DE2301077C2

DE2301077C2 - Verfahren zum Herstellen von L-Prolin

Info

Publication number: DE2301077C2
Application number: DE19732301077
Authority: DE
Inventors: Shinji Tokio/Tokyo Okumura; Takayasu Kawasaki Kanagawa Tsuchida; Fumihiro Yoshinaga
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1973-01-10
Filing date: 1973-01-10
Publication date: 1985-12-12
Also published as: DE2301077A1

Description

Brevibacterium flavum ATCC 39 681,
Brevibacterium flavum ATCC 39 682,
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 39 683 oder
Corynebacterium glutanicum ATCC 39 684

züchtet

enthält Sodann werden die gegenüber den Sulfonamid-Arzneimitteln resistemen Mutanten ausgesiebt Die Resistenz der mutierten Stämme gegenüber den Sulfonamid-Arzneimitteln wird in der Weise bestimmt, daß das relative Wachstum des mutierten Stammes auf einem Sulfonamid-Arzneimittel enthaltenden Medium mit demjenigen des Stemmstammes verglichen wird. Das bedeutet, daß das relative Wachstum des mutierten Stammes größer ist als das des Stammstammes als Ganzem. Da« relative Wachstum ist das Verhältnis des Wachstums auf einem Sulfonamid-Arzneimittel enthaltenden Medium zu dem Wachstum auf einem Fulfonamid-freien Medium.
Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Sulfonamid-Arzneimittel haben die folgenden allgemeinen Merkmale. Sie sind im allgemeinen als Antagonisten für p-Aminobenzoesäure bekannt

(1) Sie besitzen die allgemeine Formel:

Die Erfindung betrifft die Herstellung von L-Prolin gemäß dem Verfahren des Patentanspruches.

L-Prolin, das nachstehend als Prolin bezeichnet werden soll, dient als Nahrungsmittel-Ergänzung, Arzneimittel und für medizinische Forschungszwecke.

Es ist bereits bekannt, daß bestimmte auxotrophe Organismen, welche zur Art Brevibacterium gehören, dazu imstande sind, in einem Medium Prolin herzustellen (US-PS 33 29 577). Die Konzentration des nach dieser Methode hergestellten Prolins beträgt aber höchstens 1,5 g je Deciliter bei günstigen Umständen.

Es wurde nun gefunden, daß erheblich verbesserte Mengen von Prolin in einem wäßrigen Kulturmedium angesammelt werden, wenn man mutierte Stämme, welche gegenüber Sulfonamid-Arzneimitteln bzw. Sulfa-Arzneimitteln resistent sind, von Mikroorganismen der Art Brevibacterium oder Corynebacterium verwendet. Wenn die mutierten Stämme von Stammstämmen von Prolin produzierenden auxotrophen Organismen hergeleitet sind, dann wird die Produktivität von Prolin extrem verbessert. Darüber hinaus können sogar mutierte Stämme, welche sich von Stammstämmen herleiten, die zur Bildung von Prolin nicht imstande sind, signifikante Mengen von Prolin erzeugen.

Die Mikroorganismen, die bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind Mutanten, welche gegenüber Sulfonamid-Arzneimitteln bzw. Sulfa-Arzneimitteln resistent bzw. beständig sind.

Die Methode der Mutation erfolgt auf herkömmliche Weise, beispielsweise durch Aussetzen der Zellen der Stammstämme gegenüber ultraviolettem Licht, Röntgenstrahlen oder Gammastrahlen in mutagenen Dosen oder gegenüber Natriumnitrit, Nitrosoguanidin oder Diäthylsulfatlösung in herkömmlicher Weise. So können z. B. die Zellen des Stammstammes auf einem Agar-Nährmedium dem ultravioletten Licht (0,2375 μπι) über einen Zeitraum von 3 Minuten von einer Quelle ausgesetzt werden, welche 30 cm entfernt angeordnet ist.

