DE3486232T2

DE3486232T2 - Verfahren zur Herstellung von L-Arginin.

Info

Publication number: DE3486232T2
Application number: DE89108171T
Authority: DE
Inventors: Masako Hara; Ryoichi Katsumata; Toru Mizukami; Tetsuo Oka; Akio Ozaki; Haruhiko Yokoi
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1983-02-17
Filing date: 1984-02-16
Publication date: 1994-03-17
Anticipated expiration: 2004-02-17
Also published as: DE3486147D1; DE3486229D1; DE3484378D1; WO1984003301A1; DE3486232D1; EP0334391A1; EP0136359A1; EP0136359B1; DE3486188T2; EP0332234A1; EP0336452A1; DE3486147T2; AU2572184A; EP0336452B1; AU568340B2; EP0136359A4; DE3486188D1; EP0332233A1; DE3486229T2; EP0334391B1

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Arginin durch ein neues Verfahren zur Expression eines Gens. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von L-Arginin durch Transformation eines zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehörenden Wirtsmikroorganismus mit einer rekominanten DNA eines DNA-Fragments, das ein an der Biosynthese von L-Arginin beteiligtes Gen enthält, und einer Vector-DNA, die Züchtung der Transformante in einem Nährmedium, die Akkumulation des L-Arginins im Nährmedium und seine Gewinnung daraus.
Verfahren zur direkten Herstellung von Aminosäuren durch Fermentation unter Verwendung von Wildtypstämmen oder mutierten Stämmen, wie auxotrophen und gegenüber Aminosäure- Analogen resistenten Stämmen der zur Gattung Corynebacterium, Brevibacterium, Serratia und ähnlichen gehörenden Bakterien, sind bekannt.
Zum Beispiel die Herstellung von Histidin unter Verwendung eines gegen Histidin-Analoge resistenten Stammes (Japanische Patentveröffentlichung Nr. 8596/81), die Herstellung von Tryptophan unter Verwendung eines gegen Tryptophan-Analoge resistenten Stammes (Japanische Patentveröffentlichungen mit den Nrn. 4505/72 und 19037/76), die Herstellung von Isoleucin unter Verwendung eines gegen Isoleucin-Analoge resistenten Stammes (Japanische Patentveröffentlichungen mit den Nrn. 38995/72, 6237/76 und 32070/79), die Herstellung von Phenylalanin unter Verwendung eines gegen Phenylalanin-Analoge resistenten Stammes (Japanische Patentveröffentlichung Nr. 10035/81), die Herstellung von Tyrosin unter Verwendung eines für sein Wachstum Phenylalanin benötigenden oder gegen Tyrosin resistenten Stammes [Agr. Chem.
Soc., Japan 50 (1) (1976), R79-R87], die Herstellung von Arginin unter Verwendung eines gegen L-Arginin-Analoge resistenten Stammes [Agr. Biol. Chem. 36 (1972), 1675-1684, japanische Patentveröffentlichungen mit den Nrn. 37235/79 und 150381/82] und ähnliches ist bekannt.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von L-Arginin zum Zweck einer verbesserten L-Arginin-Produktivität durch rekombinante, sich von dem üblichen Mutationszüchtungsverfahren unterscheidende DNA-Technologie, unter Verwendung eines zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehörenden Mikroorganismus.
Die hier genannten Erfinder konstruierten Plasmidvektoren, die in einem zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehörenden Mikroorganismus zur autonomen Replikation befähigt sind und die selektierbare Marker und geeignete Clonierungsstellen aufweisen, und entwickelten ein sehr wirksames Transformationssystem (Japanische, veröffentlichte, nicht-geprüfte Patentanmeldungen mit den Nrn. 183799/82, 186492/82 und 186489/82). Die hier genannten Erfinder erkannten ferner den Nutzen der Plasmidvektoren zur Expression eines Fremdgens in einem Wirtsmikroorganismus und zur Erhöhung der Aminosäureproduktivität durch eine den Verfahren der rekombinanten DNA-Technologie (Methods in Enzymology 68, Recombinant DNA, herausgegeben von Ray Wu, Academic Press 1979, US-Patent Nr. 4,237,224) entsprechende Legierung eines DNA-Fragmentes, das ein an der Biosynthese von Aminosäuren, zum Beispiel von Glutaminsäure und Lysin, beteiligtes Fremdgen enthielt, mit den Plasmidvektoren und die Transformation von Corynebacterium glutamicum L-22 oder seiner Abkömmlinge unter Verwendung der von den hier genannten Erfindern entwickelten Transformationsverfahren (Japanische, veröffentlichte, nicht-geprüfte Patentanmeldung Nr. 126789/83).
Die hier genannten Erfinder haben festgestellt, daß die durch das vorstehend beschriebene Verfahren erzeugten Mikroorganismen eine erhöhte Arginin-Produktivität erwerben.
Es gibt keinen Bericht über ein Beispiel für einen zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehörenden Wirtsmikroorganismus, in dem ein gewünschtes Gen exprimiert und die Produktivität von L-Arginin erhöht wird, durch Einführung einer das gewünschte Gen und den Vektor, von denen eine(s)r für den Wirtsmikroorganismus fremd ist, enthaltenden rekombinanten DNA in einen solchen Wirtsmikroorganismus.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend im einzelnen erläutert.
Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur Herstellung von L-Arginin durch Züchtung einer Transformante in einem Medium, die durch Transformation eines zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehörenden Mikroorganismus mit einer rekombinanten DNA eines DNA-Fragments erhalten wird, das ein an der Biosynthese von L-Arginin beteiligtes Gen und eine Vektor-DNA enthält.
Bezüglich des DNA-Fragments, das das in der vorliegenden Erfindung verwendete Gen enthält, wird das DNA-Fragment verwendet, das ein an der Biosynthese von L-Arginin beteiligtes Gen enthält, das von Eukarvoten, Prokaryoten, Viren, Bacteriophagen oder Plasmiden stammt. Bezüglich des von Prokarvoten stammenden Gens wird vorzugsweise das Gen verwendet, das von einem zur Gattung Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium, Microbacterium, Bacillus, Staphylococcus, Streptococcus oder Serratia gehörenden Bakterium stammt und an der Biosynthese von L-Arginin oder an dem die Biosynthese betreffenden Metabolismus beteiligt ist.
