DE2034406A1 - Verfahren zur Herstellung von L Lysin - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von L Lysin

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DE2034406A1 DE19702034406 DE2034406A DE2034406A1 DE 2034406 A1 DE2034406 A1 DE 2034406A1 DE 19702034406 DE19702034406 DE 19702034406 DE 2034406 A DE2034406 A DE 2034406A DE 2034406 A1 DE2034406 A1 DE 2034406A1
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Description

"Verfahren zur Herstellung von L-Lysin"
Priorität: 23. Juli 1969, Japan, Nr. 57 652/69
Ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin auf mikrobiologischem Wege mithilfe von mutierten Stämmen, die von bestimmten Nährstoffen abhängig sind, ist bekannt; vergl. japanische Auslegeschrift Nr. 6 499/1961 und Zeitschrift "Hakko to Taisha", Band 2, Seite 105 (1960). Diese Mutanten von Stämmen von Mikroorganismen benötigen zum Wachstum einen der folgenden Nährstoffe: Homoserin, Threonin, Threonin mit Methionin, Leucin oder Isoleucin. Sie sind dann in der Lage, beträchtliche Mengen von L-Lysin zu bilden. Es ist jedoch bekannt, daß die Konzentration an Threonin, Isoleucin usw. im Nährmedium einen sehr großen Einfluß auf die Ausbeute an L-Lysin hat,
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wenn bei den Verfahren die üblichen Mikroorganismen verwendet werden, welche von den vorgenannten Nährstoffen abhängig sind. Wenn die Konzentration an Threonin und ähnlichen Substanzen zu groß wird, sinkt die Ausbeute an L-Lysin beträchtlich.
Aufgabe der Erfindung war es daher, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von L-Lysin zu schaffen, das die Nachteile und Schwächen der bisherigen Verfahren vermeidet, das wirksam und relativ einfach in technischem Maßstab durchgeführt werden kann und eine hohe Ausbeute an Produkt ergibt. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.
Der Erfindung liegt die Feststellung zugrunde, daß Mikroorganismen, die nicht nur von den vorerwähnten Nährstoffen abhängig, sondern auch gegen Rückkopplungshemmung und/oder Repressionswirkung durch Lysin, Threonin und Isoleucin und deren Analoge resistent sind, und insbesondere Mikroorganis-* ' men der Gattungen Brevibacterium, Corynebacterium, Arthröbacter, Microbacterium, Bacillus oder Nocardia im Vergleich zu den von diesen Nährstoffen abhängigen Mikroorganismen im Verlauf der Fermentation beträchtliche Mengen von L-Lysin bilden und anreichern können.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin auf mikrologischem Wege, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen L-Lysin erzeugenden Mikroorganismus der Gattung Brevibacterium, Corynebacterium, Arthrobacter, Microbacterium, Bacillus oder Nocardia, der ab-
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hängig ist von Homoserin, Threonin, Threonin plus Methionin, Leucin, Isoleucin oder deren Genischen und gegen Rückkopplungshenunung und/oder Repression durch mindestens eine der Verbindungen Lysin und Lysin-Analoge, Threonin und Threonin-Analoge und Isoleucin und Isoleucin-Analoge resistent ist, unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen liährmedium züchtet und das sich in der Gärmaische anreichernde L-Lysin in bekannter Weise abtrennt.
Ein Vorteil des Verfahrens der Erfindung gegenüber den vorgenannten bekannten Verfahren ist eine signifikante Steigerung der Ausbeute an L-Lysin. Die Ausbeutesteigerung an L-Lysin beträgt mehr als 10;·«. Dies ist von industriellen Standpunkt aus vorteilhaft.
Ein weiterer Vorteil des Verfahrens der Erfindung ist die Tatsache, daß die Fähigkeit der KikroOrganismen zur Bildung von L-Lysin durch die Konzentration an Threonin oder anderen im Nährmediun verwendeter Nährstoffe nicht wesentlich beeinflußt wird, wie aus Beispiel 1 hervorgeht.
