DE2350647A1 - Verfahren zur herstellung von l-lysin - Google Patents
Verfahren zur herstellung von l-lysinInfo
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Description
Priorität: 9. Oktober 1972, Nr. 101446/1972, Japan
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin und spezieller ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin
durch Fermentation.
L-Lysin wurde bisher durch Fermentation mit Hilfe von drei
Arten von Bakterien hergestellt. Die erste Art bzw. der erste Typ erfordert für ihr Wachstum Aminosäuren, die in Zusammenhang
mit der Biosynthese von L-Lysin stehen. Ein Beispiel für diesen Typ ist eine Homoserin-abhängige Mutante von Micrococcus glutamicus,
die in der US-PS 2 979 439 beschrieben wird. Zu dem zweiten Typ gehören Threonin- oder Methionin-empfindliche Mutanten,
deren Wachstum durch das Vorliegen einer gewissen Menge an Threonin oder Methionin inhibiert wird, d.h. unter Bedingungen, unter
denen das Wachstum des Wildstammes, nicht inhibiert wird, und Mutanten, welche diese Threonin- oder Methionin-Empfindlichkeit in
Verbindung mit einem Nährstoff-Bedarf an Threonin aufweisen (PR-PS 1 533 688). Für den dritten Typ ist die Resistenz gegen-
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über S-(2-Aminoätbyl)-L-cystein (nachstehend kurz als AEC bezeichnet) kennzeichnend, ein Schwefel-Analoges von 3>-Lysin
(US-PS 3 707 441).
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, L-Lysin in einfacher
Weise und mit geringem Aufwand aus leicht zugänglichen Ausgangsmaterialien herzustellen. Es ist gut bekannt, daß L-Lysin für
die menschliche und tierische Ernährung unerläßlich ist und die Anreicherung von Nahrungsmitteln stellt ein weites Anwendungsgebiet
für diese Verbindung dar.
Es wurde nun gefunden, daß Mutanten, die Resistenz gegenüber Rückkopplungshemmung durch Lysin und dessen Analoge, wie
AEC, in Konzentrationen von 1 mg/ml oder darüber in Kombination mit einer Methionin-Empfindlichkeit oder in Kombination
mit dieser Methionin-Empfindlichkeit und einem Nährstoffbedarf für mindestens eine der Aminosäuren Prolin und Arginin
zeigen, in einem Nährmedium große Mengen an L-Lysin bilden.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin durch Züchten eines Lysin-bildenden Stammes des Genus
Corynebacterium unter aeroben Bedingungen in einem Medium, das
assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie anorganische
Salze, für das Wachstum wesentliche Substanzen und organische wachstumsfördernde Substanzen enthält, bei einem pH-Wert
von 5 bis 9.
Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm
von Corynebacterium verwendet, der
a) unempfindlich bzw. resistent gegen Rückkopplungshemmung durch Lysin und Lysin-Analoge ist und
b) Methionin-Empfindlichkeit zeigt
tnd das gebildete L-Lysin aus dem Medium gewinnt.
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Die Methionin-Empfindlichkeit der erfindungsgemäß verwendeten Mutanten beruht auf einem anderen Prinzip als die Threonin-
oder Methionin-Empfindlichkeit der Mutante gemäß PR-PS 1 533 688. So wird das Wachstum des in dieser französischen Patentschrift
beschriebenen Mutantenstammes durch das Vorliegen einer dieser beiden Aminosäuren Threonin und Methionin in einem Medium inhibiert,
wogegen das Wachstum des Wildstammes nicht inhibiert wird, und die Wachstumshemmung durch Threonin wird durch Zugabe von
Methionin und die Hemmung durch Methionin wird durch Zugabe von Threonin aufgehoben. Andererseits wird das Wachstum des erfindungsgemäß
verwendeten Methionin-empfindlichen Stammes durch das
Vorliegen von Methionin, nicht Jedoch durch Threonin, gehemmt und die Wachstumshemmung durch Methionin kann durch Zugabe von Threonin
nicht aufgehoben werden.