Bezüglich der am meisten bevorzugten Quelle für das Gen werden Aminosäure-erzeugende Stämme und Aminosäure- Analoge-resistente Stämme, die von den vorstehend beschriebenen Bakterien stammen, verwendet. Die Resistenz gegenüber Aminosäure-Analoge kann auf einem Plasmid nach seiner Clonierung übertragen werden.
Als an der Biosynthese von L-Arginin beteiligte Enzyme werden die N-Acetylglutamat-Synthetase beschrieben, die N-Acetylglutamo-Kinase, N-Acetylglutamat-γ-semialdehyd- Dehydrogenase, N-Acetylornithin-δ-amino-Transferase, Acetylornithin-Deacetylase, N-Acetylglutamatacetylornithinacetyl- Transferase, Ornithincarbamoyl-Transferase, Arginosuccinat- Synthetase, Argininsuccinase und ähnliche [Agr. Biol. Chem. 43 (1979) , 1899-1903].
Als Gen, das die an der Biosynthese von L-Arginin beteiligten Enzyme codiert, wird die DNA verwendet, die die genetische Information von mindestens einem dieser Enzyme trägt.
Als DNA, die das an der Biosynthese von L-Arginin beteiligte und in der vorliegenden Erfindung verwendete Gen enthält, werden Gene erwähnt, die konvergent bei etwa 90 Minuten auf der Chromosomenkarte von Escherichia coli K-12 liegen, die die Acetylornithin-Deacetylase (argE), N-Acetylglutamat-γ-semialdehyd-Dehydrogenase (argC), N-Acetylglutamo-Kinase (argB) und Argininsuccinase (argH) codierenden Gene enthalten [N. Glansdorff, Genetics 51 (1965), 167].
Im Beispiel wird das rekombinante Plasmid pEarg1 verwendet, das die DNA der an der Biosynthese von L-Arginin beteiligten Escherichia coli K-12-Gene enthält.
pEarg1 kann als eine Rekombinante unter Verwendung eines Wirt-Vektor-Systems von Escherichia coli aus pLC20-10 und pCE53 erhalten werden. pLC20-10 wird aus der Genbank von Escherichia coli K-12 erhalten und ist als ein Plasmid bekannt, daß die vorstehend beschriebenen an der Biosynthese von Arginin beteiligten Gene trägt [Clarke, L. et al., Cell 9 (1976) , 91].
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Vektor sollte in Zellen des Wirtsmikroorganismus autonom replizieren. Es werden vorzugsweise Plasmide beschrieben, die von den hier genannten Erfindern aus den zur Gattung Corynebacterium gehörenden Mikroorganismen isoliert wurden, oder Abkömmlinge davon, wie pCG1 (Japanische, veröffentlichte, nicht-geprüfte Patentanmeldung mit der Nr. 134500/82), pCG2 (Japanische, veröffentlichte, nicht-geprüfte Patentanmeldung mit der Nr. 35197/83), pCG4 (Japanische, veröffentlichte, nicht-geprüfte Patentanmeldung mit der Nr. 183799/82), pCE51, pCE52 (Japanische, veröffentlichte, nicht-geprüfte Patentanmeldung mit der Nr. 126789/83), pCE53 (Japanische, veröffentlichte, nicht-geprüfte Patentanmeldung mit der Nr. 25398/83), pCE54, pCG11, pCB100 (Japanische, veröffentlichte, nicht-geprüfte Patentanmeldung mit der Nr. 105999/83) und ähnliche.
Diese Plasmide tragenden Mikroorganismen sind unter den nachstehend aufgeführten Hinterlegungsnummern beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, und bei der American Type Culture Collection, USA, hinterlegt worden. Plasmid Ferm P- ATCC
Die Plasmide pCE51, 52, 53 und 54 Können, wie nachstehend beschrieben, aus den vorstehend aufgeführten Plasmiden entwickelt werden.
pCE51 wird zum Beispiel wie nachstehend beschrieben hergestellt.
pCG1 wird aus den gezüchteten Zellen von Corynebacterium glutamicum 225-57 (Ferm P-5865, ATCC 31808) durch das in der Beschreibung der japanischen, veröffentlichten, nicht-geprüften Patentanmeldung mit der Nr. 134500/82 beschriebene Verfahren isoliert. pGA22 wird durch ein übliches Verfahren aus den gezüchteten, das Plasmid tragenden Escherichia coli-Zellen isoliert [An, G. et al., J. Bacteriol. 140 (1979), 400]. Das Plasmid pCG1 wird mit der Restriktionsendonuclease BglII linearisiert und ein mit BamHI gespaltenes und das Kanamycin-Resistenz-(Km®)-Gen enthaltende Fragment von pGA22 unter Verwendung der bei beiden Plasmiden gleichen überstehenden Enden mit dem linearisierten pCG1 ligiert. Die Isolierung von pCE51 aus dem ligierten DNA-Gemisch wird durch Selektion der Transformanten, die zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehören und die von pGA22 stammende Km® enthalten, und durch eine Analyse des Plasmids in der Transformante erreicht.
pCE51 weist ein Molekulargewicht von etwa 6 kb und Spaltstellen für HincII, HindIII, SmaI, XhoI und EcoRI auf und zeigt einen Km®-Phänotyp.
pCE52 und pCE53 werden, wie nachstehend beschrieben, hergestellt.
Das Plasmid pCG1 wird aus den gezüchteten Zellen von Corynebacterium glutamicum 225-57 (FERM P-5865, ATCC 31808) durch das in der vorstehenden Anmeldung beschriebene Verfahren und das Plasmid pGA22 durch ein übliches Verfahren aus den gezüchteten, das Plasmid tragenden Escherichia coli- Zellen isoliert. pCG1 mit einer einzigen BglII-Stelle wird mit dem Restriktionsenzym BglII linearisiert und pGA22 mit zwei BamHI-Stellen mit BamHI partiell gespalten. Die überstehenden Enden beider Plasmide werden aneinandergelagert und zur Herstellung eines zusammengesetzten Moleküls mit T4-Phagen-DNA-Ligase ligiert. Die Selektion der rekombinanten Plasmide im Legierungsgemisch erfolgt durch Isolierung der Transformanten der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium aufgrund der von pGA22 stammenden Arzneimittelresistenzen und durch eine anschließende Analyse der Plasmide in den Transformanten.
pCE52 und pCE53 weisen ein Molekulargewicht von etwa 10,9 kb und Spaltstellen für EcoRI, SalI, SmaI und XhoI auf. Während pCE52 einen Phänotyp mit Chloramphenicolresistenz (Cm®) und Km® zeigt, verleiht pCE53 einen Phänotyp mit Tetracyclinresistenz (Tc®), Cm® und Km®. Die Lage der Spaltstelle für XhoI im Km®-Gen ermöglicht eine Selektion durch Insertions- Inaktivierung (Verhinderung der Genexpression durch Insertion eines DNA-Fragmentes in das Gen).
