DE68919246T2

DE68919246T2 - Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren.

Info

Publication number: DE68919246T2
Application number: DE68919246T
Authority: DE
Inventors: Ryoichi Katsumata; Kuniki Kino
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1988-03-04
Filing date: 1989-03-01
Publication date: 1995-03-16
Anticipated expiration: 2009-03-02
Also published as: KR920007405B1; EP0331145B1; EP0331145A3; DE68919246D1; KR890014748A; JP2578488B2; JPH01317395A; EP0331145A2; US5595906A; US5484716A

Description

Hintergrund der Erfindung

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L- Tryptophan, L-Tyrosin oder L-Phenylalanin durch Fermentation. L- Tryptophan ist eine Aminosäure, die als Medikament, als Nahrungsmittel und als Zusatz zur Tiernahrung etc. verwendet werden kann; L-Tyrosin ist eine Aminosäure, die insbesondere als Medikament verwendet werden kann; und L-Phenylalanin ist eine Aminosäure, die in der pharmazeutischen und Nahrungsmittelindustrie verwendet werden kann.
Bis jetzt sind verschiedene Verfahren zur Herstellung von L- Tryptophan unter Verwendung coryneformer Glutaminsäure produzierender Bakterien bekannt; zum Beispiel ein Verfahren unter Verwendung eines Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium mit Bedarf an L-Tyrosin und L-Phenylalanin und Resistenz gegen mindestens eines der Tyrosinanaloga und Phenylalaninanaloga (japanische veröffentlichte geprüfte Patentanmeldung Nr. 19037/1976); ein Verfahren unter Verwendung eines Mikroorganismus, der gegen Tryptophananaloga wie 5- Methyltryptophan (japanische veröffentlichte geprüfte Patentanmeldung Nr. 18828/1973, 38795/1976 und 39517/1978) resistent ist; ein Verfahren unter Verwendung eines Mikroorganismus mit Bedarf an Histidin (japanische veröffentlichte geprüfte Patentanmeldung Nr. 4505/1972); und ein Verfahren unter Verwendung eines Brevibacterium-Stamms, dessen Pyruvatkinase-Aktivität erniedrigt ist oder fehlt (japanische veröffentlichte nicht-geprüfte Patentanmeldung Nr. 253391/1987)
Darüberhinaus sind verschiedene Verfahren zur Herstellung von L- Tyrosin oder L-Phenylalanin durch Fermentation unter Verwendung coryneformer Glutaminsäure produzierender Bakterien bekannt; zum Beispiel ein Verfahren unter Verwendung eines auxotrophen Mutantenstamms mit Bedarf an Aminosäuren, eines Mutantenstamms, der resistent gegen Aminosäureanaloga ist, eines Mutantenstamms, dessen Pyruvatkinase-Aktivität erniedrigt ist oder fehlt, oder eines Stamms, der alle diese Eigenschaften gleichzeitig aufweist (Nippon Nogeikagaku Kaishi, 50 (1), S.R. 79 (1979); japanische veröffentlichte nicht-geprüfte Patentanmeldung Nr. 128897/1986).
Andererseits sind Mikroorganismen, die L-Tyrosin oder L-Phenylalanin herstellen können, mittels rekombinanter DNA-Technik konstruiert worden. Als Beispiel eines L-Tyrosinproduzierenden Mikroorganismus ist ein eine rekombinante DNA tragender Stamm bekannt, die ein Gen enthält, das die 3-Desoxy-D-arabino-heptulosonat-7-phosphat-Synthase (nachstehend als DS bezeichnet) codiert, ein Gen, das die Chorismatmutase (nachstehend als CM bezeichnet) codiert, und ein Gen, das die Prephenatdehydrogenase oder Pretyrosin-Aminotransferase codiert (japanische veröffentlichte nicht-geprüfte Patentanmeldung Nr. 34197/1985). Als Beispiel für L-Phenylalanin produzierende Mikroorganismen ist ein Stamm bekannt, der eine rekombinante DNA trägt, die ein DS codierendes Gen enthält, oder Gene, die CM und Prephenatdehydratase (nachstehend als PD bezeichnet) codieren (japanische veröffentlichte nicht-geprüfte Patentanmeldung Nr. 24192/1985, 260892/1986 und 124375/1986).
Mit steigendem Bedarf für L-Tryptophan, L-Tyrosin und L-Phenylalanin in den letzten Jahren ist der Wunsch nach verbesserten Verfahren zu deren industriellen Herstellung aufgekommen.
Als Ergebnis intensiver Studien zur Gewinnung eines neuen Stammes mit höherer L-Tryptophan-, L-Tyrosin- oder L-Phenylalanin-Produktivität haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung herausgefunden, daß Stämme coryneformer Glutaminsäure produzierender Bakterien, die L- Tryptophan, L-Tyrosin oder L-Phenylalanin herstellen können, wenn sie mutiert werden, so daß die Phosphoenolpyruvatcarboxylase (EC. 4.1.1.31) (nachstehend als PC bezeichnet)-Aktivität abnimmt oder fehlt, diese Aminosäuren in hohem Maße produzieren können.

