DE60120619T2

DE60120619T2 - Verfahren zur Herstellung einer Zielsubstanz durch Fermentation

Info

Publication number: DE60120619T2
Application number: DE60120619T
Authority: DE
Inventors: c/o Ajinomoto Co. Akira Kawasaki-ku Kawasaki-shi Imaizumi; c/o Ajinomoto Co. Yoshihiro Kawasaki-ku Kawasaki-shi Usuda; c/o Ajinomoto Co. Shinichi Kawasaki-ku Kawasaki-shi Sugimoto
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2000-12-22
Filing date: 2001-12-21
Publication date: 2007-06-14
Anticipated expiration: 2021-12-22
Also published as: EP1217076A1; EP1217076B1; BR0106255A; US20020155556A1; DE60120619D1; ATE330022T1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft die Fermentationsindustrie. Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur effizienten Produktion einer L-Aminosäure durch Fermentation unter Einsatz eines Mikroorganismus.
Stand der Technik
In Escherichia coli verringert sich die Proteintranslationsaktivität während des Übergangs von der Wachstumsphase in die stationäre Phase. Man geht davon aus, dass dieses Phänomen auf die Dimerisierung von intrazellulären Ribosomen zurückzuführen ist. Als ein Protein, das an dieser Ribosomendimerisierung beteiligt ist, wurde das RMF-Protein gefunden, das ein kleines Protein mit 55 Aminosäureresten ist und ein Molekulargewicht von 6,5 kDa hat (Wada et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, S. 2657–2661, 1990).
Das für das RMF-Protein codierende rmf-Gen ist an der Position bei 21,8 Minuten auf dem Escherichia-coli-Chromosom lokalisiert. Es zeigte sich, dass die Expression des rmf-Gens in der logarithmischen Wachstumsphase, in der die Zellen rasch wachsen, supprimiert wird, dass die Expression während des Übergangs in die stationäre Phase während einer Periode mit geringer Wachstumsrate induziert wird und dass die Expression dieses Gens durch den OS-Faktor nicht reguliert wird, der bekanntlich für die Expression von spezifischen Genen der stationären Phase verantwortlich ist (Yamagishi et. al., The EMBO Journal, 12, S. 625–630, 1993). Es wurde auch berichtet, dass die Ausschaltung des rmf-Gens dazu führt, dass Ribosomendimere auch in der stationären Phase als Phänotyp auftreten und die Überlebensrate in der stationären Phase gesenkt wird (Yamagishi et al., The EMBO Journal, 12, S. 625–630, 1993). Des Weiteren wurde berichtet, dass ein Stamm, in dem dieses Gen überexprimiert wird, nicht wachsen kann (Wada et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 214, S. 410–417, 1995), und es besteht die starke Vermutung, dass dieses Gen ein Faktor ist, der am Wachstum von Escherichia-coli-Bakterien und deren Überleben in der stationären Phase beteiligt ist.
Chou Chih-Hsiung et al.: "Genetic manipulation of stationaryphase genes to enhance recombinant protein production in Escherichia coli" (Biotechnology and Bioengineering, Vol. 50, Nr. 6, 1996, S. 636–624, XP002192962 ISSN: 0006-3592) offenbart die Manipulation des rmf-Gens zur Erhöhung der Produktion von rekombinantem Protein in Escherichia coli.
Es gibt jedoch keinen Bericht über die Verbesserung des Wachstums oder die Verbesserung der Substanzproduktion unter den Bedingungen einer geringen Wachstumsrate bezüglich des rmf-Gens.
Offenbarung der Erfindung
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, die Produktionseffizienz oder die Produktionsrate bei der Produktion einer nützlichen Substanz durch Fermentation unter Einsatz von Escherichia-coli-Bakterien.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben eingehende Untersuchungen durchgeführt, um das vorstehend genannte Ziel zu erreichen, und sie haben als Ergebnis einen globalen Faktor, der in der stationären Phase exprimiert wird, gefunden, und sie haben gefunden, dass die Substanzproduktion durch Escherichia-coli-Bakterien durch Modifizieren dieses Gens verbessert werden konnte. Genauer gesagt haben sie das rmf-Gen als ein Gen identifiziert, das in der stationären Phase von E scherichia coli eine deutlich erhöhte Expression zeigt, indem sie ein Genexpressionsanalyseverfahren auf der Grundlage des DNA-Array-Verfahrens effektiv ausnutzten (H. Tao, C. Bausch, C. Richmond, F. R. Blattner, T. Conway, Journal of Bacteriology, 181, S. 6425–6440, 1999). Sie haben außerdem gefunden, dass die Ausschaltung des rmf-Gens das Wachstum in der stationären Phase und die Fähigkeit zur Produktion einer L-Aminosäure verbesserte. Auf diese Weise haben sie die vorliegende Erfindung gemacht.
Das heißt, die vorliegende Erfindung stellt Folgendes bereit.

(1) Ein Verfahren zur Produktion einer L-Aminosäure durch Verwendung eines Mikroorganismus, welches die Stufen umfasst, bei denen ein zu Escherichia coli gehörendes Bakterium in einem Medium kultiviert wird, wobei die Aminosäure in dem Medium oder den Zellen des Bakteriums hergestellt und angehäuft wird, und die L-Aminosäure gewonnen wird, wobei (1) die Transkription oder Translation eines rmf-Gens des zu Escherichia coli gehörenden Bakteriums inhibiert ist, wodurch ein RMF-Protein, welches das Genprodukt des rmf-Gens ist, nicht produziert wird oder die Produktion des RMF-Proteins verringert ist, oder (2) ein RMF-Protein mutiert ist, wodurch die ursprüngliche Funktion des RMF-Proteins beeinträchtigt oder ausgeschaltet ist.
(2) Das Verfahren nach (1), wobei das RMF-Protein in dem zu Escherichia coli gehörenden Bakterium aufgrund der Störung des rmf-Gens auf dem Chromosom des Bakteriums nicht normal funktioniert.
(3) Das Verfahren nach (1) oder (2), wobei die L-Aminosäure L-Lysin ist.

Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung eingehender beschrieben.
Das zu Escherichia coli gehörende Bakterium, das in der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, ist nicht besonders eingeschränkt, solange es ein Mikroorganismus ist, der zu Escherichia coli gehört und die Fähigkeit zur Produktion einer L-Aminosäure hat. Im Speziellen können die in Neidhardt et al. (Neidhardt, F. C. et al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D. C., 1208, Table 1) genannten Bakterien eingesetzt werden.