Die gegenüber den Sulfonamid-Arzneimitteln resistenten Mutanten werden von den ausgesetzten Stammstämmen nach herkömmlichen Methoden selektiert. Die ausgesetzten Stammstämme werden auf einem Agar-Medium oder in einem wäßrigen Nährmedium kultiviert, welches eine für den Stammstamm wachstumsinhibierende Menge der Sulfonamid-Arzneimittel NH₂-

-SO₂NH-

und haben eine antimikrobielle Aktivität.

(2) Die antimikrobielle Aktivität wird durch p-Aminobenzoesäure unterdrückt

Beispiele für bekannte Sulfonamid-Arzneimittel mit den oben angegebenen Merkmalen sind Sulfapyridin, Sulfathiazol, Sulfadiazin, Sulfaguanidin, Sulfamethazin, Sulfamerazin, Sulfadimethoxin, Sulfamethomidin, Sulfamethoxypyridazin, Sulfisomidin, Sulfisoxazol, -Acetosulfamin, Sulfanylamid, Sulfimezol, Sulfaphenazol, Sulfamethizol, Sulfaäthizol, Suflapyrazin, Irgrafen und Irgamid.

Die wirksamsten Prolin-erzeugenden Mutanien, welche bislang aufgefunden worden sind (und die zur Selektion verwendeten Sulfonamid-Arzneimittel) sind Brevibacterium flavum ATCC 39 681 (Sulfaguanidin), Brevibacterium flavum ATCC 39 682 (Sulfaguanidin), Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 39 683 (Sulfameradin) und Corynebacterium glutamicum ATCC 39 684 (Sulfaguanidin).

Die Mikroorganismentstämme mit den Hinterlegungsmummern ATCC 39 681, ATCC 39 682 und ATCC 39 683 waren ursprünglich am 14. November 1972 unter den Hinterlegungsnummern Ferm-P 1681, Ferm-P 1682 und Ferm-P1683 bei dem Fermentation Research Institut hinterlegt worden. Der Stamm ATCC 39 684 war am 19. Dezember 1972 unter der Hinterlegungsnummer Ferm-P 1781 bei dem Fermentation Research Institut hinterlegt worden. Die Stämme wurden am 18. April 1984 von FRI unmittelbar bei der ATCC hinterlegt, wo sie die Hinterlegungsbezeichnungen ATCC 39 681,39 682,39 683 und 39 684 bekamen.

Die zur Fermentierung der erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen verwendeten Nährmedien sind herkömmlicher Natur. Sie enthalten assimilierbare Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff sowie anorganische Salze. Es können geringere Mengen von organischen Nährstoffen wie Vitaminen und Aminosäuren zugesetzt werden. Beispiele für assimilierbare Kohlenstoffquellen sind Kohlenhydrate wie Glucose, Stärkehydrolysate oder Molassen, Alkohole wie Äthanol, organische Säuren wie Essigsäuren und andere herkömmliche Kohlenstoffquellen. Beispiel für assimilierbare

23 Ol 077

Stickstoffquellen sind organische oder anorganische Stickstoff enthaltende Verbindungen wie Nitrate, Ammoniumsalze, Ammoniakgas, Ammoniumhydroxidlösungen und Harnstoff.

Zur Erzielung guter Prolinausbeuten wird die Fermentation aerobisch unter Belüftung und/oder Durchbewegung durchgeführt Beste Ausbeuten erfordern eine pH-Kontrolle im Bereich von 5 bis 9. Der gewünschte pH-Wert kann durch Zugabe von gasförmigem oder wäßrigem Ammoniak, Calciumcarbonat, Alkalimetallhydroxid, Harnstoff, organischen oder anorganischen Säuren zu dem Medium von Zeit zu Zeit aufrechterhalten werden. Ein Teil dieser Mittel kann auch dazu dienen, um assimilierbaren Stickstoff zuzuführen. Wenn die Fermentation bei 24 bis 37° C durchgeführt wird, dann erreicht die Prolinkonzentration in der Brühe innerhalb 2 bis 7 Tagen das Maximum.