Zusammenfassung der Erfindung

Diese Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von L- Tryptophan, L-Tyrosin oder L-Phenylalanin bereit, umfassend die Züchtung eines coryneformen Glutaminsäure produzierenden Bakteriums, das L-Tryptophan, L-Tyrosin oder L-Phenylalanin produzieren kann und auch eine erniedrigte oder keine PC-Aktivität aufweist, in einem Medium und Gewinnung von in dessen Kulturbrühe angereichertem L- Tryptophan, L-Tyrosin oder L-Phenylalanin.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Das hier beschriebene coryneforme Glutaminsäure produzierende Bakterium ist ein Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium.
Als erfindungsgemäße Mutantenstämme können alle coryneformen Glutaminsäure produzierenden Bakterien, die L-Tryptophan, L-Tyrosin oder L-Phenylalanin produzieren können und auch erniedrigte oder keine PC-Aktivität aufweisen, verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Mutantenstämme können von jedem coryneformen Glutaminsäure produzierenden Bakterium stammen. Bevorzugte Beispiele für Spenderstämme sind die folgenden:
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium herculis ATCC13868
Corynebacterium lilium ATCC15990
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
Brevibacterium thiogenitalis ATCC19240
Die L-Tryptophan produzierenden Stämme können von den vorstehend erwähnten coryneformen Glutaminsäure produzierenden Bakterien durch Übertragung des Bedarfs an Tyrosin und Phenylalanin und/oder der Resistenz gegen Tryptophananaloga, wie 5-Methyltryptophan, stammen. Ein Beispiel für einen L-Tryptophan produzierenden Stamm ist Corynebacterium glutamicum ATCC 21851.
Die L-Tyrosin produzierenden Stämme können von coryneformen Glutaminsäure produzierenden Bakterien durch Übertragung des Bedarfs an L-Phenylalanin und/oder Resistenz gegen Aminosäureanaloga oder durch Einführung einer rekombinanten DNA, die Gene enthält, die DS, CM und Prephenatdehydrogenase oder Pretyrosinaminotransferase codieren (japanische veröffentlichte nicht-geprüfte Patentanmeldung Nr. 34197/1985) abgeleitet werden.
Darüberhinaus können die L-Tyrosin produzierenden Stämme auch durch Einführung einer rekombinanten DNA, die ein die genetische Information von Enzymen, die an der Biosynthese von L-Tyrosin beteiligt sind, wie DS und CM, betreffendes DNA-Fragment umfaßt, in einen L-Tryptophan produzierenden Mikroorganismus und dadurch Umwandlung des L-Tryptophan produzierenden Mikroorganismus in einen L-Tyrosin produzierenden Stamm gewonnen werden (japanische veröffentlichte nicht-geprüfte Patentanmeldung Nr. 94985/1988)
Die L-Phenylalanin produzierenden Stämme können von den coryneformen Glutaminsäure produzierenden Bakterien durch Übertragung des Bedarfs an L-Tyrosin und/oder Resistenz gegen Aminosäureanaloga oder durch Einführung einer rekombinanten DNA, die Gene enthält, die DS oder CM und PD codieren, abgeleitet werden(japanische veröffentlichte nichtgeprüfte Patentanmeldungen Nr. 24192/1985, 260892/1986 und 124375/1986). Darüberhinaus können L-Phenylalanin produzierende Stämme auch durch Einführung einer rekombinanten DNA, die ein die genetische Information von Enzymen, die an der Synthese von DS, CM und PD beteiligt sind, betreffendes DNA-Fragment umfaßt, in einen L- Tryptophan produzierenden Mikroorganismus und dadurch Umwandlung des L-Tryptophan produzierenden Mikroorganismus in einen L-Phenylalanin produzierenden Stamm gewonnen werden (japanische veröffentlichte nicht-geprüfte Patentanmeldung Nr. 105688/1988)
