Aufgabe
der Erfindung ist es, neue Maßnahmen
zur verbesserten fermentativen Herstellung von L-Threonin bereitzustellen.
Beschreibung
der Erfindung
Gegenstand
der Erfindung ist ein Fermentationsverfahren, das dadurch gekennzeichnet
ist, dass man
- a) das Bakterium in mindestens
einem ersten Nährmedium
inokuliert und kultiviert, anschließend
- b) einen Teil der Fermentationsbrühe abtrennt, wobei mehr als
90 Vol.-%, insbesondere mehr als 91 Vol.-%, mehr als 92 Vol.-%,
mehr als 93 Vol.-%, mehr als 94 Vol.-%, mehr als 95 Vol.-%, mehr
als 96 Vol.-%, mehr als 97 Vol.-% oder mehr als 98 Vol.-% und wobei
maximal 99 Vol.-%, 99,3 Vol.-%, 99,6 Vol.-% oder 99,9 Vol.-% des
Gesamtvolumens der Fermentationsbrühe im Fermentationsbehälter verbleiben,
anschließend
- c) die verbleibende Fermentationsbrühe mit einem oder mehreren
weiteren Nährmedien
auffüllt,
wobei das weitere Nährmedium
oder die weiteren Nährmedien
mindestens eine Kohlenstoffquelle, mindestens eine Stickstoffquelle
und mindestens eine Phosphorquelle enthalten, und die Kultivierung
unter Bedingungen die die Bildung von L-Threonin erlauben, fortsetzt,
- d) die Schritte b) und c) gegebenenfalls mehrfach durchführt, und
- e) die Konzentration der Kohlenstoffquelle(n) während der
Kultivierung gemäß Schritt
c) und/oder d) bei maximal 30 g/l eingestellt wird.
Die
Kultivierung des Bakteriums gemäß Schritt
a) erfolgt typischerweise in einem Fermenter (Bioreaktor). Diese
haben im Maßstab
der industriellen Produktion ein Volumen von ca. 10–500 m3 (Kubikmeter). Im Labormaßstab in
dem das erfindungsgemäße Verfahren
auf einfache Weise geprüft
werden kann sind Fermentervolumina von 1–50 l typisch. Im halbtechnischen
Maßstab
sind Fermentervolumina von 50 l bis 10 m3 gebräuchlich.
Unter
dem Begriff Anlagenleistung versteht man, dass in einer Anlage (plant)
wie z. B. einem Fermenter die Masse bzw. Menge eines Produktes mit
einer bestimmten Ausbeute und mit einer bestimmten Geschwindigkeit
bzw. Produktivität
oder Raum-Zeit-Ausbeute hergestellt wird. Diese Parameter bestimmen
weitgehend die Kosten oder die Wirtschaftlichkeit eines Verfahrens.
Unter
einer Fermentationsbrühe
versteht man die durch die Kultivierung eines Mikroorganismus – im Falle
der vorliegenden Erfindung ein L-Threonin produzierendes Bakterium – in einem
Nährmedium
unter Verwendung eines Fermenters entstandene Suspension eines Mikroorganismus.
Erfindungsgemäß kann die
Anlagenleistung einer L-Threonin produzierenden Fermenters dadurch
gesteigert werden, dass man in dem oben beschriebenen ersten Schritt
a) nach dem Satzverfahren (batch) oder Zulaufverfahren (fed batch)
kultiviert, wobei bei Verwendung des Zulaufverfahrens mindestens
ein Zusatz-Nährmedium
eingesetzt wird. In dem beschriebenen Schritt b) wird der Kultur
Fermentationsbrühe
entzogen, wobei weniger als 10 Vol.-%, insbesondere weniger als
9 Vol.-%, weniger als 8 Vol.-%, weniger als 7 Vol.-%, weniger als
6 Vol.-%, weniger als 5 Vol.-%, weniger als 4 Vol.-%, weniger als
3 Vol.-% oder weniger als 2 Vol.-% und wobei als Minimum 1 Vol.-%,
0,7 Vol.-%, 0,4 Vol.-% oder 0,1 Vol.-% des Gesamtvolumens der Fermentationsbrühe abgetrennt
werden. Dementsprechend verbleiben bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
gemäß Schritt
b) mehr als 90 bis maximal 99,9 Vol.-% der Fermentationsbrühe in dem
Fermenter.
Anschließend, im
Schritt c) wird die verbleibende Fermentationsbrühe mit einem oder mehreren
weiteren Nährmedien
bis auf ca. 100 % des ursprünglichen
Volumens aufgefüllt,
wobei das weitere Nährmedium oder
die weiteren Nährmedien
mindestens eine Kohlenstoffquelle, mindestens eine Stickstoffquelle
und mindestens eine Phosphorquelle enthalten, und die Kultivierung
unter Bedingungen fortgesetzt, die die Bildung von L-Threonin erlauben.
Dieser Schritt c) wird gegebenenfalls mehrfach wiederholt. Das gebildete
L-Threonin wird gesammelt und gegebenenfalls gereinigt und isoliert.
Während des
Kultivierungsschrittes a) wird das Bakterium in mindestens einem
ersten Nährmedium inokuliert
und nach dem Satzverfahren (batch) oder Zulaufverfahren (fed batch)
kultiviert. Bei Verwendung des Zulaufverfahrens wird nach mehr als
0 bis maximal 10 Stunden, vorzugsweise nach 1 bis 10 Stunden, bevorzugt
nach 2 bis 10 Stunden und besonders bevorzugt nach 3 bis 7 Stunden
ein Zusatz-Nährmedium
zugeführt.
Das
erste Nährmedium
enthält
als Kohlenstoffquelle eine oder mehrere der Verbindungen ausgewählt aus
der Gruppe Saccharose, Melasse aus Zuckerrüben oder Zuckerrohr, Fruktose,
Glukose, Stärkehydrolysat, Laktose,
Galaktose, Maltose, Xylose, Cellulosehydrolysat, Arabinose, Essigsäure, Ethanol
und Methanol in den Konzentrationen von 1 bis 100 g/kg oder 1 bis
50 g/kg, bevorzugt von 10 bis 45 g/kg, besonders bevorzugt von 20
bis 40 g/kg. Unter Stärkehydrolysat
versteht man erfindungsgemäß das Hydrolysat
von Stärke
aus Mais, Getreide, Kartoffeln oder Tapioka.
Als
Stickstoffquelle im erste Nährmedium
können
organische, Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt,
Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und
Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniak, Ammoniumsulfat,
Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat
Kaliumnitrat, Kaliumnatriumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln
oder als Mischung in den Konzentrationen von 1 bis 40 g/kg, bevorzugt
von 1 bis 30 g/kg oder 10 bis 30 g/kg, besonders bevorzugt von 1
bis 25 g/kg oder 10 bis 25 g/kg, ganz besonders bevorzugt 1 bis
30 g/kg oder 1 bis 25 verwendet werden.
Als
Phosphorquelle im ersten Nährmedium
können
Phosphorsäure,
Alkali- oder Erdalkalisalze der Phosphorsäure, insbesondere Kaliumdihydrogenphosphat
oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natriumhaltigen
Salze, Polymere der Phosphorsäure
oder das Hexaphosphorsäureester
des Inosits, auch Phytinsäure
genannt, oder deren Alkali- oder Erdalkalisalze in den Konzentrationen
von 0,1 bis 5 g/kg, bevorzugt von 0,3 bis 3 g/kg, besonders bevorzugt
von 0,5 bis 1,5 g/kg verwendet werden. Das erste Nährmedium
muss weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z.B. Magnesiumsulfat
oder Eisensulfat, die für
das Wachstum notwendig sind. Diese Substanzen liegen in den Konzentrationen
von 0,003 bis 3 g/kg vor. Schließlich werden essentielle Wuchsstoffe
wie Aminosäuren
(z.B. Homoserin) und Vitamine (z.B. Thiamin) zusätzlich zu den oben genannten
Stoffen eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie
z.B. Fettsäurepolyglykolester
eingesetzt werden.
