PROCESO PARA PRODUCIR UNA SUSTANCIA BÁSICA Campo Técnico La presente invención se relaciona a una técnica para la industria microbiana, más precisamente, un método para producir una sustancia básica mediante fermentación. Como sustancias básicas producibles por fermentación, por ejemplo, la L-lisina es útil como un aditivo para alimento de animales, y L-arginina y L-histidina son útiles para preparaciones farmacéuticas tales como infusiones. Técnica Antecedente En los métodos para producir sustancias básicas por fermentación, los microorganismos que tienen una habilidad para producir una sustancia básica se cultivan para producir y acumular la sustancia básica en un medio, y la sustancia básica se recolecta del medio. En tales métodos, el cultivo se realiza como cultivo en lotes, cultivo de alimentación o cultivo continuo. En tal producción de sustancias básicas por fermentación, los iones de sulfato o cloruro se han adicionado típicamente a un medio como aniones contrarios para una sustancia objetivo que se disocia en un catión en el medio a fin de mantener el pH del medio a un nivel neutro
(Patentes Japonesas Abiertas al Público (Kokai) Nos. 5-30985 y 5-244969) . En muchos casos, las sustancias básicas se
recolectan de un medio mediante un intercambio de iones, cuando la purificación es requerida. Por ejemplo, en el caso de la L-lisina, después de que el caldo de fermentación se hace débilmente acidico, la L-lisina se adsorbe sobre una resina de intercambio de iones y luego se eluye de la resina con iones de amonio. La L-lisina eluida se utiliza como se encuentra como base de lisina, o se puede cristalizar con ácido clorhídrico para formar clorhidrato de L-lisina. Cuando los iones de cloruro se utilizan como aniones contrarios en el medio en la purificación mencionada en lo anterior de L-lisina, el clorhidrato de L-lisina se puede obtener directamente al concentrar el medio. Sin embargo, puesto que los iones de cloruro corroen los tanques de fermentación de metal etc., no es preferible hacer que existan en el medio en concentración alta en la producción actual . Por otra parte, cuando la sustancia básica no se purifica, el caldo de fermentación se concentra como se encuentra, o se hace débilmente acidico con ácido clorhídrico o ácido sulfúrico, seguido por la granulación por roció. En este caso, los componentes residuales que contienen los aniones contrarios adicionados al medio, y por lo tanto la cantidad de la sustancia básica se reduce en el producto de fermentación resultante. La Patente Japonesa abierta al público No. 2002-
65287 (Solicitud de Patente norteamericana No. 2002025564) divulga un método de utilización, en la producción de un aminoácido básico mediante la fermentación, de iones de carbonato y de bicarbonato como aniones contrarios del aminoácido básico para sustituir una parte de los iones de sulfato o cloruro. Los iones de carbonato y bicarbonato se pueden remover comparativamente de manera fácil del medio de cultivo al hacer el pH del medio acidico, o al concentrar el medio, o ambos. La publicación citada en lo anterior enseña un método para controlar la presión interna en el tanque de fermentación de modo que es positiva durante la fermentación, o adicionar gas de dióxido de carbono o un gas mezclado que contiene dióxido de carbono al medio, como un medio para adicionar iones de carbonato y iones de bicarbonato al medio. Sin embargo, en condiciones del medio típicas, tal como un pH neutro, únicamente una pequeña cantidad de gas de dióxido de carbono se disuelve, si es que lo hace. Por lo tanto, para mantener la presencia de los iones de bicarbonato y carbonato en el medio de cultivo para que el efecto de reducción de la concentración de iones de sulfato o cloruro se mantenga, el cultivo se debe realizar en un pH alcalino. Sin embargo, si el pH llega a ser alto, la proporción de crecimiento bacteriano y la productividad de la sustancia objetivo generalmente se reducen. Descripción de la- Invención
Un objetivo de la presente invención es proporcionar un método para lograr tanto la reducción de iones de sulfato y iones de cloruro como la producción eficiente de una sustancia objetivo en la producción de una sustancia básica mediante la fermentación utilizando un microorganismo que tiene una habilidad para producir la sustancia básica objetivo y la utilización de iones de carbonato y iones de bicarbonato como aniones contrarios de la sustancia básica con la prevención de reducción de la proporción de crecimiento del microorganismo o reducción de la productividad de la sustancia objetivo. Cuando se utilizan bacterias corineformes o Escherichia para producir sustancias básicas mediante la fermentación, si el pH llega a ser muy alto, la proporción del crecimiento bacteriano o la productividad de la sustancia objetivo usualmente se reduce. Los inventores de la presente invención encontraron que el factor principal que causa este fenómeno es el amoniaco, que se adiciona al medio como una fuente de nitrógeno para la producción de la sustancia básica, para el crecimiento bacteriano, o como una fuente de iones contrarios de la sustancia básica, y la reducción de la proporción de crecimiento del microorganismo o la productividad de la sustancia básica bajo una condición de pH alto podria ser marcadamente suprimida al realizar la fermentación con el control de la concentración de amoniaco
total para estar dentro de un intervalo de concentración adecuado . La presente invención se logró sobre la base de los descubrimientos mencionados en lo anterior. Esto es, la presente invención proporciona lo siguiente . (1) Un método para producir una sustancia básica mediante la fermentación que comprende cultivar un microorganismo que tiene una habilidad para producir una sustancia básica en un medio liquido contenido en un tanque de fermentación para producir y acumular la sustancia básica en el medio, en donde la cantidad de iones de sulfato y/o cloruro utilizados como iones contrarios de la sustancia básica se reducen al ajustar la concentración de amoniaco total en el medio para estar dentro de un intervalo de concentración especifico durante por lo menos una parte del periodo total del proceso de cultivo . (2) El método de acuerdo a (1), en donde el intervalo de concentración especifico de la concentración de amoniaco total es un intervalo que satisface las siguientes condiciones : (A) la concentración de iones de amonio en el medio está en tal nivel que la suma de los equivalentes de ion de los iones de bicarbonato y/o iones de bicarbonato y otros aniones disueltos en el medio es más grande que el
equivalente del ion de la sustancia básica ionizada de la sustancia básica acumulada en el medio, y (B) la concentración de amoniaco total en el medio está en un nivel que no inhibe la producción de la sustancia básica mediante el microorganismo, que se determina de antemano como sigue: el microorganismo se cultiva en el medio que tiene varios valores de pH y varias concentraciones de amoniaco total, la productividad de la sustancia básica se mide en cada valor de pH y en cada concentración de amoniaco total, y una concentración de amoniaco total que proporciona 50% o más de productividad de la sustancia básica basado en la productividad obtenida bajo condiciones óptimas es determinada para cada valor de pH. (3) El método de acuerdo a (1), en donde el intervalo especifico de la concentración de amoniaco total se determina de antemano como sigue: (A' ) el cultivo se realiza en un medio que contiene iones de sulfato y/o cloruro en una cantidad suficiente para realizar el cultivo en un pH de 7.2 o más bajo como una fuente de iones contrarios de la sustancia básica objetivo, del cual el pH se mantiene para estar en el intervalo de entre 6.5 a 7.2 al adicionar por lo menos un gas de amoniaco, amoniaco acuoso y urea, y se mide la productividad de la sustancia básica,
(B' ) el cultivo se inicia en el mismo medio como aquel utilizado en la etapa (A' ) excepto que los iones de sulfato y/o iones de cloruro de los componentes del medio son más bajos mediante una cantidad deseada, y el cultivo se continúa con varias concentraciones de amoniaco total durante un periodo donde llega a ser imposible mantener el pH del medio para ser de 7.2 o más bajo debido a la escasez de iones de sulfato y/o iones de cloruro como iones contrarios de la sustancia básica causada por la acumulación de la sustancia básica objetivo para determinar un total de intervalo de concentración de amoniaco que proporciona 50% o más de productividad basado en la productividad medida en la etapa
(A') . (4) El método de acuerdo a (1), en donde por lo menos una parte del periodo total incluye por lo menos un periodo donde el pH del medio se incrementa debido a la escasez de los iones contrarios causada con la acumulación de la sustancia básica objetivo, y un periodo donde el pH se incrementa debido a la adición de cationes al medio. (5) El método de acuerdo a (1), en donde la concentración de amoniaco total en el medio se ajusta al adicionar amoniaco o urea al medio cuando la actividad del microorganismo se reduce o cesa como se determina basado en los indicadores: concentración de oxigeno disuelta en el medio, proporción de consumo de la fuente de carbono en el medio, turbiedad del
medio, productividad de la sustancia básica, y cambio del pH en el medio observado. (6) El método de acuerdo a (1), en donde un medio que tiene la misma composición como aquella de un medio que contiene iones de sulfato y/o iones de cloruro como una fuente de iones contrarios de la sustancia básica en una cantidad suficiente para realizar el cultivo en un pH de 7.2 o más bajo excepto que la cantidad de iones de sulfato y/o iones de cloruro se reduce mediante una cantidad deseada se utiliza como el medio, y la por lo menos una parte del periodo total es un periodo donde el pH del medio no se puede mantener para ser 7.2 o más bajo debido a la escasez de iones contrarios para la sustancia básica que se ha acumulado en el medio. (7) El método de acuerdo al (2), en donde los otros iones se seleccionan de iones de sulfato, iones de cloruro, iones de fosfato y ácidos orgánicos ionizados. (8) El método de acuerdo a (2) o (7) en donde la cantidad total de los otros aniones es de 900 meq/1 o más bajo. (9) El método de acuerdo a (1), en donde la concentración de amoniaco total en el medio se ajusta para ser 200 mM o más bajo. (10) El método de acuerdo a (1), que comprende la etapa de proliferación del microorganismo. (11) El método de acuerdo a (10), en donde la concentración
de amoniaco total no se ajusta durante la etapa de proliferación del microorganismo. (12) El método de acuerdo a (1), en donde la sustancia básica se selecciona de L-lisina, L-arginina y L-histidina. (13) El método de acuerdo a (12), en donde la sustancia básica es L-lisina. (14) El método de acuerdo a (12), en donde la sustancia básica es L-arginina. (15) El método de acuerdo a (1), en donde el medio o producto procesado del mismo se calienta después de la fermentación para eliminar los iones de bicarbonato y los iones de carbonato. (16) El método de acuerdo a (1), en donde el microorganismo es una bacteria corineforme o una bacteria Escherichia . (17) Un caldo de fermentación o producto de fermentación que contiene una sustancia básica, que es obtenible mediante el método de acuerdo a (15) . Breve Descripción de los Dibujos La Fig. 1 muestra los resultados del cultivo para la producción de L-lisina realizado al utilizar un medio convencional y el método de cultivo. La Fig. 2 muestra los resultados del cultivo para la producción de L-lisina realizado en un medio con una concentración de amonio limitada. La Fig. 3 muestra los resultados del cultivo para
la producción de L-lisina realizado al controlar únicamente la concentración de amoniaco total y no al controlar el pH . La Fig. 4 muestra los cambios de la concentración de amoniaco total y el pH a través del tiempo en un medio convencional y un medio sin el sulfato de amonio y cloruro de amonio. La Fig. 5 muestra los cambios en el crecimiento, concentración de amoniaco total, pH, y cantidad de azúcar restante a través del tiempo en la fermentación de la L-arginina en un medio con una concentración de amonio limitada . La Fig. 6 muestra los resultados de un cultivo para la producción de L-arginina en un medio con una concentración de amonio limitada. Modalidades Preferidas de la Invención Después en la presente, la presente invención será explicada en detalle. El método de la presente invención es un método para producir una sustancia básica mediante la fermentación, que comprende cultivar un microorganismo que es capaz de producir la sustancia básica en un medio liquido contenido en un tanque de fermentación para producir y acumular la sustancia básica en el medio. El método de la presente invención se caracteriza en que la cantidad de iones de sulfato y/o iones de cloruro utilizados como iones contrarios
de la sustancia básica se reducen al ajustar la concentración de amoniaco total en el medio para estar dentro de un intervalo de concentración especifico durante por lo menos una parte del periodo total del proceso de cultivo. Esto es, el método de la presente invención es un método para producir la sustancia básica en el medio en la que los iones de sulfato y iones de cloruro se reducen al utilizar tal concentración de amoniaco total que el amoniaco total se asegura en una cantidad requerida para el crecimiento de microorganismo o la producción de la sustancia objetivo como una fuente de nitrógeno, y el crecimiento del microorganismo o la producción de la sustancia objetivo no se inhibe. Ejemplos de intervalo especifico de la concentración de amoniaco total incluyen un intervalo que satisface las siguientes condiciones: (A) la concentración de iones de amonio en el medio está en tal nivel que la suma de los equivalentes de iones de bicarbonato y/o carbonato, y otros aniones disueltos en el medio es más grande que el equivalente de ion de la sustancia básica ionizada de la sustancia básica acumulada en el medio, y (B) la concentración de amoniaco total en el medio está en un nivel que no inhibe la producción de la sustancia básica por el microorganismo, que se determina de antemano como sigue: el microorganismo se cultiva en el medio que tiene
varios valores de pH y varias concentraciones de amoniaco total, la productividad de la sustancia básica se mide en cada valor de pH y en cada concentración de amoniaco total, y una concentración de amoniaco total que proporciona 50% o más de productividad de la sustancia básica basado en la productividad obtenido bajo condiciones óptimas se determina para cada valor de pH . Además, en otra modalidad de la presente invención, el intervalo especifico de la concentración de amoniaco total se determina de antemano como sigue. (A') (Procedimiento 1: Evaluación del resultado de la fermentación bajo condición neutra) El cultivo se realiza en un medio que contiene una cantidad de iones de sulfato y/o cloruro que es suficiente para realizar el cultivo en un pH de 7.2 o más bajo como una fuente de iones contrarios de la sustancia básica objetivo, de la cual el pH se mantiene para estar en el intervalo entre 6.5 a 7.2 al adicionar por lo menos uno de gas de amoniaco, amoniaco acuoso y urea, y se mide la productividad de la sustancia básica, (B' ) (Procedimiento 2: Evaluación de los resultados de la fermentación con cantidad reducida de iones de sulfato e iones de cloruro en varias concentraciones de amonio) El cultivo se inicia en el mismo medio como aquel utilizado en el procedimiento 1 (etapa A' ) descrito en lo