Bis jetzt war ein Lysinbildner mit dieser speziellen Art von Methionin-Empfindlichkeit
nicht bekannt«.
Der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Mikroorganismus kann auch ein Mutantenstamm sein, der andere biologische Eigenschaften,
wie einen anderen Nährstoffbedarf und/cder Resistenz
gegenüber anderen Reagenzien in Verbindung mit den vorstehend angegebenen Erfordernissen und der Resistenz gegenüber
AEG zeigt.
Die erfindungsgemäßen Mutanten werden mit Hilfe üblicher mutagener
Mittel aus Mutterstämmen des Genus Corynebacterium und durch Auswahl der so gebildeten Mutanten durch "screening-Methodenw
im Hinblick auf die erforderliche Resistenz, Empfindlichkeit und den Nährstoffbedarf, erhalten. Das Verfahren zur Herstellung
dieser Mutantenstämme wird in der nachstehenden Versuchsbeschreibung
erläutert*
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1 ·) Der Mutantenstamm Corynebaeierium glutamicuin AJ34OO wurde
mit -Hilfe des nachstehend beschriebenen Verfahrens erhalten:
Die Mikroben-Zellen τοη Micrococciis glutamieus ATGO13Q32 (dietaxonomische
Bezeichnung dieses Stammes wird© kürzlich in Corynebacterium
glutamicum geändert) yraräen mit 250 jag/zal litro-
-soguanidin bei 30°C 30 Minuten behandelt. Baaaeh wurden sie auf
-flache Agarplatten der folgenden Zusammensetzung aufgeiapft und
4 bis 10 Sage bei 310C gezüchtete
Susammensetzung des Mediums % 2- f Glucose s O93 $ Harnstoff, 1 %
(NH4)2S04, 0,1 Ji EH2PO4, 0,04 $ MgSO4..7HgO9 2 ppm Fe+"1", 2 ppm
Mn++, 50 pg/1 Biotin, 100 Mg/1 fhiamia. EGl9 0,3^ threonin,
O93 ^ IEC und 2 $>
Agar» Das Medium hatte eiaen pH-Wert iron 7,0.
Aus den Kolonien, die nach der Züchtung auf den Platten erhalten
worden waren, konnten sahireiche Mutantenstämme isoliert
.werden, die zur Bildung von L-Lysin befälligt sind» 5er Stamm
AJ340O wurde aus diesen Mutantenstämmen als guter Lysinbildner
isoliert und mit Hilfe der nachstehend beschriebenen Versuche wurde festgestellt, daß'er'Resistenz gegenüber ASC und Methionin-Empfindlichkeit
zeigte*
Uer Stamm AJ34OO, der -vorher 24 Stunden auf Bouillon-Schrägagar
bei 31 0 gezüchtet worden war, wurde in' 3 ml eines Grundmediums
der nachstehend angegebenen Zusammensetzung suspendiert. Je 0,1 ml dieser Suspension wurde zu 3 ml-Proben des Grundmediums
gegeben, dem Q,.04 $ der in Tabelle 1 gezeigten Aminosäure
zugesetzt worden war, und die Züchtung wurde 24 Stunden bei 310C
durchgeführt. Bas Wachstum des Stammes in jedem Medium wurde durch Messen der lichtabsorption der lulturbrühe, die auf das
26-faeJbe ihres ursprüngliches TolumeBS verdünnt worden war und
wobei das Calciumcarbonat is der Brühe durch Zusatz von HCl gelöst
worden war, bei 562 mp geprüft. Die optische Dichte (OD)
der angegebenen Suspension bei 562 mp betrug nach der Verdünnung
auf das 26-fache ihres ursprünglichen Volumens 0,345.
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Zusammensetzung des Grundmediums:
2 # Glucose, 1 % (NH4)2SQ4, 0,1 # KH2PO4, 0,04 # MgSO4.7H2
2 ppm Fe++, 2 ppm Mn , 50 ug/1 Biotin, 200 ug/1 Thiamin·
HCl und 2 ?£ Calciumcarbonat.
Dieses Medium hatte einen pH-Wert von 7»0.
