DE2342912A1

DE2342912A1 - Verfahren zur herstellung von l-histidin

Info

Publication number: DE2342912A1
Application number: DE19732342912
Authority: DE
Inventors: Hirotaka Kamijo; Kanagawa Kawasaki; Osamu Mihara; Hiroshi Okada; Shinji Okumura
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1972-08-25
Filing date: 1973-08-24
Publication date: 1974-03-07
Also published as: JPS5123593B2; US3875001A; FR2197066B1; JPS4941592A; FR2197066A1; DE2342912C2; GB1431593A

Description

Priorität: 25. August 1972, Japan, Nr. 85 715/1972

Verfahren zur Herstellung von L-Histidin

Die Erfindung betrifft die" Herstellung von L-Histidin, das nachstehend als Histidin abgekürzt werden soll, durch Fermentation und insbesondere eine Verbesserung des in der US-PS 3 716 453 beschriebenen Verfahrens.

In dieser Patentschrift wird bereits beschrieben, daß Histidin durch Fermentation von herkömmlichen Kulturmedien durch Mikroorganismen der Arten Brevibacterium, Corynebacterium und Arthrobacter, die künstlich induzierte Mutanten von Stammstämrnen sind.die bei den gleichen Bedingungen zur Bildung von Histidin nicht fähig sind, hergestellt werden kann. Diese Mutanten sind gegenüber 2-Thiazolalanin in Konzentrationen von mehr als 1 mg/ml des Kulturmediums beständig..

Es wurde nun gefunden, daß andere Mutanten, die zu den Arten Brevibaeterium und Corynebacterium gehören und bei denen eine Beständigkeit gegenüber 2-Thiazolalanin mit speziellen Nährstofferfordernissen kombiniert .ist, den in dieser Patentschrift beschriebenen

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Mikroorganismen hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur ferraentativen Erzeugung von Histidin stark überlegen sind. Die erforderlichen Nährstoffe sind Arginin, Methionin, Tryptophan, Leucin, Phenylalanin, Lysin, Threonin, Xanthin, üracil und/oder Shikimisäure.

Die erfindungsgemäß verwendeten Mutanten werden aus den ent-■ sprechenden Ausgangsstämmen bzw. Stammstämmen durch herkömmliche Methoden hergestellt, die zum Teil in der genannten Patentschrift beschrieben werden. Beispiele hierfür sind die Aussetzung des Ausgangsstammes gegenüber eine ionisierenden Strahlung (Ultraviolettstrahlung, Röntgenstrahlen, Gammastrahlen) oder gegenüber chemischen rautagenen Mitteln (Natriumnitrit, Nitrosoguanidxn, Diäthy!sulfat). So führt in typischer V/eise das Aussetzen gegenüber 25o/Ug/ml Nitrosoguanidin bei 30⁰C über einen Zeitraum von 3o Minuten zu dem gewünschten Effekt.

Die erzeugten Mutanten werden auf ein sonst herkömmliches Kulturmedium inokuliert, welches genügend 2-Thiazolalanin enthält, daß das Wachstum des Stammstammes bzw. Ausgangsstammes unterdrückt wird. Dies erfordert im allgemeinen mehr als 1 mg/ml 2-Thiazolalanin, wobei die besten Histidin-erzeugenden Stämme auf I4edien wachsen können, die 5 mg 2-Thiazolalanin Je ml enthalten. Die beständigen Stämme werden gesammelt und sie können einer weiteren Behandlung mit mutagenen Mitteln unterworfen werden. Die Stämme, welche die oben angegebenen spezifischen Nährstoffe erfordern, -werden sodann in herkömmlicher Weise aus der ersten oder zweiten Generation von Mutanten ausgewählt.

Diese Stämme erzeugen alle Histidin durch eine aerobisehe Fermentation von herkömmlichen wässrigen Kulturmedien, die assimilierbare Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff und geringere Mengen von anorganischen Salzen und organische Nährstoffe mit Einschluß der spezifisch erforderlichen Substanz oder Substanzen enthalten.

Die besten Histidin-erzeugenden Stämme, die derzeit verfügbar sind, sind untenstehend mit ihrer Hinterlegungsnummer (FERM-P) bein

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Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology at Inage, Chiba-shi, Japan und den in Klammern angegebenen spezifischen Nährstoffen aufgeführt. Sie leiten sich von B. flavum ATCC ΙΛ067, B. lactofermentum ATCC I3869 und C.acetoacidophilum ATCC 13870 ab.