Die Transformation mit dem ligierten DNA-Gemisch wird unter Verwendung von Protoplasten der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium und den in den japanischen, veröffentlichten, nicht-geprüften Patentanmeldungen mit den Nrn.
186492/82 und 186489/82 beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Mit Ausnahme des durch Insertion inaktivierten Resistenzgens werden die Gene, die die von pGA22 stammende Arzneimittelresistenz verleihen, zur Selektion verwendet. Im System ohne DNA-Zusatz werden die Transformanten als Kolonie gewonnen, die auf einem hypertonischen, üblicherweise 0,4-1,6 ug/ml Tc, 2,5-5 ug/ml Cm, 100-800 ug/ml Km, 100-400 ug/ml Sm oder 200-1000 ug/ml Spec enthaltenden Agarmedium regeneriert wird, das den nicht mit dem Legierungsgemisch behandelten Empfänger-Protoplasten die Reversion in normale Zellen nicht gestattet. In einer anderen Ausführungsform werden Transformanten auf einem Regenerationsmedium nichtselektiv regeneriert und die erhaltenen Zellen abgeschabt und resuspendiert, worauf anschließend diejenigen Zellen isoliert werden, die auf einem Agarmedium wachsen, das ein Arzneimittel in einer Konzentration enthält, bei der die normalen Zellen des Empfängers nicht wachsen können, das heißt üblicherweise 0,5-4 ug/ml Tc, 2-15 ug/ml Cm, 2-25 ug/ml Km, 5-50 ug/ml Sm oder 50-500 ug/ml Spec. Einige der mit Tc®, Cm® oder Km® selektierten Transformanten sind gleichzeitig mit weiteren, vom Plasmid pGA22 stammenden Arzneimittelresistenzen ausgestattet.
Die Plasmid-DNA-Moleküle in diesen Transformanten können nach den in den japanischen, veröffentlichten, nichtgeprüften Patentanmeldungen mit den Nrn. 134500/82 und 186489/82 beschriebenen Verfahren aus den gezüchteten Zellen der Transformanten isoliert und gereinigt werden. Die Strukturen der DNA-Moleküle können durch Spaltung mit verschiedenen Restriktionsendonucleasen und Analyse der DNA-Fragmente durch Agarose-Gelelektrophorese bestimmt werden. Die aus den Transformanten isolierten Plasmide sind pCE51, pCE52 und pCE53. Die Gewinnung der Plasmide aus den Stämmen wird nach den in den japanischen, veröffentlichten, nicht-geprüften Patentanmeldungen mit den Nrn. 134500/82, 183799/82 und 35197/83 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die Herstellung einer rekombinanten DNA von einer Vektor-DNA mit einem ein Gen enthaltenden DNA-Fragment wird durch die übliche Technik der In vitro-DNA-Rekombination durchgeführt.
Die Technik der In vitro-DNA-Rekombination wird durch Spaltung und Legierung einer ein gewünschtes Gen enthaltenden Donor-DNA mit einer Vektor-DNA durchgeführt (vgl. die japanische, veröffentlichte, nicht-geprüfte Patentanmeldung mit der Nr. 126789/83 und US-Patent Nr. 4,237,224).
Die Ligasereaktion liefert rekombinante Moleküle, die andere Gene als das gewünschte Gen enthalten. Die gewünschte rekombinante DNA kann erhalten werden durch direkte Transformation eines Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium mit dem ligierten DNA-Gemisch, Selektion der Transformanten, die den vom gewünschten Gen stammenden Phänotyp aufweisen, und Isolierung der gewünschten rekombinanten DNA aus den gezüchteten Zellen der Transformanten. Anstelle der direkten Clonierung des gewünschten Gens in einen Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium kann das gewünschte Gen durch Verwendung eines anderen Wirt-Vektor-Systems, zum Beispiel Escherichia coli, cloniert werden. Es wird dann in einen Vektor der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium zur Transformation dieser Mikroorganismen in vitro umcloniert, und das gewünschte rekombinante Plasmid enthaltende Transformanten werden, wie vorstehend beschrieben, selektiert.
Das Verfahren zur Clonierung eines Gens in den Wirtsmikroorganismus Escherichia coli wird zum Beispiel in Methods in Enzymology 68 (1979), Ray Wu (Hrsg.), Academic Press, New York, beschrieben.
Die nachstehend angegebenen Verweise sind bei der Konstruktion rekombinanter DNA hilfreich:
Cohen, S. N. et al., US-Patent Nr. 4,237,224;
Idenshi Sosa Jikkenho, herausgegeben von Yasuyuki Takagi, gedruckt von Kodansha Scientific (1980);
Methods in Enzymology 68, Recombinant DNA, herausgegeben von Ray Wu, Academic Press, 1979;
Japanische, veröffentlichte, nicht-geprüfte Patentanmeldung mit der Nr. 126789/83.
In der vorliegenden Erfindung können Mikroorganismen, die zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehören und zur Aufnahme von DNA-Molekülen kompetent sind, als Wirtsmikroorganismen verwendet werden. Nachstehend sind Beispiele geeigneter Wirtsmikroorganismen aufgeführt. Hinterlegungsnummer Ferm P- ATCC Corynebacterium glutamicum Corynebacterium glutamicum L-15 Corynebacterium glutamicum LA-105 Corynebacterium glutamicum K-38 Corynebacterium glutamicum K-43 Corynebacterium herculis Corynebacteriumherculis L-103 Corynebacterium acetoacisophilum Corynebacterium lilium Brevibacterium divaricatum Brevibacterium divaricatum L-204 Brevibacterium lactofermentum Brevibacterium lactofermentum L-312 Brevibacterium flavum Brevibacterium immariophilium Brevibacterium thiogenitalis
Die Transformation der Wirtsmikroorganismen mit rekombinanten DNA-Molekülen wird in den nachstehend beschriebenen Schritten durchgeführt:
1) Herstellung von Protoplasten aus gezüchteten Zellen;
2) Transformation der Protoplasten mit einer rekombinanten DNA;
3) Regeneration der Protoplasten zu normalen Zellen und Selektion einer Transformante.
Diese Schritte sind nachstehend im einzelnen beschrieben.