Dieses Medium hatte einen pH-Wert von 7»0.
a b e 1 1 e | 1 | relatives Wachstum | |
Zugesetzte Aminosäure | Wachstum | ||
(OD562) | 100 | ||
keine | 0,345 | 92 | |
Ir-Arginin | 0,317 | 111 | |
Ir-Cy st ein. HCl | 0,384 | 91 | |
!-Histidin | 0,314 | 78 | |
L-Isoleucin | 0,270 | 78 | |
L-Ieucin | 0,268 | 15 | |
L-Methionin | 0,051 | 120 | |
!-Phenylalanin | 0,415 | 82 | |
!-Threonin | 0,280 | ||
Ir-Threonin + | 11 | ||
L-Methionin | 0.040 |
2.) Das Wachstum des Stammes AJ3400 in einem Medium, das L-
Methionin in verschiedenen Anteilen, wie sie in Tabelle gezeigt sind, enthielt, wurde geprüft.
Der Stamm AJ3400, der vorher 24 Stunden auf Bouillon-Schrägagar bei 310C gezüchtet worden war, wurde in 3 ml des nachstehend angegebenen Grundmediums eingeimpft, dem L-Methionin
und/oder L-Threonin in den in Tabelle 2 gezeigten verschiedenen
Mengen zugesetzt worden waren, und bei 310C während 24 Stunden
gezüchtet. Die Anzahl der Zellen in dem Medium zu Beginn der Züchtungsperiode betrug 5 x 10 Zellen/ml.
Die optische Dichte (OD) jeder Kulturbrühe wurde durch Messung der Lichtabsorption bei 562 mu der Lösung bestimmt, die durch
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Zugabe von 5 ml Wasser und einem Tropfen konzentrierter ühlcr
wasserstoffsäure zu 0,2 ml jeder Kulturbrühe erhalten wurde.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
Zusammensetzung des Grundmediums j
2 # Glucose, 1 # (NH4)2S04, 0,1 # KH2PO4, 0,04 # MgSO4.7HgO,
2 ppm Fe++, 2 ppm Mn++, 50 ug/1 Biotin, 200 pg/1 Thiamin.HCl,
0,05 # KaCl und 2 $> Calciumcarbonat. Das Medium hatte einen
pH-Wert von 7,0.
Zugesetztes L-Methio- | Zugesetztes X-Threo- | 3,0 | Wachstum |
niD (mMol/1) | nin (mMol/1) | 30 | (OD) |
0 | — | 100 | 0,450 |
0,03 | - | 0,283 | |
0,1 | - . | 0,054 | |
0,3 | - | 0,047 | |
. 1,0 | — | 0,040 | |
3,0 | 0,040 | ||
3.0 | 0,042 | ||
3.0 | 0,040 | ||
3,0 | 0,042 |
Der Stamm AJ3400 zeigte bei 24-stündiger Züchtung in einem Medium,
dem mehr als 0,1 mMol (14,9 mg/l) Ir-Methionin zugesetzt
waren, kein Wachstum.
Der Elternstamm Micrococcus glutamicus ATCC13032 zeigte dagegen
gutes Wachstum bei 24-stündiger Züchtung in einem Medium, dem mehr als 50 mMol (7,450 mg/1) !-Methionin zugesetzt waren.