Das Verfahren der Erfindung ist gegenüber den üblichen Verfahren von besonderen: Vorteil, wenn billige,natürliche Rohstoffe, wie Melassen und Hydrolysate von natürlichen Proteinen, als Quelle für die benötigten Kährstoffe verwendet werden.
Wie vorstehend angegeben, werden im Verfahren der Erfindung Stänae von .Mikroorganismen der Gattungen-Brevibacteriur;,
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Corynebacteriuin, Arthrobacter, Mikrobacterium, Bacillus oder Nocardia verwendet. Diese Mikroorganismen sind von mindestens einer der folgenden Aminosäuren als Nährstoff abhängig: Homoserin, Threonin, Threonin plus Methionin, Leucin und Isoleucin. Der hier verwendete Ausdruck "nährstoffabhängiger Stamm" hat eine weite Bedeutung und soll auch für unvollständige^defekte Stämme, wie z. B. dem sogenannten "leaky"-Typ, gelten.
Zusätzlich zu den genannten Nährstofferfordernissen sind die zur Herstellung von L-Lysin erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen Stämme, deren. System zur Lysin-Biosynthese resistent gegen Rückkopplungshemmung und/oder Repression durch Lysin, Threonin, Isoleucin oder Gemische derselben ist.
Es ist ein Zuchtverfahren bekannt, nach dem man L-Lysinbildner erhalten kann, die von Homoserin, Threonin, Threonin plus Methionin, Leucin oder Isoleucin abhängig sind. Natürliche Mutanten dieser Stämme kann man durch Selektion aus der Gesamtkultur gewinnen. Durch Verwendung chemischer und physikalischer Methoden kann die Zahl der Mutanten erhöht werden, um aus ihnen solche mit guten Produktionseigenschaften zu selektieren. Die erfindungsgemäß verwendeten Stämme von Mikroorganismen, die außer der vorstehenden Nährstoffabhängigkeit die Eigenschaft haben, gegen Rückkopplungshemiming und/oder Repression durch Lysin, Threonin und/oder Isoleucin resistent zu sein, kann man durch mutagene Behandlung eines der Stämme, die die genannten Nährstoffe benötigen und zu den genannten Gattungen gehören, erhalten, wie z. B. Stämme, die gegen die
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wachstumshemmende Wirkung folgender Verbindungen resistent gemacht wurden:
a. Lysin oder Lysin-Analoge, z.B. S-(ß-Aminoäthyl)-cystein, 5-Hydroxylysin, 2,6-Diaminoheptansäure, N-£-iOrmyllysin, trans-2,6-Diamino-4—hexensäure, 2,6-Diaminohexinsäure,
2-Amino-;5-(ß-aminoäthoxy)-propionsäure, 2-Amino-j5-(j5'-aminocyclohexyl)-propionsäure, 4-Azalysin oder 2-Amino.-2-(3'-aminomethylcyclohexyl)-essigsäure;
b. Threonin oder Threonin-Analoge, z.B. et-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure, ß-Hydroxyleucin oder Norleucin;
c. Isoleucin oder Isoleucin-Analoge, z.B. 2-Amino-3-methyl-. ·· · thiobutt er säure, f' -Aminobuttersäure, L-O-Methyl threonin,
€ -Dehydroisoleuein, 2-Amino-2-(j5' -cyclopentenyl)-essigsäure, 2-Amino-2-cyclopentenylessigsäure, 2-Amino-2-(2f-cyclopentenyl) -essigsäure, ß-Hydroxyleucin oder Methallyl-glycin; oder
d. Gemische dieser Verbindungen.
Diese Stämme kann man auch durch natürliche Auslese oder künstliche Mutation erhalten.