Das
Zusatz-Nährmedium,
welches in einem Zulaufverfahren (fed batch) angewandt wird, enthält im allgemeinen
lediglich als Kohlenstoffquelle eine oder mehrere der Verbindungen
ausgewählt
aus der Gruppe Saccharose, Melasse aus Zuckerrüben oder Zuckerrohr, Fruktose,
Glukose, Stärkehydrolysat,
Laktose, Galaktose, Maltose, Xylose, Cellulosehydrolysat, Arabinose,
Essigsäure,
Ethanol und Methanol in den Konzentrationen von 300 bis 700 g/kg,
bevorzugt von 400 bis 650 g/kg, und gegebenenfalls eine anorganische
Stickstoffquelle wie z.B. Ammoniak, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid,
Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumnitrat, Kaliumnitrat
oder Kaliumnatriumnitrat. Alternativ können diese und andere Komponenten
auch separat zugefüttert
werden.
Es
wurde gefunden, dass bei dem erfindungsgemäßen Verfahren gemäß Schritt
c) und/oder d) die Bestandteile des weiteren Nährmediums in Form eines einzigen
weiteren Nährmediums
sowie in einer Vielzahl von weiteren Nährmedien der Kultur zugeführt werden
können.
Erfindungsgemäß wird das
weitere Nährmedium
beziehungsweise werden die weiteren Nährmedien in mindestens einem
(1) Zufütterungsstrom
oder in einer Vielzahl an Zufütterungsströmen mindestens
2 bis 10, vorzugsweise 2 bis 7 oder 2 bis 5 Zufütterungsströmen der Kultur zugeführt.
Das
weitere Nährmedium
bzw. die weiteren Nährmedien
enthält/enthalten
als Kohlenstoffquelle eine oder mehrere der Verbindungen ausgewählt aus
der Gruppe Saccharose, Melasse aus Zuckerrüben oder Zuckerrohr, Fruktose,
Glukose, Stärkehydrolysat,
Maltose, Xylose, Cellulosehydrolysat, Arabinose, Essigsäure, Ethanol
und Methanol in den Konzentrationen von 20 bis 700 g/kg, bevorzugt
von 50 bis 650 g/kg.
Weiterhin
enthält
das weitere Nährmedium
bzw. enthalten die weiteren Nährmedien
eine Stickstoffquelle bestehend aus organischen, Stickstoff-haltigen
Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt,
Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische
Verbindungen wie Ammoniak, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat,
Ammoniumcarbonat, Ammoniumnitrat und/oder Kaliumnitrat oder Kaliumnatriumnitrat.
Die Stickstoffquellen können
einzeln oder als Mischung in den Konzentrationen von 5 bis 50 g/kg,
bevorzugt von 10 bis 40 g/kg, verwendet werden.
Weiterhin
enthält
das weitere Nährmedium
bzw. enthalten die weiteren Nährmedien
eine Phosphorquelle bestehend aus Phosphorsäure oder den Alkali- oder Erdalkalisalzen
der Phosphorsäure,
insbesondere Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat
oder die entsprechenden Natriumhaltigen Salze, Polymere der Phosphorsäure oder
das Hexaphosphorsäureester
des Inosits, auch Phytinsäure
genannt, bzw. die entsprechenden Alkali- oder Erdalkalisalze. Die
Phosphorquellen können
einzeln oder als Mischung in den Konzentrationen von 0,3 bis 3 g/kg,
bevorzugt von 0,5 bis 2 g/kg verwendet werden. Das weitere Nährmedium bzw.
die weiteren Nährmedien
muss/müssen
weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z.B. Magnesiumsulfat oder
Eisensulfat, die für
das Wachstum notwendig sind, in den Konzentrationen von 0,003 bis
3 g/kg, bevorzugt in den Konzentrationen von 0,008 bis 2 g/kg. Schließlich werden
essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren (z.B. Homoserin) und Vitamine
(z.B. Thiamin) zusätzlich
zu den oben genannten Stoffen eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung
können
Antischaummittel wie z.B. Fettsäurepolyglykolester
eingesetzt werden.
Bei
Verwendung eines einzigen weiteren Nährmediums wird dieses typischerweise
in einem Zufütterungsstrom
der Kultur zugeführt.
Bei Verwendung einer Vielzahl weiterer Nährmedien werden diese in einer entsprechenden
Vielzahl an Zufütterungsströmen zugeführt. Bei
der Verwendung einer Vielzahl weiterer Nährmedien ist zu beachten, dass
diese jeweils nur eine der beschriebenen Kohlenstoff-, Stickstoff-,
oder Phosphorquellen enthalten können,
aber auch eine Mischung von den beschriebenen Kohlenstoff-, Stickstoff-,
oder Phosphorquellen.
Erfindungsgemäß wird das
zugeführte
weitere Nährmedium
oder die zugeführten
weiteren Nährmedien
so eingestellt, das ein Phosphor zu Kohlenstoffverhältnis (P/C
Verhältnis)
von maximal 4; von maximal 3; von maximal 2; von maximal 1,5; von
maximal 1; von maximal 0,7; von maximal 0,5; maximal 0,48; maximal 0,46;
maximal 0,44; maximal 0,42; maximal 0,40; maximal 0,38; maximal
0,36; maximal 0,34; maximal 0,32; maximal 0,30 mmol Phosphor/mol
Kohlenstoff besteht.
Das
in Schritt b) beschriebene Abtrennen der Fermentationsbrühe geschieht
in weniger als 180 Minuten, vorzugsweise in weniger als 120 Minuten,
besonders bevorzugt in weniger als 60 Minuten und ganz besonders
bevorzugt in weniger als 30 bis weniger als 15 Minuten.
Wird
ein weiteres oder mehrere weitere Nährmedien wie unter Schritt
c) beschrieben zum Auffüllen genutzt,
kann dieses Auffüllen
in Form eines oder mehrerer Sätze
(batch) bzw. Chargen oder kontinuierlich oder einer Kombination
aus beiden Verfahrensweisen erfolgen. Hierbei wird wieder ein Füllstand
von ca. 100 des ursprünglichen
Volumens erreicht. Der Begriff „ca. 100" bedeutet in diesem Zusammenhang, dass
es im Rahmen der technischen Möglichkeiten
zu Schwankungen kommen kann, die beispielsweise dazuführen, dass
auf 97%–103%,
98%–102%,
99%–101%,
99,5%–100,5%
oder 99,9%–100,1%
des ursprünglichen
Volumens aufgefüllt
wird.
Erfolgt
das Auffüllen
in Form eines oder mehrerer Sätze,
geschieht dies erfindungsgemäß schnellstmöglich d.h.
in weniger als 180 Minuten, vorzugsweise in weniger als 120 Minuten,
besonders bevorzugt in weniger als 60 Minuten, besonders bevorzugt
in weniger als 30 Minuten bis weniger als 15 Minuten. Nach dem oben
beschriebenen Auffüllen
auf ca. 100 des ursprünglichen
Volumens erfolgt die Kultivierung bis zum Verbrauch der Kohlenstoffquelle
oder bis zu einem anderen geeigneten Zeitpunkt kurz vor dem vollständigen Verbrauch
der Kohlenstoffquelle, bevor wiederum Fermentationsbrühe gemäß Schritt
b) abgelassen wird. Zu diesem geeigneten Zeitpunkt beträgt die Konzentration
der Kohlenstoffquelle > 0
bis ≤ 5 g/l, > 0 bis ≤ 3 g/l, > 0 bis ≤ 2 g/l, > 0 bis ≤ 2 g/l, > 0 bis ≤ 1 g/l, > 0 bis ≤ 0,5 g/l.
Beim
kontinuierlichen Auffüllen
erfolgt das Auffüllen
mit einem oder mehreren weiteren Nährmedien unter fortwährender
Kultivierung der Fermentationsbrühe
bis der Füllstand
von annähernd
100 wieder erreicht ist. Die Fermentationsbrühe wird so lange weiterkultiviert
bis die Kohlenstoffquelle verbraucht oder nahezu (siehe oben) verbraucht
ist.
Bei
der Kombination aus beiden Verfahrensweisen werden ein oder mehrere
weitere Nährmedien
in Form eines oder mehrer Sätze
schnellstmöglich
zugegeben und anschließend
ein oder mehrere weitere Nährmedien
kontinuierlich unter fortwährender
Kultivierung zugeführt
werden. Die Fermentationsbrühe
wird so lange weiterkultiviert bis die Kohlenstoffquelle verbraucht
oder nahezu (siehe oben) verbraucht ist.