Das in der Fermentationsbrühe akkumulierte Prolin kann nach herkömmlichen Methoden isoliert werden, beispielsweise durch Entfernung der Zellen durch Filtration oder Zentrifugation, Leiten der Brühe über Ionenaustauscher-Harze und Ausfällung am isoelektrischen Punkt des Prolins.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert

Beispiel 1

Es wurde das relative Wachstum des gegenüber SuI-fonamiden resistenten mutierten Stammes Brevibacterium flavum ATCC 39 681 bestimmt, welcher in einem Sulfoguanidin enthaltenden Medium unter Verwendung eines Agar-Mediums selektiert worden war, welches 500 γ Sulfaguanidin/ml enthielt Ebenfalls wurde das relative Wachstum des Stammstammes Brevibacterium flavum ATCC 15 940 (eine Isoleucin-erfordernde und Prolin-erzeugende Mutante) bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt:

Tabelle 1

zugegebenes relatives Wachstum von

Sulfaguanidin Brev. flavum Brev. flavum

(ylm\) ATCC 39 681 ATCC 15 940

lOOO^Thiamin-HCl/L 10 mg L-Isoleucin/dl, 0,1 ml Sojabohnenprotein-Hydrolysat/dl und 5 g CaCO₃ZdI enthielt Der pH-Wert wurde auf 7,0 eingestellt 300 ml-Ansätze des Mediums wurden in 1000-ml-Fermentationsgefäße gebracht wodurch Wasserdampf sterilisiert und mit Brevibacterium flavum FERM-P 1681 inokuliert Die Fermentation erfolgte 22 Stunden bei 37°C. Durch Einführung von gasförmigem Ammoniak wurde während der Fermentation der pH-Wert des Mediums kontroUiert

Nach der Kultivierung wurden 2,89 g Prolin/dl in der Fermentationsbrühe festgestellt 11 der kombinierten Brühe wurde zur Entfernung der Zellen filtriert und über ein Ionenaustauscher-Harz geleitet Das Harz wurde mit einer Ammoniumhydroxidlösung eluiert und das Eluat wurde im Vakuum teilweise eingedampft. Sodann wurden den 14,5 g Prolinkristalle erhalten, indem in das Eluat Äthylalkohol eingegossen wurde.
Bei der Kultivierung von Brevibacterium flavum ATCC 15 940 auf die gleiche Weise wurden 1,50 g Prolin/dl in der Fermentationsbrühe festgestellt.

Beispiel 2

Es wurde das relative Wachstum der Sulfonamid-resistenten Mutante Brevibacterium flavum ATCC 39 682 die auf einem Agar-Medium, das 500 ^Sulfaguanidin/ml enthielt, selektiert worden war in einem Sulfanguanidin enthaltenden Medium, sowie dasjenige des Stammstammes Brevibacterium flavum ATCC 15 942 (eine Histidin-erfordernde und Prolin-erzeugende Mutante) bestimmt Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle Il zusammengestellt

Tabellen

100
200
300
400
500
600

100
98
95
90
68
40
11

100

95

88

42

Medium:

2 g Glucose/dl, 1 g (NH₄J₂S(VdI, 0,1 g Farnstoff/dl, 50/ Biotin/1, 100/Thiamin-HCl/l, 20 mg L-Isoleucin/dl, 0,1 g KH₂PO₄ZdI, 0,3 g K₂HPO₄ZdI, 0,1 g MgSO₄ · 7 H₂OZdI, 2 ppm Fe⁺ +, 2 ppm Mn⁺ + und Sulfaguanidin wie in der Tabelle angegeben.

Kultivierung:

3 ml des Mediums werden in 10 ml Reagenzgläser gegeben, mit 2 χ 10⁷ Zellen inokuliert und 48 Stunden bei 31,5° C fermentiert.

Es wurde ein wäßriges Medium hergestellt, welches 10 g Glucose/dl, 4 g (NH₃J₂SO₄ZdI, 0,1g KH₂PO₄ZdI, 0,04 g MgSO₄ · 7 H₂OZdI, 0,1 g WeinsäureZdl, 0,2 mg Eisen(III)-ionenZdl, 0,2 mg ManganionenZdl, 450 y Biotin/1,

zugegebenes	40	0	relatives Wachstum von	Brev. flavum
Sulfaguanidin	100	Brev. flavum	ATCC15 942
(y!m\)	200	ATCC 39 682
300		100
45 400	100	100
500	100	100
600	100	75
97	13
78	0
47	0
30

Es wurde bei den gleichen Kultivierungsbedingungen wie im Beispiel 1 gearbeitet, mit der Ausnahme, daß 20 mg Histidin/dl anstelle von 20 mg L-Isoleucin/dl verwendet wurden.