anterior excepto que los iones de sulfato y/o cloruro de los componentes del medio son más bajos mediante una cantidad deseada, y el cultivo se continúa con varias concentraciones de amoniaco total durante un periodo donde llega a ser imposible mantener el pH del medio para ser 7.2 o más bajo debido a la escasez de iones de sulfato y/o iones de cloruro como iones contrarios de la sustancia básica causada con la acumulación de la sustancia básica objetivo para determinar un intervalo de concentración de amoniaco total que proporciona 50% o más de productividad basado en la productividad medida en etapa (A' ) . Por otra parte, en otra modalidad de la presente invención, cuando el intervalo especifico de la concentración de amoniaco total no se determina de antemano, la concentración de amoniaco total se puede ajustar para estar dentro del intervalo predeterminado. Específicamente, la concentración de amoniaco total en el medio se ajusta al adicionar amoniaco o urea al medio cuando la actividad del microorganismo se reduce o cesa como se determina sobre la base de la concentración de oxigeno disuelto en el medio, proporción de consumo de la fuente de carbono en el medio, turbiedad del medio, productividad de la sustancia básica, y el cambio de pH en el medio observado como Índices. El medio tiene la misma composición como aquel de un medio que contiene iones de sulfato y/o iones de cloruro como una
fuente de iones contrarios de la sustancia básica en una cantidad suficiente para realizar el cultivo en un pH de 7.2 o más bajo excepto que la cantidad de los iones de sulfato y/o iones de cloruro se reduce mediante una cantidad deseada. Ejemplos de por lo menos una parte del periodo total incluye un periodo donde el pH del medio no se puede mantener para ser 7.2 o más bajo debido a la escasez de los iones contrarios para la sustancia básica que se acumulado en el medio. Ejemplos de los otros aniones incluyen iones de cloruro, iones de sulfato, iones de fosfato, iones de ácido orgánicos (ácido acético, ácido láctico, ácido succinico etc.), y asi sucesivamente. Además, los iones de bicarbonato y/o iones de carbonato disueltos en el medio funcionan como aniones contrarios de la sustancia básica. En la presente invención, un equivalente de ion es un valor obtenido al multiplicar la concentración molar de cada ion por la valencia del ion, y es representada en una cantidad de eq/1. Esto es, el equivalente de ion de 1 mM de un ion monovalente es uno meq/1, y el equivalente de ion de 1 mM de un ion divalente es 2 meq/1. La concentración de amoniaco total mencionado en lo anterior se ajusta a fin de hacer que el amoniaco total salga en el medio en una cantidad requerida para el crecimiento del microorganismo o la producción de la sustancia básica, y en
una concentración que no inhibe la producción de la sustancia básica por el microorganismo, y el medio se ajusta por lo tanto automáticamente a un pH adecuado para disolver los iones de bicarbonato y/o los iones de carbonato requeridos como aniones contrarios de la sustancia básica. En la presente invención, "el amoniaco total" significa la suma de los iones de amoniaco (NH3) y amonio (NH4+) no disociados. Cuando se ajusta la concentración de amoniaco total, los iones de amoniaco o amonio no disociados se pueden medir, o ambos se pueden medir. Típicamente, el sulfato de amonio y el cloruro de amonio se adicionan al medio como fuentes de aniones contrarios de la sustancia básica y la fuente de nitrógeno, en general. Por otra parte, puesto que el amoniaco y la urea típicamente se utilizan para ajustar el pH del medio, la concentración alta de iones de amoniaco y amonio están presentes en el medio. Cuando se reduce la cantidad de sulfato de amonio o cloruro de amonio a fin de reducir la cantidad de iones de sulfato o cloruro adicionados al medio, una fuente de nitrógeno tal como amoniaco se suministra en una cantidad que corresponde a la cantidad que se reduce. Para tal operación, ha sido necesario desarrollar un método para suministrar amoniaco, que toma en consideración el balance entre los cationes que incluyen aquellos producidos por la bacteria e incrementa con el progreso del cultivo tal
como aquellos de la sustancia básica objetivo, los cationes que se ionizan del amoniaco adicionado, los cationes adicionados al medio tal como iones de sodio y potasio, y asi sucesivamente, y los aniones que se incrementan en el medio debido a la generación mediante la respiración de la bacteria o adición al medio. Si el balance no se mantiene, la fermentación no progresará debido a que la concentración de amoniaco llegará a ser indebidamente alta, o el pH llegará a ser excesivamente alto, o a la inversa, el amoniaco podria llegar a ser disminuido. De acuerdo a la presente invención, el desarrollo de un método para adicionar amoniaco para ajustar la concentración de amoniaco total que está dentro de un intervalo especifico puede permitir el mantenimiento favorable del balance mencionado en lo anterior de cationes y aniones, y asi el crecimiento favorable de un microorganismo y generación favorable de una sustancia básica se puede realizar aun bajo una condición que la cantidad de iones - de sulfato y iones de cloruro presentes en el medio se reduzca. La concentración de amoniaco total en el medio se ajusta al adicionar por lo menos uno de gas de amoniaco, solución de amoniaco y urea al medio de modo que la concentración de amoniaco total en el medio está en un nivel aceptable. Además, una sal de amonio tal como cloruro de amonio o sulfato de amonio también se puede adicionar, a menos que no sea nocivo al efecto de la invención. Por otra
parte, una sal de amonio que contiene ion de bicarbonato o ion de carbonato como un ion contador, que se puede remover fácilmente como un gas después de la terminación del cultivo, también se puede utilizar. La concentración de amoniaco total se puede ajustar al utilizar valores medidos de ion de amonio o concentración de amoniaco en el medio o el gas de escape como un Índice. Por otra parte, también es posible ajustar la concentración de amoniaco total al determinar de antemano un pH que proporciona una concentración de amoniaco total aceptable cuando el pH se ajusta con amoníaco y se adiciona al amoníaco de modo que tal pH se puede obtener. El tal caso, el pH determinado como se describe en lo anterior se puede cambiar durante el cultivo, si se necesita. Por otra parte, la concentración de amoníaco total en el medio también se puede ajustar al adicionar amoníaco o urea al medio cuando la actividad del microorganismo se reduce o cesa como se determina sobre la base de la concentración de oxígeno disuelto en el medio, la proporción de consumo de la fuente de carbono en el medio, turbiedad del medio, productividad de la sustancia básica, y el cambio en el pH en el medio observado como índices. Esto es, si la fuente de nitrógeno en el medio se agota o se disminuye, la proliferación del microorganismo o la actividad del microorganismo tal como la producción de una sustancia objetivo se reducen o cesa. La actividad de un microorganismo
usualmente se manifiesta del consumo del oxígeno disuelto y una fuente de carbono en un medio, incremento de la turbiedad del medio, producción de una sustancia objetivo, y la reducción del pH del medio debido al consumo del amoníaco o la liberación de dióxido de carbono mediante la respiración. Por lo tanto, cuando la actividad de un microorganismo se reduce o cesa, la concentración de oxígeno disuelto en un medio se incrementa cuando la aireación y las proporciones de agitación por tiempo unitario son constantes, y el pH de un medio se incrementa debido a una disminución en el consumo de amoníaco y secreción de dióxido de carbono. Además, la proporción de consumo de una fuente de carbono, que incrementa la proporción de turbiedad de un medio y la proporción de producción de una sustancia objetivo se reducen. Por lo tanto, cuando el estancamiento de la actividad de un microorganismo se observa sobre la base de estos artículos utilizado como Índices bajo un estado que los componentes del medio diferentes a una fuente de nitrógeno son suficientes, la fuente de nitrógeno se agota o ha sido disminuida. Si esto ocurre, el amoniaco o urea se adicionan al medio en una cantidad que es requerida para el crecimiento del microorganismo o la producción de la sustancia objetivo. Al repetir este procedimiento, la concentración de amoniaco total en el medio es mantenida para estar dentro de un intervalo específico como resultado. Si el cultivo se realiza
con la adición de urea al medio, la urea se utiliza por el microorganismo, y el amoníaco se libera en el medio. Si la adición de amoníaco o urea se repite como se describe en lo anterior, el pH del medio gradualmente se incrementa. La cantidad de amoníaco o urea adicionados en cada punto de tiempo puede ser, por ejemplo, 300 mM, preferiblemente 200 mM, más preferiblemente 100 mM, expresado como la concentración final del amoníaco total en el medio. Alternativamente, el amoníaco o urea se pueden adicionar de modo que el pH se incrementa por 0.3 o menos, preferiblemente 0.15 o menos, más preferiblemente 0.1 o menos, después de la adición de amoníaco o urea. La concentración de oxígeno disuelto en el medio se puede medir, por ejemplo, al utilizar un electrodo de oxigeno disuelto. Si la suma de los equivalentes de iones de bicarbonato y/o iones de carbonato y los otros aniones, que todos están disueltos en el medio es más alto que el equivalente de ion de la sustancia básica que se ha acumulado en el medio se puede confirmar al medir las concentraciones de iones de bicarbonato, iones de carbonato y otros aniones así como la concentración de la sustancia básica. Por otra parte, las condiciones anteriores también se pueden ejecutar al conducir un experimento preliminar para determinar el pH y/o la cantidad de adición de amoníaco que satisface las
condiciones mencionadas en lo anterior, y realizar el cultivo en el pH predeterminado y/o la adición de la cantidad predeterminada de amoníaco. En la presente invención, el pH del cultivo puede o no puede ser constante. Por otra parte, cuando el pH del medio se controla, se puede controlar al utilizar pH por si mismo, o indirectamente al controlar la concentración de amoníaco total sin controlar directamente el pH. Además, si el amoníaco o urea se adicionan utilizando la actividad del microorganismo como un Índice como se describe en lo anterior, la concentración de amoniaco total en el medio se ajusta de modo que está dentro de un intervalo de concentración apropiado, y el pH gradualmente se incrementa con la acumulación de la sustancia básica. Por otra parte, si el cultivo se realiza con el control de la concentración de amoniaco total para estar dentro de un intervalo especifico, el pH cambia como resultado del cambio del balance de acumulación de varios cationes y aniones en el medio. Cualquier medio se elige, la concentración de amoníaco total en el medio se ajusta para estar dentro de un intervalo de concentración específico como resultado, y así la cantidad de iones de sulfato y/o iones de cloruro utilizados como iones contrarios de la sustancia básica se pueden reducir. En la presente invención, la expresión "que no inhibe la producción de una sustancia básica" significa que
el microorganismo utilizado para la presente invención crece favorablemente, y la sustancia básica favorablemente se produce. Cuando el crecimiento del microorganismo es insuficiente, o cuando la sustancia básica no se produce eficientemente a pesar del crecimiento favorable del microorganismo, se considera que la producción de la sustancia básica se inhibe. Específicamente, el microorganismo utilizado para la presente invención se cultiva en varios niveles de pH y las concentraciones de amoníaco total del medio, se miden las productividades de la sustancia básica acumulada en el medio, y las concentraciones de amoníaco total que dan por resultado la producción de la sustancia básica en una proporción de preferiblemente 50% o más, más preferiblemente 70% o más, particularmente de manera preferible 90% o más, como es comparado a la cantidad de la sustancia básica obtenible bajo condiciones óptimas, por ejemplo, condiciones generales convencionalmente utilizadas en un pH neutro, en cada valor de pH se consideran que son concentraciones "que no inhibe la producción de la sustancia básica". En la presente invención, "productividad" se refiere a la producción, la proporción de producción o la cantidad total producida. La "producción" de refiere a la cantidad de producción de la sustancia básica basado en la fuente de carbono presente en el medio que es capaz de ser consumida, y la "proporción de producción" se
refiere a una cantidad de producción por tiempo unitario. Por otra parte, cuando el término "cantidad de producción" o "cantidad producida" se utiliza solamente, se refiere a la cantidad de la sustancia básica que se acumula en el medio una vez que la fuente de carbono se consume completamente. Alternativamente, el microorganismo utilizado para la presente invención se cultiva bajo condiciones óptimas por ejemplo, condiciones generales convencionalmente utilizadas como un pH neutro, y la productividad de la sustancia básica que se acumulado en el medio se mide. Luego, el cultivo se realiza en un medio que tiene la misma composición excepto que la cantidad de los iones de sulfato y/o iones de cloruro se reducen mediante una cantidad deseada, y la productividad de la sustancia básica se mide. En este caso, existe un período donde el pH del medio se incrementará debido a la escasez de iones de sulfato y/o iones de cloruro como los iones contrarios con acumulación de la sustancia básica objetivo. Para ese periodo, el cultivo se realiza con el mantenimiento de la concentración de amoníaco total para estar dentro del intervalo de concentración específico. Como para el intervalo dentro del cual la concentración se controla, el cultivo se realiza con varias concentraciones dentro del intervalo de 1 a 500 mM, y las concentraciones dentro de un intervalo que proporciona una productividad de la sustancia básica de preferiblemente 50% o más
preferiblemente 70% o más, particularmente de manera preferible 90% o más, de la productividad obtenible bajo condiciones óptimas se determinan por ser concentraciones "que no inhiben la producción de la sustancia básica". Ejemplos del medio utilizado para "las condiciones generales convencionalmente utilizadas en un pH neutro" anteriormente mencionado incluye un medio que contiene iones de sulfato y/o iones de cloruro en una cantidad suficiente para realizar el cultivo en un pH de 7.2 o más bajo. La cantidad deseada por la cual los iones sulfato y/o iones de cloruro se reducen no se limita particularmente, mientras que se puede obtener la productividad objetivo de. la sustancia básica. La concentración de amoníaco total que se define como "que no inhibe la producción de la sustancia básica" también se puede determinar, por ejemplo, como sigue. El microorganismo utilizado para la presente invención se cultiva en varios niveles de pH en la concentración de amoníaco total del medio, y la cantidad de la sustancia básica que se acumula en el medio son medidas. La cantidad acumulada de la sustancia básica que se obtiene bajo varias condiciones se compara con la cantidad acumulada bajo las condiciones óptimas. Así, la concentración de amoníaco total que no inhibe la producción de la sustancia básica se puede determinar. Las condiciones óptimas se definen como
condiciones de cultivo que utilizan iones contrarios suficientes en un pH neutro como en las condiciones generales típicamente utilizadas como un pH neutro. Además, otro método para determinar la concentración de amoníaco total que se define como "que no inhibe la producción de la sustancia básica" es, por ejemplo, como sigue. El microorganismo utilizado para la presente invención se cultiva bajo condiciones óptimas, por ejemplo, condiciones generales típicamente utilizadas como un pH neutro, y la productividad de la sustancia básica que se acumula en el medio es medida. Luego, el cultivo se realiza en un medio que tiene la misma composición excepto que los iones de sulfato y/o los iones de cloruro se reducen por una cantidad deseada, y la productividad se examina. En este caso, existe un período donde el pH del medio se incrementará debido a la escasez de iones de sulfato y/o iones de cloruro como los iones contrarios con la acumulación de la sustancia básica objetivo. Para ese período, el cultivo se realiza con el mantenimiento de la concentración de amoníaco total para estar con el intervalo de concentración específico. Como para el intervalo dentro del cual la concentración se controla, el cultivo se realiza con varias concentraciones dentro del intervalo de 1 a 500 mM, y las productividades obtenidas mediante lo cual se comparan a esa bajo las condiciones óptimas.
