CN114317511B - 蛋白、基因、重组载体、表达盒、宿主及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种蛋白、基因、重组载体、表达盒、宿主及用途。本发明提供的蛋白，相较于常规的6‑磷酸葡萄糖异构酶，其第521位氨基酸为谷氨酸，具有6‑磷酸葡萄糖异构酶活性，且酶活力相较于常规的6‑磷酸葡萄糖异构酶提升了至少40%。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种蛋白、基因、重组载体、表达盒、宿主及用途。
背景技术
淀粉是一类在植物叶绿体中合成并最终贮存在其他异养器官（如种子、根、果实等）中的高聚化、非水溶性的碳水化合物。随着科学技术的发展，淀粉除了作为生物的能量来源之外，还被广泛应用于医疗、能源、化工、建筑、材料等多种行业。
6-磷酸葡萄糖异构酶（简称PGI）同时存在于植物的质体与胞质中，是植物体内淀粉合成或代谢途径中的关键酶，它能够可逆地催化6-磷酸葡萄糖和6-磷酸果糖的相互转变。在植物叶绿体中，6-磷酸葡萄糖异构酶能够催化6-磷酸果糖转化成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸果糖是卡尔循环重要的终产物之一，而6-磷酸葡萄糖是淀粉合成过程中重要的中间产物。在植物细胞质中，6-磷酸葡萄糖异构酶参与了植物糖代谢过程（酶）。植物质体中的PGI突变失活后，植物表现出叶片淀粉合成明显减少、生长缓慢等表型，而植物胞质中的PGI突变失活后，植物表现出生长受阻、淀粉明显积累、生殖生长受到严重干扰等表型，因此PGI对植物体内的淀粉合成或代谢过程具有重要意义。在动物中，PGI参与了细胞内的糖酵解过程，并与人类多种代谢类疾病密切相关；同时很多证据表明PGI还可以分泌到细胞外，起到细胞因子的作用。
在实现本发明的过程中，发明人发现，现有6-磷酸葡萄糖异构酶的酶活性仍有待提升。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于进一步提升现有6-磷酸葡萄糖异构酶的酶活性，从而提供一种蛋白、基因、重组载体、表达盒、宿主及用途。
为此，本发明提供一种蛋白，由6-磷酸葡萄糖异构酶蛋白的第521位氨基酸突变为谷氨酸后得到。
可选的，所述第521位氨基酸由苏氨酸突变为谷氨酸。
可选的，所述6-磷酸葡萄糖异构酶蛋白满足如下a～c中的任一项：
a、以小偃54小麦材料的c DNA为模板，利用FastPfu（全式金）对小麦PGI蛋白基因进行PCR扩增得到SEQ ID NO:1所示的基因序列，利用SEQ ID NO:1所示的基因序列进行体外表达所得；
b、包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
c、包含由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经除第521位氨基酸以外的至少一个氨基酸取代、缺失或添加后得到的氨基酸序列，且与a中所述蛋白具有相同或相似的功能。
可选的，所述蛋白满足如下A或B中的任一项：
A、包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
B、包含由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列经除第521位氨基酸以外的至少一个氨基酸取代、缺失或添加后得到的氨基酸序列，且与包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的蛋白具有相同或相似的功能。
可选的，上述c或B中所述的蛋白可由人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
本发明还提供了一种基因，所述基因为编码本发明中任一项所述的蛋白的基因。
可选的，所述基因满足如下C～E中的任一项：
C、包含SEQ ID NO:3所示的基因；
D、在严格条件下与SEQ ID NO:3所示的基因杂交且编码本发明中任一项所述的蛋白的基因；
E、与C或D中所述的基因具有80%以上同源性且编码本发明中任一项所述的蛋白的基因。示例性地，E中所述的基因可以与C或D中所述的基因具有85%以上、90%以上或95%以上的同源性。
本发明还提供了一种表达盒，所述表达盒中含有本发明中任一项所述的基因。
可选的，所述表达盒中还可以含有启动子和终止子，所述启动子例如可以是T7promoter，所述终止子例如可以是T7Terminator。
本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体含有本发明中任一项所述的基因或本发明的表达盒。
可选的，所述重组载体中，表达载体可以为pHUE表达载体。
本发明还提供了一种宿主，所述宿主中含有本发明中任一项所述的基因或者表达盒或者重组载体。