Beispiele von Aminosäuren umfassen L-Lysin, L-Threonin, L-Homoserin, L-Glutaminsäure, L-Leucin, L-Isoleucin, L-Valin und L-Phenylalanin.
Zu Escherichia coli gehörende L-Lysin-produzierende Bakterien sind beispielsweise Mutanten mit einer Resistenz gegen ein L-Lysin-Analogon. Das L-Lysin-Analogon inhibiert das Wachstum der zu der Gattung Escherichia gehörenden Bakterien, diese Inhibition wird jedoch vollständig oder teilweise ausgeschaltet, wenn L-Lysin gleichzeitig in dem Medium vorhanden ist. Beispiele von L-Lysin-Analoga umfassen Oxalysin, Lysinhydroxamat, S-(2-Aminoethyl)-L-cystein (AEC), γ-Methyllysin, α-Chlorcaprolactam und so weiter. Mutanten mit einer Resistenz gegen diese Lysin-Analoga können dadurch erhalten werden, dass Bakterien der Gattung Escherichia einer herkömmlichen künstlichen Mutagenesebehandlung unterworfen werden. Spezifische Beispiele von Bakterienstämmen, die für die Produktion von L-Lysin eingesetzt werden, umfassen Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; siehe die offengelegte Japanische Patentanmeldung (Kokai) Nr. 56-18596 und das US-Patent Nr. 4,346,170) und Escherichia coli VL611. In diesen Mikroorganismen ist die Rückkopplungshemmung von Aspartokinase durch L-Lysin ausgeschaltet.
Neben den vorstehend genannten Bakterien können beispielsweise die nachstehend beschriebenen L-Threonin-produzierenden Bakterien genannt werden, weil die Inhibition von Aspartokinase durch L-Lysin im Allgemeinen auch in L-Threonin-produzierenden Bakterien ausgeschaltet ist.
In den nachstehend beschriebenen Beispielen wurde der Stamm WC196 als L-Lysin-produzierendes Bakterium von Escherichia coli eingesetzt. Der Bakterienstamm wurde dadurch gezüchtet, dass die AEC-Resistenz auf den Stamm W3110 übertragen wurde, der von Escherichia coli K-12 abgeleitet ist. Dieser Stamm wurde als Stamm Escherichia coli AJ13069 bezeichnet und wurde am 6. Dezember 1994 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (derzeit National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM P-14690. Dann wurde der Stamm unter den Vorschriften des Budapester Abkommens am 29. September 1995 in eine internationale Hinterlegung überführt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM BP-5252 (vergleiche die Internationale Patentveröffentlichung WO96/17930).
Beispiele von zu Escherichia coli gehörenden L-Threonin-produzierenden Bakterien umfassen Escherichia coli VKPM B-3996 (RIA 1867) (vergleiche das US-Patent Nr. 5,175,107), den Stamm MG442 (vergleiche Gusyatiner et al., Genetika (auf Russisch), 14, S. 947–956, 1978) und so weiter.
Beispiele von zu Escherichia coli gehörenden L-Homoserin-produzierenden Bakterien umfassen den Stamm NZ10, der eine Leu⁺-Revertante des Stammes C600 ist (vergleiche Appleyard R. K., Genetics, 39, S. 440–452, 1954).
Beispiele von zu Escherichia coli gehörenden L-Glutaminsäure-produzierenden Bakterien umfassen den Stamm AJ12624 (FERM BP-3853, vergleiche die offengelegte Französische Patentanmeldung Nr. 2,680,178) und L-Valin-resistente Stämme, wie Escherichia coli B11, Escherichia coli K-12 (ATCC10798), Escherichia coli B (ATCC11303) und Escherichia coli W (ATCC9637).
Beispiele von zu Escherichia coli gehörenden L-Leucin-produzierenden Bakterien umfassen Bakterienstämme mit β-2-Thienylalaninresistenz, Bakterienstämme mit β-2-Thienylalaninresistenz und β-Hydroxyleucinresistenz (vergleiche die Japanische Patentveröffentlichung (Kokoku) Nr. 62-34397) und Bakterienstämme mit 4-Azaleucinresistenz oder 5,5,5-Trifluorleucinresistenz (offengelegte Japanische Patentanmeldung (Kokai) Nr. 8-70879). Im Speziellen kann der Stamm AJ11478 genannt werden (FERM P-5274, vergleiche die Japanische Patentveröffentlichung (Kokoku) Nr. 62-34397).
Beispiele von zu Escherichia coli gehörenden L-Isoleucin-produzierenden Bakterien umfassen Escherichia coli KX141 (VKPM B-4781, vergleiche die Europäische Patentveröffentlichung Nr. 519,113).
Beispiele von zu Escherichia coli gehörenden L-Valin-produzierenden Bakterien umfassen Escherichia coli VL1970 (VKPM B-4411, vergleiche die Europäische Patentveröffentlichung Nr. 519,113).
Beispiele von L-Phenylalanin-produzierenden Bakterien umfassen Escherichia coli AJ12604 (FERM BP-3579, vergleiche die Europäische Patentveröffentlichung Nr. 488,424).
Außerdem können zu Escherichia coli gehörende Bakterien mit der Fähigkeit zur Produktion von L-Aminosäuren auch durch Einführen von DNA mit genetischer Information, die an der Biosynthese von L-Aminosäuren beteiligt ist, und durch Erhöhen der Fähigkeit unter Einsatz eines Genrekombinationsverfahrens gezüchtet werden. Beispielsweise können für L-Lysin-produzierende Bakterien einzuführende Gene genannt werden, beispielsweise Gene, die für Enzyme des Biosyntheseweges von L-Lysin codieren, wie für Phosphoenolpyruvatcarboxylase, Aspartokinase, Dihydrodipicolinatsynthetase, Dihydrodipicolinatreduktase, Succinyldiaminopimelattransaminase und Succinyldiaminopimelatdeacylase. Im Fall eines Gens für ein Enzym, das einer Rückkopplungshemmung durch L-Asparaginsäure oder L-Lysin unterliegt, wie Posphoenolpyruvatcarboxylase oder Aspartokinase und Dihydrodipicolinatsynthetase, ist es wünschenswert, ein mutiertes Gen einzusetzen, das für ein Enzym codiert, bei dem eine solche Inhibition ausgeschaltet ist.