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ORIGINAL INSPEOTSO
ORIGINAL INSPEOTSO
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3o) Die Mutantenstaom©
AJ3610 wurden mit : gestellt;
Der Stamm AJ3400 wurde ernemt 30
Nitrosoguanidin behandelt. Dureii ti©s©
tenstäfflme mit gewissem Mhrstoffbedarf-(repriea
method) isoliert,,
glutamioma ÄJ36O9 und
tehendea ¥erfahrens.herbei
300G mit 250 pg/ml
Behandlung tmrden Mutan-
clurch Ibs&asmte Implikation
Die Mutantenstämme AJ36O9ß finr Argiai&bedarf zusätzlich am äer
Resisteas gegea ÄSÖ nnfi fies Seaaibilltät gegenüter Methionin hat9
unä ÄJ361O;, äer Prolin^sflarf g&sät&lich ^u Ser lesietenz gegenAEG MBd der Seasi"bilität geg©atb©E Methionia aufweist 9 wxxals
gut® L
auf die Ergebnisse äer irorstehead besetoiebenen Yersuche ■
iet erflBäiaagsgemäß @ia Methionizii-enipfisdlicher Mikroorganismus,
der sich iür die Zwecke der Erfindung eignets al© Stamm definiert»
deasea Wachstum bei 24*»siiiadiger Eüciituag auf eiaem Mnimalmedii3m8
äsm 0s 1 Milliaol !^Methionin zugesetzt siufis merklich inhibiert
wird und dessea Wachstumshemmung durch' Ir=Methi03aia nieht
weites© Zugabe- ύοώ. li-fhreoniB "beseitigt
Die bei dem @r£indungsgemäS@a ¥erfahrea verwendeten repräsentativen
Stämme sind Corynebaeterium glutamicum AJ34OO (PERM P 1639),
AJ36O9 -(FERM "Ρ 2278) und AJ361O (S1SRM P. 2279)«. Me PERM P-Mummer
ist die Mederlegungsnummer des Stammes bei dem Fermentation
Research Institute» Agency ©f Industrial Science and Technology
des Ministeriums für iateraationalen Hendel-uad Industrie, Nr.
1-8-5» XaBgehigashij, Chibashia Ghiba-=&©B9
Sie EiasajBiaensetsung des erfiadungsgemäi verwendeten Fermentationsffisdiums
und die Eüehtuagsiaethofiis entsprechen üblichen Medien
UBd konventionellen Verfahren» wie eie "bei üblichen Aminosäure-Gärungen,
bzw» S"ermeBtationen verwendet warden. 'Zu diesem
Zweck eignen sich gut die bekannten Medien zur Herstellung von
Lysin durch Fermentationβ So ist zur-Züchtung der erfindungsgemäß
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verwendeten Stämme entweder ein synthetisches Kulturmedium
oder ein natürliches Nährmedium geeignet, solange es die wesentlichen Nährstoffe für das Wachstum des verwendeten Stammes
enthält. Diese Nährstoffe sind auf diesem Fachgebiet gut bekannt und umfassen Substanzen, wie eine Kohlenstoffquelle, eine
Stickstoffquelle und anorganische Verbindungen, die von dem Mikroorganismus
verbraucht werden und in geeigneten Mengen vorliegen.
So können beispielsweise als Kohlenstoffquellen Kohlenhydrate,
wie Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Stärke, Stärkehydrolysat,
Melassen und dergleichen oder beliebige andere geeignete Kohlenstoffquellen, wie organische Säuren, beispielsweise Essigsäure,
Propionsäure, Fumarsäure und dergleichen, organische Chemikalien, beispielsweise Benzoesäure, Alkohole, beispielsweise
Äthanol, verwendet werden. Diese Substanzen können entweder für sich oder in Form von Gemischen aus zwei oder mehreren Substanzen
eingesetzt werden.
In Abhängigkeit von der Assimilationsfähigkeit des verwendeten
Mikroorganismus ist es möglich, Kohlenwasserstoffe in einer großen oder geringeren Menge als Kohlenstoffquelle dem Fermentationsmedium
zuzusetzen.
Als Stickstoffquelle können verschiedene Arten anorganischer oder organischer Salze oder Verbindungen verwendet werden, wie
Harnstoff oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat und dergleichen oder eine
oder mehrere Aminosäuren in Form eines Gemisches, natürliche Stickstoff enthaltende Substanzen, wie Maisquellwasser, Hefeextrakt,
Fleischextrakt, Fischmehl, Pepton, Bouillon, Caseinhydro-Iysate,
lösliche Fischbestandteile, Reiskleieextrakt und dergleichen. Diese Substanzen können auch entweder für eich oder in
Kombinationen aus zwei oder mehreren Substanzen eingesetzt v/erden.
A 0 9 8 1 7 / 1 1 2 1
Zu anorganischen Verbindungen, die dem Kulturmedium zugesetzt werden können, gehören Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat,
Kaliummonohydrogenphosphat, Eisensulfat oder andere Eisensalze, Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumchlorid
und dergleichen.