La concentración que se define como "que no inhibe la producción de la sustancia básica" incluye, por ejemplo, una concentración que permite la producción de la sustancia básica preferiblemente a 50% o más, más preferiblemente 70% o más, particularmente de manera preferible 90% o más, como es comparado a la productividad de la sustancia básica bajo condiciones óptimas. Específicamente, la concentración de amoníaco total en el medio es, por ejemplo, preferiblemente 300 mM o menos, más preferiblemente 200 mM o menos, particularmente de manera preferible 100 mM o menos. El grado por el cual el amoníaco se desasocia se reduce conforme el pH se incrementa. El amoníaco no disasociado es más tóxico a la bacteria como es comparado con el ion de amonio. Por lo tanto, el limite superior de la concentración de amoníaco total también depende sobre el pH del medio. Esto es, conforme el pH del medio se incrementa, la concentración de amoníaco total aceptable llega a ser inferior. Por lo tanto, como para la concentración de amoníaco total mencionado en lo anterior que se define como "que no inhibe la producción de la sustancia básica", un intervalo de concentración de amoníaco total aceptable para el pH más alto durante el cultivo se puede reagregar como el intervalo de concentración de amoníaco total por todo el cultivo. Por otra parte, la concentración total de amoníaco como una fuente de nitrógeno, que es requerida para el
crecimiento del microorganismo y la producción de la sustancia básica, no se limita particularmente, mientras que la productividad de la sustancia objetivo proporcionada por el microorganismo no se reduce debido a la escasez de la fuente de nitrógeno durante el cultivo, y se puede determinar aproximadamente. Por ejemplo, la concentración de amoníaco se mide a través del tiempo durante el cultivo, y cuando el amoníaco en el medio se disminuye, una cantidad pequeña de amoníaco se puede adicionar al medio. Aunque la concentración después de la adición de amoníaco no se limita particularmente, es, por ejemplo, preferiblemente 1 mM o más alto, más preferiblemente 5 mM o más alto, particularmente de manera preferible 10 mM o más alto, en términos de la concentración de amoníaco total. El método de la presente invención puede incluir una etapa de cultivo que es principalmente para la proliferación del microorganismo que tiene una habilidad para producir una sustancia básica, y una etapa de cultivo que es principalmente para permitir al microorganismo producir la sustancia básica. Además, en el método de la presente invención, la proliferación del microorganismo y la producción de la sustancia básica se pueden realizar en paralelo. Además, también tal cultivo como se describe en lo anterior, que también se puede llamar fermentación principal, cultivo principal o los similares, un precultivo también se
puede realizar independientemente. En la presente invención, además de ajustar la concentración de amoníaco total en medio como se describe en lo anterior, una operación que facilita la disolución de iones de bicarbonato y/o iones de carbonato en el medio también se puede realizar. Ejemplos de tal operación incluyen controlar la presión en el tanque de fermentación durante el cultivo de modo que es positivo, suministrar gas de dióxido de carbono o un gas mezclado que contiene gas de dióxido de carbono al medio, limitar la aireación en el tanque de fermentación para que los iones de bicarbonato y/o iones de carbonato se disuelvan en el medio, incrementar el pH del medio al adicionar cationes diferentes a los iones de amonio tales como iones de sodio y iones de potasio al medio, y así sucesivamente. Para hacer la presión en el tanque de fermentación positiva, por ejemplo, la presión del suministro de aire al tanque de fermentación se puede hacer más alta que la presión del escape. Al hacer la presión en el tanque de fermentación más alta, el gas de dióxido de carbono generado por la fermentación se disuelve en el medio de cultivo y produce iones de bicarbonato o iones de carbonato. Específicamente, la presión en el tanque de fermentación puede ser 0.13 a 0.3 MPa, preferiblemente p.15 a 0.25 MPa. Además, el gas de dióxido de carbono se puede
disolver en el medio de cultivo al suministrar gas de dióxido de carbono o un gas mezclado que contiene gas de dióxido de carbono en el medio. Alternativamente, al limitar la aireación al tanque de fermentación, el gas de dióxido de carbono generado por la fermentación también se puede disolver en el medio. Una proporción de aireación adecuada se puede determinar, por ejemplo, al medir la cantidad de iones de bicarbonato o iones de carbonato en el medio, o medir el pH y la concentración de amoníaco del medio. Cuando el gas de dióxido de carbono se suministra al medio, por ejemplo, gas de dióxido de carbono puro o un gas mezclado que contiene 5% en volumen o más de gas de dióxido de carbono se puede burbujear en el medio. Los métodos mencionados en lo anterior para disolver iones de bicarbonato y/o iones de carbonato en el medio se pueden utilizar independientemente o como una combinación de 2 o más. La operación de ajuste de la concentración de amoníaco total en el medio y la operación para facilitar la disolución de los iones de bicarbonato y/o iones de carbonato en el medio si se necesita se puede realizar durante por lo menos una parte del período total del proceso de cultivo. Aunque la "por lo menos una parte del período total" particularmente no se limita mientras que la productividad deseada se obtenga, puede ser específicamente, por ejemplo, 1/10 o más, preferiblemente 1/5 o más, del
proceso de cultivo total del cultivo principal. Más específicamente, los ejemplos del periodo incluyen un período donde el pH del medio se incrementa debido a la escasez de los iones contrarios tales como iones de sulfato y/o iones de cloruro, con la acumulación de la sustancia básica objetivo, o un período donde el pH del medio se incrementa debido a la adición de cationes, o ambos de estos períodos. El medio utilizado para la presente invención particularmente no se limita, mientras que por lo menos la concentración de amoníaco total se pueda hacer para estar dentro del intervalo mencionado en lo anterior mediante la operación de ajuste de la concentración de amoníaco total, y un medio que contiene nutrientes orgánicos e inorgánicos tales como una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno y otros nutrientes de pequeñísimas cantidades pueden ser utilizados adecuadamente dependiendo del microorganismo que se utiliza. Cualquier fuente de carbono se puede utilizar, mientras que se pueda consumir por el microorganismo, y los ejemplos incluyen sacáridos tales como sacarosa, glucosa, fructosa, melasas e hidrolizados de almidón, ácido orgánicos tales como ácido acético, alcoholes tales como etanol, e hidrocarburos tales como metano. Ejemplos de la fuente de nitrógeno incluyen sustancias inorgánicas tales como amoníaco, hidrolizados de
proteína, extracto de levadura y así sucesivamente. Ejemplos de nutrientes de pequeñísimas cantidades incluyen aminoácidos, vitaminas y elementos de metal pequeñísimos. Ejemplos de aniones diferentes a los iones de bicarbonato y/o iones de carbonato que están presentes en el medio incluyen iones de cloruro, iones de sulfato, iones de fosfato, ácidos orgánicos ionizados, iones de hidróxido y asi sucesivamente. La suma de los equivalentes de ion de estos otros iones es usualmente 900 meq/1 o menos, preferiblemente 700 meq/1 o menos, más preferiblemente 500 meq/1 o menos, todavía más preferiblemente 300 meq/1 o más, particularmente de manera preferible de 200 meq/1 o menos. Uno de los objetivos de la presente invención es reducir la cantidad de iones de sulfato y/o iones de cloruro utilizados, y el equivalente de ion de los iones de sulfato o iones de cloruro, o la suma de los equivalentes de ion de estos iones presentes en el medio es usualmente 700 meq/1 o menos, preferiblemente meq/1 o menos, más preferiblemente 300 meq/1 o menos, todavía más preferiblemente 200 meq/1 o menos, particularmente de manera preferible 100 meq/1 o menos. El esquema de fermentación no se limita particularmente, y puede ser un cultivo de lotes en el que el medio no se alimenta, un cultivo de alimentación en el que el medio se alimenta después de que la azúcar cargada se consume, un cultivo continuo en el que el medio se extrae
cuando el volumen del medio excede el volumen aceptable para un tanque de fermentación, un método de reciclado de célula en el que las células bacterianas se reciclan, y así sucesivamente. La temperatura del cultivo se puede determinar apropiadamente dependiendo del microorganismo elegido. Es usualmente 25 a 45°C, preferiblemente 30 a 40°C. Además, es preferible agitar suficientemente de modo que el oxígeno suficiente esté presente durante la fermentación. El cultivo para producir la sustancia básica objetivo se realiza específicamente, por ejemplo, como sigue. Un medio que contiene componentes del medio típico se prepara, pero la mayoría sino todo de las sales de amonio tales como sulfato de amonio y cloruro de amonio se eliminan. Un microorganismo que ha sido cultivado separadamente se inocula en este medio, y el cultivo mientras que controla la concentración de amoníaco total que está dentro de un intervalo adecuado para los microorganismos elegidos, el cual se determina como se describe en lo anterior. La concentración de amoníaco en el medio en el tanque de fermentación o el medio de muestra se puede medir al utilizar, por ejemplo un medidor de iones comercialmente disponible o el similar. Al utilizar los valores medidos como un índice, la concentración de amoníaco total se puede controlar. Para mantener la concentración de amoníaco total dentro del intervalo de concentración predeterminado, el gas
de amoníaco, amoníaco acuoso o urea se pueden adicionar al medio. La concentración de amoníaco total en el medio también se puede medir indirectamente al medir la concentración de amoníaco en el gas de escape del tanque de fermentación utilizando un electrodo de amoníaco común. Además, en la presente invención, la concentración de amoníaco total en el medio se puede ajustar mediante el siguiente método que utiliza el pH del medio como un índice, como se describe en lo anterior. El cultivo se realiza en un medio que tiene la misma composición como el medio que contiene iones de sulfato y/o iones de cloruro en una cantidad suficiente para mantener el cultivo en un pH de 7-2 o más bajo, excepto que la cantidad de iones de sulfato y/o iones de cloruro se reducen por una cantidad deseada en varios niveles de pH, en donde el nivel de pH se cambia al adicionar por lo menos uno de un gas de amoníaco, amoníaco acuoso y urea, y el cultivo se continua mientras que mantiene la concentración3 de amoníaco total en el medio de modo que está dentro del intervalo de concentración preferido al adicionar por lo menos cualquiera de uno de gas de amoníaco, amoníaco acuoso y urea al medio basado en los indicadores tales como el cambio en la concentración de oxígeno disuelto en el medio, el cambio en la proporción de consumo de la fuente de carbono en el medio, el cambio en la turbiedad del medio, el cambio del pH en el
medio, o el similar en una manera indirecta durante un período donde el pH del medio no se puede mantener en 7.2 o más bajo debido a la escasez de iones contrarios a la sustancia básica que se ha acumulado en el medio. Ejemplos de la sustancia básica producida por el método de la presente invención incluyen aminoácidos básicos, específicamente, L-lisina, L-arginina y L-histidina. Entre estos, la L-lisina es preferida. El microorganismo que es capaz de producir una sustancia básica no se limita particularmente, y cualquier microorganismo se puede elegir mientras que pueda producir la sustancia básica mediante la fermentación. En particular, un microorganismo que produce favorablemente la sustancia básica aun en un pH alto del medio, si la concentración de amoníaco total del medio es baja, es preferiblemente elegido. Ejemplos de tal microorganismo incluyen bacterias que pertenecen a la bacteria coryneforme, género Escheri chia , Serra tia , o Bacillus . Las bacterias corineformes y las bacterias Escherichia serán explicadas después en la presente, sin embargo, el microorganismo utilizado para el método de la presente invención no se limita a estas bacterias. Las bacterias corineformes utilizadas para la presente invención incluyen las bacterias Corynebacteri um y aquellas bacterias que han sido previamente clasificadas en
el género Breviba cteri um que han sido reclasificadas con el género Corynebacterium (Int. J. Syst. Bateriol . , 41,