Die L-Tryptophan, L-Tyrosin oder L-Phenylalanin produzierenden Mikroorganismen, deren PC-Aktivität vermindert ist oder fehlt, können aus einem bekannten L-Tryptophan, L-Tyrosin oder L-Phenylalanin produzierenden Stamm durch Mutation, die eine solche Änderung in der PC-Aktivität hervorruft, gewonnen werden. In einer anderen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Mikroorganismen auch durch Übertragung der Auxotrophie und/oder Resistenz gegen Aminosäureanaloga auf einen Mutantenstamm, dessen PC-Aktivität vermindert ist oder fehlt, gewonnen werden.
Die Mikroorganismen, deren PC-Aktivität erniedrigt ist oder fehlt, können durch Behandlung der Zellen mit einem Mutagen mittels üblicher Verfahren, zum Beispiel Ultraviolettbestrahlung und Behandlung mit chemischen Mutagenen, wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (nachstehend als NTG bezeichnet) und salpetriger Säure, und nachfolgender Isolierung des gewünschten Stamms als Stamm mit Glutaminsäure-Bedarf gewonnen werden. Ein Mutantenstamm, dessen PC- Aktivität erniedrigt ist, kann auch als Stamm, der gegenüber einem Affinitätsmarkierungsreagenz für das Enzym empfindlicher ist, oder als prototrophe Revertante des Stamms mit Bedarf an L-Glutaminsäure und Mangel an PC-Aktivität isoliert werden.
Das Affinitätsmarkierungsreagenz, das auch als irreversibler, auf die aktive Stelle gerichteter Inhibitor bezeichnet wird, ist eine Verbindung, die spezifisch an das aktive Zentrum eines Enzyms binden kann und dadurch die katalytische Aktivität inaktiviert.
Beispiele von Stämmen, deren PC-Aktivität erniedrigt ist oder fehlt, sind Corynebacterium glutamicum BPS-13, das L-Tryptophan produzieren kann, Corynebacterium glutamicum K77, das L-Tyrosin produzieren kann, und Corynebacterium glutamicum K78, das L-Phenylalanin produzieren kann.
Die Produktion von L-Tryptophan, L-Tyrosin oder L-Phenylalanin durch einen erfindungsgemäßen Mikroorganismus kann auf eine für die Produktion von Aminosäuren übliche Weise durchgeführt werden.
Entweder ein synthetisches Medium oder ein natürliches Medium kann verwendet werden, solange es Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Substanzen, Wachstumsfaktoren und dergleichen enthält.
Als Kohlenstoffquelle können Kohlenhydrate, wie Glucose, Glycerin, Fructose, Saccharose, Maltose, Mannose, Stärke, Stärkehydrolysat und Melasse; Polyalkohole; und verschiedene organische Säuren, wie Benztraubensäure, Fumarsäure, Milchsäure und Essigsäure, verwendet werden. Kohlenwasserstoffe und Alkohole können in Abhängigkeit von der Assimilationsfähigkeit der Mikroorganismen verwendet werden. Bevorzugt wird Restmelasse verwendet.
Als Stickstoffquelle sind Ammoniak, verschiedene organische und anorganische Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumacetat; Harnstoff und andere stickstoffhaltige Verbindungen; und stickstoffhaltige organische Verbindungen, wie Pepton, NZ-Amin, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Caseinhydrolysat, Fischmehl oder seine Verdauungsprodukte, geeignet. Als anorganische Verbindungen werden Kaliummonohydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisensulfat, Mangansulfat und Calciumcarbonat erwähnt.
Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen als Schüttelkultur, durch Belüftung währende des Umrührens, etc. durchgeführt. Die bevorzugte Kulturtemperatur beträgt im allgemeinen 20 bis 40ºC. Der pH-Wert des Mediums wird etwa um den Neutralpunkt gehalten. Die Züchtungszeit ist im allgemeinen im Bereich von 1 bis 5 Tagen. L-Tryptophan, L-Tyrosin oder L-Phenylalanin können aus der Kultur durch Entfernen der mikrobiellen Zellen mittels Filtration oder Zentrifugation und Gewinnung der Aminosäure aus dem Filtrat oder dem Überstand gemäß bekannten Verfahren, wie Kristallisation durch Konzentrierung, Behandlung mit Aktivkohle und Behandlung mit einem Ionenaustauscher-Harz, isoliert werden.
Die folgenden Beispiele erläutern weiter die vorliegende Erfindung.
Beispiel 1: Isolierung eines Mutantenstamms, dessen PC-Aktivität erniedrigt ist.