Außer den Selektionsverfahren mithilfe dieser Verbindungen können die erfindungsgemäß verwendeten Stämme als'Stämme mit der
gleichen Nährstoffabhängigkeit wie der ursprüngliche Stamm / durch Rückmutation von mutierten Stämmen, denen ein
Enzym der Lysinbiosynthese fehlt, erhalten werden. Es werden im Verfahren der Erfindung Stämme verwendet, deren L-Lysinbildung im Vergleich zu den Stämmen, die nur ein Nährstofferfordernis aufweisen, wesentlich verbessert ist. Diese Stämme werden durch Züchtung und Selektionieren der durch solche Behandlung erhaltenen Stämme verwendet.
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Die mit Mutanten der Stämme Corynebacterium glutamicum (Micrococcus glutamicus: Japanische Auslegeschrift Nr. 8398/ 1957) und Brevibacterium flavum durchgeführten Versuche erläutern die Umzüchtung.
Versuch 1
Dieser Versuch erläutert ein Verfahren zur Umzüchtung eines Stammes von Corynebacterium glutamicum, der von Homoserin (oder Threonin plus Methionin) und Leucin abhängig und gegen Rückkopplungshemmung durch Lysin und Threonin resistent ist.
Der Stamm Corynebacterium glutamicum A.T.CC. 13287, der von Homoserin (oder Threonin plus Methionin) abhängig ist, wurde durch Ultraviolettbestrahlung und Selektionieren von Corynebacterium glutamicum A.T.C.C. I3032 erhalten. Durch weitere mutagene Behandlung und Selektion aus dem Stamm A.T.C.C. 13287 wurde, ein Mutantenstamm Corynebacterium glutamicum A.T.C.C. 21253 gewonnen, der sowohl von Homoserin als auch von Leucin abhängig ist. Dabei wurde eine Zellsuspension dieses Stammes einer Behandlung mit Nitrosoguanidin unterzogen«, Dann wurden die behandelten Mikroorganismen auf eine flache Agarscheibe eingeimpft, wobei diese Scheibe ein Minimalmedium enthielt, das mit 1000 itg/ml Threonin, 10 ^&g/ml Methionin, 20 ^tg/ml Leucin und 8 mg/ml S-(ß-Aminoäthyi)-cystein ergänzt war. Die wachsenden Kolonien wurden isoliert» Der so erhaltene Stamm. hatte, verglichen mit Corynebacterinm glutamicum A0T0G0G0 21253« eine merklich verbesserte Fähigkeit zur Bildung von Is-Lysin«
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Dieser typische Stamm wurde Nr. "BL-25" genannt. Versuch 2 .
Das folgende Umzüchtungsverfahren wurde angewandt, um einen Stamm von Bre\'ibacterium flavum zu erhalten, der von Threonin abhängig und gegen Rücklcopplungshemmung durch Lysin und Threonin resistent ist.
Durch mutagene Behandlung von Brevibacteriuin flavum A.T.C.C. 1406? wurde ein threoninabhängiger Stamm Brevibacterium flavum - KY 10171 erhalten. Eine Zellsuspensiori des Stammes KY 10171 wurde hierauf einer mutagenen Behandlung mit Nitrosoguanidin unterzogen. Der behandelte Stamm wurde dann auf eine flache Agarscheibe eingeimpft, die ein Minimalmedium enthielt, das mit 1000 ug/nil Threonin, 20 Jig/ml Ke t hl on in, 2 mg/ml S-(B-Aminoäthyl)-cystein und 2 mg/ml fl£-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure ergänzt war. Die wachsenden Kolonien wurden isoliert. Der so erhaltene Stana hatte im Vergleich zu Brevibacterium flavum KY 10171 eine -beträchtlich verbesserte Fähigkeit zur Herstellung von L-Lysin. Der typische Stamm wurde "LT-I" genannt.