255(1981), y además incluyen bacterias que pertenecen al genero Breviba cteri um, que es extremadamente cercano al género Coryneba cteri um . Ejemplos específicos incluyen lo siguiente : Corynebacterium acetoacidophilum Corynebacterium acetoglutamicum Corynebacterium alkanolyticum Corynebacterium callunae Corynebacterium gl utamicum Corynebacterium lil ium (Corinebacterium gl utamicum) Corynebacterium melassecola Corynebacterium thermoaminogenes Corynejbac eriuin effi ciens Corynebacterium herculis Brevibacterium divarica tum (Corinevacterium glutamicum) Brevibacterium flavum (corynebacterium gl utamicum) Brevibacterium immaríophilum Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum)
Brevibacterium roseum Brevibacterium saccharli ticum Brevibacterium thiogeni talis Brevibacterium álbum Brevibacterium cerinum
Microbacterium ammoniaphilum Específicamente, las siguientes cepas se incluyen: Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806 Corynejbacteriu/n alkanolyticum ATCC 21511 Corynebacterium callunae ATCC 15991 Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060
Corynebacterium lilium (Corynebacterium glutamicum) ATCC
15990 Corynebacterium melassecola ATCC 17965 Cory ebacteriuin thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539) Corynebacterium herculis ATCC 13868 Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum) ATCC
14020 Brevibacterium flavum (Corynebacterium) ATCC 13826, ATCC
14067 Brevibacterium immariophilum ATCC 14068 Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum)
ATCC 13665, ATCC 13869 Brevibacterium roseum ATCC 13825 Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066 Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240 Brevibacterium ammoniagenes (Corynebacterium ammoniagenes)
ATCC 6871 Brevibacterium álbum ATCC 15111
Brevibac erium cerinum ATCC 15112 Microbacterium ammoniaphilum SCTT 15354 Un ejemplo de las bacterias Escheri chia es el Escherichia coli . Cuando el Escherichia coli se desarrolla al utilizar técnicas de ingeniería genética la cepa E. coli K12 y los derivados de los mismos, es decir, cepa E . col i MG1655 (ATCC No. 47076), cepa W3110 (ATCC No. 27325), y así sucesivamente, se pueden elegir. La cepa E . col i se aisló en la Universidad de Stanford en 1922, y es una bacteria lisogénica de ? fago. Además, es una cepa altamente versátil que tiene al factor F, por le cual los recombinantes genéticos se pueden crear mediante la conjugación y los similares. Además, la secuencia genómica de la cepa E. coli K12 ha sido determinada, y la información genética está públicamente disponible la cepa E. coli K12 y los derivados de la misma se pueden obtener de American Type Culture Collection (ATCC, Dirección: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, Estados Unidos de América). Ejemplos de bacterias corineformes que son capaces de producir L-lisina incluyen cepas mutantes resistentes S-(2-aminoetil) cisteína (abreviadas como "AEC" después en la presente, cepas mutantes que requieren un aminoácido tal como L-homoserina para el crecimiento (publicación de patente Japonesa (Kokoku) Nos. 48-28078 y 56-6499), cepas mutantes con resistencia al AEC y además requieren un aminoácido tal
como L-leucina, el-homoserina, L-prolina, L-serina, L-arginina, L-alanina y L-valina (patentes norteamericanas Nos. 3,708,395 y 3,825,472), cepas mutantes que producen L-lisina con resistencia al DL-a-amino-e-caprolactama, alfa-amino-lauril lactama, análogo de ácido aspártico, fármaco de sulfa, quinoide y N-lauroileucina, cepas mutantes que produce L-lisina con resistencia al oxaloacetato de descarboxilasa o un inhibidor de enzima del tracto respiratorio (Patente Japonesa abierta al público No. 50-53588, 50-31093, 52-102498, 53-9394, 53-86089, 55-9783, 559759, 56-32995, 56-39778, publicación de patente Japonesa Nos. 53-43591 y 53-1833), cepas mutantes que producen L-lisina que requieren inositol y ácido acético (Patente Japonesa abierta al público Nos. 55-9784 y 56-8692), cepas mutantes que producen L-lisina que son susceptibles al ácido fluoropirúvico o una temperatura de 34°C o más alta (patentes japonesas expuestas Nos. 55-9783 y 53-86090), cepas mutantes que producen L-lisina de las bacterias Brevibacteri um o Corynebacteri um con resistencia al etilenglicol (solicitud de patente norteamericana No. 333,455), y así sucesivamente. Ejemplos específicos incluyen, por ejemplo, las cepas Breviba cteri um la ctofermen tum ATCC 31269,
Breviba cteri um flavum ATCC 21475 y Coryneba cteri um acetaflutamicum ATCC21491. Además, la cepa plysE, Brevibacteri um ATCC
13869/pVK-C* descrita en los ejemplos también es una bacteria corineforme que produce L-lisina preferida. Esta cepa se obtuvo al incorporar un plásmido pVK-C* que contiene el gen que codifica la aspartoquinasa que se desensibiliza a la inhibición de la retroalimentación por la L-lisina y L-treonina (lysC*) y un plásmido plysE (solicitud de patente norteamericana No. 2003113899) que contiene el gen lysE que es homólogo al gen que promueve la secreción de la L-lisina conocida para las bacterias Coryneba cteri um (publicación de patente Internacional. 9723597 A2 ) en la cepa ATCC 13869, que es una cepa de tipo silvestre Breviba cteri um la ctofermen tum . El gen lysC* se puede aislar de, por ejemplo, la cepa mutante que produce la L-lisina AJ3463 (FERM P-1987) (ver Publicación de Patente Japonesa No. 51-34477) que se genera por la mutagénesis de la cepa ATCC 13869. La cepa AJ3463 se depositó en el Depositario del Organismo de Patentes Internacional, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada (formalmente Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial, Dirección: Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japón) el 22 de Marzo de 1973, y se le asignó el número de acceso FERM P-1987. Además. Un fragmento del gen lysC* también se puede aislar de la cepa Breviba cteri um lactofermentum AJ12691 que contiene un plásmido p399AK9B que
contiene el gen. La cepa AJ12691 se depositó en el Depositario del Organismo de Patentes Internacional, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada el 10 de Abril de 1992 y se le asignó el número de acceso FERM P-12918. Luego, se convirtió en un depósito internacional bajo las provisiones del Tratado de Budapest el 10 de Febrero de 1995, y se le asignó el número de acceso FERM BP-4999. El plásmido p399AK9B (patente norteamericana No. 5,766,925) se obtuvo al insertar un fragmento de DNA que permite la replicación autónoma del plásmido en las bacterias CoryneJacterium en un plásmido p399A 9 que se obtuvo al insertar el lysC derivado de la cepa AJ3463 en el vector de clonación pHSG399 (ver Takeshita, S y colaboradores Gene (1987) , 61, 63-74) . En la aspartoquinasa desensibilizada mencionada en lo anterior, el residuo de alanina en la posición 279 de la subunidad a y el residuo de alanina en la posición 30 de la subunidad ß de la aspartoquinasa de tipo silvestre cada una se reemplaza con un residuo de treonina. La subunidad a y la subunidad ß ambas se codifican en el mismo cuadro del gen dé lysC. La secuencia de nucleótidos del gel lysC* y la secuencia de aminoácidos de la subunidad alfa de la aspartoquinasa desensibilizada se muestran en el listado de secuencia como SEQ ID NOS: 5 y 6, respectivamente, y la secuencia de nucleótidos del mismo gen y la secuencia de
aminoácidos de la subunidad ß de la aspartoquinasa desensibilizada se muestran como SEQ ID NOS: 7 y 8, respectivamente . El gen de lysE de las bacterias corineformes se pueden obtener mediante la PCR (reacción en cadena de la polimerasa, ver White, T.J. y colaboradores, Trends Gene., 5, 185 (1989)) que utiliza los cebadores basados en la secuencia de nucleótidos reportados (acceso GenBank X96471), por ejemplo, los cebadores mostrados como SEQ ID NOS: 3 y 4, y un DNA cromosomal de la bacteria corineforme como la plantilla. Una secuencia de nucleótidos de un fragmento de DNA que contiene los genes Coryneba cteri um gl utami cum lysG y lysE (acceso de GenBank X96471) se muestra como SEQ ID NO: 10, y la secuencia de aminoácidos de la proteína lysE codificada por este gen se muestra como SEQ ID NO 9. El lysG se codifica mediante una secuencia complementaria que corresponde a los números de nucleótidos 1723 a 2352 en SEQ ID NO: 8. La codificación del DNA para la subunidad a, subunidad ß y la proteína LysE de la aspartoquinasa incluyen la codificación del DNA para las proteínas que pueden incluir supresiones, constituciones, inserciones, o adiciones de uno o varios residuos de aminoácidos en una o varias posiciones en cada proteína, con la condición de que las actividades de las proteínas no se pierdan. Aunque el número de residuos de aminoácidos propuestos por el término "varios" puede variar
dependiendo de las posiciones en las estructuras tridimensionales de las proteínas y tipos de residuos de aminoácidos, es preferible 2 a 30, más preferiblemente 2 a 20, particularmente de manera preferible de 2 a 10, para cada proteína. Esto se basa en las siguientes razones. Esto es, es debido a que algunos aminoácidos son altamente homólogos entre sí, y las diferencias entre tales aminoácidos no afectan grandemente las estructuras tridimensionales y las actividades de las proteínas. Por lo tanto, cada proteína puede ser una que tiene una homología de 50% o más, preferiblemente 70% o más, más preferiblemente 90% o más, particularmente de manera preferible 95% o más, a los residuos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6, 8 o 10 y que tiene la actividad de la aspartoquinasa o la proteína LysE. Tal modificación de las proteínas como se describe en lo anterior es una mutación conservativa que mantiene la actividad de cada proteína. La sustitución es un cambio en el que por lo menos un residuo en una secuencia de aminoácidos es removido, y otro residuo se inserta ahí. Ejemplos de la sustitución de un residuo de aminoácido para un residuo de aminoácido original considerado como una sustitución conservadora incluyen la sustitución de ser thr para ala, sustitución de gln, his o lys para arg, sustitución de glu, gln, lys, his o asp para asn, sustitución para asn, glu o gln para asp, sustitución de ser o ala para cys, sustitución de
asn, glu, lys, asp o arg para gln, sustitución de asn, fin, lys o asp para glu, sustitución de pro para gly, sustitución de asn, lys, gln, arg o tyr para his, sustitución de leu, met, val o phe para ile, sustitución de ile, met, val o phe para leu, sustitución de asn, glu, gln, his o arg para lys, sustitución de ile, leu, val o phe para met, sustitución de trp, tyr, met ile o leu para phe, sustitución de thr o ala para ser, sustitución de ser o ala para thr, sustitución de phe o tyr pra trp, sustitución de his, phe o trp para tyr, y sustitución de met, ile o leu para val. Una codificación de DNA para sustancialmente la misma proteína como la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NOS: 6, 8 y 10 se puede obtener al modificar la codificación de secuencia de nucleótidos para la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NOS: 6, 8 o 10 al utilizar, por ejemplo, la mutagénesis de sitio específico, de modo que la sustitución, supresión, inserción o adición de 1 o varios residuos de aminoácido ocurre. Tal DNA modificado se puede obtener en una manera convencional al tratar con un reactivo o bajo condiciones que causa una mutación. Ejemplos de tal tratamiento incluyen tratar la codificación de DNA para la proteína de la presente invención con hidroxilamina, y radiación de rayos ultravioleta de un microorganismo que contiene DNA, tratar con un reactivo tal como N-metil-N' -
nitro-N-nitrosoguanidina o ácido nitroso. Una codificación de DNA para tal proteína modificada como se describe en lo anterior también se puede obtener al aislar un DNA que es capaz de hibridizarse con el gen de lysC, el gen lysE o una porción de estos genes bajo condiciones severas y todavía codifica una proteína que tiene actividad de aspartoquinasa o la actividad de la proteína LysE. El término "condiciones severas" incluye una condición cuando un híbrido específico así llamado es formado, y el híbrido no específico no es formado. Las condiciones severas incluyen, por ejemplo, condiciones bajo las cuales los DNA tienen alta homología entre sí, por ejemplo, DNAs que tienen una homología de no menor que 70%, preferiblemente no menor que 80%, más preferiblemente no menor que 90%, particularmente de manera preferible no menor que 95%, son capaces de hibridizarse. Las condiciones severas también incluyen condiciones de lavado típicas de hibridización meridional, es decir, 1 x SSC, 0.1% SDS, preferiblemente 0.1 x SSC, 0.1% SDS, a 60°C. Ejemplos de bacterias que producen L-lisina que pertenecen al género Escheri chia incluyen mutantes que tienen resistencia a los análogos de L-lisina. El análogo de L-lisina inhibe el crecimiento de las bacterias Escheri chia , pero esta inhibición es completa o parcialmente eliminada cuando la L-lisina coexiste en un medio. Ejemplos de análogos