Die
Kultivierung in den Schritten a) und c) erfolgt unter Bedingungen
die die Bildung von L-Threonin erlauben: Während der Kultivierung wird
die Temperatur in einem Bereich von 27 bis 45°C, vorzugsweise 29 bis 42°C, besonders
bevorzugt 33 bis 40°C,
eingestellt. Die Fermentation kann bei Normaldruck oder gegebenenfalls
bei Überdruck,
vorzugsweise bei 0 bis 2,5 bar Überdruck,
besonders bevorzugt bei 0 bis 1,5 bar durchgeführt werden. Der Sauerstoffpartialdruck
wird auf 5 bis 50%, vorzugsweise ca. 20%, Luftsättigung geregelt. Die Regelung
des pH-Wertes auf pH ca. 6 bis 8, vorzugsweise 6,5 bis 7,5 kann
mit 25%igem Ammoniakwasser erfolgen. Die Bedingungen der Kultivierung
können
während
der Kultivierung konstant bleiben oder verändert werden. Ebenso können die
Kultivierungsbedingungen in Schritt a) und c) identisch sein oder
sich unterscheiden.
Die
Wiederholung der Schritte b) und c) gemäß d) erfolgt > (größer) 0 bis
100 mal, bevorzugt 2 bis 90 oder 2 bis 80 mal, besonders bevorzugt
4 bis 70, 4 bis 60, 4 bis 50 oder 4 bis 40 mal und besonders bevorzugt 5
bis 30, 6 bis 30, 7 bis 30, 8 bis 30, 9 bis 30 oder 10 bis 30 mal.
Die
Zeit zwischen Abtrennen von mindestens 0,1 Vol.-% bis weniger als
10 Vol.-% des Gesamtvolumens der Fermentationsbrühe, dem vollständigen Auffüllen auf
ca. 100%, der sich anschließenden
Kultivierung und dem erneuten Abtrennen von Fermentationsbrühe beträgt maximal
10 Stunden oder maximal 5 Stunden, bevorzugt maximal 3 Stunden,
besonders bevorzugt maximal 2 Stunden bis maximal 1 Stunde.
Dementsprechend
erfolgt das Abtrennen der Fermentationsbrühe, das Wiederauffüllen mit
Nährmedium,
die sich anschließende
Kultivierung und das erneute Abtrennen der Fermentationsbrühe mit einer
Geschwindigkeit, die einer mittleren Verweilzeit von kleiner als
100 Stunden oder kleiner als 50 Stunden, bevorzugt kleiner als 30,
ganz besonders bevorzugt kleiner als 20 oder kleiner als 10 Stunden
entspricht. Dabei ist die mittlere Verweilzeit (residence time)
die theoretische Zeit, die Teilchen in einer Kultur verbleiben.
Die mittlere Verweilzeit wird beschrieben durch das Verhältnis des
Flüssigkeitsvolumens
des Reaktors und der Durchflussmenge (Biotechnologie; H. Weide,
J. Páca
und W. A. Knorre; Gustav Fischer Verlag Jena; 1991). Die Durchflussmenge
ist definiert durch das Volumen der abgelassenen Fermentationsbrühe bzw.
das Volumen des zum Auffüllen
verwendeten Nährmediums
oder der weiteren Nährmedien.
Die Füllstandmessung
kann direkt z.B. über
Radarmessung oder indirekt z.B. über
eine Massebestimmung erfolgen.
Erfindungsgemäß wird die
Konzentration der Kohlenstoffquelle während der Kultivierung gemäß Schritt
c) und/oder d) im Allgemeinen bei maximal 30 g/l, bei maximal 20
g/l, bei maximal 10 g/l, bevorzugt bei maximal 5 g/l, besonders
bevorzugt maximal 2 g/l eingestellt. Diese Konzentration wird mindestens
während 75%,
bevorzugt mindestens während
85%, besonders bevorzugt während
mindestens 95% der Zeit der Kultivierung gemäß Schritt b) und/oder c) aufrechterhalten.
Dabei wird die Konzentration der Kohlenstoffquelle anhand von Methoden
bestimmt, die Stand der Technik sind. β-D-Glukose wird z.B. in einem
Glukoseanalysator YSI 02700 Select der Firma Yellow Springs Instruments
(Yellow Springs, Ohio, USA) bestimmt.
Gegebenenfalls
kann die entnommene Kulturbrühe,
gegebenenfalls unter Rührung,
mit Sauerstoff oder einem sauerstoffhaltigen Gas versehen werden
bis die Konzentration der Kohlenstoffquelle unter 2 g/l; unter 1
g/l; oder unter 0,5 g/l sinkt.
In
einem erfindungsgemäßen Verfahren
beträgt
die Ausbeute mindestens 31%; mindestens 33%; mindestens 35%; mindestens
37%; mindestens 40%; mindestens 42%; mindestens 44%; mindestens
46%, mindestens 48%. Dabei ist die Ausbeute definiert als das Verhältnis von
der in einer Kultivierung gesamt gebildeten Menge an L-Threonin
zu der Gesamtmenge der eingesetzten oder verbrauchten Kohlenstoffquelle.
In
einem erfindungsgemäßen Verfahren
wird L-Threonin mit einer Raum-Zeit-Ausbeute von mindestens 1,5
bis 2,5 g/l pro Std., von mindestens 2,5 bis 3,5 g/l pro Std., von
mindestens 2,5 bis mehr als 3,5 g/l pro Std., von mindestens 3,5
bis 5,0 g/l pro Std., von mindestens 3,5 bis mehr als 5,0 g/l pro
Std., oder von mindestens 5,0 bis 8,0 g/l oder mehr pro Std. gebildet.
Dabei ist die Raum-Zeit-Ausbeute
definiert als das Verhältnis
von der in einer Kultivierung gesamt gebildeten Threoninmenge zu
dem Volumen der Kultur über
den gesamten Zeitraum der Kultivierung gesehen. Die Raum-Zeit-Ausbeute
wird auch volumetrische Produktivität genannt.
Naturgemäß wird bei
einem Fermentationsverfahren wie dem erfindungsgemäßen das
Produkt mit einer bestimmten Ausbeute und mit einer bestimmten Raum-Zeit-Ausbeute
(volumetrische Produktivität)
hergestellt. In einem erfindungsgemäßen Verfahren kann L-Threonin
mit einer Ausbeute von mindestens 31% und einer Raum-Zeit-Ausbeute
von mindestens 1,5 bis 2,0 g/l pro Std. hergestellt werden. Weitere
Kopplungen von Ausbeute mit Raum-Zeit-Ausbeute wie beispielsweise
eine Ausbeute von mindestens 37% und eine Raum-Zeit-Ausbeute von
mindestens 2,5 g/l pro. Std. ergeben sich zwanglos aus den obigen
Ausführungen.
Aus
der entnommenen Kulturbrühe
kann das L-Threonin gewonnen, gesammelt oder konzentriert und gegebenenfalls
gereinigt werden.
Es
ist ebenfalls möglich
aus der entnommenen Kulturbrühe
(=Fermentationsbrühe)
ein Produkt herzustellen, indem man die in der Kulturbrühe enthaltene
Biomasse des Bakteriums vollständig
(100) oder nahezu vollständig
d.h. mehr als oder größer als
(>) 90%, >95%, >97%, >99% entfernt und die übrigen Bestandteile der
Fermentationsbrühe
weitgehend d.h. zu 30%–100%,
40%–100%,
50%–100%,
60%–100%,
70%–100%, 80%–100%, oder
90%–100%,
bevorzugt größer gleich
(≥) 50%, ≥60%, ≥70%, ≥80%, ≥90% oder ≥95% oder auch
vollständig
(100) im Produkt belässt.
Zur
Entfernung oder Abtrennung der Biomasse werden Separationsmethoden
wie beispielsweise Zentrifugation, Filtration, Dekantieren, Flockung
oder eine Kombination hieraus eingesetzt.
Die
erhaltene Brühe
wird anschließend
mit bekannten Methoden wie beispielsweise mit Hilfe eines Rotationsverdampfers,
Dünnschichtverdampfers,
Fallfilmverdampfers, durch Umkehrosmose, durch Nanofiltration oder
einer Kombination hieraus eingedickt beziehungsweise konzentriert.
Diese
aufkonzentrierte Brühe
wird anschließend
durch Methoden der Gefriertrocknung, der Sprühtrocknung, der Sprühgranulation
oder durch anderweitige Verfahren zu einem vorzugsweise rieselfähigen, feinteiligen
Pulver aufgearbeitet. Dieses rieselfähige, feinteilige Pulver kann
dann wiederum durch geeignete Kompaktier- oder Granulier-Verfahren in ein
grobkörniges,
gut rieselfähiges,
lagerbares und weitgehend staubfreies Produkt überführt werden. Das Wasser wird
hierbei insgesamt zu mehr als 90% entfernt, sodass der Wassergehalt
im Produkt kleiner als 10%, kleiner als 5% beträgt.