Brevibacterium flavum ATCC 39 682 wurde in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 kultiviert, mit der Ausnähme, daß 10 mg Histidin/dl anstelle von 10 mg L-Isoleucin/dl verwendet wurden. Es wurde bei denselben Kultivierungsbedingungen wie im Beispiel 1 gearbeitet. Nach der Kultivierung wurden in der Fermentationsbrühe 266 g Prolin/1 festgestellt.

Bei der Kultivierung von Brevibacterium flavum ATCC 15 942 in der gleichen Weise wurden in der Fermentationsbrühe 0,76 g Prolin/dl festgestellt.

Beispiel 3

Es wurde das relative Wachstum in einem Sulfameradin enthaltenden Medium der Sulfonamid resistenten Mutante Corynebacterium acetoacidophilum ATCC

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39 683 bestimmt, welche auf einem Agar-Medium selektiert worden war, welches 500 γ Sulfameradin/ml enthielt Weiterhin wurde das relative Wachstum des Stammstammes Corynebacterium pcetoacidophilum FERM-P 1780 (eine Isoleucin-erfordernde und Prolinerzeugende Mutante) bestimmt Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengestellt

Tabelle III	relatives Wachstum von	Coryn. aceto
zugegebenes	Coryn.	acidophilum
Sulfameradin	acetoacidophilum	FERM-P
fr/ml)	ATCC 39 683	1780
		100
	100	100
0	100	100
100	100	75
200	96	13
300	78	0
400	50	0
500	31
600

Die Kultivierungsbedingungen waren die gleichen wie beim Beispiel 1.

Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 39 683 wurde auf die gleiche Weise wie im Beispiel 1 kultiviert Nach der Kultivierung wurden in der Fermentationsbrühe 2,10 g Prolin/dl gefunden.

Beispiel 4

Es wurde ein wäßriges Kulturmedium hergestellt, welches 0,8 g Ammoniumacetat/dl, 0,41 g Natriumacetat/dl, 0,3 g (NH₄J₂S(VdI, 0,2 g KH₂PO₄ZdI, 0,04 g MgSO₄ · 7 H₂OZdI, 0,2 mg Eisen(III)-ionen/dl, 0,2 mg ManganionsnZdl, 1 ml Sojaprotein-Hydrolysat/dl, 15 mg L-Isoleucin/dl, 450 /BiotinZl,1000 /Thiamin-HClZl,0,2 g Harnstoff/dl enthielt 300 ml dieses Mediums wurden in einen 1000-ml-Fermentator gegeben und 10 Minuten bei 110⁰C sterilisiert.

Brevibacterium flavum ATCC 39 681 wurde in einem wäßrigen Medium kultiviert, welches 14 g Stärke-Säurehydrolysat/dl, 0,3 g Ammoniumacetat/dl, 03 g (NH₄J₂SO₄ZdI, 0,15 g KH₂PO₄ZdI, 0,04 g MgSO₄ · 7 H₂OZdI, 0,2 g Eisen(III)-ionenZdl, 0,2 g ManganionenZdl, 1 ml Sojaprotein-SäurehydrolysatZdl, 15 mg L-IsoleucinZdl, 450/ BiotinZl, 1000/ Thiamin-HClZl und 0,2 g HarnstoffZdl enthielt Die Kultivierung erfolgte über einen Zeitraum von 12 Stunden bei 31,5° C. 15 ml dieser Kulturbrühe wurden in den 1000-ml-Fermentator gegeben.