Als L-Glutaminsäure-produzierende Bakterien können beispielsweise einzuführende Gene genannt werden, die beispielsweise für Glutamatdehydrogenase, Glutaminsynthetase, Glutamatsynthase, Isocitratdehydrogenase, Aconitathydratase, Citratsynthase, Phosphoenolpyruvatcarboxylase, Pyruvatdehydrogenase, Pyruvatkinase, Phosphoenolpyruvatsynthase, Enolase, Phosphoglyceromutase, Phosphoglyceratkinase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Triosephosphatisomerase, Fructose-bisphosphataldolase, Phosphofructokinase, Glucosephosphatisomerase und dergleichen codieren.
Als L-Valin-produzierende Bakterien können als einzuführende Gene beispielsweise das ilvGMEDA-Operon, vorzugsweise ein ilvGMEDA-Operon genannt werden, das die Threonindeaminaseaktivität nicht exprimiert und worin die Attenuation gelöscht ist (vergleiche die offengelegte Japanische Patentanmeldung (Kokai) Nr. 8-47397).
Außerdem kann die Aktivität eines Enzyms, welches eine Reaktion zur Produktion einer anderen Verbindung als die Zielaminosäure durch Abzweigen von dem Biosyntheseweg für die L-Aminosäure katalysiert, verringert oder ausgeschaltet sein. Beispiele eines solchen Enzyms, das eine Reaktion zur Produktion einer anderen Verbindung als L-Lysin durch Abzweigen von dem Biosyntheseweg von L-Lysin katalysiert, umfassen Homoserindehydrogenase (vergleiche die veröffentlichte Internationale Patentanmeldung WO95/23864). Außerdem umfassen Beispiele eines Enzyms, das eine Reaktion zur Herstellung einer anderen Verbindung als L-Glutaminsäure durch Abzweigen von dem Biosyntheseweg von L-Glutaminsäure katalysiert, α-Ketoglutaratdehydrogenase, Isocitratlyase, Phosphatacetyltransferase, Acetatkinase, Acetohydroxysäuresynthase, Acetolactatsynthase, Formiatacetyltransferase, Lactatdehydrogenase, Glutamatdecarboxylase, 1-Pyrrolindehydrogenase und dergleichen.
Außerdem werden zu Escherichia coli gehörende Bakterien mit der Fähigkeit zur Produktion einer Nucleinsäure beispielsweise in der offengelegten Internationalen Patentanmeldung WO99/03988 eingehend beschrieben. Im Speziellen kann der Stamm Escherichia coli FADRaddG-8-3::KQ (purFKQ, purA^–, deoD^–, purR^–, add^–, gsk^–) in dieser Offenlegungsschrift genannt werden. Dieser Stamm hat die Fähigkeit zur Produktion von Inosin und Guanosin. Dieser Stamm enthält ein mutiertes purF-Gen, das für PRPP-Amidotransferase codiert, worin der Lysin rest an der Position 326 durch einen Glutaminrest ersetzt ist und die Rückkopplungshemmung durch AMP und GMP ausgeschaltet ist, und in diesem Stamm sind das Succinyl-AMP-Synthasegen (purA), das Purinnucleosidphosphorylasegen (deoD), das Purinrepressorgen (purR), das Adenosindeaminasegen (add) und das Inosinguanosinkinasegen (gsk) ausgeschaltet. Dieser Stamm erhielt die interne Bezeichnung AJ13334 und wurde am 24. Juni 1997 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (derzeit National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) als internationale Hinterlegung unter den Vorschriften des Budapester Abkommens hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM BP-5993.
Daneben können zu Escherichia coli gehörende Bakterien mit der Fähigkeit zur Produktion anderer Aminosäuren in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.
Beim Züchten von zu Escherichia coli gehörenden Bakterien mit einer solchen Fähigkeit zur Produktion einer L-Aminosäure kann zur Einführung eines Gens in Bakterien von Escherichia zur Erhöhung deren Fähigkeiten ein Verfahren eingesetzt werden, bei dem ein in einer Zelle des zu Escherichia coli gehörenden Bakteriums autonom replizierbarer Vektor an ein Gen ligiert wird, um eine rekombinante DNA herzustellen, und dann Escherichia coli damit transformiert wird. Daneben ist es auch möglich, ein Zielgen in ein Wirtschromosom durch ein Verfahren unter Einsatz von Transduktion, unter Einsatz eines Transposons (Berg, D. E. and Berg, C. M., Bio/Technol. 1, S. 417, 1983), eines Mu-Phagen, (offengelegte Japanische Patent anmeldung (Kokai) Nr. 2-109985) oder einer homologen Rekombination (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab., 1972) einzuverleiben.
Das zu Escherichia coli gehörende Bakterium, das in der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, ist ein Bakterium, das die vorstehend genannte Fähigkeit zur Produktion einer L-Aminosäure hat und worin die Transkription oder Translation des rmf-Gens inhibiert wird und somit das RMF-Protein, das dessen Genprodukt ist, nicht produziert wird oder in geringerem Maße produziert wird, oder das eines Mutation in das hergestellte RMF-Protein eingeführt wird und somit die ursprüngliche Funktion des RMF-Proteins beeinträchtigt oder ausgeschaltet wird. Typische Beispiele des zu Escherichia coli gehörenden Bakteriums, worin das RMF-Protein nicht normal funktioniert, umfassen einen Stamm mit ausgeschaltetem Gen, worin das rmf-Gen auf dem Chromosom mittels Genrekombinationstechniken ausgeschaltet ist, und eine Mutante, worin das funktionelle RMF-Protein nicht mehr produziert wird, weil eine Mutation in eine Expressionskontrollsequenz des rmf-Gens oder in die codierende Region auf dem Chromosom eingeführt worden ist.
Im Folgenden wird ein Beispiel des Verfahrens zum Ausschalten des rmf-Gens auf dem Chromosom mittels Genrekombinationstechnik erklärt. Das rmf-Gen auf dem Chromosom kann durch Transformieren eines zu Escherichia coli gehörenden Bakteriums mit DNA, die ein modifiziertes rmf-Gen enthält, sodass kein normal funktionierendes RMF-Protein produziert wird, indem ein Teil des rmf-Gens herausgenommen wird (rmf-Gen vom Deletionstyp) und durch Bewirken einer Rekombination zwischen diesem rmf-Gen vom Deletionstyp und dem rmf-Gen auf dem Chromosom ausgeschaltet werden. Ein solches Ausschalten durch homo loge Rekombination ist ein etabliertes Verfahren, und es gibt Verfahren unter Verwendung linearer DNA, eines Plasmids, das eine temperatursensitive Replikationskontrollregion enthält, oder dergleichen. Im Hinblick auf die Zuverlässigkeit ist das Verfahren unter Einsatz eines Plasmids, das eine temperatursensitive Replikationskontrollregion enthält, bevorzugt.
Das rmf-Gen auf dem Wirtschromosom kann durch das rmf-Gen vom Deletionstyp wie folgt ersetzt werden. Das heißt, es ist möglich, dass die rekombinante DNA durch Einführen einer temperatursensitiven Replikationskontrollregion, eines mutierten rmf-Gens und eines Markergens, das gegenüber einem Arzneimittel, wie Ampicillin, Resistenz zeigt, hergestellt wird, ein zu Escherichia coli gehörendes Bakterium mit dieser rekombinanten DNA transformiert wird, und der transformante Stamm bei einer Temperatur kultiviert wird, bei der die temperatursensitive Replikationskontrollregion nicht funktioniert, und der Stamm dann in einem Medium, welches das Arzneimittel enthält, kultiviert wird, wobei ein transformierter Stamm erhalten wird, worin die rekombinante DNA in die chromosomale DNA einverleibt worden ist.
Der Stamm, in den die rekombinante DNA wie vorstehend beschrieben in die chromosomale DNA einverleibt ist, bewirkt eine Rekombination mit der rmf-Gensequenz, die ursprünglich auf dem Chromosom vorhanden war, wobei zwei Fusionsgene des chromosomalen rmf-Gens und des rmf-Gens vom Deletionstyp auf beiden Seiten des anderen Teils der rekombinanten DNA in das Chromosom eingefügt werden (Vektorteil, temperatursensitive Replikationskontrollregion und Arzneimittelresistenzmarker). Deshalb exprimiert der transformante Stamm ein normales RMF-Protein, da das normale rmf-Gen in diesem Zustand dominant ist.
Um nur das rmf-Gen vom Deletionstyp auf dem Chromosom aufrechtzuerhalten, wird dann eine Kopie des rmf-Gens von der chromosomalen DNA zusammen mit der Vektorregion (einschließlich die temperatursensitive Replikationskontrollregion und der Arzneimittelresistenzmarker) durch Rekombination der zwei rmf-Gene eliminiert. Zu diesem Zeitpunkt tritt ein Fall auf, bei dem das normale rmf-Gen auf der chromosomalen DNA belassen wird und das rmf-Gen vom Deletionstyp eliminiert wird, und ein Fall, bei dem umgekehrt das rmf-Gen vom Deletionstyp auf der chromosomalen DNA belassen wird und das normale rmf-Gen eliminiert wird. In jedem Fall bleibt die entfernte DNA in der Zelle in der Form eines Plasmids erhalten, wenn der Stamm bei einer Temperatur kultiviert wird, bei der die temperatursensitive Replikationskontrollregion funktioniert. Wenn andererseits der Stamm bei einer Temperatur kultiviert wird, bei der die temperatursensitive Replikationskontrollregion nicht funktioniert, wird ein Plasmid, welches das normale rmf-Gen enthält, aus der Zelle entfernt, wenn das rmf-Gen vom Deletionstyp auf der chromosomalen DNA belassen wird. Durch Bestätigen der Struktur des rmf-Gens in der Zelle durch Kolonie-PCR oder dergleichen kann deshalb ein Stamm erhalten werden, der das rmf-Gen vom Deletionstyp auf der chromosomalen DNA enthält, wobei aus der Zelle das normale rmf-Gen entfernt worden ist.
Als Plasmid mit einer temperatursensitiven Replikationskontrollregion, die in einer Zelle des zu Escherichia coli gehörenden Bakteriums funktioniert, kann pMAN997 (offengelegte Internationale Patentanmeldung WO99/03988) genannt werden, das in den nachstehend beschriebenen Beispielen eingesetzt wurde.
Für die übliche Genrekombination eingesetzte Techniken, wie Verdauung und Ligation von DNA, Transformation, Extraktion von rekombinanter DNA aus einem Transformantenstamm und PCR werden eingehend in der dem Fachmann bekannten Literatur beschrieben, beispielsweise Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 und dergleichen.
Ein Mutantenstamm, bei dem das funktionierende RMF-Protein nicht mehr produziert wird, kann durch Behandeln eines zu Escherichia coli gehörenden Bakteriums durch UV-Bestrahlung oder mit einem Mutagenesemittel, das bei herkömmlichen Mutationsbehandlungen eingesetzt wird, wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) oder salpetrige Säure, erhalten werden.
Eine L-Aminosäure kann durch Kultivieren eines zu Escherichia coli gehörenden Bakteriums, das wie vorstehend beschrieben erhalten wurde und das die Fähigkeit zur Produktion einer L-Aminosäure hat und worin das RMF-Protein nicht normal funktioniert, in einem Medium unter Herstellung und Anhäufung der L-Aminosäure in dem Medium oder der Zelle und durch anschließendes Gewinnen der Zielsubstanz hergestellt werden. In der vorliegenden Erfindung kann die Produktionsrate oder die Produktionseffizienz der L-Aminosäure durch Einsatz eines zu Escherichia coli gehörenden Bakteriums mit den vorstehend genannten Eigenschaften verbessert werden. Dies liegt vermutlich daran, dass, während das rmf-Gen in der stationären Phase der Kultur exprimiert wird und die Proteintranslationsaktivität in einem Wildtypstamm eines zu Escherichia coli gehörenden Bakteriums, welches das rmf-Gen enthält, verringert ist, eine Verringerung der Proteintranslationsaktivität verhindert oder eingeschränkt wird in einem Stamm, in dem das normale RMF-Protein nicht normal funktioniert.
Als für die Kultivierung des zu Escherichia coli gehörenden Bakteriums eingesetztes Medium können in der vorliegenden Erfindung herkömmlich eingesetzte, gut bekannte Medien in Abhängigkeit von der Art des eingesetzten Bakterienstammes oder der L-Aminosäure eingesetzt werden. Das heißt, übliche Medien, die eine Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle, anorganische Ionen und andere organische Komponenten bei Bedarf enthalten, können eingesetzt werden. Für die Durchführung der vorliegenden Erfindung ist kein spezielles Medium erforderlich.
Als Kohlenstoffquelle können Zucker, wie Glucose, Lactose, Galactose, Fructose und Stärkehydrolysat, Alkohole, wie Glycerin und Sorbitol, organische Säuren, wie Fumarsäure, Citronensäure und Bernsteinsäure, und dergleichen eingesetzt werden.
Als Stickstoffquelle können anorganische Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid und Ammoniumphosphat, anorganischer Stickstoff, wie Sojabohnenhydrolysat, Ammoniakgas, wässriges Ammoniak und dergleichen eingesetzt werden.
Die Quelle der organischen Spurenelemente enthält vorzugsweise geeignete Mengen der erforderlichen Substanzen, wie Vitamin B₁, L-Homoserin und L-Tyrosin, Hefeextrakt und dergleichen. Daneben werden bei Bedarf kleine Mengen von Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisenionen, Manganionen und dergleichen zugegeben.
Die Kultivierung kann unter bekannten Bedingungen durchgeführt werden, die üblicherweise in Abhängigkeit von den eingesetzten Bakterienstämmen verwendet werden. Beispielsweise wird die Kultivierung vorzugsweise unter aeroben Bedingungen während 16 bis 120 Stunden durchgeführt. Die Kultivierungs temperatur wird auf 25–45°C kontrolliert, und der pH-Wert wird während der Kultivierung auf 5–8 kontrolliert. Anorganische oder organische, saure oder alkalische Substanzen sowie Ammoniakgas und dergleichen können für die pH-Einstellung eingesetzt werden.
Um eine Zielsubstanz aus dem Medium oder den Zellen nach Beendigung der Kultivierung zu gewinnen ist in der vorliegenden Erfindung kein spezielles Verfahren erforderlich. Das heißt, das Gewinnen der Zielsubstanz kann durch eine Kombination bekannter Verfahren, wie solche, die ein Ionenaustauscherharz, Ausfällung und anderes in Abhängigkeit von der Art der Zielsubstanz einsetzen, durchgeführt werden. Außerdem kann die in den Zellen angehäufte Zielsubstanz aus einem Zellextrakt oder einer Membranfraktion in Abhängigkeit von der Zielsubstanz nach einem physikalischen oder enzymatischen Zerstören der Zelle gewonnen werden. In Abhängigkeit von der Zielsubstanz kann diese als mikrobieller Katalysator oder dergleichen eingesetzt werden, während sie in der Zelle vorhanden ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Produktionsrate oder Produktionseffizienz bei der Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Escherichia-coli-Bakterien verbessert werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt Wachstumsmuster des WC196Δrmf-Stammes, die Ergebnisse von Experimenten sind, die mit zwei Kolonien und jeweils n = 3 für jedes Experimentierfeld durchgeführt wurden. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichungen an (dasselbe gilt für die folgenden Figuren).
2 zeigt die Zuckerverbrauchsmuster des Stammes WC196Δrmf.
3 zeigt die Lysin-Anhäufungsmuster des Stammes WC196Δrmf.
4 zeigt das Wachstum des Stammes WC196Δrmf/pMPI700, erhalten durch Einführen eines Gens einer sauren Phosphatase in den Stamm WC196Δrmf und einem Kontrollstamm.
5 zeigt die Färbungsintensitäten der Banden der sauren Phosphatase, beobachtet bei der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese der rohen Enzymlösungen des Stammes WC196Δrmf/pMPI700 und des Kontrollstammes.
Beste Ausführungsform der Erfindung
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf die Beispiele eingehender beschrieben.
Beispiel 1: Extraktion der Gesamt-RNA aus Escherichia-coli-Zellen und Analyse unter Verwendung eines DNA-Makroarray
Ein Wildtypstamm von Escherichia coli, der Stamm W3110, wurde bei 37°C in 300 ml Medium, das 16 g/l MS-Medium (20 g/l Glucose, 1 g/l KH₂PO₄, 1 g/l MgSO₄, 2 g/l Hefeextrakt, (NH₃)₂SO₄) enthielt, unter Verwendung eines 1 l-Rüttelfermenters kultiviert. Die Kultivierung wurde unter Belüftung bei einer Geschwindigkeit von 150 ml/min durchgeführt, während die Rührgeschwindigkeit so kontrolliert wurde, dass die aufgelöste Sauerstoffkonzentration 5% oder höher war. Außerdem wurde der pH-Wert des Mediums durch Einspeisen von wässrigem Ammoniak auf konstant 6,8 eingestellt, und wenn die Glucose in dem Medium verbraucht war, wurde eine 500 g/l-Glucoselösung einge speist, sodass die Glucosekonzentration in der Kulturbrühe im Bereich von 0,1–10 g/l war.
Getrennt davon wurde der Stamm W3110 bei 37°C unter hin und her Schütteln bei 120 UpM unter Verwendung eines 500 ml-Sakaguchi-Kolbens mit 50 ml Medium kultiviert, welches E-100-Medium enthielt (20 mM NH₄Cl, 2 mM MgSO₄, 40 mM NaHPO₄, 30 mM KH₂PO₄, 0,01 mM CaCl₂, 0,01 mM FeSO₄, 0,01 mM MnSO₄, 5 mM Citronensäure, 50 mM Glucose, 2 mM Thiaminhydrochlorid, 2,5 g/l Casaminosäure (Difco) und 250 mM MES-NaOH (pH 6,8)).
Um die Gesamt-RNA aus Escherichia-coli-Zellen zu extrahieren wurden etwa 1 ml und etwa 10 ml der Kulturbrühen aus dem Rüttelfermenter beziehungsweise dem Kolben während der logarithmischen Wachstumsphase und der stationären Phase der Wachstumskurve als Proben entnommen. Jede Kulturbrühenprobe wurde unmittelbar auf Eis gekühlt und 2 Minuten bei 10000 g in einer gekühlten Zentrifuge zentrifugiert, und der Kulturbrühenüberstand wurde verworfen. Die Gesamt-RNA wurde aus den gewonnenen Zellen unter Verwendung eines Rneasy-Kit, hergestellt von QIAGEN, gemäß der beigefügten Anweisung gewonnen. Es wurde durch Agarosegelelektrophorese bestätigt, dass die erhaltene Gesamt-RNA ohne Zersetzung gewonnen wurde, und die Absorption bei 260 nm wurde gemessen, um die RNA-Konzentration zu bestimmen. Die erhaltene Gesamt-RNA wurde versiegelt und bei –80°C gelagert und dann für die Genexpressionsanalyse unter Verwendung von DNA-Makroarrays eingesetzt.
Es wurde eine Reverse-Transkriptions-Reaktion mit 20 μg der erhaltenen Gesamt-RNA als Matrize, 1 mM von jeweils dATP, dGTP und dTTP und 9,25 MBq [α-³²P] dCTP als Substrat unter Verwendung eines Reverse-Transcriptions-Kits, hergestellt von Promega, unter Bildung markierter cDNA in der logarithmischen Wachstumsphase und der stationären Phase durchgeführt.
Die Hybridisierung wurde unter Verwendung der erhaltenen cDNA als Sonde und der Makroarraymembran Panorama E. coli Gene Arrays, hergestellt von Sigma-Genosys, gemäß dem beigefügten Protokoll durchgeführt. Nach Beendigung der Hybridisierung wurde die Membran gewaschen. Die gewaschene Membran wurde versiegelt und mit einer Fotoplatte, hergestellt von Fuji Photo Film, während 48 Stunden kontaktiert. Danach wurde die Fotoplatte mit dem Analysiergerät FLA-3000G, hergestellt von Fuji Photo Film, gelesen. Die Dichte an jedem Punkt auf dem erhaltenen Bild wurde unter Verwendung eines DNA-Array-Bildanalysesystems AIS (Imaging Research) bestimmt und in ein Expressionsverhältnis umgewandelt, wobei die Genexpressionsprofildaten in der logarithmischen Wachstumsphase und der stationären Phase erhalten wurden.
Aufgrund der erhaltenen DNA-Array-Daten wurde eine Gruppe von Genen, deren Expressionsniveau in der logarithmischen Wachstumsphase niedrig war, jedoch in der stationären Phase höher wurde, aus der Gesamtheit der Gene von Escherichia coli ausgewählt. Das Verhältnis des Expressionsverhältnisses in der stationären Phase zu dem Expressionsverhältnis in der logarithmischen Wachstumsphase wurde für die jeweiligen Gene berechnet, die aus dem Rüttelfermenter und der Kolbenkultur erhalten wurden. Es wurden die Gene extrahiert, die die 20 höchsten Werte zeigten, die durch Multiplizieren der erhöhten Verhältnisse in den Expressionsverhältnissen der zwei Typen von Kulturen erhalten wurden. Unter diesen wurde das rmf-Gen als eines extrahiert, das den höchsten Wert unter den Genen aufwies, deren Funktion bekannt war. Die Änderungen in der Wachstumsrate und der Expressionsrate des rmf-Gens sind in Tabelle 1 gezeigt. Es zeigte sich, dass es ein Gen war, für das eine deutliche Erhöhung der Expression in der stationären Phase sowohl bei der Kultur aus dem Rüttelfermenter als auch bei der Kultur aus dem Kolben beobachtet wurde. Tabelle 1: Beziehung zwischen der Wachstumsrate und der rmf-Genexpressionsmenge unter der jeweiligen Kulturbedingung und in der jeweiligen Kulturphase

*: Relativer Wert in Bezug auf den Wert, der für die Rüttelkultur während 1,5 Stunden erhalten wurde, wobei dieser Wert als 1 genommen wird

Beispiel 2: Ausschalten des rmf-Gens von Escherichia coli und Wirkung auf die L-Lysin-Produktion
Das rmf-Gen von Escherichia coli wurde durch Crossover-PCR ausgeschaltet (vergleiche Link, A. J., Phillips, D., Church, G. M., J. Bacteriol., 179, S. 6228–6237, 1997).
Die Oligonucleotide der SEQ ID NRN: 1 und 2 (Primer 1 und 2) wurden als Primer für die Amplifizierung einer Region von etwa 1 kbp, einschließlich etwa 600 bp einer für den N-Terminus codierenden Region des rmf-Gens und einer Region stromaufwärts davon, synthetisiert, und die Oligonucleotide der SEQ ID NRN: 3 und 4 (Primer 3 und 4) wurden als Primer für die Amplifizierung einer Region von etwa 1 kbp, einschließlich etwa 600 bp einer für den C-Terminus codierenden Region des rmf-Gens und einer Region stromabwärts davon, synthetisiert. Die Primer 2 und 3 wurden so konstruiert, dass sie komplementäre gemeinsame Sequenzen als Teile davon aufwiesen, sodass ein Teil des ORF des rmf-Gens verloren gehen sollte, wenn die amplifizierten Produkte an diesen Teil ligiert werden.
Eine erste PCR wurde unter Verwendung von Kombinationen der Primer 1 und 2 und der Primer 3 und 4 und der genomischen DNA eines Wildtypstammes, hergestellt durch ein herkömmliches Verfahren, nämlich Stamm W3110, als Matrize durchgeführt. Zu diesem Zeitpunkt war das Molverhältnis der Primer 1 und 2 und der Primer 4 und 3 10:1. Eine zweite PCR wurde unter Verwendung des erhaltenen Produkts der ersten PCR als Matrize und der Primer 1 und 4 durchgeführt. Ein DNA-Fragment mit einem rmf-Gen vom Defizienztyp, konstruiert durch die zweite PCR, wurde in den Klonierungsvektor-Kit pGEMT-easy, hergestellt von Promega, gemäß dem beigefügten Protokoll kloniert, wobei der rekombinante Vektor pGEM-R erhalten wurde.
Der Vektor pGEMdR wurde mit EcoRI verdaut, wobei ein DNA-Fragment erhalten wurde, welches das rmf-Gen vom Defizienztyp enthielt. Dieses verdaute Fragment und das temperaturempfindliche Plasmid pMAN997, verdaut mit demselben Enzym und gereinigt (vergleiche die offengelegte Internationale Patentanmeldung WO99/03988), wurden unter Einsatz eines DNA-Ligation-Kit Ver. 2 (Takara Shuzo) ligiert. Das vorstehend genannte Plasmid pMAN997, wurde durch Austauschen des VspI-HindIII-Fragments von pMAN031 (J. Bacteriol., 162, S. 1196, 1985) und dasjenigen von pUC19 (Takara Shuzo) erhalten.
Kompetente Zellen von Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo) wurden mit dem vorstehend genannten Ligationsreaktionsgemisch transformiert, auf eine LB-Agarplatte, die 25 μg/ml Ampicillin enthielt (Meiji Seika, LB + Ampicillin), gegeben und bei 30°C kultiviert, um eine Ampicillin-resistente Kolonie zu selektieren. Die Kolonie wurde bei 30°C in einem Teströhrchen mit LB-Medium, das 25 μg/ml Ampicillin enthielt, kultiviert, und Plasmide wurden aus den Zellen unter Verwendung von Wizard Plus Miniprep (Promega) extrahiert. Diese Plasmide wurden mit EcoRI verdaut, und ein Plasmid, das ein Fragment mit der Ziellänge enthielt, wurde als Plasmid für das Ausschalten von rmf, pMANΔrmf, eingesetzt.