可选的，所述宿主可以是宿主菌株，宿主菌株例如可以为BL21（DE3）大肠杆菌。
本发明还提供了本发明中任一项所述的蛋白的用途，所述用途包括如下F～K中的至少一种：
F、作为6-磷酸葡萄糖异构酶的用途；
G、催化6-磷酸果糖转化为6-磷酸葡萄糖的用途；
H、催化6-磷酸葡萄糖转化为6-磷酸果糖的用途；
I、以6-磷酸果糖为原料制备6-磷酸葡萄糖酸的用途；
J、促进植物淀粉的合成的用途；
K、提高植物光合效力的用途。
本发明还提供了本发明中任一项所述的基因，或者表达盒，或者重组载体，或者宿主，在制备6-磷酸葡萄糖异构酶产品中的用途。
本发明还提供了本发明中任一项所述的蛋白的制备方法，包括如下步骤：培养本发明中所述的宿主，破碎，固液分离，纯化。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的蛋白，相较于常规的6-磷酸葡萄糖异构酶，其第521位氨基酸突变为谷氨酸，具有6-磷酸葡萄糖异构酶活性，且酶活力相较于常规的6-磷酸葡萄糖异构酶提升了至少40%。
2.本发明提供的蛋白，由6-磷酸葡萄糖异构酶蛋白经第521位氨基酸由苏氨酸突变为谷氨酸后得到，相较于常规的6-磷酸葡萄糖异构酶，其酶活力显著提高，能够用于提高植物光合效力、淀粉合成能力及作物产量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中重组表达载体pHUE-TaPGI1的质粒图谱；
图2是本发明实施例2中的SDS-PAGE电泳检测结果图；
图3是本发明实施例3中的BCA蛋白定量标准曲线；
图4是本发明实施例3中的TaPGI1和TaPGI1mT521E酶活力检测曲线。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
本发明实施例中涉及的实验材料及设备来源：
小偃54小麦（中国科学院遗传发育所李宏伟老师惠赠）；
全式金RNA-cDNA一步法试剂盒（全式金，货号：AE411-02）；
FastPfu酶（全式金，货号AP221-11）；
限制性内切酶SacII（购自：NEB，货号：R0157S）；
限制性内切酶KpnI（购自：NEB，货号：R3142S）；
pHUE表达载体（详见现有技术文献：An efficient system for high-levelexpression and easy purification of authentic recombinant proteins. ANN-MAREECATANZARITI, TATIANA A. SOBOLEVA, DAVID A. JANS, PHILIP G. BOARD, AND ROHANT. BAKER. Protein Science (2004), 13:1331–1339）；
BL21（DE3）大肠杆菌（北京市爱普益医学检验中心有限公司研发实验室保存）；
Ni-NTA亲和层析柱（购自：Invitrogen，货号：R90101）；
BCA蛋白定量试剂盒（购自：Thermo，货号：23227）；
双甘氨肽（购自：Sigma，货号：G0674-100G）；
6-磷酸果糖（购自：Sigma，货号：F-3627）；
NADP（购自：Sigma，货号：N-0505）；
MgCl2（购自：Sigma，货号：M-0250）；
6-磷酸葡萄糖脱氢酶（购自：Sigma，货号：G-6378-100UN）；
LB液体培养基（自配）：酵母提取物10g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 10g/L；
Ni-NTA lysis buffer（自配）：50 mM NaH2PO4, 300 mMNaCl, 5 mM咪唑；
wash buffer（自配）：50 mMNaH2PO4, 300 mMNaCl, 25 mM咪唑；
elute buffer（自配）：50 mMNaH2PO4, 300 mMNaCl, 250 mM咪唑；
Usp2-cc蛋白酶（自提取，详见现有技术文献：An efficient system for high-level expression and easy purification of authentic recombinant proteins.ANN-MAREE CATANZARITI, TATIANA A. SOBOLEVA, DAVID A. JANS, PHILIP G. BOARD,AND ROHAN T. BAKER. Protein Science (2004), 13:1331–1339）；
透析缓冲液（自配）：20 mMTris-HCL, pH 8.0, 100 mMNaCl。
实施例1