In dem Kulturmedium sollten Nährstoffe und andere Substanzen vorliegen, die für das Wachstum des Mutantenstamines erforderlich
sind. Die wachstumsfördernden Mittel und Spurennährstoffe, welche die Ausbeute und die Rate der Bildung von I-Lysin verbessern,
umfassen Aminosäuren, verschiedene Vitamine, Purinbasen, Sojaprotein-Hydrolysat, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Pepton,
Casein-Hydrolysat usw.
Um eine gute Ausbeute an Lysin zu erzielen, wird die Fermentation
vorzugsweise unter.aeroben Bedingungen unter Belüftung und Rühren durchgeführt. Zum Erzielen bester Ausbeuten ist eine
Regelung des pH-Werts innerhalb des Bereiches von 5 bis 9 erforderlich.
Der gewünschte pH-Wert kann mit Hilfe von gasförmigem oder wäßrigem Ammoniak, Calclumcarbonat, Alkalimetallhydrdxiden,
Harnstoff oder organischen oder anorganischen Säuren eingestellt werden.
Wenn die Gärung oder Fermentation bei einer Temperatur im Bereich von 24 bis 370C durchgeführt wird, wird die maximale
Konzentration an L—Lysin in der Kulturbrühe gewöhnlich innerhalb
von 2 bis 7 Tagen erreicht. Das in der Fermentationsbrühe
angereicherte Lysin kann mit Hilfe üblicher Methoden gewonnen
werden, beispielsweise unter Verwendung eines Ionenaustauscherharzes in Kpmbination mit Fällungsmethoden. Das Lysin wurde mit
Hilfe der Ninhydrinreaktion auf dem Papierchromatogranm,des
Rf-Werts auf dem Papierchromatogramm, durch Elektrophorese, durch
sein Ansprechen auf mikrobiologische Tests und das Ansprechen auf Lysindecarboxylase im Vergleich mit den Ergebnissen, die unter
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Verwendung einer authentischen Probe erhalten wurden, indentifiziert.
Die in der Kulturbrühe gebildete lysinmenge wurde mit Hilfe
einer colorinetrischen Kethode auf Basis der sauren Kupfer-Ninhydrin-Reaktion
bestimmt.
Die Durchführung des erfindungegemäßen Verfahrens wird durch
die nachstehenden Beispiele veranschaulicht.
20 ml-Anteile eines Mediums, das 10 f. Glucose, 4,5 # (NH.) ,-SO ,
0,1 g EH2PO4, 0,04 g KgSO4.7E2O, 2 ppm Kn++, 2 ppc Pe++, 50 μ|/1
Biotin, 200 ug/1 Thiamin.HCl und 5 $ CaiciUEcarbocat (gesondert
sterilisiert) enthielt und einen pH-Y/ert von 7,0 hatte, wurden
in gesonderte 500 ml-Schüttelkolben gegeben und sterilisiert.
Corynebacterium glutaiaicum AJ3400 (FEPJ·: P 1636), das vorher auf
Bouillon-Schrägagar gezüchtet worden war, wurde in die Kolben eingeführt und während 72 Stunden bei 310C unter Belüftung und Rühren
gezüchtet. Es wurde festgestellt, daß die Kulturbrühe 3,1 g/dl Lysin enthielt. Sin Liter der überstehenden Flüssigkeit, die aus
der Kulturbrühe durch Entfernen der Mikrobenzellen und Calciumsalze
durch Zentrifugieren erhalten worden war, wurde durch eine mit
einem Ionenaustauscherharz (Azaberlite IR-120) der H+-FOnE gefüllte
Säule geleitet und das Lysin wurde mit 3 ^-iger wäßriger Anxioniaklösung
eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck konzentriert.
Der konzentrierten Lösung wurde Chlorwasserstoffsäure zugesetzt,
die in einem Eisbad gekühlt wurde, um L-Lysin auszufällen. Dabei
wurden 20,7 g des rohen kristallinen L-Lysin-hydrochlorid-dihydrats
erhalten.