(1) L-Tryptophan produzierender Stamm

Corynebacterium glutamicum ATCC218S1, das L-Tryptophan produzieren kann, wurde als Spenderstamm verwendet. Er wurde in einem Vollmedium (ein Medium enthaltend 20 g/l Bouillonpulver und 5 g/l Hefeextrakt in Wasser; pH 7,2) bei 30ºC 16 Stunden gezüchtet. Die gesammelten Zellen wurden mit einer 0,05 M Phosphat-Puffer-Lösung (pH 7,2) gewaschen und in der vorstehend erwähnten Pufferlösung in einer Konzentration von 10&sup9; Zellen/ml suspendiert. NTG wurde dieser Suspension bis zu einer Endkonzentration von 500 ug/ml zugesetzt, und das Gemisch 20 Minuten bei 30ºC gehalten. Die so behandelten Zellen wurden mit der vorstehend erwähnten Pufferlösung gewaschen und auf einem Minimalagarmedium mit einer in Tabelle 1 gezeigten Zusammensetzung, das weiter 0,5 ug/ml 3-Brombrenztraubensäure (nachstehend als 3BP bezeichnet) enthält, die eine als Affinitätsmarkierungsreagenz für PC bekannte Verbindung ist (LT. Biochem., 86. 1251-1257 (1979)), ausgestrichen. Tabelle 1 Zusammensetzung des Minimalagarmediums Glucose Biotin p-Aminobenzoesäure Thiaminhydrochlorid L-Tyrosin L-Phenylalanin Agar
Die Züchtung wurde 5 bis 10 Tage bei 30ºC durchgeführt und die kleineren der auf dem Medium gewachsenen Kolonien wurden von der Platte aufgepickt. Stämme, die gegenüber 3BP empfindlicher sind als der Spenderstamm, wurden dann ausgewählt, und ein Stamm, dessen PC- Aktivität erniedrigt war, Corynebacterium glutamicum BPS-13, wurde schließlich aus den Mutantenstämmen, die gegenüber 3BP empfindlich sind, isoliert.
Dieser Stamm wurde am 2. März 1988 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan (FRI) unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-1777 hinterlegt.
Die Empfindlichkeit des Spenderstamms ATCC21851 und des Mutantenstamms BPS-13 gegenüber 3BP und deren PC- und Pyruvatkinase- (nachstehend als PK bezeichnet)-Aktivitäten sind in Tabelle 2 gezeigt. Die 3BP-Empfindlichkeit wurde durch Ausstreichen jeder der zwei Stämme auf Platten mit Minimalagarmedium mit der in Tabelle 1 gezeigten Zusammensetzung, das außerdem verschiedene Konzentrationen an 3BP enthielt, viertägige Züchtung der Stämme bei 30ºC und Beobachtung des Wachstumsgrades gemessen. Die PC-Aktivität und die PK-Aktivität wurden durch das in LT. Biochem., 66 (3), 297-311 (1969) und Agric. Biol. Chem., 48 (5), 1189-1197 (1984) beschriebene Verfahren unter Verwendung von Zell-Rohextrakten gemessen. Die Zell- Rohextrakte wurden gemäß dem nachstehend beschriebenen Verfahren hergestellt. Jeder der Stämme wurde in ein Medium (PH 7,2), enthaltend 30 g/l Glucose, 0,5 g/l MgSO&sub4;x7H&sub2;O, 10 mg/l FeSO&sub4;x7H&sub2;O, 1 g/l KH&sub2;PO&sub4;, l mg/1 MnSO&sub4;x4H&sub2;O, 4 g/l Ammoniumsulfat, 2 g/l Harnstoff, 50 ug/l Biotin, 2,5 mg/l p-Aminobenzoesäure, 1 mg/l Thiaminhydrochlorid, 50 mg/l Natriumchlorid, 50 mg/1 L-Tyrosin und 50 mg/l L-Phenylalanin inokuliert und unter Schütteln 24 Stunden bei 30ºC unter Schütteln gezüchtet. Die gewachsenen Zellen wurden gesammelt, zweimal mit 0,2%iger wässriger Kaliumchloridlösung gewaschen, in 0,1 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,5) suspendiert und mittels Ultraschallwellen aufgebrochen. Das 50 erhaltene Gemisch wurde zentrifugiert und der uberstand wurde über Nacht gegen die vorstehend erwähnte Pufferlösung dialysiert, wobei der Zell- Rohextrakt erhalten wurde. Die in Tabelle 2 gezeigten Werte werden durch Berechnung der spezifischen Aktivität pro Einheitsmenge des in den Rohextrakten enthaltenen Proteins und Gewinnung des relativen Wertes, wenn die spezifische Aktivität für den Spenderstamm als 100 definiert wird, erzielt. Tabelle 2 Konzentration an 3 BP (ug/ml) Stamm (Spenderstamm)