Brevibacterium flavum

FERK-P I56I (Arginin)

FERM-P 1562 (Methionin)

FERM-P I563 (Tryptophan)

FERM-P 1564 (Uraeil)

FERM-P 2168 (Shikimisäure)

FERM-P 2169 (Xanthin)

FERM-P 2170 (Threonin)

Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1565 (Leucin) FERM-P 1566 (Leucin und Tryptophan) FERM-P 1567 (Leucin und Phenylalanin) FERM-P 1568 (Phenylalanin) Corynebacterium acetoacidophilum FERM-P 1569 (Lysin)

Geeignete Kohlenstoffquellen für die Fermentationsmedien sind z.B. Kohlehydrate (Glucose, Saccharose, Stärkehydrolysat, Molassen, Stärke), organische Säuren (Essigsäure, Fumarsäure, Benzoesäure, Milchsäure, Gluconsäure und Fettsäuren) und Alkohole (Äthanol, Propanol, Butanol, Glycerin, Sorbit, Mannit).

Zur Erzielung einerguten Ausbeute an Histidin wird die Fermentation aerobisch unter Belüftung und Durchbewegung durchgeführt. Beste Ergebnisse erfordern einen pH-Wert, der im Bereich von 5 bis 9 kontrolliert wird.' Der gewünschte pH-^T.-.^Tert kann mittels gasförmigem oder wässrigem Ammoniak, Calciumcarbonat, Alkalimetallhydroxiden, Harnstoff, organischen oder anorganischen Säuren aufrechterhalten werden. Einige dieser Mittel ergeben auch die erforderliche Stickstoffzuführung. Wenn die Fermentation bei 25° bis 37°C durchgeführt wird, dann erreicht die Histidin-Konzentration in der Brühe innerhalb von 2 bis 7 Tagen ein Maximum.

Das Histidin kann aus dem Kulturmedium durch eine Ionenaustausch-Harzbehandlung der bekannten Art gewonnen werden. Eine solche wird z.B. in der genannten Patentschrift beschrieben. Darin sind auch die bekannten Methoden zur Identifizierung und zur quantitativen Bestimmung des Produktes beschrieben.-

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Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert.

Beispiel 1:

Brevibacterium flavum FERM-P 1561 wurde auf Bouillon-Agar-Schrägkulturen kultiviert. Ein wässriges Fermentationsmedium, das Je Deciliter Io g Glucose, 5 g (NHj^SO^, o,l g KH₂PO^, o,o4 g MgS0^«7H₂0, o,2 mg Fe⁺⁺, o,2 mg Mn⁺⁺, 5oyug Biotin, 5,0 /Ug Thia-" min'HCl, 0,3 ml Sojapröteinhydrolysat, 50 mg Arginin und 5 g CaCO, enthielt, wurde auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt. 2o ml-Ansätze des Mediums wurden jeweils in 500 ml Schüttelkolben überführt. Es wurde mit Wasserdampf sterilisiert und danach erfolgte die Inokulierung mit den Mikroorganismen. Jedes Kulturmedium wurde 72 Stunden bei 31⁰C geschüttelt. Es wurde festgestellt, daß die kombinierten Brühen 1,11 g/dl Histidin enthielten.

Die Mikrobenzellen wurden aus einem Liter der Brühe durch Zentrifugieren entfernt. Die überstehende Flüssigkeit wurde von Histidin befreit, indem sie über eine Säule mit dem stark sauren Ionenaustauscherharz Amberlite IR-12o (Η-Typ) geleitet wurde. Die Säule wurde gewaschen und sodann wurde das Histidin mit einer 3%-igen Ammoniumhydroxid-Lösung eluiert. Das Eluat wurde teilweise im Vakuum verdampft. Das aus dem Konzentrat kristallisierte Histidin wurde in einer Menge von 7,3 g gewonnen.

Bei einem Vergleichsversuch wurde B.flavum ATCC 2l4o6 bei den gleichen Bedingungen in dem gleichen Fermentationsmedium kultiviert. Es wurde in guter Übereinstimmungmit Beispiel 1 der genannten Druckschrift eine Histidin-Konzentration von o,4o g/dl erhalten.