1. Herstellung von Protoplasten aus gezüchteten Zellen

Die Herstellung von Protoplasten wird durch Züchtung eines Mikroorganismus unter Bedingungen durchgeführt, die eine Empfindlichkeit gegen Lysozym, einem lytischen Enzym, erzeugen und durch Behandlung der gezüchteten Zellen mit Lysozym in einer hypertonischen Lösung zur Entfernung der Zellwände. Zur Erzeugung Lysozym-empfindlicher mikrobieller Zellen werden die Synthese bakterieller Zellwände verhindernde Reagenzien verwendet. Lysozym-empfindliche mikrobielle Zellen werden zum Beispiel durch eine während der logarithmischen Wachstumsphase zugesetzte, das Wachstum nicht verhindernde oder behindernde Menge Penicillin und durch eine nachfolgende, über mehrere Generationen fortgesetzte Züchtung erhalten.
Zur Züchtung kann jedes Medium, in dem der Mikroorganismus wachsen kann, verwendet werden. Es werden zum Beispiel Nährmedium NB (pH-Wert 7,2) verwendet, das aus 20 g/l pulverförmiger Bouillon und 5 g/l Hefeextrakt besteht, und halbsynthetisches Medium SSM (pH-Wert 7,2), das aus 10 g/l Glucose, 4 g/l NH&sub4;Cl, 2 g/l Harnstoff, 1 g/l Hefeextrakt, 1 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 3 g/l K&sub2;HPO&sub4;, 0,4 g/l MgCl&sub2; · 6 H&sub2;O, 10 mg/l FeSO&sub4; · 7 H&sub2;O, 0,2 mg/l MnSO&sub4; · (4-6) H&sub2;O, 0,9 mg/l ZnSO&sub4; · 7 H&sub2;O, 0,4 mg/l CuSO&sub4; · 5 H&sub2;O, 0,09 mg/l Na&sub2;B&sub4;O&sub7; · 10 H&sub2;O, 0,04 mg/l (NH&sub4;)&sub6;Mo&sub7;O&sub2;&sub4; · 4 H&sub2;O, 30 ug/l Biotin und 1 mg/l Thiaminhydrochlorid besteht.
Das Medium wird mit mikrobiellen Zellen beimpft und die Züchtung unter Schütteln durchgeführt.
Die optische Dichte (OD) des Kulturmediums bei 660 nm wird mit einem Kolorimeter überwacht und Penicillin, zum Beispiel Penicillin G, im Anfangsstadium der logarithmischen Wachstumsphase (OD: 0,1-0,4) in einer Konzentration von 0,1 bis 2,0 E/ml zugesetzt. Die Züchtung wird bis zu einem OD-Wert von 0,3-0,5 fortgesetzt, anschließend werden die Zellen geerntet und mit SSM-Medium gewaschen. Die gewaschenen Zellen werden in einem geeigneten hypertonischen Medium resuspendiert, wie PFM-Medium (pH-Wert 7,0-8,5), bei dem 0,4 M Saccharose und 0,01 M MgCl&sub2; · 6 H&sub2;O einem zweifach verdünnten SSM-Medium zugesetzt werden, RCG-Medium (pH-Wert 7,0-8,5), das aus 5 g/l Glucose, 5 g/l Caseinhydrolysat, 2,5 g/l Hefeextrakt, 3,5 g/l K&sub2;HPO&sub4;&sub1; 1,5 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 0,41 g/l MgCl&sub2; · 6 H&sub2;O, 10 mg/l FeSO&sub4; · 7 H&sub2;O, 2 mg/l MnSO&sub4; · (4-6) H&sub2;O, 0,9 mg/l ZnSO&sub4; · 7 H&sub2;O, 0,4 mg/l CuSO&sub4; · 5 H&sub2;O, 0,09 mg/l Na&sub2;B&sub4;O&sub7; · 10 H&sub2;O, 0,04 mg/l (NH&sub4;)&sub6;Mo&sub7;O&sub2;&sub4; · 4 H&sub2;O, 30 ug/l Biotin, 2 mg/l Thiaminhydrochlorid und 135 g/l Natriumsuccinat besteht, oder RCGP-Medium, das aus RCG-Medium und 3% Polyvinylpyrrolidon besteht. Der Zusatz von Lysozym zur Zellsuspension erfolgt bis zu einer Endkonzentration von 0,2 bis 10 mg/ml, und man läßt das Gemisch sich bei einer Temperatur von 30 bis 37ºC umsetzen. Die Bildung der Protoplasten entwickelt sich mit der Zeit und wird mit einem optischen Mikroskop überwacht. Der zur Umwandlung der meisten Zellen in Protoplasten erforderliche Zeitraum hängt von den Konzentrationen des zur Lysozym-Sensibilisierung verwendeten Penicillins und der verwendeten Lysozymmenge ab. Der Zeitraum beträgt unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen 3-24 Stunden.
Da die gebildeten Protoplasten unter hypotonischen Bedingungen zerstört werden, wird die Menge der gebildeten Protoplasten indirekt aus der Zahl der die hypotonischen Bedingungen überlebenden normalen Zellen bestimmt. Üblicherweise hält man das Verhältnis der überlebenden normalen Zellen unterhalb von 10&supmin;&sup4; pro Lysozym-behandelter normaler Zelle.
Die vorstehend hergestellten Protoplasten sind auf einem geeigneten hypertonischen Agarmedium fähig, Kolonien zu bilden (zu regenerieren) . Als Agarmedium wird vorzugsweise ein Nährmedium, ein halbsynthetisches Medium oder ein verschiedene Aminosäuren enthaltendes synthetisches Medium verwendet, das 0,3 bis 0,8 M Natriumsuccinat und 0,5 bis 6% Polyvinylpyrrolidon mit einem Molekulargewicht von 10000 oder 40000 enthält. Üblicherweise wird halbsynthetisches RCGP-Medium (pH-Wert 7,2), bei dem 1,4% Agar zum RCGP-Agarmedium zugesetzt werden, verwendet. Die Regeneration wird bei einer Temperatur von 25 bis 35ºC durchgeführt. Die zur Regeneration von Protoplasten erforderliche Züchtungszeit hängt vom verwendeten Stamm ab, und Kolonien können üblicherweise nach 10 bis 14 Tagen entnommen werden. Die Wirksamkeit der Regeneration von Protoplasten auf RCGP-Medium hängt auch von dem verwendeten Stamm, den während der Züchtung zugesetzten Penicillin-Konzentrationen und der verwendeten Lysozym-Konzentration ab. Die Wirksamkeit liegt üblicherweise bei 10&supmin;² - 10&supmin;&sup4; Zellen pro normaler, mit Lysozym behandelter Zelle.

2. Transformation der Protoplasten mit einer rekombinanten DNA

Die Einführung einer rekombinanten DNA in den Protoplasten wird durch Mischen des Protoplasten und der DNA in einer die Protoplasten schützenden hypertonischen Lösung und durch Zusatz von Polyethylenglycol (PEG, durchschnittliches Molekulargewicht: 1540-6000) oder Polyvinylalkohol (PVA, Polymerisationsgrad: 500-1500) und einem zweiwertigen Metallkation, das die Aufnahme von DNA stimuliert, zu dem Gemisch durchgeführt. Üblicherweise zum Schutz der Protoplasten von anderen Mikroorganismen verwendete Wirkstoffe zur Stabilisierung der hypertonischen Bedingungen, wie Saccharose und Natriumsuccinat, werden auch verwendet. PEG und PVA können in einer Endkonzentration von 5 bis 60% bzw. 1 bis 20% verwendet werden. Zweiwertige Metallkationen, wie Ca&spplus;&spplus;, Mg&spplus;&spplus;, Mn&spplus;&spplus;, Ba&spplus;&spplus; und Sr&spplus;&spplus;, werden einzeln oder kombiniert bei einer Endkonzentration von 1 bis 100 mM wirksam verwendet. Die Transformation wird zufriedenstellend bei 0 bis 25ºC durchgeführt.