(2)L-Tyrosin produzierender Stamm

Corynebacterium glutamicum ATCC21851, das L-Tryptophan produzieren kann, wurde mit dem rekombinanten Plasmid pCDS-CM1, das DS- und CM- Gene enthält, wie in der japanischen veröffentlichten nicht-geprüften Patentanmeldung Nr. 94985/1988 beschrieben, transformiert und der Corynebacterium glutamicum T6-Stamm (ATCC21851/pCDS-CM1), der L- Tyrosin produzieren kann, wurde, wie vorstehend erwähnt, nach dem in der gleichen Patentanmeldung beschriebenen Verfahren isoliert. Das heißt, der ATCC21851-Stamm wurde in NB-Medium (ein Medium enthaltend 20 g/l Bouillonpulver und 5 g/l Hefeextrakt in Wasser; pH 7,2) gezüchtet. Dann wurden 4 ml der so erhaltenen Stammkultur in 40 ml halb-synthetisches Medium SSM (ein Medium enthaltend 20 g/l Glucose, 10 g/l (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 3 g/l Harnstoff, 1 g/l Hefeextrakt, 1 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 0,4 g/l MgCl&sub2;x6H&sub2;O, 10 mg/l FeSO&sub4;x7H&sub2;O, 0,2 mg/l MnSO&sub4;x4-6H&sub2;O, 0,9 mg/l ZnSO&sub4;x7H&sub2;O, 0,4 mg/l CuSO&sub4;x5H&sub2;O, 0,09 mg/l Na&sub2;B&sub4;O&sub7;x10 H&sub2;O, 0,04 mg/l (NH&sub4;)&sub6;Mo&sub7;O&sub2;&sub4;x4H&sub2;O, 30 ug/l Biotin und 1 mg/l Thiaminhydrochlorid in Wasser; pH 7,2) , das außerdem je 100 g/ml L-Tyrosin und L- Phenylalanin enthielt, inokuliert und die Kultur wurde unter Schütteln bei 30ºC gezüchtet. Die optische Dichte (OD) bei 660 nm wurde mittels eines Tokyo Koden Kolorimeters bestimmt und wenn die Dichte den Wert 0,2 erreichte, wurde Penicillin G bis zu einer Endkonzentration von 0,5 Einheiten/ml zugesetzt. Die Kultur wurde unter Schütteln weiter gezüchtet, bis die OD 0,6 erreichte. Die mikrobiellen Zellen wurden gesammelt und bis zu einer Endkonzentation von etwa 10&sup9; Zellen/ml in 10 ml RCGP-Medium (ein Medium enthaltend 5 g/l Glucose, 5 g/l Casaminosäure, 2,5 g/l Hefeextrakt, 3,5 g/1 K&sub2;HPO&sub4;, 1,5 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 0,41 g/l MgCl&sub2;x6H&sub2;O, 10 mg/l FeSO&sub4;x7H&sub2;O, 2 mg/1 MnSO&sub4;x4-6H&sub2;O, 0,9 mg/1 ZnSO&sub4;x7H&sub2;O, 0,04 mg/l (NH&sub4;)&sub6;Mo&sub7;O&sub2;&sub4;x4H&sub2;O, 