de L-lisina incluyen oxalisina, hidroxamato de lisina, (s)-(2-aminoetil) -L-cisteína (AEC), ?-metilisina, a-clorocaprolactama, y así sucesivamente. Los mutantes que tienen resistencia a estos análogos de lisina se pueden obtener al someter los microorganismos de Escheri chia a un tratamiento de mutación artificial convencional. Ejemplos específicos de cepas bacterianas utilizadas para producir L-lisina incluyen E. coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; ver Patente Japonesa abierta al público No. 56-18506 y patente norteamericana No. 4,346,170) y las cepas E. coli VL611. La cepa AJ11442 se depositó en el Depositario del Organismo de Patentes Internacional, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada (formalmente Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial, Dirección: Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japón) el 1 de Mayo de 1981, y se le asignó el número de acceso FERM P-5084. Luego, este depósito se convirtió en un depósito internacional bajo las provisiones del Tratado de Budapest el 29 de Octubre de 1995, y se le asignó el número de acceso FERM BP-1543. En estos microorganismos, la inhibición de la retroalimentación de la aspartoquinasa por la L-lisina se desensibiliza . Además, por ejemplo, las bacterias con la expresión aumentada de una codificación de genes para una enzima
involucrada en la biosíntesis de la L-lisina diferente a la aspartoquinasa desensibilizada también se puede utilizar como unas bacterias que producen L-lisina preferidas. Ejemplos de tal enzima incluyen enzimas involucradas en la ruta del diaminopimelato, tal como dihidrodipicolinato sintasa, dihidrodipicolinato reductasa, diaminopimelato de carboxilasa, diaminopimelato dehidrogenasa (publicación de patente internacional WO96/40934 para todas las enzimas anteriores), fosfoenolpiruvato carboxilasa (Patente Japonesa abierta al público No. 60-87788), aspartato aminotransferasa
(publicación de patente japonesa No. 6-102028), diaminopimelato epimeresa (Patente Japonesa abierta al público No. 2003-135066), y aspartato semialdehído dehidrogenasa (publicación de patente internacional WO00/61723), enzimas involucradas en la ruta de aminoadipato, tal como homoaconitato hidratasa (Patente Japonesa abierta al público No. 2000-157276), y así sucesivamente. Ejemplos específicos de cepas E. coli que tienen la habilidad para producir L-lisina incluyen la cepa E . coli W3110 (tyrA) /pCABD2 (publicación de patente internacional WO95/16042) y así sucesivamente. La cepa E . coli W3110 (tyrA) /pCABD2 se obtuvo al introducir el plásmido pCABD2 que contiene genes que codifican las enzimas de sistemas de biosíntesis de L-lisina en W3110(tyrA), que es una cepa deficiente tyrA de E. coli (se designó como AJ12604,
depositada en el Depositario del Organismo de Patentes Internacional, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada (formalmente Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial, Dirección: Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japón) el 28 de Enero de 1973, y se le asignó el número de acceso FERM P-11975, y luego el depósito se convirtió en un depósito internacional bajo las provisiones del Tratado de Budapest el 26 de Septiembre de 1991, y se le asignó el número de acceso FERM BP-3579) . El plásmido pCABD2 contiene una codificación de genes para una dihidrodipicolinato sintasa mutante, en donde el residuo de histidina en la posición 118 es mutado a un residuo de tirosina, y la inhibición de retroalimentación por la L-lisina se desensibiliza, una codificación de genes para una aspartoquinasa mutante III, en donde el residuo de treonina en la posición 352 es mutado a un residuo de isoleucina, y la inhibición de la retroalimentación por la L-lisina se desensibiliza, y la codificación de genes para la dihidrodipicolinato reductasa y la diaminopimelato dehidrogenasa . Además, la cepa E . coli W3110(tyrA) se puede obtener como se describe enseguida. Esto es, muchas cepas obtenidas al introducir un plásmido en la cepa W3110(tyrA) se
divulgan en la publicación de patente norteamericana expuesta No. 488424/1992. Por ejemplo, una cepa obtenida al introducir un plásmido pHATerm se designó como cepa E . coli 3110 (tyrA) /pHATerm, y se depositó en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial y se le asignó el número de acceso FERM BP-3653. La cepa W3110(tyrA) se puede obtener, por ejemplo, al eliminar el plásmido pHATerm de la cepa E . coli 3110 (tyrA) /pHATerm. La eliminación del plásmido se puede realizar en una manera convencional. Además, la cepa WC196 (ver Publicación de Patente Internacional WO96/17930) también se puede utilizar como una cepa que produce L-lisina de E . col i . La cepa WC196 se desarrolló al impartir resistencia AEC (S-(2-aminoetil) cisteína) a la cepa W3110 derivada de E . coli K-12. Esta cepa se designó E. coli AJ13069, y se depositó en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial (actualmente Depositario de Organismo de Patentes Internacional, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japón) ) el 6 de Diciembre de 1994 y se le asignó el número de acceso FERM .P-14690. Luego, el depósito se convirtió a un depósito internacional bajo las provisiones del Tratado de Budapest el 29 de Septiembre de 1995, y se le asignó el
número de acceso FERM BP-5252. El microorganismo utilizable para la presente invención puede tener actividad disminuida de una enzima que cataliza una reacción para la generación de compuestos diferentes a la L-lisina por la vía de la ruta que se ramifica de la ruta biosintética de L-lisina, o una enzima que regula la producción de L-lisina, o puede ser deficiente en tal enzima. Ejemplos ilustrativos de la enzima involucrada en la producción de L-lisina incluyen homoserina dehidrogenasa, lisina de carboxilasa ( cadA, IdcC) y enzima málica. Las cepas en las que las actividades de estas enzimas son disminuidas o deficientes se describen en las publicaciones de patente internacional W095/23864, WO96/17930, WO2005/010175, y así sucesivamente. Para reducir o eliminar las actividades enzimáticas, los genes que codifican las enzimas sobre un cromosoma se pueden mutar mediante un método de metagénesis común de modo que las actividades intracelulares de las enzimas se reducen o eliminan. Por ejemplo, esto se puede lograr al utilizar la recombinación genética para eliminar esta codificación de genes para las enzimas sobre un cromosoma o para modificar una secuencia de control de expresión, tal como un promotor o la secuencia Shine-Dalgarno (SD) . También se puede lograr al introducir una sustitución de aminoácido (mutación de mal sentido) , introducir un codon
de detención (mutación sin sentido) , introducir una mutación de desplazamiento de estructura que adiciona o que suprime uno o dos nucleótidos en las regiones de codificación para las enzimas sobre el cromosoma, o que suprime una parte de los genes (Journal of Biological Chemistry, 272:8611-8617 (1997)). Las actividades enzimáticas también se pueden disminuir o eliminar al construir un gen que codifique una enzima mutante, en donde la región de codificación se suprime, y reemplazar el gen de tipo silvestre sobre el cromosoma mediante la recombinación homologa o el similar con el gen mutado, o introducir un transposón como factor IS en el gen. Por ejemplo, los siguientes métodos se pueden emplear para introducir una mutación que causa una disminución en las actividades de las enzimas mencionadas en lo anterior o elimina las actividades mediante la combinación genética. El gen objetivo sobre un cromosoma se puede reemplazar con un gen mutante que no puede producir una enzima que normalmente funciona al modificar una secuencia parcial del gen objetivo para preparar el gen mutante, y transformar una bacteria corineforme con un DNA que contiene el gen mutante para causar la recombinación entre el gen mutante y el gen sobre el cromosoma. Tal mutagénesis específica de sitio basada sobre la sustitución de genes utilizando la recombinación homologa ha sido ya establecida,
y los métodos que utilizan el DNA lineal, son conocidos métodos que utilizan plásmidos que contienen un origen de replicación sensible a la temperatura (Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 2000, Vol. 97, No. 12, pp . 6640-6645; patente norteamericana No. 6,303,383: Patente Japonesa abierta al público No. 05-007491) y así sucesivamente. Además, tal mutagénesis específica de sitio basada sobre la sustitución de genes que utilizan la recombinación homologa como se describe en lo anterior también se puede realizar con un plásmido que no es capaz de replicarse en el hospedero. Además, los microorganismos que han sido modificados para que la cantidad de expresión del gen de secreción de L-lisina y L-arginina, ybjE, se incremente también se puede utilizar para la presente invención (Publicación de Patente Internacional WO2005/073390) . Ejemplos de bacteria que producen L-lisina que pertenecen al genero Serra tia incluyen bacterias Serra tia transformadas con una codificación de DNA para la dihidrodipicolinato sintasa que tiene una mutación que se desensibiliza de la inhibición de la retroalimentación por la L-lisina, y las bacterias Serra tia que contienen aspartoquinasa que se desensibiliza de la de la inhibición de retroalimentación por la L-lisina (Publicación de Patente Internacional W096/41871) . Ejemplos de bacterias corineformes que producen L-
arginina incluyen cepas de tipo silvestre de bacterias corineformes : bacterias conneformes resistentes a ciertos agentes que incluyen fármacos de sulfa, 2-t?azolealanma, ácido a-amino-ß-hidroxivalerico y así sucesivamente: bacterias conneformes que exhiben auxotrofía para la L-histidina, L-prolina, L-treonina, L-isoleucina, L-metiomna o L-tpptofan además de que son resistentes a 2-t?azolealan?na (Patente Japonesa abierta al público No. 54.44096); bacterias corineformes resistentes al ácido quetomalónico, ácido fluoromalónico, ácido monofluoroacético (Patente Japonesa abierta al público No. 57-18989); bacterias con neformes resistentes al argimnol (Patente Japonesa abierta a] público No. 62-24075); bacterias corineformes resistentes a X-guanidina (X representa un derivado de ácido graso o cadena alifática, Patente Japonesa abierta al público No. 2-186995) y así sucesivamente. Además, las bacterias corineformes que son deficientes en el represor de L-arginina (solicitud de patente norteamericana No. 20020045233), y las bacterias corineformes con actividad de glutamato de hidrogenasa incrementada (Publicación de Patente Europea revelada No. 1057893) también son cepas adecuadas para la producción de L-argimna . Específicamente, los ejemplos incluyen las cepas Breviba ctep um flavum AJ11169 (FERM BP-6802), Coryneba cteri um gl utami cu AJ12092 (FERM BP-6906) , Breviba cteri um flavum
AJ11336 (FERM BP-6893A Breviba cteri um flavum AJ11345 (FERM BP-6894), y Brevibactep um la ctofermen tum AJ12430 (FERM BP-2228) . Las cepas AJ11169 y AJ12092 son resistentes a la 2-tiazolealamna (Patente Japonesa abierta al público No. 54-44096) . La capa AJ11336 es resistente al argimnol y sulfadiazma (Publicación patente japonesa No. 62-24075). La cepa AJ11345 es resistente al arginino, 2-t?azoleal aniña y sulfaguanidma, y es auxotrófica para la histidina (Publicación de patente japonesa No. 62-24075). La cepa AJ12430 es resistente a la octilguanidma y 2-t?azolealan?na (Patente Japonesa abierta al público No. 2-186995). La Coryneba cteri um gl utami cum AJ12092 se depositó en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial (presentemente Depositario de Organismo de Patentes International, Instituto Internacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japón) el 6 de Diciembre de 1994, y se le asignó el número de acceso FERM P-12092. Luego, el depósito se convirtió a un depósito internacional bajo las provisiones del Tratado de Budapest el 1 de Octubre de 1999, y se le asignó el número de acceso FERM BP-6906. Ejemplos de bacterias Esche p chia que son capaces de producir L-argmina incluyen E . col i transformado con el gen argA (ver la Patente Japonesa abierta al público No. 57-
5693), y la cepa E . coll 237 (Solicitud de Patente Rusa No. 2000117677), que es un derivado que produce L-arginma de la cepa mutante que es capaz de asimilar un ácido acético. La cepa 237 se depositó en la Recolección Internacional Rusa de Microorganismos Industriales (VKPM) , GNU Genetika (Dirección: Rusia, 117545, Moscú, 1 Dorozhnyproezd, 1) el 10 de Abril de 2000, y se le asignó el número VKPM B-7925. El depósito se convirtió a un depósito internacional ba o las provisiones del Tratado de Budapest el 18 de Mayo del 2001. La cepa E . col i 382 es un mutante que es resistente a la inhibición de retroalimentación por la L-arginina (Patente Japonesa abierta al público No. 2002-017342), que es un derivado de la cepa 237, y también se puede emplear. La cepa E. coli 382 se depositó en la Recolección Internacional Rusa de Microorganismos Industriales (VKPM) con un número VKPM B-7926 el 10 de Abril del 2000, y el depósito se convirtió a un depósito internacional bajo las provisiones del Tratado de Budapest el 18 de Mayo de 2001. Ejemplos de las bacterias Serra tia que son capaces de producir L-arginina incluyen Serratia ma rcescens que es incapaz de descomponer la L-arginina y es resistente a un antagonista de arginina y canavanina, y es auxotorófico para la lisina (ver Patente Japonesa abierta al público No. 52-8729) . Ejemplos de corineformes que son capaces de