4 0 9 8 17/112 ϊ
ORIGINAL
ORIGINAL
Corynebaeterium glutamieum AJ34OO (TERM P 1638), AJ36O9 (PERK P
2278) und AJ361O (FERK P 2279) wurden jeweils in einem Medium
gezüchtet, das die gleiche Zusammensetzung wie im Beispiel 1 hat te, mit der Abänderung, daß 1,5 # So^aprotein-Hydrolysat (Gesamtstickstoff
gehalt 7 SO zusätzlich zugegeben wrden. Die Züchtung
erfolgte in gleicher Weise wie in Beispiel 1. Es wurde gefunden, daß die mit den angegebenen Stämmen erhaltenen
Kulturbrühen 3,53 g/dl, 3,8 g/dl bzw. 4,2 g/dl Lysin enthiel ten. ..
Corynebacterium glutamicum AJ34OO wurde während 18 Stunden bei
310C unter Belüftung und Rühren auf einem Impfkulturmedium der
nachstehenden Zusammensetzung gezüchtet.
Impfkulturmedium:
Medium mit einem pH-Wert von 7*0, enthaltend 1,5 ^ Glucose, 0,3
Ammoöiumacetat, 0,1 # Harnstoff, 0,1 f XH2PO^, 0,04 $ MgSO..7E2O
2 ppm Fe++, 2 ppm Mn++, 50 ug/1 Biotin, 200 ug/1 fhiamin^HCl und
2 $> Sojaprotein-Hydrolysat (Gesamtstickstoffgehalt 7 $>).
300 ml-Anteile des nachstehend beschriebenen Hauptkulturmediums
wurden in gesonderte I-Liter-Iermentatlonsflaechen aus Glas gegeben
und durch Erhitzen sterilisiert.
15 ml der Impfkultürbrühe wurden zugesetzt, um das Hauptkulturmedium
anzuimpf en und die Züchtung wurde bei 310C unter Rühren
begonnen, wobei pro Minute das gleiche Volumen an Luft eingeleitet
wurde. ,
Hauptkulturmedium:
Medium mit einem pH-Wert von 7,5, enthaltend 3 % Glucose, 0,5 56
Ammoniumacetat, 0,2 % Harnstoff, 0,2 % KHgPG·^, O9O4 % MgSO4.
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2 ppm Fe++, 2 ppm Mn+"1", 50 jig/1 Biotin, 50 pg/1 Thiamin.HCl
und 2 5ί Sojaprotein-Hydrolysat (Gesamtstickstoffgehalt 7 #).
Die Züchtung wurde 52 Stunden bei 31 bis 330C fortgesetzt und
-während der Züchtung wurde der pH-Wert des Mediums durch Zuführen
einer Mischlösung aus Essigsäure und Ammoniumacetat,
die 0,25 Mol Ammoniumacetat pro Mol Essigsäure enthielt und
deren Essigsäurekonzentration 60 $ betrug, zwischen 7,2 und 8,0 gehalten.
Nach 52-stündiger Züchtung waren in der !"ermentationsbrühe 5,4
g/dl I-lysin gebildet (die dem Medium zugesetzte und verbrauchte Gesamtmenge an Essigsäure betrug 20 #, bezogen auf das Anfangsvolumen
des Mediums).
Aus einem Liter der Kulturbrühe wurden in gleicher Weise wie in Beispiel "1 35,7 g L-Lysin-hydrochlorid-dihydrat erhalten.
Corynebacterium glutamicum AJ3400 wurde bei 310C während 18 Stunden
unter Belüften und Rühren auf dem gleichen Impfkulturmedium wie in Beispiel 3 gezüchtet.·
300 ml-Anteile eines Hauptkulturmediums der nachstehend angegebenen
Zusammensetzung wurden in gesonderte 1-Liter-Permentationsflaschen
aus Glas gegeben und sterilisiert.
15 ml-Anteile der Impfkultürbrühe wurden zugesetzt, um das Hauptkulturmedium
anzuimpfen, und die Züchtung wurde unter den gleichen
Bedingungen wie in Beispiel 3 begonnen.