3. Die Regeneration der Protoplasten zu normalen Zellen und die Selektion einer Transformante:

Die Regeneration des mit einer rekombinanten DNA transformierten Protoplasten wird in derselben, vorstehend beschriebenen Weise durch Verteilung der Protoplasten auf einem hypertonischen Agarmedium, wie Natriumsuccinat und Polyvinylpyrrolidon enthaltendem RCGP-Medium, und Inkubation bei einer für das Wachstum normaler Zellen erforderlichen Temperatur, üblicherweise bei 25 bis 35ºC, durchgeführt. Transformanten werden durch Selektion auf die von Donor-DNA- Molekülen stammenden Phänotypen erhalten. Die Selektion auf einen verliehenen charakteristischen Phänotyp kann gleichzeitig mit der Regeneration auf einem hypertonischen Agarmedium oder auf einem hypotonischen Agarmedium nach einer nicht-selektiven Reversion in normale Zellen auf einem hypertonischen Agarmedium durchgeführt werden.
Bei Verwendung der als bevorzugte Wirtsmikroorganismen beschriebenen Lysozym-empfindlichen Stämme kann die Transformation nach den unter (1) bis (3) beschriebenen Schritten durchgeführt werden, außer daß die Behandlung der gezüchteten Zellen direkt mit Lysozym ohne eine vorherige Behandlung mit Penicillin in Schritt (1) erfolgt. Unter diesen Umständen werden Transformanten mit einer Effizienz von 10&supmin;² bis 10&supmin;&sup4; pro regenerierter Zelle erhalten.
Die nachstehend beschriebenen Stämme sind Beispiele für Transformanten, die durch die vorliegende Erfindung erhalten werden.

Arginin-produzierende Stämme

Corynebacterium glutamicum K46, FERM BP-356
Corynebacterium herculis K47, FERM BP-367
Brevibacterium flavum K48, FERM BP-357
Die Expression des Phänotyps der rekombinanten DNA wird durch Züchtung der Transformanten in einem üblichen Nährmedium durchgeführt. Geeignete Reagenzien können, entsprechend den von der Gen- oder Vektor-DNA auf der rekombinanten DNA erwarteten Phänotypen, dem Medium zugesetzt werden.
Die so erhaltene Transformante wird in einer üblichen, bei der Produktion von Aminosäuren durch Fermentation verwendeten Weise gezüchtet. Das heißt, die Transformante wird in einem üblichen Medium, das Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Stoffe, Aminosäuren, Vitamine etc. enthält, unter aeroben Bedingungen bei einer eingestellten Temperatur und einem eingestellten pH-Wert gezüchtet. Die so im Medium angereicherten Aminosäuren werden gewonnen.
Als Kohlenstoffquellen können verschiedene Kohlehydrate, wie Glucose, Glycerin, Fructose, Saccharose, Maitose, Mannose, Stärke, Stärkehydrolysat und Melasse, Polyalkohole und verschiedene organische Säuren, wie Brenztraubensäure, Fumarsäure, Milchsäure und Essigsäure, verwendet werden. Entsprechend der Assimilationsfähigkeit des verwendeten Mikroorganismenstammes werden Kohlenwasserstoff und Alkohole verwendet. Am meisten bevorzugt wird Restmelasse verwendet.
Als Stickstoffquellen sind Ammoniak, verschiedene anorganische oder organische Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumacetat, Harnstoff und stickstoffhaltige organische Stoffe, wie Pepton, NZ-Amin, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Caseinhydrolysat, Fischmehl oder sein Aufschlußprodukt, entfettete Sojabohnen oder ihr Aufschlußprodukt und Chrysalidenhydrolysat geeignet.
Als anorganische Stoffe können Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisensulfat, Mangansulfat und Calciumcarbonat verwendet werden. Der Zusatz der für das Wachstum der Mikroorganismen erforderlichen Vitamine und Aminosäuren kann unterbleiben, sofern sie mit den anderen, vorstehend beschriebenen Komponenten zugesetzt werden.
Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, wobei geschüttelt oder unter Luftzufuhr gerührt wird. Die Züchtungstemperatur beträgt vorzugsweise 20 bis 40ºC. Der pH-Wert des Mediums wird bei der Züchtung etwa auf dem Neutralpunkt gehalten. Die Züchtung wird bis zur Anreicherung einer beträchtlichen Menge einer Aminosäure fortgesetzt, üblicherweise 1 bis 5 Tage.
Nach Abschluß der Züchtung werden die Zellen entfernt und die Aminosäure wird in üblicher Weise, zum Beispiel durch Behandlung mit Aktivkohle oder Ionenaustauscherharz aus der Kulturflüssigkeit gewonnen.
Trotz ihrer sehr ähnlichen mikrobiologischen Eigenschaften werden sogenannte Glutaminsäure-produzierende Mikroorganismen, die Glutaminsäure in großen Mengen produzieren, wahrscheinlich aufgrund ihrer industriellen Bedeutung in verschiedene Arten und sogar in verschiedene Gattungen, wie Corynebakterium und Brevibakterium eingeteilt. Es ist jedoch darauf hingewiesen worden, daß diese Mikroorganismen aufgrund der beinahe gleichen Aminosäurezusammensetzung in der Zellwand und der Basenzusammensetzung der DNA-Moleküle zu einer Art gehören sollten. Es ist vor kurzem berichtet worden, daß diese Mikroorganismen bei der DNA-DNA- Hybridisierung mindestens zu 70 bis 80% homolog sind, ein Hinweis auf die enge Verwandtschaft dieser Mikroorganismen. Vgl. z. B. Komatsu, Y., Report of the Fermentation Research Institute 55 (1980), 1, und Suzuki, K., Kaneko, T. und Komagata, K., Int. J. Syst. Bacteriol. 31 (1981), 131.
Unter Berücksichtigung der vorstehend beschriebenen Tatsachen liegt die Vermutung nahe, daß der Nutzen der vorliegenden Erfindung für sämtliche Glutaminsäure-produzierenden Mikroorganismen gilt. Für den stabilen Erhalt der rekombinanten DNA-Moleküle und die Expression der DNA in diesen Arten können geringfügig unterschiedliche Eigenschaften der Wirtsmikroorganismen wie DNA-Homologie vernachlässigt werden, und es genügt, daß die Wirtsmikroorganismen die autonome Replikation von Plasmiden und die Expression der darauf enthaltenen Gene ermöglichen. Diese Fähigkeit der Mikroorganismen geht aus der Tatsache hervor, daß das aus Corynebacterium glutamicum 225-250 (Japanische, veröffentlichte, nicht-geprüfte Patentanmeldung mit der Nr. 183799/82) isolierte und ein Streptomycin- und/oder Spectinomycin-Resistenzgen aufweisende Plasmid pCG4 in Glutaminsäure-produzierenden Mikroorganismen, die zum Beispiel zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehören, repliziert und das für die Resistenz verantwortliche Gen exprimiert werden konnte (Japanische, veröffentlichte, nicht-geprüfte Patentanmeldung mit der Nr. 186492/82). Ferner ist es nach der Beschreibung der erfindungsgemäßen Histidin-Produktion klar, daß das in Corynebacterium glutamicum exprimierte Gen in einem breiten Spektrum von Wirtsmikroorganismen der Gattungen Corynebacterium, Brevibacterium und ähnlichen exprimiert werden kann. Daher sind sämtliche Glutaminsäure-produzierenden Mikroorganismen, einschließlich der zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium, sowie die zur Art Corynebacterium glutamicum gehörigen, als Wirtsmikroorganismen der vorliegenden Erfindung geeignet.
Für die Stämme, die in der vorliegenden Beschreibung erscheinen, lauten die Hinterlegungsnummern, das Hinterlegungsdatum und das Transferdatum der Hinterlegungen gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags zur internationalen Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zweck von Patentverfahren, wie nachstehend angegeben. Hinterlegungsdatum Ferm P (Transferdatum) ATCC (BP) Tag/Monat/Jahr Corynebacterium glutamicum L-15 Corynebacterium herculis L-103 Brevibacterium divaricatum L-204 Brevibacterium lactofermentum L-312 Corynebacterium glutamicum LA103/pCE54 Corynebacterium glutamicum LA103/pCP101 Corynebacterium glutamicum LA103/pEthr1 Corynebacterium glutamicum LA103/pCG11 Corynebacterium glutamicum K17 Corynebacterium glutamicum K18 Corynebacterium glutamicum K19 Corynebacterium glutamicum K20 Corynebacterium glutamicum K31 Corynebacterium glutamicum K32 Corynebacterium herculis K33 Brevibacterium fluvum K34 Brevibacterium lactofermentum K35 Corynebacterium glutamicum K37 Corynebacterium glutamicum K36 Corynebacterium glutamicum H33 Corynebacterium glutamicum C156 Corynebacterium glutamicum K38 Corynebacterium glutamicum K39 Corynebacterium glutamicum K40 Corynebacterium glutamicum K41 Corynebacterium glutamicum K43 Corynebacterium glutamicum K44 Corynebacterium glutamicum K45 Brevibacterium fluvum K42 Corynebacterium glutamicum K46 Brevibacterium fluvum K48 Corynebacterium herculis K47 Corynebacteriumglutamicum K49
Fig. 1 stellt das Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pEarg1 dar. Die bei der Herstellung der Restriktionskarten verwendeten Restriktionsendonucleasen sind PstI, BamHI und SalI.