30 ug/l Biotin, 3 mg/l Thiaminhydrochlorid, 135 g/l Dinatriumsuccinat und 30 g/l Polyvinylpyrrolidon (M.G.: 10.000) in Wasser; pH 7,6), das außerdem 1 mg/ml Lysozym enthielt, suspendiert. Die so erhaltene Suspension wurde in ein L-Typ-Teströhrchen gebracht und vorsichtig 5 Stunden bei 30ºC zur Induktion von Protoplasten geschüttelt.
Die so erhaltene Protoplasten-Suspension (0,5 ml) wurde in ein kleines Teströhrchen verbracht und 5 Minuten bei 2 500 x g zentrifugiert, und die gesammelten Protoplasten wurden in 1 ml TSMC- Pufferlösung (10 mM MgCl&sub2;, 30 mM CaCl&sub2;, 50 mM Tris und 400 mM Saccharose; pH 7,5) suspendiert und mittels Zentrifugation gewaschen. Die Protoplasten wurden in 0,1 ml TSMC-Pufferlösung resuspendiert. Dann wurden 10 ul TSMC-Pufferlösung, enthaltend 1 ug pCDS-CMI-Plasmid- DNA, der Suspension zugesetzt, und 0,8 ml TSMC-Pufferlösung, enthaltend 20% PEG6000 (Nakarai Chemicals), wurden darüberhinaus zugesetzt. Dann wurden 2 ml RCGP-Medium (pH 7,2) 3 Minuten später zugesetzt, und das Gemisch 5 Minuten bei 2 500 x g zur Entfernung des Überstands zentrifugiert. Die präzipitierten Protoplasten wurden in 1 ml RCGP-Medium, suspendiert. Die so erhaltene Suspension (0,2 ml) wurde auf RCGP-Agarmedium (RCGP-Medium enthaltend 1,4% Agar; pH 7,2), das außerdem 400 ug/ml Spectinomycin enthielt, ausgestrichen und 7 Tage bei 30ºC gezüchtet. Der auf dem Agarmedium gewachsene Stamm wurde als Transformante isoliert.
Der so erhaltene Corynebacterium glutamicum T6-Stamm (ATCC21851/pCDS- CM1) wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 (1) beschrieben, mutiert, und der L-Tyrosin produzierende Corynebacterium glutamicum K77-Stamm, dessen PC-Aktivität erniedrigt war, wurde als 3BP- empfindlicher Mutantenstamm isoliert. Der K77-Stamm wurde am 21. September 1988 bei FRI unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-2062 hinterlegt. 3 BP-Sensitivität, PC-Aktivität und PK-Aktivität des Spenderstamms T6 und des Mutantenstamms K77 wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 (1) gemessen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 angegeben. Tabelle 3 Stamm (Spenderstamm)