Im Verfahren der Erfindung können Nährmedien üblicher Art und übliche Aainosäurefermentationsverfahren angewendet werden. Auch die für die Herstellung von Lysin auf mikrobiologischem Wege bekannten Hährmedien sind geeignet. Für die Züchtung der erfindungsgenäß verwendeten Stämne eignen sich synthetische oder natürliche Kähnaedien, sofern sie die für das wachstum
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der Stämme erforderlichen Nährstoffe enthalten. Solche Nährstoffe sind bekannt. Sie erhalten in geeigneten Mengen Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und anorganische Verbindungen, die von den verwendeten Mikroorganismen verwertet werden. Als Kohlenstoffquellen können z.B. folgende Substanzen verwendet werden: Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Stärke, Stärkehydrolysate oder Melassen, oder andere geeignete Kohlenstoffquellen, wie organische Säuren, z.B. Essigsäure, Milchsäure oder Fumarsäure, oder Alkohole, z.B. Methanol oder Äthanol. Diese Substanzen können entweder einzeln oder als Gemisch von zwei oder mehr dieser Substanzen verwendet werden.
Je nach ihrer Verwertbarkeit durch die verwendeten Mikroorganismen ist es möglich, dem Nährmedium Kohlenwasserstoffe in größeren oder geringeren Mengen als Kohlenstoffquelle zuzusetzen. Geeignete Kohlenwasserstoffe sind unverzweigte und verzweigte Paraffine, Cycloparaffine, unverzweigte und verzweigte Olefine, Cycloolefine, aromatische Kohlenwasserstoffe, z.B. Benzol oder o-Xylol, und Gemische derselben und gemischte Kohlenwasserstoffe, z.B. Petroleumderivate, wie Kerosin, Leicht öle, Schweröle, Paraffinöle oder Erdöl bzw. Rohpetroleum.
Als Stickstoffquellen können die verschiedensten anorganischen oder organischen Salze verwendet werden, wie Harnstoff oder Ammoniumsalze, z.B. Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat oder Ammoniumphosphat, oder eine oder mehrere Aminosäuren oder natürliche stickstoffhaltige Substanzen, wie Mais-
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quellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Fischmehl, Pepton, Bouillon, Caseinhydrolysate, lösliche Produkte, die bei der Fischverwertung anfallen, oder Reiskleieextrakte. Diese Substanzen können entweder einzeln oder in Gemischen von zwei oder mehr dieser Substanzen verwendet werden.
Beispiele für anorganische Verbindungen, die dem Nährmedium zugesetzt werden, sind Magnesiumsulfat, Natr'iumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliumhydrogenphosphat, Eisensulfat oder andere Eisensalze, Manganchlorid, Calciumchlorid und Natriumchlorid.
Außerdem können je nach den besonderen Nährstoffbedürfnissen der verwendeten Mikroorganismen bestimmte essentielle Nährstoffe dem Nährmedium zugesetzt werden, wie spezielle Aminosäuren der vorgenannten Art, und/oder Vitamine, wie Biotin, Thiamin oder Cobalamin.
Es ist wichtig, die Menge der benötigten Aminosäuren so zu begrenzen, daß sie unter der optimalen Konzentration für das Wachstum des Mikroorganismus liegt, was bei Herstellung von Aminosäuren auf mikrobiologisch.em Wege eine aligemein angewandte Technik darstellt.
Die Züchtung der Mikroorganismen wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, z.B. durch. Schütteln unter aeroben Bedingungen oder unter Rühren und Belüften im Submersverfatiren. Man arbeitet
bei einer Temperatur von beispielsweise 20 - 4O0C und einem
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pH-Wert von etwa 4,5 - 9»5· Nach einer Züchtung von etwa 1 bis 8 Tagen unter diesen Bedingungen reichern sich große Kengen« ■ von L-Lysin in der Gärmaische an. !