Die
angegebenen Verfahrensschritte müssen
nicht notwendigerweise in der hier aufgeführten Reihenfolge durchgeführt sondern
können
gegebenenfalls in technisch sinnvoller Weise kombiniert werden.
Das
erfindungsgemäße Verfahren
zeichnet sich gegenüber
dem üblichen
fed batch-Verfahren, vor allem durch eine erhöhte Raum-Zeit-Ausbeute aus.
Die
Analyse von L-Threonin und anderen Aminosäuren kann durch Anionenaustauschchromatographie
mit anschließender
Ninhydrin Derivatisierung erfolgen, so wie bei Spackman et al. (Analytical
Chemistry 30: 1190–1206
(1958)) beschrieben, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen,
so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51: 1167–1174 (1979))
beschrieben.
Zur
Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens
sind L-Threonin
produzierende Bakterien der Familie Enterobacteriaceae, ausgewählt aus
den Gattungen Escherichia, Erwinia, Providencia und Serratia geeignet.
Die Gattungen Escherichia und Serratia werden bevorzugt. Bei der
Gattung Escherichia ist insbesondere die Art Escherichia coli und
bei der Gattung Serratia insbesondere die Art Serratia marcescens
zu nennen.
Die
Bakterien enthalten mindestens eine Kopie eines thrA-Gens oder Allels,
das für
eine Threonin-insensitive Aspartatkinase I – Homoserindehydrogenase I
kodiert. In der Literatur wird in diesem Zusammenhang auch von „feed back" resistenten oder
auch von desensibilisierten Varianten gesprochen. Derartige Bakterien
sind typischerweise resistent gegen das Threoninanalogon α-Amino-β-Hydroxyvaleriansäure (AHV) (Shiio
und Nakamori, Agricultural and Biological Chemistry 33 (8), 1152–1160 (1969)).
Biochemische Untersuchungen zu „feed back" resistenten Aspartatkinase I – Homoserindehydrogenase
I Varianten sind beispielsweise bei Cohen et al. (Biochemical and
Biophysical Research Communications 19(4), 546–550 (1965)) und bei Omori
et al. (Journal of Bacteriology 175(3), 785–794 (1993)) beschrieben. Gegebenenfalls
wird die Threonin-insensitive Aspartatkinase I – Homoserindehydrogenase I überexprimiert.
Methoden
der Überexpression
sind im Stand der Technik hinlänglich – beispielsweise
bei Makrides et al. (Microbiological Reviews 60 (3), 512–538 (1996)) – beschrieben.
Durch Verwendung von Vektoren wird die Kopienzahl um mindestens
eine (1) Kopie erhöht.
Als Vektoren können
Plasmide wie beispielsweise in der
US 5,538,873 beschrieben
verwendet werden. Als Vektoren können
ebenfalls Phagen, beispielsweise der Phage Mu, wie in der
EP 0 332 448 beschrieben,
oder der Phage lambda (λ)
verwendet werden. Eine Erhöhung
der Kopienzahl kann auch dadurch erzielt werden, dass eine weitere
Kopie in eine weitere Stelle des Chromosoms – beispielsweise in die attsite
des Phagen λ (Yu
und Court, Gene 223, 77–81
(1998)) – eingebaut
wird. In der
US 5,939,307 wird
beschrieben, dass durch Einbau von Expressionskassetten oder Promotoren
wie beispielsweise tac-Promotor, trp-Promotor, lpp-Promotor oder
P
L-Promotor und P
R-Promotor
des Phagen λ stromaufwärts des
chromosomalen Threoninoperons eine Erhöhung der Expression erzielt
werden konnte. In gleicher Weise können die Promotoren des Phagen
T7, die gear-box-Promotoren oder der nar-Promotor verwendet werden.
Derartige Expressionskassetten oder Promotoren können auch verwendet werden
um, wie in der
EP 0 593 792 beschrieben,
plasmidgebundene Gene zu überexprimieren.
Durch Verwendung des lacI
Q-Allels lässt sich
wiederum die Expression plasmidgebundener Gene kontrollieren (Glascock
und Weickert, Gene 223, 221–231
(1998)). Durch Entfernung des Attenuators des Threonin-Operons (Park
et al., Biotechnology Letters 24, 1815–1819 (2002)) oder durch Verwendung
der thr79-20 Mutation (Gardner, Proceedings of the National Academy
of Sciences, USA 76(4), 1706–1710
(1979))oder durch Mutation des für
die Threonyl-t-RNA-Synthetase
kodierenden thrS-Gens wie bei Johnson et al. (Journal of Bacteriology
129(1), 66–70
(1977) beschrieben kann ebenfalls eine Überexpression erzielt werden.
Durch die beschriebenen Maßnahmen
wird die intrazelluläre
Konzentration der jeweiligen Aspartatkinase I – Homoserindehydrogenase I
Proteinvariante um mindestens 10% im Vergleich zum Ausgangsstamm
erhöht.
Ein
geeignetes thrA-Allel ist in der
US
4,278,765 beschrieben und in Form des Stammes MG442 bei der
Russischen Nationalsammlung für
industrielle Mikroorganismen (VKPM, Moskau, Russland) unter der
Zugangsnummer CMIM B-1628 erhältlich.
Andere geeignete thrA-Allele sind in der WO 00/09660 und WO 00/09661
beschrieben und bei dem Korean Culture Centre of Microorganisms
(KCCM, Seoul, Korea) unter den Zugangsnummern KCCM 10132 und KCCM
10133 erhältlich.
Ein weiteres geeignetes thrA-Allel ist in dem Stamm H-4581 vorhanden,
der in der
US 4,996,147 beschrieben
und unter der Zugangsnummer Ferm BP-1411 beim National Institute
of Advanced Industrial Science and Technology (1-1-1 Higashi, Tsukuba
Ibaraki, Japan) erhältlich
ist. Schließlich
sind weitere thrA-Allele in der
US
3,580,810 beschrieben, welche in Form der bei der ATCC
hinterlegten Stämme
ATCC 21277 und ATCC 21278 erhältlich
sind. Ein weiteres Allel ist in der
US
3,622,453 beschrieben und in Form des Stammes KY8284 unter
der Zugangsnummer ATCC 21272 bei der ATCC erhältlich. Darüber hinaus ist in der WO 02/064808
ein weiteres thrA-Allel
beschrieben und in Form von Stamm pGmTN-PPC12 unter der Zugangsnummer
KCCM 10236 bei der KCCM hinterlegt.
Gegebenenfalls
können
thrA-Allele, die für „feed back" resistente Aspartatkinase
I – Homoserindehydrogenase
I Varianten kodieren, mit den hinlänglich bekannten Methoden der
konventionellen Mutagenese von Zellen unter Verwendung von mutagenen
Stoffen beispielsweise N-methyl-N'-nitro-N-nitroso-guanidin (MNNG) oder Ethylmethansulfonat
(EMS) oder mutagenen Strahlen beispielsweise UV-Strahlen und anschließender Selektion
von Threoninanaloga (beispielsweise AHV) resistenten Varianten isoliert
werden. Derartige Mutagenesemethoden sind beispielsweise bei Shiio
und Nakamori (Agricultural and Biological Chemistry 33 (8), 1152–1160 (1969))
oder bei Saint-Girons und Margerita (Molecular and General Genetics
162, 101–107 (1978))
oder in dem bekannten Handbuch von J. H. Miller (A Short Course In
Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia
coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
New York, USA, 1992) insbesondere auf den Seiten 135 bis 156 beschrieben.
Shiio und Nakamori behandeln beispielsweise eine Zellsuspension
von Escherichia coli für
ca. 15 Minuten mit 0,5 mg/ml MNNG in einem 0,1 M Natriumphosphatpuffer
von pH 7 bei Raumtemperatur (d. h. im Allgemeinen ca. 16 bis 26°C) zur Erzeugung von
Mutationen. Miller empfiehlt beispielsweise eine Behandlung für 5 bis
60 Minuten mit 30 μl
EMS pro 2 ml Zellsuspension in 0,1 M TRIS-Puffer bei pH 7,5 bei
einer Temperatur von 37°C.
Diese Mutagenesebedingungen können
in naheliegender Weise abgeändert
werden. Die Selektion von AHV-resistenten Mutanten erfolgt auf Minimalagar,
der typischerweise 2 bis 10 mM AHV enthält. Die entsprechenden Allele
können
anschließend
kloniert und einer Sequenzbestimmung und die von diesen Allelen
kodierten Proteinvarianten einer Aktivitätsbestimmung unterzogen werden.
Gegebenenfalls können
die erzeugten Mutanten auch direkt verwendet werden. Das Wort „direkt" bedeutet, dass die
erzeugte Mutante für
die Herstellung von L-Threonin in einem erfindungsgemäßen Verfahren
eingesetzt werden kann oder dass an dieser Mutante weitere Veränderungen zur
Erhöhung
der Leistungseigenschaften, wie beispielsweise Abschwächung des
Threoninabbaus oder Überexpression
des Threoninoperons durchgeführt
werden können.
In
gleicher Weise können
auch Methoden der in-vitro Mutagenese verwendet werden wie sie beispielsweise
in dem bekannten Handbuch von Sambrook et al. (Molecular Cloning,
A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, New York, USA, 1989) beschrieben sind. Entsprechende
Methoden sind auch kommerziell in Form sogenannter „kits" wie beispielsweise
der von Papworth et al. (Strategies 9(3), 3–4 (1996)) beschriebene "QuikChange Site-Directed
Mutagenesis Kit" der
Firma Stratagene (La Jolla, USA) verfügbar.
Diese
Mutagenesemethoden können
naturgemäß auch auf
andere Gene, Allele oder Stämme
beziehungsweise Fragestellungen und Aufgaben, wie beispielsweise
der Erzeugung und Isolierung von Mutanten, die gegenüber L-Threonin
resistent sind, angewendet werden.
Bevorzugt
werden solche thrA-Allele, die für
Aspartatkinase I – Homoserindehydrogenase
I Varianten kodieren, die in Gegenwart von 10 mM L-Threonin mindestens
40%, mindestens 45%, mindestens 50%, mindestens 55% oder mindestens
60%, der Homoserin-Dehydrogenase Aktivität und/oder die in Gegenwart
von 1 mM L-Threonin mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 75%
oder mindestens 80%, der Homoserin-Dehydrogenase Aktivität im Vergleich
zur Aktivität
in Abwesenheit von L-Threonin aufweisen. Gegebenenfalls beträgt die Aspartatkinase-Aktivität der genannten
Aspartatkinase I – Homoserindehydrogenase
I Varianten in Gegenwart von 10 mM L-Threonin mindestens 60%, mindestens
65%, mindestens 70%, mindestens 75% bis oder mindestens 80% der
Aktivität
in Abwesenheit von L-Threonin.
Darüber hinaus
sind Bakterien der Familie Enterobacteriaceae geeignet, die ein
Stopkodon ausgewählt
aus der Gruppe opal, ochre und amber, bevorzugt amber im rpoS-Gen
und einen t-RNA-Suppressor ausgewählt aus der Gruppe opal-Suppressor,
ochre-Suppressor und amber-Suppressor,
bevorzugt amber-Suppressor enthalten. Die amber-Mutation liegt vorzugsweise
an der Position 33 entsprechend der Aminosäuresequenz des RpoS-Genproduktes.
Als amber-Suppressor wird vorzugsweise supE eingesetzt. Diese Bakterien
sind in PCT/EP02/02055 beschrieben. Ein Stamm, der die beschriebene
Mutation im rpoS-Gen und den Suppressor supE enthält, ist
unter der Zugangsnummer DSM 15189 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen
und Zellkulturen (Braunschweig, Deutschland) erhältlich.
Die
Nukleotidsequenz des rpoS-Gens kann dem Stand der Technik entnommen
werden. Die Nukleotidsequenz des rpoS- Gens entsprechend der Accession No.
AE000358 ist als SEQ ID NO. 1 dargestellt. Die Aminosäuresequenz
des dazugehörigen
RpoS-Genproduktes bzw. Proteins ist in der SEQ ID NO. 2 dargestellt.
Die Nukleotidsequenz eines rpoS-Allels, das ein Stopkodon vom Typ
amber an der Stelle der Nukleotidsequenz entsprechend Position 33
der Aminosäuresequenz
des RpoS-Genproduktes bzw. Proteins, entsprechend SEQ ID NO. 1 bzw.
SEQ ID NO. 2, enthält,
ist in SEQ ID NO. 3 wiedergegeben. Der Suppressor supE ist im Stand
der Technik beschrieben und als SEQ ID NO. 4 dargestellt.
Darüber hinaus
sind Bakterien der Familie Enterobacteriaceae geeignet, die nicht
in der Lage sind unter aeroben Kulturbedingungen Threonin abzubauen
bzw. als Stickstoffquelle zu verwerten. Unter aeroben Kulturbedingungen
versteht man solche, bei denen der Sauerstoffpartialdruck in der
Fermentationskultur während
90%, bevorzugt 95%, ganz besonders bevorzugt 99% der Fermentationsdauer
größer (>) 0% beträgt. Ein derartiger
Stamm ist beispielsweise der von Okamoto (Bioscience, Biotechnology
and Biochemistry 61(11), 1877–1882
(1997)) beschriebene Stamm KY10935. Stämme, die nicht in der Lage
sind Threonin unter Stickstoffabspaltung abzubauen, besitzen im
Allgemeinen eine abgeschwächte
vom tdh-Gen kodierte Threonin-Dehydrogenase (EC 1.1.1.103). Das
Enzym wurde von Aronson et al. (The Journal of Biological Chemistry 264(9),
5226–5232
(1989)) beschrieben. Abgeschwächte
tdh-Gene sind beispielsweise bei Ravnikar und Somerville (Journal
of Bacteriology, 1986, 168(1), 434–436), in der
US 5,705,371 , in der WO 02/26993 und
bei Komatsubara (Bioprocess Technology 19, 467–484 (1994)) beschrieben.
Ein
geeignetes tdh-Allel ist in der
US
5,538,873 beschrieben und in Form des Stammes B-3996 unter der
Zugangsnummer 1876 bei der Russischen Nationalsammlung für industrielle
Mikroorganismen (VKPM, Moskau, Russland) erhältlich. Ein weiteres tdh-Allel
ist in der
US 5,939,307 beschrieben
und in Form des Stammes kat-13 unter der Zugangsnummer NRRL B-21593
beider Agriculture Research Service Patent Culture Collection (Peoria,
Illinois, USA) erhältlich.
Schließlich
ist ein tdh-Allel in der WO 02/26993 beschrieben und in Form des
Stammes TH21.97 unter der Zugangsnummer NRRL B-30318 bei der NRRL
hinterlegt. Das für
eine defekte Threonin Dehydrogenase kodierende Allel tdh-1::cat1212
ist beim E. coli Genetic Stock Center (New Haven, Conn., USA) unter
der Zugangsnummer CGSC 6945 erhältlich.
Darüber hinaus
sind Bakterien der Familie Enterobacteriaceae geeignet, die eine
mindestens partielle Isoleucin-Bedürftigkeit („leaky"-Phänotyp)
besitzen, welche durch Gabe von L-Isoleucin in einer Konzentration von
mindestens 10, 20 oder 50 mg/l oder L-Threonin in einer Konzentration
von mindestens 50, 100 oder 500 mg/l kompensierbar ist.
Unter
Bedürftigkeit
bzw. Auxotrophie versteht man im Allgemeinen die Tatsache, dass
ein Stamm infolge einer Mutation eine Wildtypfunktion beispielsweise
eine Enzymaktivität
vollständig
verloren hat und zum Wachstum die Zugabe eines Supplementes beispielsweise
eine Aminosäure
benötigt.
Von partieller Bedürftigkeit
oder partieller Auxotrophie spricht man dann, wenn infolge einer
Mutation eine Wildtypfunktion beispielsweise die Aktivität eines
Enzyms aus dem Biosyntheseweg einer Aminosäure beeinträchtigt beziehungsweise abgeschwächt aber
nicht vollständig
ausgeschaltet ist. Stämme
mit partieller Bedürftigkeit
besitzen in Abwesenheit des Supplementes typischerweise eine im
Vergleich zum Wildtyp reduzierte, d.h. größer (>) 0% und kleiner (<) 90%, 50%, 25% oder 10% Wachstumsgeschwindigkeit.