基于小麦mRNA序列（Genebank NO. DQ456872.1）设计保守引物，如表1中SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6所示，利用全式金RNA-cDNA一步法试剂盒制备小偃54小麦材料的cDNA并作为模板，利用FastPfu酶对其6-磷酸葡萄糖酶蛋白基因进行PCR扩增。
PCR扩增反应体系为40μl，其中包括：cDNA100ng，FastPfu高保真酶1μl，
FastPfuPCR缓冲液（10
）4μl，pHUE-TaPGI1-For终浓度40pM，pHUE-TaPGI1-rev终浓度40pM，
dNTPs（2.5mM each）4μl，以及余量的ddH2O。PCR反应程序为：95℃30s，56℃30s，72℃60s，35
循环；72℃10分钟结束反应。
PCR扩增结束后，对扩增结果进行测序，测序结果显示，扩增得到的6-磷酸葡萄糖异构酶蛋白基因相较于Genbank记录的6-磷酸葡萄糖异构酶蛋白基因具有五个氨基酸对应密码子的突变，命名为TaPGI1基因，其基因序列如SEQ ID NO:1所示，对应的6-磷酸葡萄糖酶蛋白命名为TaPGI1蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
采用限制性内切酶SacII和KpnI双酶切上述扩增得到的TaPGI1基因序列以及pHUE表达载体，使酶切后的TaPGI1基因序列连接至酶切后的pHUE表达载体上，得到重组表达载体pHUE-TaPGI1，如图1所示。根据测序结果，对重组表达载体pHUE-TaPGI1进行结构描述如下：将pHUE表达载体的SacII和KpnI酶切位点之间的小片段替换为SEQ ID NO:1所示基因序列中自5＇端第1～1704位的核苷酸片段。
按照现有技术文献（Fisher, C. L., and Pei, G. K. (1997). Modificationof a PCR-based site-directed mutagenesis method. Biotechniques 23, 570-574.）中的方法和原理，以上述重组表达载体pHUE-TaPGI1为模板，采用表1中SEQ ID NO:7和SEQID NO:8所示的引物，进行PCR定点突变。
PCR定点突变反应体系为40μl，其中包括：pHUE-TaPGI1100ng，FastPfu高保真酶1μ
l，FastPfu PCR缓冲液（10
） 4μl，pHUE-TaPGI1mT521E-For终浓度40pM，pHUE-
TaPGI1mT521E-rev终浓度40pM，dNTPs（2.5mM each） 4μl，以及余量的ddH2O。PCR反应程序
为：95℃120s， 60℃40s， 72℃240s，20循环； 72℃10分钟结束反应。
PCR定点突变结束后，得到突变后的重组表达载体pHUE-TaPGI1mT521E。对重组表达载体pHUE-TaPGI1mT521E进行测序，测序结果显示，重组表达载体pHUE-TaPGI1mT521E中，pHUE表达载体的SacII和KpnI酶切位点之间具有如SEQ ID NO:3所示的基因序列，命名为TaPGI1mT521E基因，对SEQ ID NO:3所示的基因序列进行转录翻译，得到其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，命名为TaPGI1mT521E蛋白。
SEQ ID NO:2所示氨基酸序列与SEQ ID NO:4所示氨基酸序列相比，二者仅有第521位氨基酸不同，SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第521位氨基酸为苏氨酸，SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的第521位氨基酸为谷氨酸。
表1 引物
实施例2
本实施例用于说明小麦TaPGI1蛋白和TaPGI1mT521E蛋白的体外表达和纯化：
分别利用pHUE-TaPGI1重组表达载体和pHUE-TaPGI1mT521E重组表达载体通过热激转化的方式转化至BL21（DE3）大肠杆菌中，得到两种重组菌。分别将两种重组菌接种至100 ml含氨苄抗性（100 µg/ml）的LB液体培养基中，于37℃、220转/分钟的条件下震荡培养过夜。第二天，将20 ml重组菌转接到1升新鲜含氨苄抗性（100 µg/ml）的LB液体培养基中，继续于37℃、220转/分钟的条件下震荡培养至OD600nm=1.0左右（分光光度计检测），向培养液中加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG，并于18℃诱导培养16小时，诱导培养结束后于4000转/分钟的条件下离心收集菌体。
