (Japanische Patentveröffentlichung Nr. 43-8712), Citrullin- oder Arginin Auxotrophe des Genus Bacillus (Japanische Patentveröffentlichung Nr. 43-10996), Citrullin- oder Arginin- Auxotrophe des Genus Arthrobacter (Japanische Patentveröffentlichung Nr. 44-24303), Varianten von Arginin- Auxotrophen des Genus Corynebacterium, die eine Resistenz besitzen (Japanische Offenlegungsschrift Nr. 53-24096), oder Varianten des Genus Corynebacterium, die gegen 2-Thiazolalanin, Sulfaguanidinoder 2-Fluorpyruvinsäure resistent sind (Japanische Offenlegungsschrift Nr. 61-119194), bekannt.
- Ziel der vorliegenden Erfindung ist, die Fermentationsausbeute des Verfahrens zur Herstellung von L- Ornithin mit Hilfe eines Mikroorganismus-Stammes zu erhöhen und so die industrielle Herstellung von L-Ornithin zu ermöglichen.
- Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegenden Untersuchungen wurden durchgeführt, um das vorstehende Problem zu lösen.
- Als ein Ergebnis der Untersuchungen, die Produktivität der Mikroorganismen des Genus Brevibacterium, des Genus Corynebacterium und des Genus Arthrobacter, die fähig sind L- Ornithin zu produzieren, zu verbessern und ausgezeichnete Stämme zu finden, mit einer weiter verbesserten Fermentationsausbeute, wurde festgestellt, daß Stämme, denen eine Resistenz gegen Mycophenolsäure oder Ornithinol verliehen wurde, fähig sind, L-Ornithin in höherer Ausbeute zu produzieren, als herkömmliche L-Ornithin produzierende Stämme.
- Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Ornithin, das darin besteht, daß in einem flüssigen Medium ein L-Ornithin produzierender Mikroorganismus des Genus Brevibacterium, des Genus Corynebacterium oder des Genus Arthrobacter gezüchtet wird, der Auxotrophie für mindestens eine der Verbindungen Arginin oder Citrullin hat und der resistent gegenüber mindestens einer Verbindung, ausgewählt unter Mycophenolsäure und Ornithinol, ist, und daß das L-Ornithin aus dem Medium gewonnen wird.
- Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Mikroorganismen sind Varianten des Genus Brevibacterium, des Genus Corynebacterium oder des Genus Arthrobacter; sie sind resistent gegenüber Mycophenolsäure oder Ornithinol und fähig L-Ornithin zu produzieren. Die Resistenz kann entweder eine Mycophenolsäureresistenz oder eine Ornithinolresistenz sein; die Mikroorgansimen können aber auch beide Resistenzen besitzen. Um Varianten der vorliegenden Ertindung zu erhalten, muß zuerst den nachstehend beschriebenen wilden Stämmen eine L-Ornithin-Produktivität verliehen werden, dann kann Mycophenolsäureresistenz oder Ornithinolresistenz verliehen werden. Als andere Möglichkeit kann zuerst eine Mycophenolsäureresistenz oder eine Ornithinolresistenz verliehen werden und dann L-Ornithin-Produktivität, wie Arginin-Auxothrophie und Citrullin-Auxotrophie, verliehen werden.
- Wildstämme, die Ausgangsstämme der Varianten der vorliegenden Erfindung sein können, sind bekannte Bakterien des Genus Brevibacterium, des Genus Corynebacterium oder des Genus Arthrobacter, besonders die als coryneforme L- Glutaminsäure produzierenden bekannten Bakterien. Typische Beispiele sind folgende Bakterien.
- Brevibacterium divaricatum ATCC 14020
- Brevibacterium flavum ATCC 14067
- Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869
- Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
- Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
- Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
- Arthrobacter citreus ATCC 17775
- Um die Vrianten der vorliegenden Erfindung aus diesen Ausgangsstämmen durch Mutation hervorzurufen, kann ein herkömmliches Mutationsverfahren verwendet werden, das darin besteht, daß diese Stämme mit N-Methyl-N'-nitro-N- nitrosoguanidin in Berührung kommen; oder andere herkömmliche Mutagene können entsprechend verwendet werden.
- Nachfolgend werden ein spezielles Verfahren zur Mutation der Variante der vorliegenden Erfindung und die Beziehung zwischen der Konzentration von Mycophenolsäure oder Ornithinol und dem Wachstum des Stammes gezeigt.