Beispiel 1

Herstellung der Plasmid-DNA pCE53

Das als Vektor verwendete Plasmid pCE53 wurde aus dem pCE53 tragenden Corynebacterium glutamicum L-22 wie nachstehend beschrieben isoliert.
Der Stamm wurde bei 30ºC unter Schütteln in 400 ml NB-Medium bis zu einem OD-Wert von etwa 0,7 gezüchtet. Die Zellen wurden geerntet und mit TES-Puffer gewaschen. Die Zellen wurden in 10 ml der vorstehend beschriebenen Lysozym- Lösung suspendiert, und man ließ sie sich 2 Stunden bei 37ºC umsetzen. Anschließend wurden nacheinander 2,4 ml 5 M NaCl, 0,6 ml 0,5 M EDTA (pH 8,5) und 4,4 ml einer aus 4% Natriumlaurylsulfat und 0,7 M NaCl bestehenden Lösung zugesetzt. Das Gemisch wurde langsam gerührt, und man ließ es 15 Stunden in einem Eiswasserbad stehen.
Das gesamte Lysat wurde 60 Minuten bei 4ºC mit 69 400 · g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde gewonnen, und 10% (Gew.-%) Polyethylenglycol (PEG) 6000 (Nakarai Kagaku Yakuhin Co.) wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde zur vollständigen Auflösung langsam gerührt und anschließend in einem Eiswasserbad stehengelassen. Nach 10 Stunden wurde das Gemisch zur Gewinnung eines Pellets 10 Minuten mit 1500 · g zentrifugiert. Nach der vorsichtigen Wiederauflösung des Pellets in 5 ml TES-Puffer wurden 2 ml 1,5 mg/ml Ethidiumbromid zugesetzt. Anschließend wurde zur Einstellung der Dichte des Gemisches auf 1,580 langsam Cäsiumchlorid zugesetzt. Die Lösung wurde 48 Stunden bei 18ºC mit 105 000 · g zentrifugiert. Nach der Dichtegradienten-Zentrifugation wurde unter UV-Strahlung eine kovalent-geschlossene zirkuläre DNA als eine Bande von hoher Dichte nachgewiesen, die sich im unteren Teil des Zentrifugen-Röhrchens befand. Die Bande wurde zum Erhalt einer die pCE53-DNA enthaltenden Fraktion mit einem Injektor von der Seite des Röhrchens entnommen.
Zur Entfernung des Ethidiumbromids wurde die Fraktion fünfmal mit der gleichen Menge einer mit Cäsiumchlorid gesättigten Isopropylalkohol-Lösung behandelt, die aus 90 Vol.-% Isopropylalkohol und 10% TES-Pufferlösung bestand. Der Rückstand wurde anschließend gegen TES-Pufferlösung dialysiert.
pCE53 ist ein rekombinantes Plasmid, in dem das Plasmid pCG1 (Japanische veröffentlichte nicht-geprüfte Patentanmeldung Nr. 134500/82) von Corynebacterium glutamicum mit dem Plasmid pGA22 von Escherichia coli kombiniert ist, das von An, G. et al., J. Bacteriol. 140 (1979), 400, beschrieben wird. Genauer gesagt wurde pCE53 durch Insertion des BglII-gespaltenen pCG1 in die BamHI-Stelle von pGA22 ohne das Tetracyclin-Resistenzgen und durch Legierung unter Ausnutzung der von den beiden Restriktionsenzymen gebildeten, gleichen überstehenden Enden konstruiert. pCE53 weist selektive Marker, beispielsweise eine von pGA22 stammende Kanamycin-Resistenz, und lediglich eine SalI-Spaltstelle auf.