用Ni-NTA lysis buffer（50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 5 mM 咪唑）分别重悬上述收集的两种菌体，置冰上超声破碎后，得到TaPGI1或TaPGI1mT521E的全细胞裂解液，将所得全细胞裂解液于50000g条件下离心30分钟，分别收集TaPGI1或TaPGI1mT521E上清液。收集到的上清液分别经0.22μm滤膜过滤后，加载到Ni-NTA亲和层析柱，收集TaPGI1或TaPGI1mT521E的第一流穿液；然后向亲和层析柱中加入10倍柱床体积的wash buffer（50mM NaH2PO4, 300 mMNaCl, 25 mM咪唑），收集TaPGI1或TaPGI1mT521E的第二流穿液；再向亲和层析柱中加入4倍柱床体积的elute buffer（50 mM NaH2PO4, 300 mMNaCl, 250mM咪唑），收集TaPGI1或TaPGI1mT521E的洗脱蛋白，得到N端带有His-Ub标签（p-HUE载体中含有编码His-Ub标签的基因）的融合蛋白：His-Ub-TaPGI1和His-Ub-TaPGI1mT521E。
利用Usp2-cc蛋白酶，分别对从Ni-NTA洗脱下来的His-Ub-TaPGI1蛋白和His-Ub-TaPGI1mT521E蛋白进行进一步的酶切反应，以去除His-Ub融合标签，得到酶切反应液。分别将两种酶切反应液置于透析缓冲液（20 mM Tris-HCL, pH 8.0, 100 mM NaCl）中，搅拌透析过夜后，将酶切反应液再次加载到Ni-NTA柱，收集流穿蛋白，得到不带融合标签的纯化TaPGI1蛋白和纯化TaPGI1mT521E蛋白，分别浓缩分装后，-80 ℃保存。
利用SDS-PAGE电泳检测上述纯化流程中的各样品和最终收集的纯化TaPGI1蛋白和纯化TaPGI1mT521E蛋白，检测结果如图2所示。
图2中，M为蛋白分子量maker；通道1为TaPGI1全细胞裂解液；通道2为TaPGI1上清液；通道3为TaPGI1第一流穿液；通道4为TaPGI1 25 mM咪唑洗脱后的第二流穿液；通道5为TaPGI1 250 mM 咪唑洗脱后的洗脱蛋白；通道6为TaPGI1mT521E全细胞裂解液；通道7为TaPGI1mT521E上清液；通道8为TaPGI1mT521E第一流穿液；通道9为TaPGI1mT521E 25 mM咪唑洗脱后的第二流穿液；通道10为TaPGI1mT521E 250 mM 咪唑洗脱后的洗脱蛋白；通道11为TaPGI1蛋白经Usp2-cc酶切过夜后的酶切反应液；通道12为纯化TaPGI1蛋白；通道13为TaPGI1mT521E蛋白经Usp2-cc酶切过夜后的酶切反应液；通道14为纯化TaPGI1mT521E蛋白。
实施例3
本实施例用于对实施例2中纯化得到的TaPGI1蛋白和TaPGI1mT521E蛋白进行酶活检测：
（1）BCA标准曲线的建立
为了比较两个蛋白的酶活性，首先需要对目的蛋白进行定量实验，使两种蛋白具有相同浓度。采用公认的BCA蛋白定量试剂盒（Pierce）对TaPGI1蛋白和TaPGI1mT521E蛋白进行精确的定量分析。图3为采用BCA蛋白定量法对标品蛋白（BSA）建立的蛋白标准曲线，基于此标准曲线对TaPGI1蛋白和TaPGI1mT521E蛋白进行精准定量。
（2）TaPGI1蛋白和TaPGI1mT521E蛋白体外酶活力的检测和比较
采用标准的实验方法，对体外纯化的TaPGI1蛋白和TaPGI1mT521E蛋白进行酶活力检测，酶活反应原理如下：
NADPH在分光度计340nm处有稳定吸收峰，因此在6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G-6-PDH）过量的情况下，可以通过计算反应体系中340 nm分光度计数值变化，计算出TaPGI1蛋白和TaPGI1mT521E的酶活力。
计算公式如下：
上式中，0.1为试验体系总体积（0.1ml）；dilution为稀释倍数（蛋白母液浓度/蛋白稀释液浓度）；6.22为NADPH在340nm处的摩尔消光系数；0.005为反应体系中加入蛋白溶液的体积（0.005ml）。
酶活反应分析实验体系(100 μl)：42 mM双甘氨肽（pH 7.4），3.3 mM 6-磷酸果糖，0.67mM NADP，3.3 mM MgCl2，2.5U/mL 6-磷酸葡萄糖脱氢酶，其余为水。
蛋白稀释液的制备方法：分别取实施例2制备的TaPGI1蛋白和TaPGI1mT521E蛋白，用透析缓冲液（20mMTris-HCL，pH8.0,100mM NaCl）稀释，得到蛋白浓度为1mg/ml的蛋白母液，将蛋白母液继续稀释至500倍体积，得到蛋白浓度为0.002mg/ml的蛋白工作液。
整个生化反应在25℃条件下进行，分光光度计在340 nm处测取5分钟内的光吸收值。检测结果如图4和表2所示。选取酶反应最初3分钟内的数据进行计算，得到TaPGI1蛋白的酶活力为1160±110 U/mg，而TaPGI1mT521E蛋白的酶活力为1648±103 U/mg，可见TaPGI1mT521E蛋白的酶活力对比TaPGI1蛋白提升了约40%。