In der Literatur wird dieser Zusammenhang auch als „leaky"-Phänotyp oder „leakyness" bezeichnet (Griffiths
et al.: An Introduction to Genetic Analysis. 6th edition,
1996, Freeman and Company, New York, USA).
Ein
Stamm mit einer derartigen partiellen Isoleucin-Bedürftigkeit
ist beispielsweise in der WO 01/14525 beschrieben und in Form des
Stammes DSM9906 unter der Zugangsnummer KCCM 10168 bei der KCCM
hinterlegt. Threonin ausscheidende bzw. produzierende Stämme mit
einer Isoleucin-Bedürftigkeit
besitzen im Allgemeinen eine abgeschwächte vom ilvA-Gen kodierte
Threonin-Deaminase (E.C. Nummer 4.3.1.19). Die Threonin-Deaminase
ist auch unter dem Namen Threonin-Dehydratase bekannt. Ein abgeschwächtes ilvA-Gen,
das eine partielle Isoleucin-Auxotrophie
bewirkt, ist beispielsweise in der
US
4,278,765 beschrieben und in Form des Stammes MG442, hinterlegt
unter der Zugangsnummer B-1682, bei der VKPM erhältlich.
Ein
weiteres abgeschwächtes
ilvA-Gen ist beispielsweise in der WO 00/09660 beschrieben und in Form
des Stammes DSM 9807, hinterlegt unter der Zugangsnummer KCCM-10132,
bei der KCCM erhältlich. Weitere
abgeschwächte
ilvA-Gene sind bei Komatsubara (Bioprocess Technology 19, 467–484 (1994))
beschrieben.
Die
Aminosäuresequenz
einer geeigneten und neuen Threonin-Deaminase besteht beispielsweise in der
Sequenz von SEQ ID NO. 6 wobei an Position 286 jede Aminosäure außer Glutaminsäure enthalten
sein kann. Bevorzugt wird der Austausch Glutaminsäure gegen
Lysin (E286K).
Mit
dem Begriff „Aminosäure" sind insbesondere
die proteinogenen L-Aminosäuren
einschließlich
ihrer Salze, ausgewählt
aus der Gruppe L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin,
L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin,
L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan, L-Prolin
und L-Arginin gemeint.
In
SEQ ID NO. 8 ist die Aminosäuresequenz
einer Threonin-Deaminase
angegeben, die an Position 286 die Aminosäure Lysin enthält; die
dazugehörige
Nukleotidsequenz ist als SEQ ID NO. 7 dargestellt. Diese enthält an Position
856 die Nukleobase Adenin.
Eine
andere geeignete Threonin-Deaminase ist die von Lee et al. (Journal
of Bacteriology 185 (18), 5442–5451
(2003)) beschriebene Variante, bei der an Position 97 Serin gegen
Phenylalanin (S97F) ausgetauscht ist. Weitere geeignete Threonin-Deaminasen
sind die von Fischer und Eisenstein (Journal of Bacteriology 175
(20), 6605–6613
(1993)) beschriebenen Varianten, welche mindestens einen der Aminosäureaustausche
ausgewählt
aus der Gruppe: Austausch von Asparagin an Position 46 gegen Asparaginsäure (N46D), Austausch
von Alanin an Position 66 gegen Valin (A66V), Austausch von Prolin
an Position 156 gegen Serin (P156S), Austausch von Glycin an Position
248 gegen Cystein (G248C) und Austausch von Asparaginsäure an Position
266 gegen Tyrosin (D266Y) besitzen.
Durch
Insertions- oder Deletions-Mutagenese von mindestens einem Basenpaar
beziehungsweise Nukleotid oder durch Insertion oder Deletion von
mindestens einem Kodon in der Kodierregion oder durch Einbau eines
Stopkodons durch Transitions- oder Transversions-Mutagenese in die
Kodierregion des ilvA-Gens lassen sich Allele isolieren, bei denen
die Expression des ilvA-Gens im Allgemeinen vollständig ausgeschaltet ist.
Diese Methode ist auch auf andere Gene, Allele oder offene Leserahmen
wie beispielsweise das für
die Threonin-Dehydrogenase kodierende tdh-Gen übertragbar.
Darüber hinaus
sind Bakterien der Familie Enterobacteriaceae geeignet, die in ihrem
Wachstum resistent gegenüber
der Hemmung durch L-Threonin und/oder L-Homoserin sind. Threonin-resistente
Stämme
und deren Herstellung sind beispielsweise bei Astaurova et al. (Prikladnaya
Biokhimia Microbiologiya (1985), 21(5), 485 als englische Übersetzung:
Applied Biochemistry and Microbiology (1986), 21, 485–490)) beschrieben.
Die von Austaurova beschrieben Mutante ist gegenüber 40 mg/ml L-Threonin resistent.
Weiterhin ist beispielsweise in der
US
5,175,107 der Stamm 472T23 beschrieben, der in Gegenwart
von 5 mg/ml L-Threonin wachsen kann und gleichzeitig resistent gegen
L-Homoserin ist. Der Stamm 472T232 ist unter der Zugangsnummer BKIIM
B-2307 bei der VKPM und unter der Nummer ATCC 9801 bei der ATCC
erhältlich.
Weiterhin ist in der WO 00/09660 der Stamm DSM 9807 beschrieben,
der auf einem festen Nährboden
wachsen kann, welcher 7% L-Threonin enthält. Der Stamm DSM 9807 ist
unter der Zugangsnummer KCCM-10132 bei der KCCM erhältlich.
Schließlich
ist in der WO 01/14525 der Stamm DSM 9906 beschrieben, der in einem
Medium wachsen kann, das 60% bis 70% einer L-Threonin-Fermentationsmutterlauge
(L-threonine fermentation mother liquid) enthält. Der Stamm DSM 9906 ist
unter der Zugangsnummer KCCM-10168 bei der KCCM erhältlich.
Es
ist bekannt siehe
EP
0994 190 A2 und Livshits et al. (Research in Microbiology
154, 123–135 (2003)),
dass durch Verstärkung
des rhtA-Gens Resistenz gegenüber
L-Threonin und L-Homoserin hervorgerufen wird. Die Verstärkung kann
durch Erhöhung
der Kopienzahl des Gens oder durch Einsatz der rhtA23-Mutation erzielt
werden.
In
der
EP 0 994 190 A2 wird
beschrieben, dass die Verstärkung
des rhtB-Gens Resistenz gegenüber L-Homoserin
und L-Threonin, insbesondere gegen L-Homoserin bewirkt und die Threoninproduktion
verbessert. Durch Überexpression
des RhtB-Genproduktes in einem als N99 bezeichneten Stamm konnte
die minimale Hemmkonzentration von 250 μg/ml auf 30000 μg/ml gesteigert
werden.
In
der
EP 1 013 765 A1 wird
beschrieben, dass eine Verstärkung
des rhtC-Gens Resistenz gegenüber L-Threonin
hervorruft und die Threoninproduktion verbessert. Als resistent
gegenüber
L-Threonin wird ein Stamm bezeichnet, der in Gegenwart einer Konzentration
von mindestens 30 mg/ml L-Threonin auf einem Minimalagar wachsen
kann. Es wird weiterhin beschrieben, dass eine Verstärkung des
rhtB-Gens Resistenz
gegenüber
L-Homoserin bewirkt und die Threoninproduktion verbessert. Als resistent
gegenüber
L-Homoserin wird
ein Stamm bezeichnet, der in Gegenwart einer Konzentration von mindestens
5 mg/ml L-Homoserin auf einem Minimalagar wachsen kann. In der genannten
Patentanmeldung werden Stämme
beschrieben, die resistent gegenüber
10 mg/ml L-Homoserin und resistent gegenüber 50 mg/ml L-Threonin sind.
In der
US 4,996,147 wird
der Stamm H-4581 beschrieben, der gegen 15 g/l Homoserin resistent
ist. Der Stamm H-4581 ist unter der Zugangsnummer FERM BP-1411 beim
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
erhältlich.
In
der
EP 1 016 710 A2 wird
beschrieben, dass eine Verstärkung
des offenen Leserahmen bzw. Gens yfiK oder yeaS Resistenz gegenüber L-Threonin
und L-Homoserin bewirkt. Durch Überexpression
des YfiK-Genproduktes in einem als TG1 bezeichneten Stamm konnte
die minimale Hemmkonzentration bezüglich L-Homoserin von 500 μg/ml auf
1000 μg/ml
und bezüglich
L-Threonin von 30000 μg/ml
auf 40000 μg/ml
gesteigert werden. Durch Überexpression
des YeaS-Genproduktes
konnte die minimale Hemmkonzentration bezüglich L-Homoserin von 500 μg/ml auf
1000 μg/ml
und bezüglich
L-Threonin von 30000 μg/ml
auf 50000 μg/ml gesteigert
werden. In der genannten Patentanmeldung wird weiterhin gezeigt,
dass durch Überexpression
des YfiK-Genproduktes
die Threoninproduktion verbessert wird.