(3) L- Phenylalanin produzierender Stamm

Der L-Phenylalanin produzierende Corynebacterium glutamicum T17-Stamm (ATCC21851 pEaroG-pheA3) wurde durch Transformation des L-Tryptophan produzierenden Corynebacterium glutamicum ATCC21851 mit dem rekombinanten Plasmid pEaroG-pheA3, enthaltend DS-, CM- und PD-Gene von Escherichia coli, wie in der japanischen veröffentlichten nichtgeprüften Patentanmeldung Nr. 105688 offenbart, auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 (2) beschrieben, gewonnen, außer daß RCGP- Agarmedium, enthaltend 200 ug/ml Kanamycin, für das Absuchen der Transformante verwendet wurde.
Der so erhaltene L-Phenylalanin produzierende Corynebacterium glutamicum T17-Stamm (ATCC21851/pEaroG-pheA3) wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 (l) mutiert und der L-Phenylalaninproduzierende Corynebacterium glutamicum K78-Stamm, dessen PC- Aktivität erniedrigt war, wurde isoliert. Der K78-Stamm wurde am 21. September 1988 bei FRI unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-2063 hinterlegt. Die 3BP-Sensitivität, PC-Aktivität und PK-Aktivität des Spenderstamms T17 und des Mutantenstamms K78 wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 (1) gemessen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4 Stamm (Spenderstamm)

Beispiel 2

(1) Test auf die Produktion von L-Tryptophan

Corynebacterium glutamicum BPS-13 (FERM BP-1777) wurde in einen 300 ml-Erlenmeyerkolben, enthaltend 20 ml eines Ausgangsmediums (2% Glucose, 1,5% Polypepton, 1,5% Hefeextrakt, 0,25% Natriumchlorid, 0,1% Harnstoff, 200 mg/l L-Tyrosin und 200 mg/l L-Phenylalanin; pH 7,2), inokuliert und 24 Stunden bei 30ºC unter Schütteln auf einem Rundschüttler bei 210 Upm gezüchtet. Die so erhaltene Stammkultur (2 ml) wurde dann in einen 300 ml-Erlenmeyerkolben, enthaltend 20 ml eines Fermentationsmediums der nachstehend angegebenen Zusammensetzung, inokuliert und 72 Stunden unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend erwähnt gezüchtet. Der Spenderstamm ATCC21851 wurde als Kontrolle auf die gleiche Weise wie vorstehend beschrieben gezüchtet. Nach der Züchtung wurde jedes der Kulturfiltrate einer Papierchromatographie unterworfen und nach der Farbbildung mit Ninhydrin wurde die Menge an gebildetem L-Tryptophan mittels quantitativer kolorimetrischer Bestimmung gemessen.
Das Ergebnis wird in Tabelle 5 gezeigt.