Beispiel 2

Konstruktion eines L-Arginin produzierenden Mikroorganismus

(1) In vitro-Rekombination von pLC20-10 und pCE54

pLC20-10 wurde aus gezüchteten Zellen eines Abkömmlings von Escherichia coli K-12, der das betreffende Plasmid trägt, gemäß dem Verfahren von An isoliert [An, G. et al., J. Bacteriol. 140 (1979), 400]. pCE53 wurde durch das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren isoliert.
5 Einheiten PstI (5 Einheiten/ul) und 5 Einheiten BamHI (5 Einheiten/ul) wurden 30 ul einer PstI-BamHI-Reaktionspufferlösung (pH-Wert 8,0) zugesetzt, die aus 15 mM Tris, 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl, 25 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 1 mM Mercaptoethanol und 0,01% 5 ug pLC20-10-Plasmid-DNA enthaltendem Rinderserumalbumin bestand. Man ließ das Gemisch sich 90 Minuten bei 33ºC umsetzen. 5 ug Plasmid-DNA von pCE53 wurden durch das gleiche, bei pLC20-10 angewendete Verfahren behandelt. Beide Spaltprodukte wurden 10 Minuten auf 65ºC erhitzt und gemischt. Dem gesamten Gemisch wurden anschließend 10 ul einer T4-Ligase-Pufferlösung II, 1 ul 40 mM ATP, 0,3 ul T4-Ligase und 30 ul H&sub2;O zugesetzt. Die Umsetzung wurde 12 Stunden bei 4ºC durchgeführt.

(2) Gewinnung von pEarg1

Die Transformation wurde unter Verwendung eines Escherichia coli K-12-Abkömmlings Escherichia coli CH754 durchgeführt, der Methionin, Tryptophan und Arginin (Defekt- Mutation der Argininsuccinase, argH) benötigt. Die kompetenten Zellen von CH754 wurden nach dem Verfahren von Dagert hergestellt [Dagert, M. et al., Gene 6 (1979), 23]. D. h., der Stamm CH754 wurde in 50 ml L-Brühe geimpft und bei 37ºC bis zu einem OD-Wert bei 660 nm von 0,5 auf dem Tokyo Koden- Kolorimeter gezüchtet. Die Kulturbrühe wurde 10 Minuten auf einem Eiswasserbad gekühlt und zentrifugiert. Die Zellen wurden in 20 ml 0,1 M CaCl&sub2; suspendiert und gekühlt, und man ließ sie 20 Minuten bei 0ºC stehen. Die durch Zentrifugation gewonnenen Zellen wurden in 0,5 ml 0,1 M CaCl&sub2; suspendiert, und man ließ sie 18 Stunden bei 0ºC stehen. 50 ul des vorstehend erhaltenen Legierungsgemisches wurden 150 ul der CaCl&sub2;-behandelten Zellsuspension zugesetzt. Man ließ das Gemisch 10 Minuten bei 0ºC und 5 Minuten bei 37ºC stehen. Anschließend wurden 2 ml L-Brühe zugesetzt, und es wurde 2 Stunden bei 37ºC unter Schütteln gezüchtet. Die Zellen wurden anschließend zweimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und zentrifugiert. Die Zellen wurden auf einem Agarmedium verteilt, das 40 ug/ml Methionin, 40 ug/ml Tryptophan und 25 ug/ml Kanamycin enthielt. Es wurde 3 Tage bei 37ºC gezüchtet. Eine Plasmid-DNA wurde durch das gleiche Verfahren, wie bei der Isolierung von pLC20-10, aus den gezüchteten Zellen einer entwickelten Transformante isoliert. Die Plasmid-DNA wurde mit Restriktionsendonucleasen gespalten und durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Das in Fig. 1 dargestellte Plasmid weist eine Struktur auf, in der das PstI-BamHI-Fragment, das die von pLC20-10 stammenden, für die Biosynthese von Arginin verantwortlichen Gene enthält, und das PstI-BamHI-Fragment, das das von pCE53 stammende, für die Kanamycin-Resistenz verantwortliche Gen enthält, ligiert wurden. Das Plasmid erhielt die Bezeichnung pEarg1.
CH754 wurde unter Verwendung der Plasmid-DNA durch das gleiche Verfahren, wie vorstehend beschrieben, erneut transformiert. Arginin nicht-benötigende Transformanten wurden mit großer Häufigkeit erhalten, und alle wiesen den Kanamycin-resistenten Phänotyp auf. Bei der Transformation von Escherichia coli CSR603, der auf dem Biosynthese-Weg von Arginin eine defekte Acetylornithindeacetylase (argE) aufweist und ein Abkömmling von Escherichia coli K-12 ist, wurde sämtlichen Kanamycin-resistenten Transformanten eine Arginin nicht-benötigende Eigenschaft verliehen.
Corynebacterium glutamicum LA291, der Arginin für sein Wachstum benötigt, wurde mit pEarg1 transformiert. Corynebacterium glutamicum LA291 ist eine Mutante, die durch eine übliche Mutagenese vom Lysozym-sensitiv mutierten Stamm L-15 abgeleitet ist, der von Corynebacterium glutamicum ATCC 31833 stammt und Arginin für sein Wachstum benötigt. Es wird angenommen, daß der Mutationsdefekt den Verlust der Argininsuccinat-Synthetase betrifft, die argG von Escherichia coli entspricht, oder die Argininsuccinase, die argH von Escherichia coli entspricht, da die Mutante mit Citrullin, das ein Vorläufermolekül auf dem Biosyntheseweg von Arginin zwei Schritte vor dem Arginin ist, kein Wachstum zeigt. Mit einer Impfkultur von Corynebacterium glutamicum LA291 wurde NB-Medium geimpft und bei 30ºC unter Schütteln gezüchtet. Die Zellen wurden bei einem OD-Wert von 0,6 geerntet und mit einer Konzentration von etwa 10&sup9; Zellen/ml in einem 1 mg/ml Lysozym enthaltenden RCGP-Medium (pH-Wert 7,6) suspendiert. Die Suspension wurde in ein L-Röhrchen gegeben und zur Bildung von Protoplasten 5 Stunden bei 30ºC langsam geschüttelt.
Anschließend wurden 0,5 ml der Protoplasten-Suspension in ein kleines Röhrchen überführt und 5 Minuten mit 2500 · g zentrifugiert. Die Pellets wurden in 1 ml TSMC- Pufferlösung resuspendiert und zentrifugiert. Die Protoplasten wurden in 0,1 ml TSMC-Pufferlösung resuspendiert. Der Suspension wurden anschließend 100 ul eines Gemisches aus zweifach konzentrierter TSMC-Pufferlösung und der Lösung der pEargl-Plasmid-DNA (1 : 1) und 1,0 ml einer 20% PEG 6000 enthaltenden TSMC-Pufferlösung zugesetzt. Nach 3 Minuten wurde das Gemisch 5 Minuten mit 2500 · g zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit entfernt. Die ausgefällten Protoplasten wurden in 1 ml RCGP-Medium (pH-Wert 7,4) suspendiert, und die Suspension wurde 2 Stunden bei 30ºC langsam geschüttelt. Anschließend wurden 0,3 ml der Protoplasten-Suspension auf einem RCGP-Agarmedium (pH-Wert 7,4) verteilt, d. h., auf dem RCGP-Medium, das mit 400 ug/ml Kanamycin enthaltendem 1,6% Agar versetzt war, und es wurde 6 Tage bei 30ºC gezüchtet.
Sämtliche der entwickelten, Kanamycin-resistenten Transformanten wiesen eine Arginin nicht-benötigende Eigenschaft auf.
Eine Plasmid-DNA wurde durch das gleiche Verfahren, wie bei der Isolierung von pCE53, aus den gezüchteten Zellen der Transformante isoliert. Das Plasmid wurde mit Restriktionsendonucleasen gespalten und durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert, um festzustellen, ob das Plasmid die gleiche Struktur wie pEarg1 aufweist, das durch das Spaltmuster für verschiedene Restriktionsendonucleasen charakterisiert worden ist.