Hauptkulturmedium;
Medium mit einem pH-Wert von 7,5, enthaltend 2 fo Glucose, 1 i»
Ithylalkohol, 0,5 % (NH^SO^., 0,2 % Harnstoff, 0,1 £ KH2PO4,
0,04 % MgSO4.7H2O, 2 ppm ?e++, 2 ppm Mn++, 50 jag/l Biotin,
Jig/l Thiamin.HCl und 2 % Sojaprotein-Hydrolysat (Gesamtstickstoff
gehalt 7 %)«
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Während der Fermentation wurde der pH-Wert des Mediums durch
Einleiten von. gasförmigem Ammoniak in das Medium zwischen 7,2 und 7,8 gehalten. Die Menge des verbliebenen Äthanols in dem
Medium wurde durch Gaschromatographie bestimmt und Äthanol wurde dem Medium zugesetzt, wenn der verbleibende Äthanolgehalt
sich auf etwa 0,3 S^ vermindert hatte.
Nach 48-stündiger Züchtung bei 31 bis 330C wurden 4,1 g/dl
!-Lysin in der Kulturbrühe festgestellt (die Gesamtmenge des verbrauchten Äthanols betrug 17 f>, bezogen auf das Anfangsvolumen
des Mediums).
Aus einem Liter der Kulturbrühe wurden in gleicher Weise wie
in Beispiel 1 29,6 g L-Lysin-hydrochlorid-dihydrat erhalten.
Beispiel 5 ' ·. "
Corynebacterium glutamicum. AJ34OO, AJ36O9 und 1J361O wurden,
in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise in dem nachstehenden Medium gezüchtet, das Rübenzuckermelasse oder Bohrzuckermelasse
als Kohlenstoffquelle enthielt.
Zusammensetzung des Kulturmediums:
Rübenzuckermelasse oder Rohrzuckermelasse, berechnet als Glucose 10 #
)2S04 · 4,5 9δ
44
KH2PO4 0,1%
MgSO4.7H2O - 0,04 %
Fe+"1" 2 ppm
Mn++ 2 ppm
Biotin 50 pg/1
Thiamin.HCl · ■ 200 ug/1
Calciumcarbonat (gesondert sterilisiert) . 5 jS
Sojaprotein-Hydrolysat (Gesamtstickstoff 7 $) 1,5 #
(pH 7,0)
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Die Mengen an !-Lysin (als Hydrochlorid), die sich in jedem
Medium angereichert hatten, hatten folgende Werte:
Angereichertes L-Lysin (g/dl)
Verwendeter Stamm Verwendung von Rüben- Verwendung von Rohrzuckermelasse
zuckermelasse
AJ34OO 3,4 3,3
AJ36O9 4S3 4,0
AJ361O 4,5 4*2
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Claims (3)
1. Verfahren zur Herstellung von L-Lysin durch Züchten eines
Lysin-bildenden Stammes des Genus Corynebacterium unter aeroben
Bedingungen in einem Medium, das assimilierbare Kohlenstoffund Stickstoffquellen sowie anorganische Salze, für das
Wachstum wesentliche Substanzen und organische wachstumsfördernde Substanzen enthält, bei einem pH-Wert von 5 bis 9» und Gewinnen
des gebildeten Iysins aus dem Medium, dadurch gekennzeichnet , daß man als Stamm von Corynebacterium
einen der Stämme Corynebacterium glutamicum PERM P 1638,
PERM P 2278 oder PERM P 2279 verwendet, die
a) resistent gegen Rückkopplungshemmung durch lysin und Lysin-Analoge
sind und
b) Methionin-Empfindlichkeit zeigen,,
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man einen Stamm von Corynebacterium verwendet, der zusätzlich mindestens eine der Aminosäuren Prolin und Arginin
benötigt. .
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß man einen Stamm verwendet9 der resistent
gegen Ruckkopplungshemmung durch S-(2~AminoäthyI)-L-Cystein ist»
409817/ 1121
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP10144672A JPS5434835B2 (de) | 1972-10-09 | 1972-10-09 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
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