Beispiel 2;

Die Mikroorganismus-Stämme der FERM-P-Nummern I562 bis I569 und 2168 bis 2170 wurden bei den gleichen allgemeinen Bedingungen wie im Beispiel 1 in Fermentationsmedien kultiviert, welche, hinsichtlich des Gehaltes von Glucose, Monokaliumphosphat, Magnesiumsulfat Eisen(Il)- und Mangan(II)-ionen, Thiaminhydrochlorid und Calcium-

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carbonat mit dem Medium des Beispiels 1 identisch waren, kultiviert. Die Medien unterschieden sich hinsichtlich ihrer Anfangskonzentrationen von Biotin, Ammoniumsulfat und Sojaproteinhydrolysat nach den Angaben der Tabelle I. Zum Teil enthielten sie weitere organische Nährstoffe, die in Tabelle I als Meth. (Methionin), Try. (Tryptophan), Ur. (Uracil), Lys. (Lysinhydrochlorid), Shik. (Shikimisäure), Xan. (Xanthin), und Thre. (Threonin) abgekürzt sind. In der Tabelle werden auch die in Jedem Medium angesammelten Histidinmengen aufgeführt.

	Biot.	Amm.sulf.	Tabelle I	Nährstoff	-	30	Histid.
Stamm	/ug/l	g/dl	Soya Prot.	mg/dl	Try.	5o	g/dl
FEtRM-P	500	5	Hydro., g/dl	Meth.	-	5o	I,o8
I562	5oo	VJI	o,3	Try.	-		I,o2
I563	500	5	o,3	Ur.	Lys.	30	l,lo
1564	5o	3	o,3	Shik.		0,86
1565	5o	3	. 2,o	Xan.		I,o4
1566	5o	3	2,o	Thre.	3o	o,99
1567	5o	3	2,o		4o	I,o5
1568	5oo	5	2,o	15	o,52
1569	5oo	5	o,3	5o	o,92
2168	500	Ul	o,3		0,85
2169	500	5	o,3		l,oo
217ο	3:		o,3
Beispiel

Die Mikroorganismus-Stämme FERM-P 15βΐ bis I569 wurden bei 31 C 2Ό Stunden in einem Kulturmedium kultiviert, welches je dl 3 g Glucose, 0,3 g Ammoniumacetat, ο,2 g Harnstoff, o,l g ₂₄ 4o mg MgS0^»7H₂0, o,2 mg Fe⁺⁺, o,2 mg Mn⁺⁺, Io ,ug Biotin, 2o/Ug Thiämin»HCl, 2 ml Sojaproteinhydrolysat und 0,5 g Hefeextrakt enthielt und das auf einen pH-V/ert von 7,5 eingestellt worden war.

Eg wurde ein wässriges Fermentationsmedium bereitet, welches je dl 3 g Glucose, 0,5 g Ammoniumacetat, o,2' g Harnstoff, o,l g PO₄, o,o4 g MgSO₄.7 H₂O, o,2 mg Fe⁺⁺, o,2 mg Mn⁺⁺, loyu g Bio-

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tin, 5 ug Thiamin«HCl, ο,5 ml Maisquellflüssigkeit, 2 ml Sojapro teinhydrolysat enthielt und das auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt worden war. 3oo ml-Ansätze des Fermentationsmediunjs wurden jeweils in 1 1 Fermentationsgefäße gebracht. Sie wurden darin mit den erforderlichen Nährstoffen der Stämme gemäß den Angaben in den Beispielen 1 und 2 vermischt. Darauf erfolgte eine Sterilisierung und eine Inokulierung mit 15 ml-Portionen der oben genannten Samenkulturen. Es wurde bei einer Belüftungsrate von 3oo ml/min, und einer Rührung mit 15oo Upm bei 31°C gehalten.

Zu jedem Fermentationsgemisch wurde eine Lösung, die Essigsäure und Ammoniumacetat in einem Holverhältnis von 4 : 1 und insgesamt 6o g/dl Acetationen enthielt, mit einer solchen Geschwindigkeit gegeben, daß ein pH-Wert von 7*2 bis 8,ο ohne Überschreitung einer Essigsäure-Konzentration von 1,5# erhalten wurde.

Nach 5o Stunden wurde in jedem Fermentationsmedium die Histidin-Konzentration bestimmt. In den Kulturen von B. flavum FERM-P 156I bis 1564 betrugen in der angegebenen Reihenfolge die Histidin-Konzentrationen o,92, o,93, 0,88 und I,o6 g/dl. Die Mikroorganismen B.lactofermentum FERM-P I565 bis I568 lieferten o,93, o,77, o,95 und I,o2 g/dl Histidin. Die Brühe von C.acetoacidophilum FERM-P 1569 enthielt o,49 g/dl Histidin.