Nach Beendigung der Züchtung kann das L-Lysin durch übliche Verfahren aus der Gärmaische gewonnen werden, z.B. durch Adsorption an einem Ionenaustauscherharz» Extraktion mit Lösungsmitteln, Ausfällung, Absorption oder Chromatographie. Ein bevorzugtes Verfahren zur Gewinnung des Lysins umfaßt folgende Schritte: Die Gärmaische wird mit Salzsäure auf den pH-Wert 2 eingestellt und das L-Lysin wird an einem stark sauren Ionenaustauscherharz in der Ammoniumform gebunden und mit wäßrigem Ammoniak eluiert. Nach dem Entfernen des Ammoniaks kann man rohes L-Lysinhydrochlorid in kristalliner Eorm erhalten, indem man die Losung mit Salzsäure auf den pH-Wert 5-6 einstellt, eindampft und kühlt» Das Produkt kann z.B. durch Behandlung mit Aktivkohle, durch Umkristallisieren oder durch andere übliche Verfahren weiter gereinigt werden.
Die Beispiele erläutern die Erfindung. Prozentangaben beziehen sich auf das Gewichti falls nichts anderes angegeben ist.
Beispiel 1
Corynebacterium glutamicum BL-25 A.-T.C.C. 21526,. ein vom Homo serin und Leucin abhängiger und gegen das 3E»ysin~JlnalQge S-(ß- Aminoäthyl)-cystein resistenter Stamms wird als Anzuchtstamm- verwendet. Der Stamm wird 24- Stunden bei 5O°C unter aeroben
■ -· ■ Q0-98S-1/HW '■' '
ORiGfWAt INSPiECTED
Bedingungen und unter Schütteln in einem Nährmedium der folgenden Zusammensetzung gezüchtet: 4% Glucose, 2% Polypepton, 0,15% KH2PO4, 0,05% K2HPO4, 0,05% MgSO4.7H2O, 50/ig/Liter Biotin, 0,3% Harnstoff und 0,5% Hefeextrakt. Der pH-Wert des Nährmediusis ist 7*2·
Dann wird 1 ml der entstandenen Anzuchtkultur in einen 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben gegeben, der 20 ml eines Nährmediums der folgenden Zusammensetzung enthält: 10% Melasse (berechnet als Glucose), 2% mit Schwefelsäure aufgeschlossener Sojabohnenkuchen (berechnet als Sojabohnenkuchen vor dem Aufschluß), 0,07% KH2IX)4, 0,05% MgSO4.7H2O, 0,3% Harnstoff, 0,5% (NH4)2SO4 und 3% CaCO,. Der pH-Wert des Nährmediums beträgt 7t5·
Man züchtet 4 Tage bei 300C unter aeroben Bedingungen und unter Schütteln und erhält in der entstandenen Gärmaische 39»5 mg/ml L-Lysin (als Hydrochlorid).
Bei einen unter gleichen Bedingungen durchgeführten Kontrollversuch erhält man nur 34,5 mg/ml L-Lysin in der Gärmäische, wenn ein homoserin- und leucinabhängiger Stamm von Corynebacteriuai glutamicum (A.T.C.C. 21253) verwendet wird.
Wenn die Züchtung in einem Nährmedium durchgeführt wird, das zusätzlich mit 500 jug/ml L-Threonin versetzt wurde, werden 32,5 mg/ml L-Lysin mit Corynebacterium glutamicum BL-25 A.T.C.C. 21526 gebildet, während mit Corynebacterium glutamicum A.T.C.C. 21253 10,0 mg/ml L-Lysin gebildet werden.
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Beispiel 2
Brevibacterium flavum LT-1 A.T.C.C. 21528, ein threoninabhängiger und gegen das Lysin-Analoge S-(ß-Aminoäthyl)-cystein und das Threonin-Analoge oi-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure resistenter Stamm, wird als Anzuchtstamm verwendet. Die Züchtung wird unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß 200 yttg/Liter Thiamin dem Anzucht^ährmedium . w zugesetzt werden. Nach beendeter Züchtung sind in der Gärmaische 25 mg/ml L-Lysin (als Hydrochlorid) angereichert.