Zusammensetzung des Fermentationsmediums:

6% Glucose, 0.,05% KH&sub2;PO&sub4;, 0,05% K&sub2;HPO&sub4;, 0,025% MgSO&sub4;x7H&sub2;O, 2% Ammoniumsulfat, 30 ug/l Biotin, 10 mg/1 MnSO&sub4;x7H&sub2;O, 0,5% Maisquellwasser und 2% CaCO&sub3; (PH 7,2). Tabelle 5 Stamm Menge an gebildetem L-Tryptophan (mg/ml) (Spenderstamm)

(2) Test auf die Produktion von L-Tyrosin

Corynebacterium glutamicum K77 (FERM BP-2062) wurde in einen 300 ml-Erlenmeyerkolben, enthaltend 20 ml eines Ausgangsmediums (2% Glucose, 1,5% Polypepton, 1,5% Hefeextrakt, 0,25% Natriumchlorid und 0,1% Harnstoff; pH 7,2), inokuliert und unter Schütteln auf einem Rundschüttler bei 210 Upm 24 Stunden bei 30ºC gezüchtet. Die so erhaltene Stammkultur (2 ml) wurde dann in einen 300 ml- Erlenmeyerkolben, enthaltend 20 ml eines Fermentierungsmediums der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 2 (1), inokuliert und 72 Stunden unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend erwähnt gezüchtet. Getrennt davon wurde auch der Spenderstamm T6 (ATCC21851/pCDS-CM1) als Kontrolle auf die gleiche Weise gezüchtet. Nach der Züchtung wurde die so erhaltene Kulturbrühe (je 1 ml) mit 50 ul einer 6N NaOH-Lösung gemischt und 5 Minuten bei 65ºC erhitzt, um das präzipitierte L-Tyrosin vollständig zu lösen. Das Kulturfiltrat wurde einer Papierchromatographie unterworfen und nach der Farbbildung mit Ninhydrin wurde die Menge an gebildetem L-Tyrosin durch quantitative kolorimetrische Bestimmung gemessen.
Das Ergebnis wird in Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6 Stamm Menge an gebildetem L-Tyrosin (mg/ml)

(3) Test auf die Produktion von L-Phenylalanin

Corynebacterium glutamicum K78 (FERM BP-2063) und sein Spenderstamm T17 (ATCC21851/pEaroG-pheA3) wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 (2) gezüchtet. Nach der Züchtung wurde jedes der Kulturfiltrate einer Papierchromatographie unterworfen und nach der Farbbildung mit Ninhydrin wurde die Menge des gebildeten L- Phenylalanins durch quantitative kolorimetrische Bestimmung gemessen. Das Ergebnis ist in Tabelle 7 gezeigt. Tabelle 7 Stamm Menge an gebildetem L-Phenylalanin (mg/ml)

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer Aminosäure, die ausgewählt ist aus L-Tryptophan, L-Tyrosin und L-Phenylalanin, umfassend die Züchtung eines coryneformen, Glutaminsäure produzierenden Bakteriums, das L-Tryptophan, L- Tyrosin und L-Phenylalanin produzieren kann und auch eine erniedrigte Phosphoenolpyruvatcarboxylase-Aktivität aufweist, in einem Medium und Gewinnung von in dessen Kulturbrühe angereichertem L-Tryptophan, L-Tyrosin oder L-Phenylalanin.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus die Art Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium herculis, Corynebacterium lilium, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium divaricatum oder Brevibacterium thiogenitalis ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Mikroorganismus Corynebacterium glutamicum BPS-13 (FERM BP-1777), Corynebacterium glutamicuin K77 (FERM BP-2062) oder Corynebacterium glutamicum K78 (FERM BP-2063) ist.

4. Biologisch reine Kultur von Corynebacterium glutamicum BPS-13 (FERN BP 1777).

5. Biologisch reine Kultur von Corynebacterium glutamicum K77 (FERN BP-2062).

6. Biologisch reine Kultur von Corynebacterium glutamicum K78 (FERN BP-2063).