Die Fermentation erfolgte aerob bei 31,5" C. Während der Fermentation wurde der pH-Wert des Mediums durch Einleiten von gasförmigen Ammoniak und von 50 g wäßriger Essigsäurelösung/dl in den Fermentator auf 7,5 bis 8,0 gehalten. Nach einer 48stündigen Kultivierung waren 20 g Essigsäure je 100 ml Medium verbracht worden und es hatten sich 4,70 g ProlinZdl in der Fermentationsbrühe angesammelt

Aus 200 ml der Brühe wurden wie im Beispiel 1 9,1 g rohe Kristalle von Prolin isoliert.

Beispiel 5

Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 39 683 wurde wie im Beispiel 4 kultiviert. Nach einer 48stündi gen Kulitivierung waren 163 g Essigsäure je 100 ml des Mediums verbraucht worden und in der Fermentationsbrühe hatten sich 4,23 g ProlinZdl angesammelt

Beispiele

Es wurde ein wäßriges Kulturmedium hergestellt, welches 1,5 g ÄthanolZdl, 0,5 g AmmoniumsulfatZdl, 0,1 g KH₂PO₄ZdI, 0,04 g MgSO₄ · 7 H₂OZdI 0,2 g Ei sen(III)-ionenZdl, 0,2 g Manganionen/dl, 2 ml Sojapro tein-SäurehydrolysatZdl, 15 mg L-lsoleucinZdi, 450/ BiotinZl, 1000 / Thiamin-HClZl, 03 ml MaisqueüwasserZ dl und 0,1 g HarnstoffZdl enthielt. Es wurde auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt 300 ml dieses Mediums wurden in einen 1000-ml-Fermentator gegeben und mit Dampf sterilisiert

Brevibacterium flavum ATCC 39 681, das zuvor auf einer Bouillon-Agar-Schrägkultur kultiviert worden war, wurde in das Medium inokuliert und aerob bei 31,5°C kultiviert Während der Fermentation wurde der pH-Wert des Mediums bei 7,5 bis 8,0 gehalten, indem gasförmiges Ammoniak eingeleitet wurde. Die Äthanolkonzentration im Medium wurde bei etwa 0,1 gZdl gehalten, indem eine 9O°/oige Äthanollösung eingespeist wurde. Nach einer 48stündigen Kultivierung waren 10 g Äthanol je 100 ml des Mediums verbraucht worden und es hatten sich in der Fermentationsbrühe 1,00 g Prolin angesammelt

B e i s ρ i e 1 7

Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 39 683 wurde wie im Beispiel 6 beschrieben kultiviert Nach einer 48stündigen Kultivierung waren 11,2 g Äthanol je 100 ml des Mediums verbraucht worden, und in der Fermentationsbrühe hatten sich 0,8 gZdl Profin angesammelt

Beispiel 8

Das relative Wachstum in einem Sulfaguanidin-enthaltenden Medium der Sulfonamid-resistenten Mutante Corynebacterium glutamicum ATCC 39 684 welche in einem Agar-Medium selektiert worden war, das 500 /Z ml Sulfaguanidin enthielt, sowie das relative Wachstum des Stammstammes Corynebacterium glutamicum (Micrococcus glutamicus) ATCC 13 032 (ein wilder Stamm, der nicht dazu imstande ist, Prolin zu erzeugen) wurde bestimmt Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt.

Tabelle IV

zugegebenes relatives Wachstum von

Sulfaguanidin Coryn.glutamicum Coryn. O'Zml) ATCC 39 684 glutamicum

ATCC 13 032

0	100	100
60 100	100	100
200	100	95
300	100	84
400	81	50
500	32	0
65 600	0	; 0

Corynebacterium glutamicum FERM-P 1781 wurde nach der gleichen Methode wie im Beispiel 1 kultiviert.

Ol

Nach der Kultivierung wurden in der Fermentationsbrühe 1,50 g Prolin/dl gefunden.

Bei der Kultivierung von Corynebacterium glutamicum ATCC 13 032 in der gleichen Weise wurde in der
Fermentationsbrühe kein Prolin festgestellt. 5

10

20

25

30

40

45

50

55

60

65

Claims

23 Ol 077

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von L-Prolin durch Züchtung eines Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff und anorganische Salze enthält, und Isolieren des in dem Medium angereicherten L-Prolins, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus