DE2350647A1

DE2350647A1 - Verfahren zur herstellung von l-lysin

Info

Publication number: DE2350647A1
Application number: DE19732350647
Authority: DE
Inventors: Kanagawa Kawasaki; Koji Kubota; Hiroshi Okada; Yasuhiko Yoshihara
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1972-10-09
Filing date: 1973-10-09
Publication date: 1974-04-25
Also published as: CA998955A; FR2202154A1; PH10052A; IT1001556B; GB1425648A; AR199491A1; JPS4961386A; JPS5434835B2; US3871960A

Description

Priorität: 9. Oktober 1972, Nr. 101446/1972, Japan

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin und spezieller ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin durch Fermentation.

L-Lysin wurde bisher durch Fermentation mit Hilfe von drei Arten von Bakterien hergestellt. Die erste Art bzw. der erste Typ erfordert für ihr Wachstum Aminosäuren, die in Zusammenhang mit der Biosynthese von L-Lysin stehen. Ein Beispiel für diesen Typ ist eine Homoserin-abhängige Mutante von Micrococcus glutamicus, die in der US-PS 2 979 439 beschrieben wird. Zu dem zweiten Typ gehören Threonin- oder Methionin-empfindliche Mutanten, deren Wachstum durch das Vorliegen einer gewissen Menge an Threonin oder Methionin inhibiert wird, d.h. unter Bedingungen, unter denen das Wachstum des Wildstammes, nicht inhibiert wird, und Mutanten, welche diese Threonin- oder Methionin-Empfindlichkeit in Verbindung mit einem Nährstoff-Bedarf an Threonin aufweisen (PR-PS 1 533 688). Für den dritten Typ ist die Resistenz gegen-

409817/1121

über S-(2-Aminoätbyl)-L-cystein (nachstehend kurz als AEC bezeichnet) kennzeichnend, ein Schwefel-Analoges von 3>-Lysin (US-PS 3 707 441).

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, L-Lysin in einfacher Weise und mit geringem Aufwand aus leicht zugänglichen Ausgangsmaterialien herzustellen. Es ist gut bekannt, daß L-Lysin für die menschliche und tierische Ernährung unerläßlich ist und die Anreicherung von Nahrungsmitteln stellt ein weites Anwendungsgebiet für diese Verbindung dar.

Es wurde nun gefunden, daß Mutanten, die Resistenz gegenüber Rückkopplungshemmung durch Lysin und dessen Analoge, wie AEC, in Konzentrationen von 1 mg/ml oder darüber in Kombination mit einer Methionin-Empfindlichkeit oder in Kombination mit dieser Methionin-Empfindlichkeit und einem Nährstoffbedarf für mindestens eine der Aminosäuren Prolin und Arginin zeigen, in einem Nährmedium große Mengen an L-Lysin bilden.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin durch Züchten eines Lysin-bildenden Stammes des Genus Corynebacterium unter aeroben Bedingungen in einem Medium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie anorganische Salze, für das Wachstum wesentliche Substanzen und organische wachstumsfördernde Substanzen enthält, bei einem pH-Wert von 5 bis 9.

Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm von Corynebacterium verwendet, der

a) unempfindlich bzw. resistent gegen Rückkopplungshemmung durch Lysin und Lysin-Analoge ist und

b) Methionin-Empfindlichkeit zeigt

tnd das gebildete L-Lysin aus dem Medium gewinnt.

4098 17/1 121

Die Methionin-Empfindlichkeit der erfindungsgemäß verwendeten Mutanten beruht auf einem anderen Prinzip als die Threonin- oder Methionin-Empfindlichkeit der Mutante gemäß PR-PS 1 533 688. So wird das Wachstum des in dieser französischen Patentschrift beschriebenen Mutantenstammes durch das Vorliegen einer dieser beiden Aminosäuren Threonin und Methionin in einem Medium inhibiert, wogegen das Wachstum des Wildstammes nicht inhibiert wird, und die Wachstumshemmung durch Threonin wird durch Zugabe von Methionin und die Hemmung durch Methionin wird durch Zugabe von Threonin aufgehoben. Andererseits wird das Wachstum des erfindungsgemäß verwendeten Methionin-empfindlichen Stammes durch das Vorliegen von Methionin, nicht Jedoch durch Threonin, gehemmt und die Wachstumshemmung durch Methionin kann durch Zugabe von Threonin nicht aufgehoben werden.

Bis jetzt war ein Lysinbildner mit dieser speziellen Art von Methionin-Empfindlichkeit nicht bekannt«.

Der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Mikroorganismus kann auch ein Mutantenstamm sein, der andere biologische Eigenschaften, wie einen anderen Nährstoffbedarf und/cder Resistenz gegenüber anderen Reagenzien in Verbindung mit den vorstehend angegebenen Erfordernissen und der Resistenz gegenüber AEG zeigt.

Die erfindungsgemäßen Mutanten werden mit Hilfe üblicher mutagener Mittel aus Mutterstämmen des Genus Corynebacterium und durch Auswahl der so gebildeten Mutanten durch "screening-Methoden^w im Hinblick auf die erforderliche Resistenz, Empfindlichkeit und den Nährstoffbedarf, erhalten. Das Verfahren zur Herstellung dieser Mutantenstämme wird in der nachstehenden Versuchsbeschreibung erläutert*

409817/I121

23506A7

Versuchsbeschreibuiig

1 ·) Der Mutantenstamm Corynebaeierium glutamicuin AJ34OO wurde mit -Hilfe des nachstehend beschriebenen Verfahrens erhalten:

Die Mikroben-Zellen τοη Micrococciis glutamieus ATGO13Q32 (dietaxonomische Bezeichnung dieses Stammes wird© kürzlich in Corynebacterium glutamicum geändert) yraräen mit 250 jag/zal litro- -soguanidin bei 30°C 30 Minuten behandelt. Baaaeh wurden sie auf -flache Agarplatten der folgenden Zusammensetzung aufgeiapft und 4 bis 10 Sage bei 31⁰C gezüchtete

Susammensetzung des Mediums % 2- f Glucose _s O₉3 $ Harnstoff, 1 % (NH4)₂S0₄, 0,1 Ji EH₂PO₄, 0,04 $ MgSO₄..7HgO₉ 2 ppm Fe⁺"¹", 2 ppm Mn⁺⁺, 50 pg/1 Biotin, 100 Mg/1 fhiamia. EGl₉ 0,3^ threonin, O₉3 ^ IEC und 2 $> Agar» Das Medium hatte eiaen pH-Wert iron 7,0.

Aus den Kolonien, die nach der Züchtung auf den Platten erhalten worden waren, konnten sahireiche Mutantenstämme isoliert .werden, die zur Bildung von L-Lysin befälligt sind» 5er Stamm AJ340O wurde aus diesen Mutantenstämmen als guter Lysinbildner isoliert und mit Hilfe der nachstehend beschriebenen Versuche wurde festgestellt, daß'er'Resistenz gegenüber ASC und Methionin-Empfindlichkeit zeigte*

Uer Stamm AJ34OO, der -vorher 24 Stunden auf Bouillon-Schrägagar bei 31 0 gezüchtet worden war, wurde in' 3 ml eines Grundmediums der nachstehend angegebenen Zusammensetzung suspendiert. Je 0,1 ml dieser Suspension wurde zu 3 ml-Proben des Grundmediums gegeben, dem Q,.04 $ der in Tabelle 1 gezeigten Aminosäure zugesetzt worden war, und die Züchtung wurde 24 Stunden bei 31⁰C durchgeführt. Bas Wachstum des Stammes in jedem Medium wurde durch Messen der lichtabsorption der lulturbrühe, die auf das 26-faeJbe ihres ursprüngliches TolumeBS verdünnt worden war und wobei das Calciumcarbonat is der Brühe durch Zusatz von HCl gelöst worden war, bei 562 mp geprüft. Die optische Dichte (OD) der angegebenen Suspension bei 562 mp betrug nach der Verdünnung auf das 26-fache ihres ursprünglichen Volumens 0,345.

409817/1121

Zusammensetzung des Grundmediums:

2 # Glucose, 1 % (NH₄)₂SQ₄, 0,1 # KH₂PO₄, 0,04 # MgSO₄.7H₂ 2 ppm Fe⁺⁺, 2 ppm Mn , 50 ug/1 Biotin, 200 ug/1 Thiamin· HCl und 2 ?£ Calciumcarbonat.
Dieses Medium hatte einen pH-Wert von 7»0.

	a b e 1 1 e	1	relatives Wachstum
Zugesetzte Aminosäure	Wachstum
	(OD₅₆₂)	100
keine	0,345	92
Ir-Arginin	0,317	111
Ir-Cy st ein. HCl	0,384	91
!-Histidin	0,314	78
L-Isoleucin	0,270	78
L-Ieucin	0,268	15
L-Methionin	0,051	120
!-Phenylalanin	0,415	82
!-Threonin	0,280
Ir-Threonin +		11
L-Methionin	0.040

2.) Das Wachstum des Stammes AJ3400 in einem Medium, das L-

Methionin in verschiedenen Anteilen, wie sie in Tabelle gezeigt sind, enthielt, wurde geprüft. Der Stamm AJ3400, der vorher 24 Stunden auf Bouillon-Schrägagar bei 31⁰C gezüchtet worden war, wurde in 3 ml des nachstehend angegebenen Grundmediums eingeimpft, dem L-Methionin und/oder L-Threonin in den in Tabelle 2 gezeigten verschiedenen Mengen zugesetzt worden waren, und bei 31⁰C während 24 Stunden gezüchtet. Die Anzahl der Zellen in dem Medium zu Beginn der Züchtungsperiode betrug 5 x 10 Zellen/ml.

Die optische Dichte (OD) jeder Kulturbrühe wurde durch Messung der Lichtabsorption bei 562 mu der Lösung bestimmt, die durch

4098 17/1121

23506*7

Zugabe von 5 ml Wasser und einem Tropfen konzentrierter ühlcr wasserstoffsäure zu 0,2 ml jeder Kulturbrühe erhalten wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.

Zusammensetzung des Grundmediums j

2 # Glucose, 1 # (NH₄)₂S0₄, 0,1 # KH₂PO₄, 0,04 # MgSO₄.7HgO, 2 ppm Fe⁺⁺, 2 ppm Mn++, 50 ug/1 Biotin, 200 pg/1 Thiamin.HCl, 0,05 # KaCl und 2 $> Calciumcarbonat. Das Medium hatte einen pH-Wert von 7,0.

Tabelle 2

Zugesetztes L-Methio-	Zugesetztes X-Threo-	3,0	Wachstum
^niD (mMol/1)	ⁿⁱⁿ (mMol/1)	30	(OD)
0	_—	100	0,450
0,03	-	0,283
0,1	- .	0,054
0,3	-	0,047
. 1,0	—	0,040
3,0		0,040
3.0	0,042
3.0	0,040
3,0	0,042

Der Stamm AJ3400 zeigte bei 24-stündiger Züchtung in einem Medium, dem mehr als 0,1 mMol (14,9 mg/l) Ir-Methionin zugesetzt waren, kein Wachstum.

Der Elternstamm Micrococcus glutamicus ATCC13032 zeigte dagegen gutes Wachstum bei 24-stündiger Züchtung in einem Medium, dem mehr als 50 mMol (7,450 mg/1) !-Methionin zugesetzt waren.

409817/ 1121
ORIGINAL INSPEOTSO

2350847

3o) Die Mutantenstaom© AJ3610 wurden mit : gestellt;

Der Stamm AJ3400 wurde ernemt 30 Nitrosoguanidin behandelt. Dureii ti©s© tenstäfflme mit gewissem Mhrstoffbedarf-(repriea method) isoliert,,

glutamioma ÄJ36O9 und tehendea ¥erfahrens.herbei 30⁰G mit 250 pg/ml Behandlung tmrden Mutan-

clurch Ibs&asmte Implikation

Die Mutantenstämme AJ36O9ß finr Argiai&bedarf zusätzlich am äer

Resisteas gegea ÄSÖ nnfi fies Seaaibilltät gegenüter Methionin hat₉ unä ÄJ361O;, äer Prolin^sflarf g&sät&lich ^u Ser lesietenz gegenAEG MBd der Seasi"bilität geg©atb©E Methionia aufweist ₉ wxxals gut® L

auf die Ergebnisse äer irorstehead besetoiebenen Yersuche ■ iet erflBäiaagsgemäß @ia Methionizii-enipfisdlicher Mikroorganismus, der sich iür die Zwecke der Erfindung eignet_s al© Stamm definiert» deasea Wachstum bei 24*»siiiadiger Eüciituag auf eiaem Mnimalmedii3m₈ äsm 0_s 1 Milliaol !^Methionin zugesetzt siufi_s merklich inhibiert wird und dessea Wachstumshemmung durch' Ir=Methi03aia nieht weites© Zugabe- ύοώ. li-fhreoniB "beseitigt

Die bei dem @r£indungsgemäS@a ¥erfahrea verwendeten repräsentativen Stämme sind Corynebaeterium glutamicum AJ34OO (PERM P 1639), AJ36O9 -(FERM "Ρ 2278) und AJ361O (S¹SRM P. 2279)«. Me PERM P-Mummer ist die Mederlegungsnummer des Stammes bei dem Fermentation Research Institute» Agency ©f Industrial Science and Technology des Ministeriums für iateraationalen Hendel-uad Industrie, Nr. 1-8-5» XaBgehigashij, Chibashi_a Ghiba-=&©B₉

Sie EiasajBiaensetsung des erfiadungsgemäi verwendeten Fermentationsffisdiums und die Eüehtuagsiaethofiis entsprechen üblichen Medien UBd konventionellen Verfahren» wie eie "bei üblichen Aminosäure-Gärungen, bzw» S"ermeBtationen verwendet warden. 'Zu diesem Zweck eignen sich gut die bekannten Medien zur Herstellung von Lysin durch Fermentation_β So ist zur-Züchtung der erfindungsgemäß

409817/1121

verwendeten Stämme entweder ein synthetisches Kulturmedium oder ein natürliches Nährmedium geeignet, solange es die wesentlichen Nährstoffe für das Wachstum des verwendeten Stammes enthält. Diese Nährstoffe sind auf diesem Fachgebiet gut bekannt und umfassen Substanzen, wie eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und anorganische Verbindungen, die von dem Mikroorganismus verbraucht werden und in geeigneten Mengen vorliegen.

So können beispielsweise als Kohlenstoffquellen Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Stärke, Stärkehydrolysat, Melassen und dergleichen oder beliebige andere geeignete Kohlenstoffquellen, wie organische Säuren, beispielsweise Essigsäure, Propionsäure, Fumarsäure und dergleichen, organische Chemikalien, beispielsweise Benzoesäure, Alkohole, beispielsweise Äthanol, verwendet werden. Diese Substanzen können entweder für sich oder in Form von Gemischen aus zwei oder mehreren Substanzen eingesetzt werden.

In Abhängigkeit von der Assimilationsfähigkeit des verwendeten Mikroorganismus ist es möglich, Kohlenwasserstoffe in einer großen oder geringeren Menge als Kohlenstoffquelle dem Fermentationsmedium zuzusetzen.

Als Stickstoffquelle können verschiedene Arten anorganischer oder organischer Salze oder Verbindungen verwendet werden, wie Harnstoff oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat und dergleichen oder eine oder mehrere Aminosäuren in Form eines Gemisches, natürliche Stickstoff enthaltende Substanzen, wie Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Fischmehl, Pepton, Bouillon, Caseinhydro-Iysate, lösliche Fischbestandteile, Reiskleieextrakt und dergleichen. Diese Substanzen können auch entweder für eich oder in Kombinationen aus zwei oder mehreren Substanzen eingesetzt v/erden.

A 0 9 8 1 7 / 1 1 2 1

Zu anorganischen Verbindungen, die dem Kulturmedium zugesetzt werden können, gehören Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Eisensulfat oder andere Eisensalze, Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumchlorid und dergleichen.

In dem Kulturmedium sollten Nährstoffe und andere Substanzen vorliegen, die für das Wachstum des Mutantenstamines erforderlich sind. Die wachstumsfördernden Mittel und Spurennährstoffe, welche die Ausbeute und die Rate der Bildung von I-Lysin verbessern, umfassen Aminosäuren, verschiedene Vitamine, Purinbasen, Sojaprotein-Hydrolysat, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Pepton, Casein-Hydrolysat usw.

Um eine gute Ausbeute an Lysin zu erzielen, wird die Fermentation vorzugsweise unter.aeroben Bedingungen unter Belüftung und Rühren durchgeführt. Zum Erzielen bester Ausbeuten ist eine Regelung des pH-Werts innerhalb des Bereiches von 5 bis 9 erforderlich. Der gewünschte pH-Wert kann mit Hilfe von gasförmigem oder wäßrigem Ammoniak, Calclumcarbonat, Alkalimetallhydrdxiden, Harnstoff oder organischen oder anorganischen Säuren eingestellt werden.

Wenn die Gärung oder Fermentation bei einer Temperatur im Bereich von 24 bis 37⁰C durchgeführt wird, wird die maximale Konzentration an L—Lysin in der Kulturbrühe gewöhnlich innerhalb von 2 bis 7 Tagen erreicht. Das in der Fermentationsbrühe angereicherte Lysin kann mit Hilfe üblicher Methoden gewonnen werden, beispielsweise unter Verwendung eines Ionenaustauscherharzes in Kpmbination mit Fällungsmethoden. Das Lysin wurde mit Hilfe der Ninhydrinreaktion auf dem Papierchromatogranm,des Rf-Werts auf dem Papierchromatogramm, durch Elektrophorese, durch sein Ansprechen auf mikrobiologische Tests und das Ansprechen auf Lysindecarboxylase im Vergleich mit den Ergebnissen, die unter

40 98 17/1121

2350547

Verwendung einer authentischen Probe erhalten wurden, indentifiziert.

Die in der Kulturbrühe gebildete lysinmenge wurde mit Hilfe einer colorinetrischen Kethode auf Basis der sauren Kupfer-Ninhydrin-Reaktion bestimmt.

Die Durchführung des erfindungegemäßen Verfahrens wird durch die nachstehenden Beispiele veranschaulicht.

Beispiel 1

20 ml-Anteile eines Mediums, das 10 f. Glucose, 4,5 # (NH.) ,-SO , 0,1 g EH₂PO₄, 0,04 g KgSO₄.7E₂O, 2 ppm Kn⁺⁺, 2 ppc Pe⁺⁺, 50 μ|/1 Biotin, 200 ug/1 Thiamin.HCl und 5 $ CaiciUEcarbocat (gesondert sterilisiert) enthielt und einen pH-Y/ert von 7,0 hatte, wurden in gesonderte 500 ml-Schüttelkolben gegeben und sterilisiert.

Corynebacterium glutaiaicum AJ3400 (FEPJ·: P 1636), das vorher auf Bouillon-Schrägagar gezüchtet worden war, wurde in die Kolben eingeführt und während 72 Stunden bei 31⁰C unter Belüftung und Rühren gezüchtet. Es wurde festgestellt, daß die Kulturbrühe 3,1 g/dl Lysin enthielt. Sin Liter der überstehenden Flüssigkeit, die aus der Kulturbrühe durch Entfernen der Mikrobenzellen und Calciumsalze durch Zentrifugieren erhalten worden war, wurde durch eine mit einem Ionenaustauscherharz (Azaberlite IR-120) der H⁺-FOnE gefüllte Säule geleitet und das Lysin wurde mit 3 ^-iger wäßriger Anxioniaklösung eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck konzentriert.

Der konzentrierten Lösung wurde Chlorwasserstoffsäure zugesetzt, die in einem Eisbad gekühlt wurde, um L-Lysin auszufällen. Dabei wurden 20,7 g des rohen kristallinen L-Lysin-hydrochlorid-dihydrats erhalten.

4 0 9 8 17/112 ϊ
ORIGINAL

Beispiel 2

Corynebaeterium glutamieum AJ34OO (TERM P 1638), AJ36O9 (PERK P 2278) und AJ361O (FERK P 2279) wurden jeweils in einem Medium gezüchtet, das die gleiche Zusammensetzung wie im Beispiel 1 hat te, mit der Abänderung, daß 1,5 # So^aprotein-Hydrolysat (Gesamtstickstoff gehalt 7 SO zusätzlich zugegeben wrden. Die Züchtung erfolgte in gleicher Weise wie in Beispiel 1. Es wurde gefunden, daß die mit den angegebenen Stämmen erhaltenen Kulturbrühen 3,53 g/dl, 3,8 g/dl bzw. 4,2 g/dl Lysin enthiel ten. ..

Beispiel 3

Corynebacterium glutamicum AJ34OO wurde während 18 Stunden bei 31⁰C unter Belüftung und Rühren auf einem Impfkulturmedium der nachstehenden Zusammensetzung gezüchtet.

Impfkulturmedium:

Medium mit einem pH-Wert von 7*0, enthaltend 1,5 ^ Glucose, 0,3 Ammoöiumacetat, 0,1 # Harnstoff, 0,1 f XH₂PO^, 0,04 $ MgSO..7E₂O 2 ppm Fe⁺⁺, 2 ppm Mn⁺⁺, 50 ug/1 Biotin, 200 ug/1 fhiamin^HCl und 2 $> Sojaprotein-Hydrolysat (Gesamtstickstoffgehalt 7 $>).

300 ml-Anteile des nachstehend beschriebenen Hauptkulturmediums wurden in gesonderte I-Liter-Iermentatlonsflaechen aus Glas gegeben und durch Erhitzen sterilisiert.

15 ml der Impfkultürbrühe wurden zugesetzt, um das Hauptkulturmedium anzuimpf en und die Züchtung wurde bei 31⁰C unter Rühren begonnen, wobei pro Minute das gleiche Volumen an Luft eingeleitet wurde. ,

Hauptkulturmedium:

Medium mit einem pH-Wert von 7,5, enthaltend 3 % Glucose, 0,5 56 Ammoniumacetat, 0,2 % Harnstoff, 0,2 % KHgPG·^, O₉O4 % MgSO₄.

4 09817/1121

2 ppm Fe⁺⁺, 2 ppm Mn⁺"¹", 50 jig/1 Biotin, 50 pg/1 Thiamin.HCl und 2 5ί Sojaprotein-Hydrolysat (Gesamtstickstoffgehalt 7 #).

Die Züchtung wurde 52 Stunden bei 31 bis 33⁰C fortgesetzt und -während der Züchtung wurde der pH-Wert des Mediums durch Zuführen einer Mischlösung aus Essigsäure und Ammoniumacetat, die 0,25 Mol Ammoniumacetat pro Mol Essigsäure enthielt und deren Essigsäurekonzentration 60 $ betrug, zwischen 7,2 und 8,0 gehalten.

Nach 52-stündiger Züchtung waren in der !"ermentationsbrühe 5,4 g/dl I-lysin gebildet (die dem Medium zugesetzte und verbrauchte Gesamtmenge an Essigsäure betrug 20 #, bezogen auf das Anfangsvolumen des Mediums).

Aus einem Liter der Kulturbrühe wurden in gleicher Weise wie in Beispiel "1 35,7 g L-Lysin-hydrochlorid-dihydrat erhalten.

Beispiel 4

Corynebacterium glutamicum AJ3400 wurde bei 31⁰C während 18 Stunden unter Belüften und Rühren auf dem gleichen Impfkulturmedium wie in Beispiel 3 gezüchtet.·

300 ml-Anteile eines Hauptkulturmediums der nachstehend angegebenen Zusammensetzung wurden in gesonderte 1-Liter-Permentationsflaschen aus Glas gegeben und sterilisiert.