producir L-histidina incluyen microorganismos que pertenecen al genero Brevibactep um que son resistentes a un antagonista de tiamina, específicamente, las cepas Breviba ctep um lactofermen tum FERM P-2170, Ferm P-2316, FERM P-6478, FERM P-6479, FERM P-6480 y FERM P-6481 (Publicación de Patente Japonesa abierta al público No. 59-63194). Ademas, los ejemplos incluyen cepas mutantes que pertenecen al género Brevibacteri um o Corynebacteri um que son resistentes a los poliquetidos y la habilidad de producir L-histidina, específicamente, las cepas FERM P-4161, FERM P-7273, FERM P-8371, FERM P-8372 y ATCC 14067. Ejemplos de bacterias Escheri chia que son capaces de producir L-histidma incluyen cepas mutantes que pertenecen al género Escherichia que son resistentes a un análogo de histidina, por ejemplo, la cepa E . col i R-344, y las bacterias Escherichia transformadas con los genes de enzima del sistema de síntesis de L-histidma aislados de la cepa R-344. Específicamente, los ejemplos incluyen Jas cepas E . coll NRRL-12116, NRRL-12118, NRRL-12119, NRRL-12120 y NRRL-1212 (Patente Japonesa abierta a] público No. 56-5099) . Ejemplos de bacterias Baci l l us capaces para producir la L-histidma incluyen cepas mutantes que pertenecen al genero Baci ll us que son resistentes a un análogo de histidma, y las bacterias Ba cil l us transformadas con un gen obtenido de estas cepas mutantes se involucran a
la resistencia al antagonista de histidina. Específicamente, los ejemplos incluyen las cepas FERM BP-218, FERM BP-2245 y FERM BP-219 (Patente Japonesa abierta al público No. 58-107192) . El caldo de fermentación o el producto procesado del mismo que contiene la sustancia básica obtenida mediante la presente invención contendrá iones de carbonato o iones de bicarbonato como aniones contrarios para la sustancia básica desasociada. Estos iones de carbonato o iones de bicarbonato se emiten como gas de dióxido de carbono cuando el medio de cultivo se calienta o se concentra, o si el pH del medio se disminuye al adicionar un ácido fuerte tal como ácido clorhídrico. La cantidad relativa de la sustancia básica entre los componentes sólidos en el caldo de fermentación así se incrementa. De acuerdo a la presente invención, al utilizar iones de bicarbonato, iones de carbonato o los similares en lugar de los iones de cloruro y los iones de sulfato, la cantidad de los iones de cloruro se puede reducir a un nivel que no causa corrosión de los equipos, o los iones de sulfato se pueden reducir. Además, después de la fermentación, los iones de bicarbonato y los iones de carbonato se pueden reemplazar con iones de cloruro únicamente al adicionar ácido clorhídrico el medio, el clorhidrato de lisina se puede obtener únicamente mediante la concentración adicional del
medio sin utilizar el intercambio de iones, y además los cristales de clorhidrato de lisina se pueden separar directamente . En la presente invención, el "producto de fermentación" incluye el producto concentrado y seco obtenido del caldo de fermentación, y los productos obtenidos mediante el procesamiento del caldo de fermentación o el producto seco del mismo. Ejemplos Después en la presente, la presente invención será explicada más específicamente con referencia a los siguientes ejemplos . Ejemplo 1: Construcción de la bacteria corineforme que produce L-lisina Una codificación de genes para la aspartoqumasa desensibilizada y una codificación de genes para un factor de secreción de lisina se introdujeron en una bacteria cormeforme silvestre para preparar una bacteria que produce
L-lisina . (1) Adquisición de la codificación de genes para la aspartoqumasa desensibilizada Un gen ( lysC*) que codifica para la aspartoquinasa (Ask*) que se desensibiliza a la inhibición de retroalimentación mediante la L-lisina y L-treonina se aisló mediante la PCR de una cepa mutante que produce -lisina,
AJ3463 (FERM P-1987, ver Publicación de patente japonesa No.
51-34477) derivada de la cepa Corynebacteri um gl ?tami cum
(Breveiba cteri um lactofermen tum) ATCC 13869 mediante la mutagénesis . La cepa AJ3463 se cultivó en el medio CM-Dex, y el
DNA cromosomal se extrajo de las células obtenidas mediante un método típico (Biochem. Biophys. Acta., 72, 619-629
(1963)). Al utilizar este DNA cromosomal como una plantilla con un oligonucleótido ASK-F (SEQ ID N0:1) para introducir un sitio de enzima de restricción Bam I en el extremo 5' del fragmento de DNA objetivo y un oligonucleotido ASK-R (SEQ ID NO: 2) para introducir un sitio de enzima de restricción kpnl en el extremo 3' del fragmento de DNA objetivo como cebadores para la PCR, un fragmento de DNA de genes que contiene lysC* como los genes objetivos se amplifico. Para la amplificación, un ciclo que consiste de una etapa de desnaturalización a 98°C durante 10 segundos, se repitió una etapa de recalentamiento a 55°C durante 30 segundos y una etapa de extensión a 72°C durante 2 minutos 25 veces. La enzima, Polimerasa de DNA Pyrobest (Takara Shuzo) , se utilizó de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El fragmento de DNA amplificado se purificó mediante un tratamiento con fenol/cloroformo y la precipitación de etanol, y luego se digirió con las enzimas de restricción BamWl y Kpnl . La mezcla de reacción obtenida
se desarrolló mediante la electroforesis de gel de agarosa, la banda que contiene el gen de lysC* se cortó, y el fragmento de genes se purificó mediante métodos convencionales . Un vector de lanzadera para el E . col i y
Coryneba cteri um gl utamicum, pVK7 (ver patente norteamericana No. 6,004773), se trató separadamente con las enzimas de restricción BamHIy Kpnl en una manera similar, y se ligaron al fragmento lysC * mencionado en lo anterior. Las células competentes de la cepa E . coli JM 109 (Takara Shuzo) se transformaron con la mezcla de reacción de ligación de acuerdo al protocolo del fabricante, y se seleccionaron varias colonias resistentes a la canamicina. El pVK7 se construyó al ligar un pJásmido críptico de Breviba ctep um la ctofermen tum, pAM330, a un vector para el E . col i , pHSG299 (Kmr, ver Takeshita, S. y colaboradores, Gene, 61, 63-74, (1987)) como sigue (ver Patente Japonesa abierta al público No. 11-266881, Publicación Internación de Patente WO99/07853) . La pAM330 se preparó a partir de la cepa Brevibactepum lactofermentum ATCC 13869. La pHSG299 se digirió con Aval I (Takara Shuzo) , que había sido de extremo redondeado con polimerasa T4 DNA, luego se digirió con polimerasa T4 de DNA. Así, el pVK7 se obtuvo. El pVK7 es replicable autónomamente en células de E . col l y Breviba ctep um la ctofermen tum, y contiene un sitio de
clonación múltiple derivado del pHSG299, la cZ ' , y un gen de resistencia a la canamicina como un marcador. Los DNAs de plásmido se extrajeron de las colonias resistentes a la canamicina obtenidas como se describe en lo anterior de una manera convencional, y el plásmido que contiene el gen lysC* objetivo se designó pVK-C*. (2) Adquisición de una codificación de genes para el factor de secreción de lisina lysE Al utilizar el DNA cromosomal de la Breviba cter i um la ctofermen tum, ATCC 13869 como una plantilla, el gen de lysE se aisló mediante la PCR (ver la solicitud de patente norteamericana No. 2003113899). El gen lysE ha sido conocido por funcionar en bacterias Coryneba cteri um para promover la secreción de la L-lisina (Publicación de Patente Internacional 9723597A2) . El DNA cromosomal de la cepa se preparó de la misma manera como se describe en lo anterior. La LysE-F (SEQ ID NO: 3) y LysE-R (SEQ ID NO: 4) se utilizaron como los cebadores. La PCR se realizó utilizando el Pyrobest (Takara Shuzo) con un tratamiento con calor a 94°C durante 90 segundos, y el siguiente ciclo se repitió 30 veces: la desnaturalización a 94°C durante 20 segundos, recocción a 55°C durante 30 segundos y la reacción de extensión a 72°C durante 60 segundos. Luego la reacción se incubó a 72°C durante 10 minutos. Un fragmento de DNA del tamaño pronosticado se obtuvo mediante esta reacción. Este
fragmento de DNA se purificó, y luego se clonó en el vector de clonación PCR2.1 ( Invitrogene) de acuerdo al protocolo del fabricante. Las células del componente de la cepa E . col l JM109 (Takara Shuzo) se transformaron con la mezcla de reacción de ligación de acuerdo al protocolo del fabricante, se seleccionaron varias colonias resistentes a la amp cilina. Los DNAs del plásmido se extrajeron de estas colonias, y el plásmido que tiene la estructura deseada se designó PCR lysE. Luego, el pCRlysE se digirió con las enzimas de restricción Bamtil y Xbal , y se sometieron a la electroforesis de gel de agarosa para obtener un fragmento que contiene el gen de lysE. Un vector de lanzadera para la E . coli y Coryneba cteri um gl utamicum , pKC (ver la solicitud de patente norteamericana No. 2003113899), se trató separadamente con las enzimas de restricción Bam I y Kpnl en una manera similar, y se sometieron a la electroforesis de gel de agarosa para obtener un fragmento de gen que contiene el gen de resistencia al cloranfenicol . Este gen se purifico y luego se ligó al fragmento lysE mencionado en lo anterior. Al utilizar esta mezcla de reacción de ligación, las células competentes de la cepa E . coli JM109 (Takara Shuzo) se transformaron de acuerdo al protocolo del fabricante, y se eligieron varias colonias resistentes al cloranfenicol . Los plásmidos se prepararon a partir de las colonias obtenidas como se describe en lo anterior para obtener el plásmido de
expresión LysE, plysE. El pKC4 se preparó como sigue. Un plásmido pHK4 (ver Patente Japonesa abierta al público No. 5-7491) que tiene .un origen de replicación derivado del plásmido ya obtenido pHM1519, que es replicable autónomamente en la bacteria corineforme (Agrie. Biol. Chem., 48, 2901-1903 (1984)), se digirió con las enzimas de restricción BamH? y Kpnl para obtener un fragmento de genes que contiene el origen de replicación. El fragmento obtenido se terminó redondeado con un Kit de redondeo de DNA (Takara Shuzo) , y se insertó en el sitio Kpnl del pHSG399 (Takara Shuzo) mediante la ligación utilizando un enlazador Kpnl (Takara Shuzo) . Las células competentes de la cepa E . coli JM109 (Takara Shuzo) se transformaron con esta mezcla de reacción de ligación de acuerdo al protocolo del fabricante, y se seleccionaron varias colonias resistentes al cloranfenicol. Los plásmidos se separaron de las colonias obtenidas como se describe en lo anterior para obtener pKC4. (3) Construcción de la bacteria corineforme que produce L-lisina Los dos plásmidos descritos en lo anterior, pVK-C* y plyE, se introdujeron en la cepa Breviba cteri um lactofermen t um ATCC 13869 mediante la electroporación. La electroporación se realizó al utilizar un pulsador de genes (BIO-RAD) . La distancia entre los electrodos en la probeta
fue 0.1 cm y las condiciones de aplicación del pulso eléctrico fueron 25 µF; 200 O y 1.8 kV . Las cepas que contienen los plásmidos se seleccionaron sobre una placa de agar CM-Dex (ver enseguida para la composición del medio) que contiene 5 µg/1 de cloranfenicol y 25 µg/1 de canamicina. La cepa que contiene el plásmido se cultivó durante la noche a 31.5°C con agitación en el medio líquido CM-Dex que contiene 5 µg/1 de cloranfenicol y 25 µg/1 de canamicina. El cultivo se realizó en 3 ml del medio de cultivo en un tubo de prueba con agitación. El medio CM-Dex se preparó como sigue. Todos los componentes listados en la Tabla 1 se mezclaron, se ajustaron a un pH de 7.5 con KOH, y luego se esterilizaron mediante el autoclave a 120°C durante 20 minutos. En el medio de agar, el agar se adicionó a una concentración final de 20 g/L.
(Llenado a 1L con agua esterilizada) Como se describe en lo anterior, se obtuvo una bacteria corineforme que produce L-lisina, ATCC 13869/pVKC*, plysE . Ejemplo 2: Crecimiento de la bacteria que produce L-lisina en el medio alcalino, y efecto de la concentración de amoníaco total sobre la producción de L-lisina Al utilizar la bacteria que produce L-lisina construida en el Ejemplo 1, se investigó la concentración de amoníaco total que no inhibe la productividad de la L-lisina en un medio alcalino. Primero, se utilizó un método de cultivo convencional. Esto es, se utilizó un medio (medio B) obtenido al adicionar sulfato de amonio se adicionó a medio A (la composición se muestra en la Tabla 2) en una cantidad de 55% (p/p) basado en la glucosa. El pH del medio se mantuvo constante con el gas de amoníaco durante el cultivo, para realizar la fermentación de la L-lisma. El pH se controló para ser 7.0 u 8.0.