- Bakterienzellen des Arthrobacter citreus AJ 12441 (FERM BP-2341), mit einer Arginin-Auxotrophie, die in Nähragarschrägflächen bei 30ºC in 24 Stunden gezüchtet wurden, wurden in einer M/30 Phosphatpufferlösung suspendiert. Zu der Zellsuspension wurden 100 ul/ml von N- Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin hinzugefügt. Das Gemisch ließ man bei 30ºC 30 Minuten lang reagieren. Dann wurden die Zellen gewonnen. Nach gründlichem Waschen mit M/30 Phosphatpufferlösung, wurden die Zellen auf ein Medium mit folgender Zusammensetzung geimpft und bei 31,5ºC 5 Tage lang gezüchtet. Unter den Bakterienstämmen, die auf dem Medium gewachsen sind, werden hauptsächlich große Kolonien abgenommen. Die meisten der abgenommenen Stämme hatten eine hohe L-Qrnithin-Produktivität. Zusammensetzung des Mediums (pH 7,0) Komponente Gehalt Glucose Harnstoff KH&sub2;PO&sub4; MgSO&sub4;.7H&sub2;O FeSO&sub4;.7H&sub2;O MnSO&sub4;.7H&sub2;O Biotin Thiaminhydrochlorid L-Arginin Mycophenolsäure Agar pH
- Von den auf dem Agarmedium gezüchteten Stämmen wurde Arthrobacter citreus AJ 12442 (FERM BP-2342; Arginin- Auxotrophie, Citrullin-Auxotrophie und Mycophenolsäureresistenz) mit einer hohen L-Ornithin- Produktivität erhalten.
- Orni thinol-resistentes Brevibacterium lactofermentum AJ 12444 (FERN BP-2344) wurde aus Brevibacterium lactofermentum AJ 12443 (FERM BP-2343; Arginin- und Citrullin-Auxotrophie) in einer Weise, ähnlich dem vorstehend beschriebenen Verfahren gezüchtet, außer, daß L-Arginin und Mycophenolsäure im vorstehend beschriebenen Medium durch Chemikalien ausgetauscht wurden, die diese benötigten oder gegen die diese resistent wurden. Corynebacterium glutamicum AJ 12445 (FERN BP-2345; Arginin- und Citrullin-Auxotrophie, Vitamin P- Resistenz, Mycophenolsäureresistenz und Ornithinolresistenz) wurde aus Corynebacterium glutamicum AJ 11589 (FERM BP-5644; Arginin- und Citrullin-Auxotrophie, Vitamin P-Resistenz) durch das Verfahren der Zweifachzüchtung gewonnen.
- Die Mycophenolsäure- oder Ornithinolresistenz der so erhaltenen Varianten wurde mit der der Ausgangsstämme verglichen.
- Auf ein Medium, das zusammengesetzt ist aus 0,5 g/dl Glucose, 0,15 g/dl Harnstoff, 0,15 g/dl Ammoniumsulfat, 0,3 g/dl KH&sub2;PO&sub4;, 0,1 g/dl K&sub2;HPO&sub4;, 0,01 g/dl MgSO&sub4;.7H&sub2;O, 0,1 mg/dl CaCl&sub2;.2H&sub2;O, 100 ul/l Biotin, 100 ul/l Thiaminhydrochlorid, 0, 002 g/dl FeSO&sub4;.7H&sub2;0, 0,002 g/dl MnSO&sub4;.7H&sub2;0, 15 mg/dl L- Arginin und Mycophenolsäure oder Ornithinol in Mengen, die in der Tabelle aufgelistet sind, und auf pH 7,0 eingestellt ist, wurde eine Zellsuspension in sterilem Wasser geimpft. Die Zellen waren durch Kultivierung in natürlichem Medium (1 g/dl Polypepton, 1 g/dl Hefeextrakt und 0,5 g/dl NaCl, pH 7,0), in einer Agarschrägfläche bei 31,5ºC in 24 Stunden erhalten worden. Nach der Schüttelkultur in einem Reagenzglas für 24 Stunden wurde der Wachstumsgrad anhand der Trübung bestimmt. Tabelle 1 Stämme Mycophenolsäure-Konzentration (%) Ornithinol-Konzentration (%) Arthrobacter citreus Brevibacterium lactofermentum Corynebacterium glutamicum
- Andere Mikroorganismen des Genus Brevibacterium, des Genus Corynebacterium oder des Genus Arthrobacter, auf die das Verfahren der vorliegenden Erfindung anwendbar ist, können wie vorstehend beschrieben gewonnen werden.