Gemäß diesen
technischen Anleitungen werden Stämme hergestellt die in Gegenwart
von ≥ (mindestens) ≥ 5 g/l, ≥ 10, ≥ 20 g/l, ≥ 30 g/l, ≥ 40 g/l, ≥ 50 g/l, ≥ 60 g/l und ≥ 70 g/l L-Threonin
wachsen können,
d. h. gegenüber
L-Threonin resistent
sind, und für
die Herstellung von L- Threonin
in einem erfindungsgemäßen Verfahren
geeignet sind.
Für das erfindungsgemäße Verfahren
sind insbesondere Stämme
geeignet, die mindestens folgende Merkmale aufweisen:
- a) eine Threonin-insensitive Aspartatkinase I – Homoserindehydrogenase
I, welche gegebenenfalls überexprimiert
vorliegt, und
- b) ein Stopkodon ausgewählt
aus der Gruppe opal, ochre und amber, bevorzugt amber im rpoS-Gen
und einen t-RNA-Suppressor
ausgewählt
aus der Gruppe opal-Suppressor,
ochre-Suppressor und amber-Suppressor, bevorzugt amber-Suppressor.
Für das erfindungsgemäße Verfahren
sind außerdem
insbesondere Stämme
geeignet, die mindestens folgende Merkmale aufweisen:
- a) eine Threonin-insensitive Aspartatkinase I – Homoserindehydrogenase
I, welche gegebenenfalls überexprimiert
vorliegt,
- b) nicht in der Lage sind unter aeroben Kulturbedingungen Threonin
abzubauen, bevorzugt durch Abschwächung der Threonin-Dehydrogenase,
- c) eine mindestens partielle Isoleucin-Bedürftigkeit, und
- d) Wachstum in Gegenwart von mindestens 5 g/l Threonin.
Für das erfindungsgemäße Verfahren
sind ganz besonders Stämme
geeignet, die mindestens folgende Merkmale aufweisen:
- a) eine Threonin-insensitive Aspartatkinase I – Homoserindehydrogenase
I, welche gegebenenfalls überexprimiert
vorliegt,
- b) ein Stopkodon ausgewählt
aus der Gruppe opal, ochre und amber, bevorzugt amber im rpoS-Gen
und einen t-RNA-Suppressor
ausgewählt
aus der Gruppe opal-Suppressor,
ochre-Suppressor und amber-Suppressor, bevorzugt amber-Suppressor,
- c) nicht in der Lage sind unter aeroben Kulturbedingungen Threonin
abzubauen, bevorzugt durch Abschwächung der Threonin-Dehydrogenase,
- d) eine mindestens partielle Isoleucin-Bedürftigkeit, und
- e) Wachstum in Gegenwart von mindestens 5 g/l Threonin.
Darüber hinaus
können
die für
das erfindungsgemäße Verfahren
eingesetzten Bakterien weiterhin eines oder mehrere der folgenden
Merkmale aufweisen:
- • Abschwächung der vom pckA-Gen kodierten
Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (PEP-Carboxykinase) wie beispielsweise
in der WO 02/29080 beschrieben,
- • Abschwächung der
vom pgi-Gen kodierten Phoshoglucose-Isomerase (Froman et al. Molecular and
General Genetics 217(1): 126–31
(1989)).
- • Abschwächung des
vom offenen Leserahmens ytfP kodierten YtfP-Genproduktes wie beispielsweise
in der WO 02/29080 beschrieben,
- • Abschwächung des
vom offenen Leserahmen yjfA kodierten YjfA-Genproduktes wie beispielsweise
in der WO 02/29080 beschrieben,
- • Abschwächung der
vom poxB-Gen kodierten Pruvat-Oxidase wie beispielsweise in der
WO 02/36797 beschrieben,
- • Abschwächung des
vom offenen Leserahmen yjgF kodierten YjgF-Genproduktes wie beispielsweise
in der PCT/EP03/14271 beschrieben. Der yjgF-Orf von Escherichia coli
ist von Wasinger VC. und Humphery-Smith I. (FEMS Microbiology Letters
169(2): 375–382
(1998)), Volz K. (Protein Science 8(11): 2428–2437 (1999)) und Parsons et
al. (Biochemistry 42(1): 80–89
(2003)) beschrieben worden. Die dazugehörigen Nukleotid bzw. Aminosäuresequenzen
sind unter der Zugangsnummer (Accession No.) AE000495 in öffentlichen
Datenbanken verfügbar.
Der besseren Übersichtlichkeit
halber sind diese als SEQ ID NO. 9 und SEQ ID NO. 10 dargestellt.
- • Verstärkung der
von den Genen pntA und pntB kodierten Transhydrogenase wie beispielsweise
in der EP 0 733 712
A1 beschrieben,
- • Verstärkung der
von dem pps-Gen kodierten Phosphoenolpyruvat-Synthase wie beispielsweise
in der EP 0 877 090
A1 beschrieben,
- • Verstärkung der
vom ppc-Gen kodierten Phosphoenolpyruvat-Carboxylase wie beispielsweise
in der EP 0 723 011
A1 beschrieben, und
- • Verstärkung des
vom rseB-Gen kodierten Regulators RseB wie beispielsweise in der EP 1382685 beschrieben.
Der Regulator RseB ist von Missiakas et al. (Molecular Microbiology
24(2), 355–371
(1997)), De Las Penas et al. (Molecular Microbiology 24(2): 373–385 (1997))
und Collinet et al. (Journal of Biological Chemistry 275(43): 33898–33904 (2000))
beschrieben worden. Die dazugehörigen
Nukleotid bzw. Aminosäuresequenzen
sind unter der Zugangsnummer (Accession No.) AE000343 in öffentlichen
Datenbanken verfügbar.
- • Verstärkung des
vom galP-Gen kodierten Galaktose-Proton Symporter's (= Galaktose-Permease)
wie beispielsweise in der DE
10314618.0 beschrieben. Das galP-Gen und seine Funktion
sind von Macpherson et al. (The Journal of Biological Chemistry
258 (7): 4390–4396
(1983)) und Venter et al. (The Biochemical Journal 363(Pt 2): 243–252 (2002))
beschrieben worden. Die dazugehörigen
Nukleotid bzw. Aminosäuresequenzen
sind unter der Zugangsnummer (Accession No.) AE000377 in öffentlichen
Datenbanken verfügbar.
- • Fähigkeit
Saccharose als Kohlenstoffquelle verwenden zu können. Genetische Determinanten
zur Saccharoseverwertung sind im Stand der Technik beispielsweise
in der FR-A-2559781, bei Debabov (In: Proceedings of the IV International
Symposium on Genetics of Industrial Microorganisms 1982. Kodansha
Ltd, Tokyo, Japan, p 254–258),
Smith and Parsell (Journal of General Microbiology 87,129–140 (1975))
und Livshits et al. (In: Conference on Metabolic Bacterial Plasmids.
Tartusk University Press, Tallin, Estland (1982), p 132–134 und
144–146)
und in der US 5,705,371 beschrieben.
Die genetischen Determinanten zur Saccharoseverwertung des von Smith
und Parsell beschriebenen Stammes H155 wurden durch Konjugation
in eine gegen Nalidixinsäure
resistente Mutante von Escherichia coli K-12 überführt und die entsprechende Transkonjugante
am 16. März
2004 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen
(Braunschweig, Deutschland) als DSM 16293 hinterlegt. Genetische
Determinanten zur Saccharoseverwertung sind ebenfalls in dem in
der US 5,631,157 beschriebenen
Stamm 472T23 enthalten, der bei der ATCC unter Bezeichnung ATCC
9801 erhältlich
ist. Eine weitere genetische Determinante zur Saccharoseverwertung
wurde von Bockmann et al. (Molecular and General Genetics 235, 22–32 (1992))
beschrieben und ist unter der Bezeichnung csc-System bekannt.
- • Verstärkung des
vom offenen Leserahmen yedA kodierten YedA-Genproduktes wie beispielsweise
in der WO 03/044191 beschrieben.