Der Stamm Escherichia coli WC196 wurde mit pMANΔrmf transformiert. Der Stamm WC196 ist ein AEC-resistentes, L-Lysin-produzierendes Escherichia-coli-Bakterium und erhielt die interne Bezeichnung AJ13069 und wurde beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (derzeit National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) unter der Hinterlegungsnummer FERM P-14690 hinterlegt. Dann wurde der Stamm am 29. September 1995 gemäß den Vorschriften des Budapester Abkommens in eine internationale Hinterlegung unter der Nummer FERM BP-5252 überführt (vergleiche die offengelegte Internationale Patentanmeldung WO96/17930).
Der transformierte Stamm wurde bei 30°C auf einer LB + Ampicillinplatte kultiviert, und eine Ampicillin-resistente Kolonie wurde selektiert. Die selektierte Kolonie wurde über Nacht bei 30°C flüssig kultiviert, 10^–3-fach verdünnt und auf eine LB + Ampicillinplatte gegeben, und eine Ampicillin-resistente Kolonie wurde bei 42°C selektiert. Bei dieser Stufe wurde pMANΔrmf in chromosomale DNA einverleibt.
Danach wurde die selektierte Kolonie über eine LB + Ampicillinplatte ausgestrichen und bei 30°C kultiviert, und dann wurde eine geeignete Menge von Zellen in 2 ml LB-Medium suspendiert und bei 42°C während 4–5 Stunden unter Schütteln kultiviert. Die Ampicillinempfindlichkeit oder Ampicillinresistenz wurde durch Ausstreichen einer 10^–5-fach verdünnten Kulturbrühe auf einer LB-Platte, Auftragen mehrerer 100 Kolonien unter den erhaltenen Kolonien auf eine LB-Platte und eine LB + Ampicillinplatte und Untersuchen ihres Wachstums bestätigt. In der chromosomalen DNA von Ampicillin-empfindlichen Stämmen wurde ein Vektorteil von pMANΔrmf und ein normales rmf-Gen, das ursprünglich auf der chromosomalen DNA vorhanden war, oder ein rmf-Gen vom Deletionstyp entfernt. Mehrere Ampicillin-empfindliche Stämme wurden einer Kolonie-PCR ausgesetzt, um einen Stamm zu selektieren, bei dem das rmf-Gen wie gewünscht durch ein Gen vom Deletionstyp ersetzt wurde. Auf diese Weise wurde ein Stamm mit ausgeschaltetem rmf-Gen, nämlich der Stamm WC196Δrmf, aus dem L-Lysin-produzierenden Bakterium Escherichia-coli WC196 erhalten.
Der Stamm mit ausgeschaltetem rmf-Gen WC196Δrmf und dessen Ausgangsstamm WC196 wurden in einem Medium, das 20 mM NH₄Cl, 2 mM MgSO₄, 40 mM NaHPO₄, 30 mM KH₂PO₄, 0,01 mM CaCl₂, 0,01 mM FeSO₄, 0,01 mM MnSO₄, 5 mM Citronensäure, 50 mM Glucose, 2 mM Thiaminhydrochlorid, 2,5 g/l Casaminosäure (Difco) und 250 mM MES-NaOH (pH 6,8) enthielt, unter Verwendung eines konischen Kolbens mit Umlenkblechen mit einem Volumen von 200 ml kultiviert. Die Kulturbrühe wurde in einer Menge von 20 ml bei Beginn der Kultivierung eingesetzt, und die Kultivierung wurde bei 37°C unter Rotationsschütteln bei einer Rotationsgeschwindigkeit von 144 UpM durchgeführt. Das Medium, der Behälter und dergleichen wurden vor der Verwendung autoklaviert.
Die Zelldichte, die Glucosekonzentration und die L-Lysin-Akkumulation in der Kulturbrühe wurden im Zeitverlauf gemessen. Die Zelldichte wurde durch Messen der Trübung bei 600 nm mit einem Spektrofotometer (Beckman) unter Verwendung der mit Wasser auf eine geeignete Dichte verdünnten Kulturbrühe erhalten. Der Kulturbrühenüberstand, der durch Zentrifugation erhalten wurde, wurde mit Wasser auf eine geeignete Konzentration verdünnt, und dann wurde die Glucosekonzentration und die L-Lysin-Konzentration unter Verwendung eines Biotech Analyzers (Sakura Seiki) gemessen. Die Ergebnisse sind in den 1 bis 3 gezeigt. Die Werte der L-Lysin-Anhäufung und des verbleibenden Zuckers nach 17 Stunden der Kultivierung sind ebenfalls gezeigt.
Als Ergebnis wurde erkannt, dass der Stamm mit ausgeschaltetem rmf-Gen im Vergleich zum Kontrollstamm sowohl beim Wachstum (1) als auch bei der Zuckerverbrauchsrate (2) sowie der L-Lysin-Produktionsrate (3) verbessert war.
Tabelle 2: L-Lysin-Produktion des Stammes WC196Δrmf
Beispiel 3: (Nicht vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfasst): Wirkung des Ausschaltens des rmf-Gens von Escherichia coli auf die Proteinproduktion
(1) Einführen eines saure Phosphatase überexprimierenden Plasmids in einen Stamm mit ausgeschaltetem rmf-Gen und Expression desselben.
Der in Beispiel 2 erhaltene Stamm mit ausgeschaltetem rmf-Gen WC196Δrmf und dessen Ausgangsstamm WC196 wurden mit dem Plasmid pMPI700, das ein mutiertes Gen für saure Phosphatase enthielt, transformiert, wobei der Stamm WC196/pMPI700 und der Stamm WC196Δrmf/pMPI700 erhalten wurden. Die mutierte saure Phosphatase ist ein mutiertes Enzym mit einer verringerten 5'-Nucleotidaseaktivität (Phosphatesterhydrolyseaktivität), während eine Nucleosid-5'-phosphatester-produzierende Aktivität (Phosphotransferaktivität) aufrechterhalten bleibt, und worin der Glycinrest 92 und der Isoleucinrest 171 durch einen Asparaginsäurerest beziehungsweise einen Threoninrest ersetzt sind. Das Plasmid pMPI700 ist ein Plasmid, das wie folgt erhalten wird (Applied and Environmental Microbiology, 66 (7), S. 2811–2816, Juli 2000).