- Medien, die zur Züchtung solcher Varianten verwendet werden, können herkömmliche Medien sein, die Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Ionen, Substanzen, die der vorstehend beschriebenen Auxotrophie genügen und, wenn nötig, andere organische Spurennährstoffe, einschließlich Vitamine usw., enthalten. Als Kohlenstoffquellen werden vorzugsweise Kohlenhydrate, wie Glucose, Sacharose, usw., organische Säuren, wie Essigsäure, usw., verwendet. Als Stickstoffquellen werden vorzugsweise Ammoniakwasser, Ammoniakgas, Ammoniumsalze, usw., verwendet. Als anorganische Ionen werden, abhängig von der Notwendigkeit, Kaliumionen, Natriumionen, Magnesiumionen, Phosphationen und ähnliche, dem Medium hinzugefügt.
- Die Inkubation wurde unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Wenn die Inkubation bei einer Einstellung des pH-Werts des Mediums auf einen Bereich von 4 bis 8 bei einer Temperatur von 25ºC bis 37ºC durchgeführt wird, können bessere Ergebnisse erzielt werden. Auf diese Art werden, während der Züchtung von 1 bis 7 Tagen, bemerkenswerte Mengen von L-Ornithin produziert und im Medium angereichert.
- Zur Gewinnung von L-Ornithin aus der Nährlösung, können herkömmliche Verfahren, wie ein Verfahren, das Ionenaustauscherharz usw. verwendet, angewandt werden.
- Durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung, kann die Ausbeute des durch Fermentation hergestellten L-Ornithins verbessert und die Produktionskosten können gesenkt werden.
- Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf das nachstehende Beispiel beschrieben.
- Ein Medium, das 10 g/dl Glucose, 7 g/dl (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 0,15 g/dl KH&sub2;PO&sub4;, 0,04 g/dl MgSO&sub4;.7H&sub2;O, 1 mg/dl FeSO&sub4;.7H&sub2;O, 1 mg/dl MnSO&sub4;.4H&sub2;O, 100 ug/l Thiaminhydrochlorid, 100 ug/l Biotin, 60 mg Sojabohnenproteinsäurehydrolysat (berechnet als Gesamtstickstoff), 15 mg/dl L-Arginin und 5 g/dl Calciumcarbonat (unabhängig sterilisiert) enthielt, wurde auf pH 7,2 eingestellt; 25 ml dieses Mediums wurden in eine Flasche mit einer Schulter und einem Fassungsvermögen von 500 ml gefüllt und nachfolgend durch Erhitzen sterilisiert. Eine Platinschlinge von dem Stamm, der in Tabelle 2 aufgelistet ist, wurde in das Medium geimpft und 4 Tage lang bei einer Temperatur von 31,5ºC geschüttelt. L-Ornithin wurde in der Menge hergestellt und in der Kulturlösung eines jeden Stammes angereichert, wie sie in der Tabelle 2 angegeben ist. Tabelle 2 Stamm Eigenschaft Menge des angereicherten L-Ornithin (g/dl) Arthrobacter citreus Brevibacterium lactofermentum Corynebacterium glutamicum Arg : Arginin-Auxotrophie Cit : Citrullin-Auxotrophie MPAγ : Mycophenolsäureresistenz ORLγ : Ornithinolresistenz VPγ : Vitamin P-Resistenz
Claims (3)
1. Verfahren zur Herstellung von L-Ornithin, das darin
besteht, daß in einem flüssigen Medium ein L-Ornithin
produzierender Mikroorganismus des Genus Brevibacterium, des Genus
Corynebacterium oder des Genus Arthrobacter gezüchtet wird,
der Auxothrophie für mindestens eine der Verbindungen Arginin
oder Citrullin hat und der resistent gegenüber mindestens
einer Verbindung, ausgewählt unter Mycophenolsäure und
Ornithinol, ist, und daß das L-Ornithin aus dem Medium gewonnen
wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Mikroorganismus
unter
Arthrobacter citreus AJ 12442 (FERM BP-2342)
Brevibacterium lactofermentum AJ 12444 (FERN BP-2344)
Corynebacterium glutamicum AJ 12445 (FERN BP-2345)
ausgewählt wird.
3. Mikroorganismus, der ausgewählt ist unter
Arthrobacter citreus AJ 12442 (FERN BP-2342)
Brevibacterium lactofermentum AJ 12444 (FERN BP-2344)
Corynebacterium glutamicum AJ 12445 (FERN BP-2345)
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