Bei einem unter gleichen Bedingungen durchgeführten Kontrollversuch, jedoch unter Verwendung des threoninabhängigen Stammes Brevibacterium flavum A.T.C.C. 21129, erhält man in der Gärmaische nur 17 mg/ml L-Lysin (als Hydrochlorid).
Beispiel 3
Corynebacterium glutamicum EL-9 A.T.C.C. 2154-3, ein homoserin- und leucinabhängiger und gegen das Lysin-Analoge S-(ß-Aminoäthyl)-cystein resistenter Stamm, Corynebacterium glutamicum T-135 A.T.C.C. 21527» ein homoserin- und leucinabhängiger und gegen das Threonin-Analoge a-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure,resistenter Stamm, und Corynebacterium glutanicum LT-32-6 A.T.CC* 21544, ein homoserin- und leucinabhängiger und gegen das Isoleucin-Analoge 2-Amino-3-methylthiobuttersäure resistenter Stamm, werden jeweils als Anzuchtstämme verwendet und gemäß Beispiel 1 gezüchtet. Die in der Gärmaische gebildeten Mengen
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an L-Lysin sind in Tabelle I angegeben.
Tabelle I
Menge an gebildeten ,L-Ly5inr Verwendete Stämme ' mg/ml·""
gegen S-(ß-Aminoäthyl)-cystein
resistenter Stamm 39,4-
gegen α-Amino-ß-hydroxyvaler!ansäure resistenter Stamm
38,2
gegen 2-Amino-3-Eiethylthiobutter-
säure resistenter Stamm '
38,1
Beispiel 4
Brevibacterium flavum T-3O1 A.T.C.C. .21529-, ein threoninabhängiger und gegen das Threonin-Analoge Gt—Amino-ß-hydroxyvaleriansäure resistenter Stamm, wird als Anzuchtstamm verwendet. Die Züchtung wird unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt, ,jedoch werden 200 Ltg/Liter Thiämin dem in Beispiel 1 beschriebenen Nährmedium zugesetzt. Nach beendeter Züchtung sind in der G-ärmaische 30,1 mg/ml L-Lysin (als Hydrochlorid) angereichert.
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Claims (4)

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von L-Lysin auf mikrobiologischem Wege, dadurch gekennzeichnet, daß man einen L-Lysin erzeugenden Mikroorganismus der Gattung Brevibacterium, Corynebacterium, Arthrobacter, Microbacterium, Bacillus oder Nocardia, der. abhängig ist von Homoserin, Threonin, Threonin plus Methionin, Leucin, Isoleucin oder deren Gemischen und gegen Rückkopplungsheiiimung und/oder Repression durch mindestens eine der Verbindungen Lysin und Lysin-Analoge, Threonin und Threonin-Analoge und Isoleucin und Isoleucin-Analoge resistent ist, unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium züchtet und das sich in der Gärmaische anreichernde L-Lysin in bekannter Weise abtrennt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man die Züchtung bei Temperaturen von etwa 20 bis 400C und bei einem pH-Wert von etwa 4-,O bis 9,5 durchführt.
3· Verfahren nach Anspruch 1, -dadurch gekennzeichnet , daß man die Menge der zum Wachstum des Mikroorganismus erforderlichen Aminosäure, die dem Nährmediuni zugesetzt wird, auf einen Wert unterhalb der für optimales Wachstum benötigten Menge einstellt»
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Corynebacterium glutamicum BL-25 A.T.C.C. 21526, Brevi-
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bacterium flavum LT-1 A.T.C.C. 21^28, Corynebacterium clutamicum T-135 A.T.C.C. 21^27, Corynetacteriua Glutamicum "EL-9 A.T.CC.
215A3/Coi-jTiOhactoriua clutanicua LY-32-6 A.T.C.C. 215-4Λ ver-
BAO ORtQlNAf
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