Específicamente, el cultivo se realizó como sigue. La cepa mencionada en lo anterior se inoculó en 3 ml del medio líquido CM-Dex y se cultivó durante la noche a 31.5°C con agitación, y 200 µl del medio se esparció uniformemente sobre el medio de agar CM-Dex. El cultivo se realizó durante la noche a 31.5°C como un cultivo estacionario. Luego, un tercio de las células bacterianas que producen L-lisina las cuales crecieron sobre el medio de agar sobre una placa se inocularon a 300 ml del medio B en un frasco fermentador y se cultivaron. Durante el cultivo, el medio se aireó con 300 ml por minuto de aire esterilizado filtrado, la proporción de agitación se mantuvo a 700 rpm, y la temperatura del medio se mantuvo a 31.5°C. Los resultados se muestran en la Fig. 1. Como resultado, en el pH de 7.0, se acumularon 17.4 g/L de L-lisina, y la proporción de producción fue de 0.725 g/L/hr. Por otra parte, en el pH de 8.0, el crecimiento de las células casi no fue existente y la fermentación no
progresó (Fig. 1) . Luego, la fermentación se realizó utilizando las bacterias que producen L-lisina en un medio sin sulfato de amonio . La cepa mencionada en lo anterior se inoculó en 3 ml del medio líquido CM-Dex y se cultivó durante la noche a 31.5°C con agitación, y 200 µl del medio se esparcieron uniformemente sobre el medio de agar CM-Dex y se dejaron durante la noche a 31.5°C. 300 ml del medio A (sin el sulfato de amonio) se colocó en un frasco fermentador y el pH se ajustó a 7.8, 8.2 y 8.9 al burbujear el gas de amonio a través del medio. Un tercio de las células bacterianas que producen L-lisina que crecieron sobre el medio de agar sobre una placa se inocularon en el medio, y se cultivaron. Durante el cultivo, el medio se aireó con 300 ral por minuto de aire esterilizado filtrado, la proporción de agitación se mantuvo a 700 rpm y la temperatura del medio se mantuvo constante a 31.5°C. Durante el cultivo, un pH constante se mantuvo mediante el burbujeo del gas de amoniaco a través del medio. Como resultado, se confirmó que, en el pH de 8.9, después de la concentración de amoniaco total en el medio excedió 100 mM, el crecimiento y la producción de la L-lisina, en particular, se inhibieron fuertemente. En el método de cultivo mencionado en lo anterior, el gas de dióxido de carbono generado por las bacterias que
producen L-lisina disueltas en el medio como iones de carbonato o iones de bicarbonato, los cuales dan por resultado un pH disminuido como los progresos del cultivo. Por lo tanto, la cantidad del amoníaco adicionado necesario para controlar el pH en el nivel predeterminado se incrementa. Además, el nivel de pH por el cual el medio había sido ajustado llegó a ser más alto, las concentraciones de los iones de carbonato y los iones de bicarbonato disueltos llegaron a ser más altos, y por lo tanto la concentración del amoníaco adicionado a fin de ajustar el pH al valor predeterminado llegó a ser más alto. El amoníaco no disasociado fácilmente penetra las células que dan por resultado el daño celular en las células. Puesto que un pH más alto da por resultado una cantidad más baja de disociación del amoníaco, el crecimiento de las bacterias se inhibió como conforme el pH se incrementó, aún si la concentración de amoniaco total se mantiene en un nivel constante. Por lo tanto, se concluyó que en el pH de 8.9 o más bajo, si la concentración de amoníaco total se controla para ser baja, por ejemplo, a 100 mM o más baja, la inhibición del crecimiento bacteriano y la acumulación de L-lisina no es significante. Luego, el cultivo para la producción de L-lisina se realizó mientras que la concentración de amoníaco total en el medio se controló a 100 mM o más bajo a un pH de 7.8, 8.2 u
8.9. La cepa mencionada en lo anterior se inoculó en 3 ml del medio líquido CM-Dex y se cultivó durante la noche a 31.5°C con agitación, y se esparcieron uniformemente 200 µl del medio sobre el medio de agar CM-Dex y se dejaron durante la noche a 31.5°C. 300 ml del medio A (sin sulfato de amonio) se colocaron en un frasco fermentador y el pH se ajustó a 7.5, 7.8, 8.2 u 8.9 mediante el burbujeo del gas de amoniaco a través del medio. Un tercio de las células bacterianas que producen L-lisina que crecieron sobre el medio de agar sobre una placa se inocularon en el medio, y se cultivaron. Durante el cultivo, el medio se airó con 300 ml por minuto de aire esterilizado de filtro, la proporción de agitación se mantuvo a 700 rmp, y la temperatura del medio se mantuvo a 31-.5°C. Durante el cultivo, el pH se mantuvo en cada uno de los niveles predeterminados con hidróxido de potasio 6 N en lugar del amoníaco. La concentración de amoníaco total en el medio se midió al utilizar un electrodo de amoníaco y un medidor de iones (Orion) . El medio se muestreó periódicamente y la concentración de amoníaco total se controló dentro de 0 a 100 mM al adicionar 10% de solución de amoníaco acuosa como se requiera. Además, al monitorear la concentración de oxígeno disuelto en el medio, se detectó un incremento agudo en la concentración del oxígeno disuelto cuando el amoniaco se
agotó. Cuando esto ocurrió, un 10% de solución de amoníaco acuosa se adicionó para prevenir la disminución continua del amoníaco en el medio. Los resultados se muestran en la Fa g . 2. Como resultado, el crecimiento favorable y la producción de L-lisma se observaron en todos los niveles de pH de 7.8 a 8.9. Comparados con la fermentación realizada en un pH de 7.0 que utiliza el método de cultivo convencional, se observó la proporción de producción de 115% o más alta. Ejemplo 3: Producción de la L-lisina En este ejemplo, la fermentación de L-l sina se realizó al controlar únicamente la concentración de amoníaco total, pero no al controlar el pH. El intervalo de la concentración de amoníaco total se mantuvo a 100 mM o más bajo. Este intervalo se eligió basado en los resultados en el Ejemplo 2. La cepa mencionada en lo anterior se inoculó en 3 ml del medio líquido CM-Dex y se cultivó durante la noche a 31.5°C con agitación, y se propagaron uniformemente 200 µl del medio sobre el medio de agar CM-Dex y se dejaron durante la noche a 31.5°C. 300 ml de medio A (sin el sulfato de amonio) en un frasco fermentador, y la concentración de amoníaco total del medio se ajustó a 23.8 mM mediante el burbujeo del gas de amoníaco a través del medio. Un tercio de las células bacterianas que producen L-lisina que crecieron
sobre el medio de agar sobre una placa se inocularon en el medio, y se cultivaron. Durante el cultivo, el medio se airó con 300 ml por minuto de aire esterilizado de fAtro, la proporción de agitación se mantuvo a 700 rpm y la temperatura del medio se mantuvo a 31.5°C. La concentración de amoníaco total se midió periódicamente, y una cantidad apropiada de 10% de amoníaco acuoso se adicionó al medio como es requerido de modo que la concentración de amoníaco total se mantuvo entre 0 a 100 mM. Como resultado, 15.9 g/L de sina se acumuló, la fermentación de la L-lisina progreso (Fig. 3).
Ejemplo 4: construcción de la bacteria E . col i que produce L-lisina <1> Construcción de la cepa en la que la codificación de los genes cadA y IdcC para la lisina carboxilasa se interrumpe. Una cepa deficiente de lisina de carboxilasa se construyó primero. La lisina de carboxilasa se codificaron mediante el gen cadA (acceso de Genbank No. NP_418555, SEQ ID NO: 15), y el gen ldcC (acceso de Genbank No. NP_414728, SEQ ID NO: 17) (ver Publicación de Patente Internacional WO96/17930). En este ejemplo, la cepa WC196 se utilizó como la cepa de origen. La codificación de los genes cadA y IdcC para la Usina de carboxilasa se suprimió al utilizar el método desarrollado primero por Datsenko y Wanner llamado "Red-driven integration" (Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 2000, Vol.
97, No. 12, pp . 6640-6645), y un sistema de escisión derivado de ? fago (J. Bactepol,. 2002 Sep., 184 (18):5200-3, las Interacciones entre la mtegrasa y la excisionasa en el complejo de nucleoproteína excisiva fago lamba, Cho EH, Gumport Rl, Gardner JF) . De acuerdo al método "Integración conducido rojo" un producto de PCR obtenido utilizando los cebadores de oligonucleótidos sintéticos en el que una parte del gen objetivo se designa sobre el lado 5' y la parte de un gen de resistencia al antibiótico se designa sobre el lado 3' , se puede utilizar par obtener una etapa de cepas interrumpidas de genes. Además, al utilizar el sistema de excisión derivado del ? fago en combinación, el gen de resistencia al antibiótico que había sido incorporado en la cepa de interrupción del gen se puede eliminar (Patente Japonesa abierta al público No. 2005-058227). (1) Interrupción del gen cadA El plásmido pMW118-attL-Cm-attR (Patente Japonesa abierta al público No. 2005-058827) se utilizó como una plantilla en la PCR. El pMW118-attL-Cm-attR se obtuvo al insertar los genes a t tL y a t tR que son los sitios de unión del Fago, y el gen ca t que es un gen de resistencia al antibiótico en el pMW118 (Takara Bio) . El orden de inserciones es a t tL-ca t -a t tR . La PCR se realizó con los cebadores de oligonucleótidos sintéticos mostrados como DEQ ID NOS: 11 y
12 los cuales tienen secuencias que corresponden a ambos extremos de a t tL y a t tR en los extremos 3' de los cebadores, y una secuencia que corresponde a una porción del gen cadA objetivo en los extremos 5' de los cebadores. El producto de PCR amplificado se purificó sobre gel de agarosa y se introdujo mediante la electroporación en la cepa E . coli WC169 que contiene el plásmido pKD46 que es replicable sensible a la temperatura. El plásmido pKD46 (Proc. Nati. Acad. Dci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, pp . 6540-6645) contiene un fragmento de DNA de 2154 nucleótidos en total de la codificación de genes que contienen ? fago para la recombinasa Red del sistema de recombinación homólogo del Rojo ? (genes ?,ß,exo) controlado por el promotor para B inducible en arabinosa (Acceso de GenBank/EMBL No. J02459, nucleótidos en las posiciones 31088 a 33241). Se requiere el plásmido pKD46 para incorporar el producto de PCR en el cromosoma de la cepa WC196. Las células competentes para la electroporación se prepararon como sigue. Esto es, la cepa E . coli WC196 cultivada durante la noche a 30°C en el medio LB que contiene 100 mg/L de ampicilina se diluyó 100 veces con 5 mL del medio SOB (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2nd Edición, Sambrooc, J. y colaboradores, cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) que contiene ampicilina (20 mg/L) y L-arabinosa (1 mM) . Las células en el cultivo diluido se hicieron crecer
a 30°C con aireación hasta que el OD600 alcanzó aproximadamente 0.6, y luego el cultivo se concentró 100 veces y se lavó tres veces con 10% de glicerol de modo que las células podrían ser útiles para la electroporación. La electroporación se realizó al utilizar 70 µl de las células competentes y aproximadamente 100 ng del producto de PCR. Después de la electroporación, las células se adicionaron a 1 mL del medio SOC (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edición, Sambrook, J. y colaboradores, Cold Spring Harbore Laboratory Press (1989)), se cultivaron a 37°C durante 2.5 hora, y luego se cultivaron a 37°C como cultivo de placa sobre el medio de agar L que contiene 25 mg/L de Cm (cloranfenicol), y recombinantes resistentes a Cm se seleccionaron. Luego, a fin de remover el plásmido pKD46, las células se sub-cultivaron dos veces a 42°C sobre el medio de agar L que contiene Cm, y la resistencia a la ampicilina de las colonias se examinó para obtener una cepa sensible a la ampicilina sin pKD46. La supresión del gen cadA en el mutante identificado sobre la base del gen de resistencia al cloranfenicol se confirmó por la PCR. La cepa deficiente de cadA obtenida se designó cepa WC196?cadS : : att-cat . Luego, a fin de remover el gen a t t -ca t el cual había sido introducido en el gen cadA, un plásmido auxiliar pMW-intxis-ts (Patente Japonesa abierta al público No. 2005-
058827) se utilizó. El pMW-mtxis-ts lleva una codificación de genes para la mtegrasa (Int) y una codificación de genes para la excisionasa (Xis) de ? fago, y es replicable sensible a la temperatura. Las células competentes de la cepa WC196?cadA: : att-cat obtenida en lo anterior se prepararon en una manera convencional, se transformaron con el plásmido auxiliar pMW-íntxis-ts, y se cultivaron sobre el medio de agar L que contiene 50 mg/L de ampicilina a 30°C como un cultivo de placa, y se seleccionaron las cepas resistentes a la ampicilina . Luego, a fin de remover el plásmido pMW-intxis-ts, la cepa seleccionadas se sub-cultivaron dos veces sobre el medio de agar L a 42°C, y la resistencia a la ampiciLma y la resistencia al cloranfenicol de las colonias obtenidas se examinaron para obtener una cepa interrumpida con cadA sensible al cloranfenicol y a la ampicilina sin el att-cat y pMW-mtxis-ts . Esta cepa se designó WC196?cadA. (2) Supresión del gen ldcC de la cepa WC196?cadA. El gen idcC se suprimió de la cepa WC196?cadA de acuerdo al método mencionado en lo anterior utilizando los cebadores de SEQ ID NOS: 13 y 14 como cebadores para la interrupción del ídcC. La cepa interrumpida con cadA- y ídcC, WC196?cadA?ldcC, de esta manera se obtuvo. <2> Introducción del plásmido para la producción de Lys en la