- • Wachstum
in Gegenwart mindestens 0,1 bis 0,5 mM oder mindestens 0,5 bis 1
mM Borrelidin (Borrelidinresistenz) wie in US 5,939,307 beschrieben. Der gegen
Borrelidin resistente Stamm kat-13 ist unter der Zugangsnummer NRRL
B-21593 bei der NRRL erhältlich.
- • Wachstum
in Gegenwart von mindestens 2 bis 2,5 g/l oder mindestens 2,5 bis
3 g/l Diaminobernsteinsäure (Diaminobernsteinsäure Resistenz)
wie in WO 00/09661 beschrieben. Der gegen Diaminobernsteinsäure resistente
Stamm DSM 9806 ist unter der Zugangsnummer KCCM-10133 bei der KCCM
erhältlich.
- • Wachstum
in Gegenwart von mindestens 30 bis 40 mM oder mindestens 40 bis
50 mM α-Methylserin (α-Methylserin
Resistenz) wie in WO 00/09661 beschrieben. Der gegen α-Methylserin resistente
Stamm DSM 9806 ist unter der Zugangsnummer KCCM-10133 bei der KCCM
erhältlich.
- • Wachstum
in Gegenwart von höchstens
30 mM oder höchstens
40 mM oder höchstens
50 mM Fluorobrenztraubensäure
(Fluorobrenztraubensäure
Sensitivität)
wie in WO 00/09661 beschrieben. Der gegen Fluorobrenztraubensäure sensitive
Stamm DSM 9806 ist unter der Zugangsnummer KCCM-10133 bei der KCCM
erhältlich.
- • Wachstum
in Gegenwart von mindestens 210 mM oder mindestens 240 mM oder mindestens
270 mM oder mindestens 300 mM L-Glutaminsäure (Glutaminsäure Resistenz)
wie in WO 00/09660 beschrieben. Der gegen Glutaminsäure resistente
Stamm DSM 9807 ist unter der Zugangsnummer KCCM-10132 bei der KCCM
erhältlich.
- • Eine
mindestens partielle Bedürftigkeit
für Methionin.
Ein Stamm mit einer mindestens partiellen Methionin Bedürftigkeit
ist beispielsweise der in der US
5,017,483 beschriebene Stamm H-4257, der unter der Zugangsnummer
FERM BP-984 beim National Institute of Advanced Industrial Science
and Technology erhältlich
ist. Durch Zugabe von mindestens 25, 50 oder 100 mg/l L-Methionin
ist die Bedürftigkeit
kompensierbar.
- • Eine
mindestens partielle Bedürftigkeit
für m-Diaminopimelinsäure. Ein
Stamm mit einer mindestens partiellen m-Diaminopimelinsäure Bedürftigkeit
ist beispielsweise der in der US
5,017,483 beschriebene Stamm H-4257, der unter der Zugangsnummer
FERM BP-984 beim National Institute of Advanced Industrial Science
and Technology erhältlich
ist. Durch Zugabe von mindestens 25, 50 oder 100 mg/l m-Diaminopimelinsäure ist
die Bedürftigkeit
kompensierbar.
- • Wachstum
in Gegenwart von mindestens 100 mg/l Rifampicin (Rifampicin Resistenz)
wie in US 4,996,147 beschrieben.
Der gegen Rifampicin resistente Stamm H-4581 ist unter der Zugangsnummer
FERM BP-1411 beim National Institute of Advanced Industrial Science
and Technology erhältlich.
- • Wachstum
in Gegenwart von mindestens 15 g/l L-Lysin (Lysin Resistenz) wie
in US 4,996,147 beschrieben.
Der gegen L-Lysin resistente Stamm H-4581 ist unter der Zugangsnummer
FERM BP-1411 beim National Institute of Advanced Industrial Science
and Technology erhältlich.
- • Wachstum
in Gegenwart von mindestens 15 g/l Methionin (Methionin Resistenz)
wie in US 4,996,147 beschrieben.
Der gegen Methionin resistente Stamm H-4581 ist unter der Zugangsnummer
FERM BP-1411 beim National Institute of Advanced Industrial Science
and Technology erhältlich.
- • Wachstum
in Gegenwart von mindestens 15 g/l L-Asparaginsäure (Asparaginsäure Resistenz)
wie in US 4,996,147 beschrieben.
Der gegen L-Asparaginsäure
resistente Stamm H-4581 ist unter der Zugangsnummer FERM BP-1411
beim National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
erhältlich.
- • Verstärkung der
vom pyc-Gen kodierten Pyruvat-Carboxylase.
Geeignete pyc-Gene bzw. Allele sind beispielsweise die von Corynebacterium
glutamicum (WO 99/18228, WO 00/39305 und WO 02/31158), Rhizobium
etli ( US 6,455,284 ),
Bacillus subtilis ( EP 1092776 ).
Gegebenfalls kann auch das pyc-Gen von weiteren Mikrorganismen verwendet
werden, die endogen eine Pyruvat-Carboxylase enthalten, wie beispielsweise
Methanobacterium thermoautotrophicum oder Pseudomonas fluorescens.
Bei
Verwendung Saccharose-haltiger Nährmedien
werden die Stämme
mit genetischen Determinanten zur Saccharoseverwertung ausgerüstet.
Der
Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem
Zusammenhang die Erhöhung
der intrazellulären
Aktivität
oder Konzentration eines oder mehrerer Enzyme oder Proteine in einem
Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden,
indem man beispielsweise die Kopienzahl des offenen Leserahmens, Gens
oder Allels bzw. der offenen Leserahmen, Gene oder Allele um mindestens
eine (1) Kopie erhöht,
einen starken Promotor oder ein Gen oder Allel verwendet, das für ein entsprechendes
Enzym bzw. Protein mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls
diese Maßnahmen
kombiniert.
Bei
den Maßnahmen
der Verstärkung
und auch bei den Maßnahmen
der Abschwächung
wird die Verwendung endogener Gene, Allele oder offener Leserahmen
im Allgemeinen bevorzugt. Unter „endogenen Genen" oder „endogenen
Nukleotidsequenzen" versteht
man die in der Population einer Art vorhandenen Gene oder offene
Leserahmen oder Allele beziehungsweise Nukleotidsequenzen.
Bei
Verwendung von Plasmiden zur Erhöhung
der Kopienzahl werden diese gegebenenfalls stabilisiert durch einen
oder mehreren der genetischen Orte (Loci) ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus dem parB Locus des Plasmides R1 beschrieben von Rasmussen et
al. (Molecular and General Genetics 209 (1), 122–128 (1987)), Gerdes et al.
(Molecular Microbiology 4 (11), 1807–1818 (1990)) und Thistedt
und Gerdes (Journal of Molecular Biology 223 (1), 41–54 (1992)),
dem flm Locus des F Plasmids beschrieben von Loh et al. (Gene 66
(2), 259–268
(1988)), dem par Locus des Plasmids pSC101 beschrieben von Miller
et al. (Gene 24 (2–3),
309–315
(1983), dem cer Locus des Plasmids ColE1 beschrieben von Leung et
al. (DNA 4 (5), 351–355
(1985), dem par Locus des Plasmids RK2 beschrieben von Sobecky et
al. (Journal of Bacteriology 178 (7), 2086–2093 (1996)) und Roberts and
Helinsky (Journal of Bacteriology 174 (24), 8119–8132 (1992)), dem par Locus
des Plasmids RP4 beschrieben von Eberl et al. (Molecular Microbiology
12 (1), 131–141 (1994))and
dem parA Locus des Plasmids R1 beschrieben von Gerdes and Molin
(Journal of Molecular Biology 190 (3), 269–279 (1986)), Dam and Gerdes
(Journal of Molecular Biology 236 (5), 1289–1298 (1994)) and Jensen et
al (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 95 (15),
8550–8555
(1998).
Durch
die Maßnahmen
der Verstärkung,
insbesondere Überexpression,
wird die Aktivität
oder Konzentration des entsprechenden Proteins oder Enzyms im Allgemeinen
um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder
500%, maximal bis 1000 oder 2000 bezogen auf die des Wildtyp-Proteins
beziehungsweise der Aktivität
oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus erhöht.
Zur
Erzielung einer Verstärkung
können
beispielsweise die Expression der Gene oder die katalytischen oder
funktionellen Eigenschaften der Enzyme oder Proteine erhöht werden.
Gegebenenfalls können beide
Maßnahmen
kombiniert werden.