15 ml-Anteile der Impfkultürbrühe wurden zugesetzt, um das Hauptkulturmedium anzuimpfen, und die Züchtung wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 3 begonnen.

Hauptkulturmedium;

Medium mit einem pH-Wert von 7,5, enthaltend 2 fo Glucose, 1 i» Ithylalkohol, 0,5 % (NH^SO^., 0,2 % Harnstoff, 0,1 £ KH₂PO₄, 0,04 % MgSO₄.7H₂O, 2 ppm ?e⁺⁺, 2 ppm Mn⁺⁺, 50 jag/l Biotin, Jig/l Thiamin.HCl und 2 % Sojaprotein-Hydrolysat (Gesamtstickstoff gehalt 7 %)«

409817/1121

Während der Fermentation wurde der pH-Wert des Mediums durch Einleiten von. gasförmigem Ammoniak in das Medium zwischen 7,2 und 7,8 gehalten. Die Menge des verbliebenen Äthanols in dem Medium wurde durch Gaschromatographie bestimmt und Äthanol wurde dem Medium zugesetzt, wenn der verbleibende Äthanolgehalt sich auf etwa 0,3 S^ vermindert hatte.

Nach 48-stündiger Züchtung bei 31 bis 33⁰C wurden 4,1 g/dl !-Lysin in der Kulturbrühe festgestellt (die Gesamtmenge des verbrauchten Äthanols betrug 17 f>, bezogen auf das Anfangsvolumen des Mediums).

Aus einem Liter der Kulturbrühe wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1 29,6 g L-Lysin-hydrochlorid-dihydrat erhalten.

Beispiel 5 ' ·. "

Corynebacterium glutamicum. AJ34OO, AJ36O9 und 1J361O wurden, in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise in dem nachstehenden Medium gezüchtet, das Rübenzuckermelasse oder Bohrzuckermelasse als Kohlenstoffquelle enthielt.

Zusammensetzung des Kulturmediums:

Rübenzuckermelasse oder Rohrzuckermelasse, berechnet als Glucose 10 #

)₂S0₄ · 4,5 9δ

₄₄

KH₂PO₄ 0,1%

MgSO₄.7H₂O - 0,04 %

Fe⁺"¹" 2 ppm

Mn++ 2 ppm

Biotin 50 pg/1

Thiamin.HCl · ■ 200 ug/1

Calciumcarbonat (gesondert sterilisiert) . 5 jS Sojaprotein-Hydrolysat (Gesamtstickstoff 7 $) 1,5 #

(pH 7,0)

409 817/1121

Die Mengen an !-Lysin (als Hydrochlorid), die sich in jedem Medium angereichert hatten, hatten folgende Werte:

Angereichertes L-Lysin (g/dl)

Verwendeter Stamm Verwendung von Rüben- Verwendung von Rohrzuckermelasse zuckermelasse

AJ34OO 3,4 3,3

AJ36O9 4_S3 4,0

AJ361O 4,5 4*2

409817/1121

Claims

PAfEN !ANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung von L-Lysin durch Züchten eines Lysin-bildenden Stammes des Genus Corynebacterium unter aeroben Bedingungen in einem Medium, das assimilierbare Kohlenstoffund Stickstoffquellen sowie anorganische Salze, für das Wachstum wesentliche Substanzen und organische wachstumsfördernde Substanzen enthält, bei einem pH-Wert von 5 bis 9» und Gewinnen des gebildeten Iysins aus dem Medium, dadurch gekennzeichnet , daß man als Stamm von Corynebacterium einen der Stämme Corynebacterium glutamicum PERM P 1638, PERM P 2278 oder PERM P 2279 verwendet, die

a) resistent gegen Rückkopplungshemmung durch lysin und Lysin-Analoge sind und

b) Methionin-Empfindlichkeit zeigen,,

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm von Corynebacterium verwendet, der zusätzlich mindestens eine der Aminosäuren Prolin und Arginin benötigt. .

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß man einen Stamm verwendet₉ der resistent gegen Ruckkopplungshemmung durch S-(2~AminoäthyI)-L-Cystein ist»

409817/ 1121