(3) Produktion von L-Arginin durch die pEarg1-tragenden Stämme

Die Protoplasten von Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium herculis ATCC 13868 und Brevibacterium flavum ATCC 14067 wurden mit pEarg1 transformiert. Die Stämme wurden unter Schütteln 16 Stunden bei 30ºC in NB-Medium gezüchtet, und 0,1 ml der Saatkultur in 10 ml SSM-Medium in einem L-Röhrchen überimpft. Die Züchtung wurde bei 30ºC in einem Kulturbad vom Typ Monod durchgeführt und Penicillin G bei einem OD-Wert von 0,15 bis zu einer Konzentration von 0,5 Einheiten/ml zugesetzt. Die Züchtung wurde bis zu einem OD-Wert von etwa 0,6 fortgesetzt. Die Zellen wurden geerntet und in 2 ml 1 mg/ml Lysozym enthaltendem RCGP-Medium (pH-Wert 7,6) suspendiert. Die Suspension wurde in ein L-Röhrchen gegeben und zum Erhalt von Protoplasten 14 Stunden bei 30ºC langsam geschüttelt. Anschließend wurde 1 ml der Protoplasten-Suspension in ein kleines Teströhrchen gegeben und 15 Minuten mit 2500 · g zentrifugiert. Die Protoplasten wurden in 1 ml TSMC-Puffer resuspendiert, erneut mit 2500 · g zentrifugiert und gewaschen. Die gewaschenen Protoplasten wurden in 0,1 ml TSMC-Pufferlösung resuspendiert. 100 ul eines Gemisches (1 : 1) aus einem zweifach konzentrierten TSMC-Puffer, und dem vorstehend beschriebenen pEarg1-DNA-Gemisch wurde der Protoplasten-Suspension zugesetzt. Die Transformation wurde unter Verwendung von PEG 6000 durch das gleiche, in Beispiel 1 beschriebene Verfahren zur Expression des gewünschten Gens durchgeführt. Anschließend wurden 0,3 ml des Gemisches auf einem 400 ug/ml Kanamycin enthaltenden RCGP-Agarmedium verteilt, und es wurde 10 Tage bei 30ºC inkubiert.
Die Kanamycin-resistenten Stämme wurden unter Schütteln in 400 ml SSM-Medium gezüchtet, und Penicillin G wurde bei einem OD-Wert von 0,15 bis zu einer Konzentration von 0,5 Einheiten/ml zugesetzt. Die Züchtung wurde bis zu einem OD-Wert von 0,65 fortgesetzt, und die Zellen wurden geerntet. Die Plasmide wurden durch das gleiche Verfahren wie bei der Isolierung von pCE53 in Beispiel 1 aus den Zellen isoliert. Diese Plasmide wurden mit Restriktionsendonucleasen gespalten und durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Die Analyse zeigte, daß die Plasmide die gleiche Struktur wie pEarg1 aufwiesen, das durch das Spaltmuster für verschiedene Restriktionsendonucleasen charakterisiert worden ist. Solche Transformanten sind Corynebacterium glutamicum K46 (FERM BP-356), Corynebacterium herculis K47 (FERM BP-367) und Brevibacterium flavum K48 (FERM BP-357).
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium herculis ATCC 13868, Brevibacterium flavum ATCC 14067 und ihre pEarg1-tragenden Stämme wurden, wie nachstehend beschrieben, auf ihre Produktion von L-Arginin getestet. Die Stämme wurden 16 Stunden bei 30ºC unter Schütteln in NB-Medium gezüchtet, und mit 0,5 ml der Impfkultur wurde ein Produktionsmedium (pH-Wert 7,0) beimpft, das aus 80 g/l Melasse (als Glucose), 4 g/l (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 0,5 g/l KH&sub2;PO&sub4;&sub1; 0,5 g/l K&sub2;HPO&sub4; und 20 g/l CaCO&sub3; bestand. Es wurde 72 Stunden bei 30ºC unter Schütteln gezüchtet. Mit dem Kulturfiltrat wurde eine Papier-Chromatographie und eine Farbreaktion mit Ninhydrin durchgeführt. Die Menge an gebildetem L-Arginin wurde kolorimetrisch bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I dargestellt.

Tabelle I

Stamm Menge an L-Arginin (mg/ml)
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 0
Corynebacterium glutamicum K46 1,6
Corynebacterium herculis ATCC 13868 0
Corynebacterium herculis K47 1,8
Brevibacterium flavum ATCC 14067 0
Brevibacterium flavum K48 1,0.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von L-Arginin, umfassend das Züchten eines Mikroorganismus, der durch Transformation eines zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium gehörenden Wirtsorganismus mit einer rekombinanten DNA erhalten wurde in einem Medium, wobei ein DNA-Fragment in eine Vektor-DNA eingefügt wird, das die Acetylornithindeacetylase, N-Acetylglutamat-γ-semialdehyddehydrogenase, N-Acetylglutamokinase und Argininsuccinase codierenden, aus Escherichia coli isolierten Gene enthält, die Anreicherung von L-Arginin in der Kultur und die Gewinnung von L-Arginin daraus.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die rekombinante DNA das Plasmid pEarg1 (FERM BP-356, FERM BP-367 oder FERM BP-357) ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus Corynebacterium glutamicum K46, FERM BP-356, Corynebacterium herculis K47, FERM BP-367 oder Brevibacterium flavum K48, FERM BP-357, ist.

4. Biologisch reine Kultur von Corynebacterium glutamicum K46, FERM BP-356, Corynebacterium herculis K47, FERM BP-367 oder Brevibacterium flavum K48, FERM BP-357.