cepa WC196?cadA?ldcC. La cepa WC196?cadA?ldcC se transformó con el plásmido pCABD2 para la producción de Lys que lleva los genes dapA, dapB y lysC (Publicación de Patente Internacional WO01/53459) en una manera convencional para obtener la cepa WC196?cadA?ldcC/pCABD2 (WC196LC/pCABD2 ) . Ejemplo 5: Producción de L-lisina utilizando E . coll Este ejemplo muestra un ejemplo de la presente invención aplicado a la producción de la L-lisina por el E . coli , en este ejemplo, la L-lisina se produjo mediante la fermentación sin la adición de sulfato de amonio y cloruro de amonio, los cuales se adicionan generalmente a los medios para el propósito para suministrar nitrógeno y los iones contrarios para la L-lisina en la producción de L-lisina mediante la fermentación. Específicamente, el cultivo se realizó sin el control del pH, pero con el control de la concentración de amoníaco en el medio. El intervalo dentro del cual la concentración de amoníaco en el medio debe ser controlado se examinó de antemano. Como resultado, se confirmó que la concentración de amoníaco total está preferiblemente en el intervalo de 50 a lOOmM. Por lo tanto, en el cultivo principal práctico, la concentración de amoníaco total se controló para hacer 100 mM o más bajo mediante el burbujeo del gas de amoníaco. Además, cuando la concentración de amoníaco total disminuyó a 50 mM, se
controló con gas de amoniaco para mantener esa concentración. El WC196?cadA?ldcC/pCABD2 se utilizó para la producción de lisina. Se utilizaron 300 ml del medio de producción de L-lisina para el E . coli mostrado en la Tabla 3 colocado en un frasco fermentador. La concentración de amoníaco total se ajustó para 95 mM mediante el burbujeo del gas de amoníaco. A este medio, las células obtenidas mediante el cultivo de la cepa que produce L-lisina sobre la superficie completa del medio de agar LB que contiene 20 µg/L de estreptomicina y cultivándolo a 37°C durante 24 horas se inocularon. La cantidad de las células inoculadas correspondieron a las células desarrolladas sobre tres placas del medio de agar. El cultivo se realizó con una temperatura del medio mantenida a 37°C, la aireación de 50 ml por minuto del aire esterilizado de filtro, y una proporción de agitación de 700 rpm. Cuando la concentración de oxígeno disuelta en el medio disminuyó a 20% de saturación, la proporción de aireación se cambió a 100 ml por minuto. La solución de alimentación para el E . col i mostrada en la Tabla 4 se adicionó apropiadamente a manera de goteo al medio de modo que la glucosa no se agotó, y la concentración de la misma no llegó a ser de 30 g/L o más alta en el medio. Finalmente, cuando 36 g de la glucosa se consumieron el cultivo se terminó. Como resultado, el cultivo podría ser favorablemente realizado de modo que toda la glucosa
adicionada se consumió después de 33 horas, 13.4 g de L-lisina se acumuló, y la proporción de producción de la L-lisma fue de 1.2 g/L/hr. El producto de esta producción fue de 37%. Como control, los resultados se muestran para la producción de L-lisma realizadas con la misma cepa al adicionar sulfato de amonio, y sin controlar la concentración de amoníaco total, pero controlando el pH, similar a Los métodos de producción comunes para los aminoácido básicos. La misma cepa se inoculó en una manera similar a un medio que consiste del medio de producción de L-lisina para el E. coll mostrado en la Tabla 3 adicionado con 13 g/L de sulfato de amonio y se cultivó mientras que se controla el pH para ser constante a 6.7 al burbujear apropiadamente el gas de amoníaco. La temperatura del cultivo, la proporción de aireación y la proporción de agitación fueron los mismos como aquellos descritos en lo anterior. En este caso, la solución de alimentación para el £. coli adicionado con 112.5 g/L de sulfato de amonio (que contiene sulfato de amonio, Tabla 5) se adicionó en lugar de la solución de alimentación para el E. coli mostrado en la Tabla 4, de modo que la glucosa no se agotó, y la concentración de glucosa no debe llegar a ser 30 g/L o más alta en el medio, y finalmente 36 g de gLucosa se consumieron. Como resultado, toda la glucosa adicionada se consumió después de 33 horas, 14.7 g de L-lisma se
acumularon, y la proporción de producción de la L-lisma fue de 1.3 g/L/hr. El rendimiento de esta producción fue de 40%. Todas las concentraciones de lisma descritas en lo anterior se muestran en términos de clorhidrato de lisma. Además, los cambios en la concentración de amoníaco total y el pH durante los cultivos se muestran en la Fig. 4. A partir de la comparación de estos resultados, se confirmó que, cuando el método de la presente invención se utilizó, la producción de L-lisma mediante la fermentación podría ser realizada sin la adición de sulfato de amonio o cloruro de amonio en una proporción de producción de aproximadamente 92%, un rendimiento de aproximadamente 93% y una cantidad de producción de L-lisma de aproximadamente 91% comparada con aquella obtenida en la producción fermentativa común en la que el sulfato de amonio se adicionó. Tabla 3: Composición del medio de producción para el L-li sma para el £. coll (por 1 L)
La glucosa y el FeS?4-7H20 se pesaron como una porción A, los otros componentes se pesaron como una porción B, y la porción A como fue y la porción B se ajustó a un pH de 5.0 se esterilizaron separadamente mediante el autoclave a 115°C durante 10 minutos, y luego se mezclaron. Se adicionaron 20 µg/L de estreptomicina al medio antes del uso. Tabla 4: Composición de la solución de alimentación para la E . coli (por 1 L)
Los componentes se esterilizaron mediante el autoclave a 120°C durante 20 minutos. Se adicionaron 20 µg/L de estreptomicina al medio antes del uso. Tabla 5: Composición de la solución de alimentación para la E . col i que contiene sulfato de amonio (por 1 L)
Los componentes se esterilizaron mediante el autoclave a 120°C durante 20 minutos. Se adicionaron 20 µg/L de estreptomicina al medio antes del uso. Ejemplo 6: Producción de L-arginina Este ejemplo muestra un ejemplo de la presente invención aplicado a la producción de L-arginina mediante una bacteria corineforme. Se utilizó la Coryneba cteri um gl utami cum AJ12092 (FERM BP-6906) como la cepa que produce L- arginina . Primero, como control, los resultados se muestran para la producción de L-arginina realizada con la misma cepa al adicionar sulfato de amonio, y sin controlar la concentración de amoníaco total, pero controlando el pH, similar a unos métodos comunes para la producción de un aminoácido básico. Un medio para la producción de L-arginina que tiene la composición mostrada en la Tabla 6, con la adición de 65 g/L de sulfato de amonio, también, la concentración de glucosa se cambió a 40 g/L. 300 ml de este medio se colocaron en un frasco fermentador y el pH se controló para ser 7.0 al burbujear el gas de amoniaco. A este medio, dos placas de células obtenidas mediante el cultivo de la cepa Coryneba cteri um gl utami cum AJ12092 sobre la
superficie completa del medio de agar CM-Dex a 31.5°C durante 24 horas se inocularon. El cultivo se realizó a una temperatura del medio mantenida a 31.5°C con aireación de 150 ml por minuto del aire esterilizado de filtro y la agitación a una proporción de 700 rpm. Además, durante el cultivo, el pH se controló para ser 6.9 al adicionar una solución 6N de KOH que había sido esterilizada separadamente. Conforme el cultivo progresa, la concentración de glucosa disminuye. A fin de mantener la concentración de glucosa de 30 a 40 g/L, se adicionó apropiadamente una solución de glucosa separadamente esterilizada de 692 g/L. El cultivo se realizó durante 54 horas. Como resultado, 23.4/L de L-arg nina se acumularon, el rendimiento de producción de la L-arginina fue de 26.7% de la glucosa consumida, y la proporción de producción fue de 0.43 g/L/hr. La cantidad de la glucosa consumida durante el cultivo fue de 29.1 g por lote. La producción de la L-arginina cuando el sulfato de amonio no se adiciona al medio, y mientras que controla únicamente la concentración de amoníaco total, pero no el pH se realizó. Los resultados se muestran después en la presente. 300 ml del medio de producción de L-arginina que tiene la composición mostrada en la Tabla 6 pero que no contiene sulfato de amonio se colocó en un frasco fermentador, y la concentración de amoníaco total se ajustó a 12.6 mM al burbujear el gas de amoníaco. A este medio, dos
placas de células de la cepa que produce L-arginina cultivadas en la misma manera como aquellas del control se inocularon. El cultivo se realizó de la misma manera como aquel del control con el mantenimiento de la temperatura a 31.5°C, la aireación 150 ml por minuto de aire esterilizado de filtro, y el mantenimiento de la proporción de agitación a 700 rpm. Al medir la concentración de amoníaco total del medio periódicamente o utilizando un aparato que controla la concentración de amoníaco, el amoníaco total en el medio se controló de modo que estuvo en varios niveles durante el cultivo. Como resultado, se confirmó que la concentración de amoníaco total en el medio controlado para ser aproximadamente 20 mM al adicionar gas de amoníaco como es requerido proporcionó resultados favorables. El cultivo realizado con el control de la concentración de amoníaco total en el medio para ser aproximadamente 200 mM basado en el resultado anterior favorablemente progresado, 24.2 g/L de L-argimna se acumuló después de 51 horas, y así la fermentación de L-argimna se logró (Fig. 4). La glucosa consumida durante el cultivo fue de 35.1 g por lote, el rendimiento de producción de la L-argimna fue de 20.6% de la glucosa consumida, y la proporción de producción fue de 0.47 g/L/hr. Además, el pH del medio se incrementó de 7.92 en el inicio en el cultivo a 8.02 en el final del cultivo. A partir de la comparación de estos resultados con
aquellos del experimento de control, se demostró que la producción de L-argimna mediante la fermentación podría ser realizada si la adición de sulfato de amonio o cloruro de amonio en un rendimiento de aproximadamente 77% y una proporción de producción más alta por aproximadamente 9% comparada con aquella obtenida en la producción fermentativa común en la que el sulfato de amonio se adicionó. Tabla 6: Composición del medio de producción de L-arginina (por 1 L)
El medio se ajustó a un pH de 7.0 con solución acuosa de hidróxido de potasio, hasta 1 L, y se esterilizó mediante el autoclave a 115°C durante 10 minutos. Explicación del Listado de Secuencias SEQ ID NO: 1: Secuencia del cebador para la clonación del gen
lysC SEQ ID NO: 2: Secuencia del cebador para la clonación del gen lysC, SEQ ID NO: 3: Secuencia del cebador para la clonación del gen lysE SEQ ID NO: 4: Secuencia del cebador para la clonación del gen lysE SEQ ID NO: 5: Secuencia del nucleótido del gen lycC* y la secuencia de aminoácidos de una subunidad a de la aspartoqumasa desensibilizada de inhibición SEQ ID NO: 6: Secuencia de aminoácido de una subunidad a de la aspartoqumasa desensibilizada de inhibición SEQ ID NO: 7: Secuencia de nucleótidos del gen lycC* y la secuencia de aminoácidos de una subunidad ß de la aspartoquinasa desensibilizada de inhibición SEQ ID NO: 8: Secuencia de aminoácidos de una subunLdad ß de la aspartoqumasa desensibilizada de inhibición SEQ ID NO: 9: Secuencia del nucleótido del gen lysE y la secuencia de aminoácidos de la proteína LysE SEQ ID NO: 10: Secuencia de aminoácidos de la proteína LysE SEQ ID NO: 11: Cebador para la interrupción del gen cadA SEQ ID NO: 12: Cebador para la interrupción del gen cadA SEQ ID NO: 13: Cebador para la interrupción del gen ldc SEQ ID NO: 14: Cebador para la interrupción del gen ldc SEQ ID NO: 15: Secuencia de nucleotidos del gel cadA y la
secuencia de aminoácidos de la lisina descarboxilasa SEQ ID NO: 16: Secuencia de aminoácidos de lisina de descarboxilasa ( cadA) 5EQ ID NO: 17: Secuencia de nucleótidos del gen Idx y la secuencia de aminoácidos de la lisina descarboxilasa SEQ ID NO: 16: Secuencia de aminoácidos de la lisina de descarboxilasa ( ldc) Campo de Aplicación Industrial De acuerdo a la presente invención, se puede producir una sustancia básica mediante la fermentación aun a un pH alto, lo cual permite la reducción de las cantidades de materiales en bruto industriales tales como sulfato de amonio, sin degradar sustancialmente los desempeños esencialmente obtenidos en los métodos de cultivo comunes convencionales tales como productividad. Aunque el caldo de fermentación obtenido mediante el método de la presente invención contiene iones de carbonato y/o iones de bicarbonato, estos se emiten fácilmente en el aire mediante el calentamiento, y por lo tanto un caldo de fermentación o producto de fermentación con una cantidad grande de la sustancia básica presente como un sólido se puede obtener. Además, cuando la purificación es necesaria, si un ácido más fuerte que el ácido carbónico se adiciona al caldo de fermentación, el carbonato se puede reemplazar fácilmente con el ácido más fuerte sin realizar el
intercambio de iones, que se realiza usualmente en los métodos de producción convencionales. Además, los cristales de clorhidrato de lisina se pueden obtener directamente mediante la concentración del caldo de fermentación.