Durch Verwendung des Plasmids pMPI501, das ein Gen für saure Phosphatase aus Morganella morganii NCIMB 10466 enthält (offengelegte Japanische Patentanmeldung (Kokai) Nr. 9-37785; US-Patent Nr. 6,010,851), als Matrize wurde das Gen mit einer statistischen Mutation durch Fehler-auslösende PCR eingeführt. Das Fragment des für saure Phosphatase codierenden Gens (EcoRI-HindIII), in das eine Mutation eingeführt worden war, wurde in pUC18 eingeführt, und E. coli JM109 wurde mit dem erhaltenen rekombinanten Plasmid transformiert. Ein transformierter Stamm mit einer Phosphotransferaktivität, die derjenigen von E. coli (pMPI501) äquivalent war, und einer verringerten 5'-Nucleotidaseaktivität, wurde unter den Transformanten erhalten und als JM109 (pMPI600) bezeichnet. Die statistische Mutation wurde unter Einsatz des Plasmids pMPI600, das in diesem Stamm enthalten war, auf ähnliche Weise eingeführt, wobei das Plasmid pMPI700 erhalten wurde.
Der Escherichia-coli-Stamm JM109, der ein Plasmid pMPI505 enthielt, welches ein DNA-Fragment, erhalten durch weiteres Kürzen des Fragments des Gens für saure Phosphatase, enthalten in pMPI501, durch Subklonieren, enthielt, wurde als AJ13143 bezeichnet. Dieser Stamm wurde beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (derzeit National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan), welches eine internationale Hinterlegungsstelle gemäß den Bestimmungen des Budapester Abkommens ist, am 23. Februar 1996 unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-5422 hinterlegt. Ein dem Plasmid pMPI700 ähnliches Plasmid kann durch Einsatz von pMPI505 anstelle von pMPI501 erhalten werden.
Die Stämme WC196/pMPI700 und WC196Δrmf/pMPI700 wurden in LB-Medium, das 100 μg/ml Ampicillin enthielt, unter Verwendung eines 500 ml-Sakaguchi-Kolbens kultiviert. Die Kulturbrühe wurde in einer Menge von 50 ml bei Beginn der Kultivierung eingesetzt, und die Kultivierung wurde bei 37°C unter hin und her Schütteln bei einer Rotationsgeschwindigkeit von 120 UpM durchgeführt. Das Medium, der Behälter, und dergleichen wurden vor der Verwendung autoklaviert. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Zelldichte in der Kulturbrühe gemessen. Die Zelldichte wurde durch Messen der Trübung bei 600 nm mit einem Spektrofotometer (Beckman) unter Verwendung einer mit Wasser auf eine geeignete Dichte verdünnten Kulturbrühe erhalten. Außerdem wurde eine Zellen-enthaltende Kulturbrühe im Zeitverlauf gewonnen, und Zellen wurden durch Zentrifugation gewonnen, in 100 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert, durch Ultraschallbehandlung während 20 Minuten aufgebrochen und erneut zentrifugiert, wobei ein Überstand einer Rohenzymlösung erhalten wurde, der für die Messungen der Proteinkonzentration und der Enzymaktivität der sauren Phosphatase eingesetzt wurde. Die Proteinkonzentration in der Rohenzymlösung wurde durch das Bradford-Verfahren gemessen.
Die Enzymaktivität wurde wie folgt gemessen. Eine enzymatische Reaktion wurde bei 30°C in einem 100 mM MES/KOH-Puffer (pH 6,0) unter Verwendung von 10 mM p-Nitrophenylphosphat als Substrat durchgeführt. Eine Minute nach der Zugabe der Rohenzymlösung wurde das Reaktionsgemisch mit 1/5 Volumen 2 N KOH versetzt, um die Reaktion zu beenden. Nach der Zentrifugation wurde das hergestellte p-Nitrophenolphosphat in dem Überstand quantifiziert. Das hergestellte p-Nitrophenolphosphat wurde durch Messen der Absorption bei 410 nm unter Verwendung eines Spektrofotometers (Beckman) quantifiziert. Außerdem wurde die Enzymaktivität dadurch berechnet, dass ein molarer Absorptionskoeffizient von p-Nitrophenolphosphat von 17,52 mM^–1·cm^–1 angenommen wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Das Wachstum jedes Bakterienstammes während der Kultivierung (OD₆₀₀) ist in 4 gezeigt.
Als Ergebnis wurde erkannt, dass der Stamm mit ausgeschaltetem rmf-Gen im Vergleich zu den Kontrollstämmen sowohl beim Wachstum als auch bei der spezifischen Aktivität sowie bei der Gesamtaktivität pro Volumeneinheit der Kulturbrühe verbessert war (Tabelle 3).
Tabelle 3: Aktivität der sauren Phosphatase in der Rohenzymlösung
Außerdem wurde die vorstehend genannte Rohenzymlösung einer SDS-Gelelektrophorese unter Verwendung eines 15% Polyacrylamidgels unterworfen und mit CYPRO Orange (Bio-Rad) gefärbt, und das Bild des gefärbten Gels wurde mit dem Analysiergerät FLA-3000G, hergestellt von Fuji Photo Film, gelesen. Die Konzentration an jedem Punkt wurde anhand des erhaltenen abgelesenen Bildes unter Verwendung einer Bildanalysesoftware, nämlich Image Gauge, quantifiziert, um die Expression des Zielenzymproteins zu bestätigen und die Expressionsmengen zu vergleichen. Als Ergebnis wurde eine Zielbande nachgewiesen, deren Konzentration die spezifische Aktivität gut widerspiegelte (5).
Sequenzliste

Claims

Verfahren zur Produktion einer L-Aminosäure durch Verwendung eines Mikroorganismus, welches die Stufen umfasst, bei denen ein zu Escherichia coli gehörendes Bakterium in einem Medium kultiviert wird, wobei die L-Aminosäure in dem Medium oder den Zellen des Bakteriums hergestellt und angehäuft wird, und die L-Aminosäure gewonnen wird, wobei (1) die Transkription oder Translation eines rmf-Gens des zu Escherichia coli gehörenden Bakteriums inhibiert ist, wodurch ein RMF-Protein, welches das Genprodukt des rmf-Gens ist, nicht produziert wird oder die Produktion des RMF-Proteins verringert ist, oder (2) ein RMF-Protein mutiert ist, wodurch die ursprüngliche Funktion des RMF-Proteins beeinträchtigt oder ausgeschaltet ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das RMF-Protein in dem zu Escherichia coli gehörenden Bakterium aufgrund der Störung des rmf-Gens auf dem Chromosom des Bakteriums nicht normal funktioniert.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die L-Aminosäure L-Lysin ist.