Zu Vergleichszwecken wurden analoge Fermentationsversuche mit B. flavum ATCC 2l4o6 und C.acetoacidophilum ATCC 2l4o7 durchgeführt. Inden jeweiligen Brühen wurden nach 5o Stunden 0,38 und 0,18 g/dl Histidin festgestellt. Die zwei letztgenannten Mikroorganismus-Stämme sind aus der genannten-US-PS 3 716 453 bekannt. Sie sind zwar gegenüber 2-Thiazolalanin beständig, jedoch fehlen bei ihnen spezifische Nährstofferfordernisse.

Beispiel 4»

Inocula der in Beispiel 3 genannten 11 Mikroorganismen wurden wie in vorstehendem Beispiel in einem Medium hergestellt, das anstelle

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von Ammoniumsulfat weiteren o,l g/dl Harnstoff enthielt.

Das grundlegende Fermentationsmedium, das verwendet wurde, enthielt je dl 1 g Glucose, 1,5 g Äthanol, o,5 g Ammoniumsulfat, o,2 g Harnstoff, o,1 g KHgPO^, o,o4 g MgSO₂^H₂Q, o,2 mg jeweils von Fe⁺⁺ und Mn⁺⁺, Io/Ug Biotin, 5,cyug Thiamin'HCl, 2 ml So Japroteinhydrolysat und o,5 ml Maisquellflüssigkeit. Das Medium hatte einen pH-Wert von 7*2. J5oo ml-Ansätze dieses Fermentationsmediums wurden mit den spezifischen Nährstoffen, die in den Beispielen 1 und 2 angegeben sind, vermischt. Es wurde mit Wasserdampf in 1 1 Fermentationsgefäßen sterilisiert und es erfolgte eine Inokulierung mit 15 ml der jeweiligen Kulturen. Es wurde unter Belüften mit 3oo ml/min, und Rührung mit 15oo Upm bei j51°C gehalten. Gasförmiges Ammoniak wurde jedem Fermentationsgemisch mit einer solchen Geschwindigkeit zugeführt, daß der pH-Wert zwischen 7#o und 7*5 gehalten wurde. Es wurde Äthanol zugeführt, das eine Konzentration von o,5 g/dl aufrechterhalten wurde.

Nach 48 Stunden wurden die 11 Brühen auf den Histidin-ßehalt untersucht. Die neun erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen ergaben in der Reihenfolge der ansteigenden FERM-P~Nummern o,79, o,7o, o,73, o,84, o,8l, o,66, 0,78, 0,85 und o,4o g/dl Histidin» Demgegenüber enthielten die Brühen der zwei Kontrollstämme 0,28 bzw. o,15 g/dl Histidin.

- Patentansprüche -

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Claims

Patentansprüche

(Iy Verfahren zur Herstellung von L-Histidin, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) einen Stamm von Brevibacterium und/oder Corynebacterium bei aerobischen Bedingungen in einem wässrigen Medium kultiviert, welches Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff und geringere Mengen von anorganischen Salzen und für das Wachstum des Stammes erforderliche organische Nährstoffe enthält, bis sich Histidin in dem Medium ansammelt, wobei der verwendete Stamm eine künstliche induzierte Mutante ist, die dazu imstande ist, in einem Medium zu wachsen, das mehr als 1 mg 2-Thiazolalanin je ml enthält und die für das Wachstum mindestens einen der organischen Nährstoffe Arginin, Methionin, Tryptophan, Leu-. ein, Phenylalanin, Lysin, Threonin, Uracil, Xanthin und/oder Shikimisäure benötigt und daß man

(b) das angesammelte Histidin aus dem Medium gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η ze-lehnet, daß man als Mikroorganismus-Stamm Brevibacterium flavum PERM-P 1561, PERM-P 1562, FERM-P I563, PERM-P 1564, Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1565» FERM-P 1566, FERM-P

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1567 s FERM-P 1568 und/oder Corynebacterium ac et oac idophilum FEEM-P I569 verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus-Stamm Brevibaeterium flavum FERM-P 2168, 2169 und/oder FERM-P 217o verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch I₉ _ dadurch gekennzeichnet, daß man als Stamm einen Stamm von Brevibaeterium flavum verwendet.

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