表2 TaPGI1蛋白和TaPGI1mT521E蛋白的酶活力检测数值
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 北京爱普益医学检验中心有限公司
<120> 蛋白、基因、重组载体、表达盒、宿主及用途
<130> HA202108474-YS
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1704
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggcgtcgc cggcgctcat ctccgacacc gaccagtgga aggccctcca ggcgcacgtc 60
ggcgcgatcc acaagacgca cctgcgcgac ctcatgacgg acgccgaccg atgcaaggca 120
atgacggcgg aattcgaagg cgtctacctg gactactcga ggcagcaggc caccacggag 180
accatcgaca agctgttcaa gctggcagag gctgcaaagc tcaaggagaa gattgacaag 240
atgtttaaag gcgaaaagat aaataccact gagaacagat cagtgctcca tgtggctcta 300
agggctccaa gagacgcagt cataaacagt gacggtgtga atgtggtccc cgaagtttgg 360
gctgttaagg ataaaatcaa gcagttttca gagactttca gaagtggctc atgggttggg 420
gcaactggga aaccattgac aaatgttgtc tcggtcggga ttggtggtag cttccttgga 480
cctctgtttg tgcatacggc tctccagact gacccggaag cagcggaagc tgccaaaggc 540
cgacaactga gatttcttgc aaatgttgat ccagttgatg ttgcacggag catcaaagat 600
ttagatcctg caaccactct tgttgtggtt gtctcaaaga ccttcacgac agctgaaaca 660
atgttaaatg ctcgaactat caaggagtgg attgtctctt ctcttggacc tcaggctgtt 720
tccaaacaca tgattgctgt cagtactaat cttaagcttg tcaaggagtt cggaattgac 780
cctaacaacg cttttgcgtt ttgggactgg gttggcggcc gctatagtgt ttgcagtgct 840
gtcggtgttc tgcccttatc tcttcagtat ggatttccaa ttgttcagaa atttctggag 900
ggtgcttcta gcattgacaa tcatgtccat acatcttcat ttgagaaaaa tatacctgta 960
ctccttggtt tgttgagtgt gtggaatgtt tcatttctcg gatatccggc tagggcaata 1020
ttgccatact gtcaagcact tgagaaacta gcaccacata ttcagcagct tagcatggag 1080
agtaatggaa agggtgtctc cattgatggt gttcgacttc catttgaggc tggtgaaatt 1140
gattttggtg aacctggaac aaacgggcaa cacagcttct atcaattaat ccatcaggga 1200
agagttattc cttgtgattt tattggcgtc ataaaaagcc agcagcccgt ttacctgaaa 1260
ggggaaactg ttagcaatca tgatgagttg atgtccaatt tctttgctca gcctgatgcg 1320
cttgcctatg ggaagactcc tgagcaatta cacagcgaga aagttcccga aaatcttatc 1380
cctcacaaga cttttcaggg caaccggcca tcactgagtt tcttgctgtc ttcgttatct 1440
gcctatgaga ttggacagct tttatccatc tatgagcacc ggatcgcagt tcagggtttc 1500
atatggggaa tcaactcgtt tgaccagtgg ggagtggagc tgggcaagtc actggcttct 1560
acagtgagga aacagttgca tgcatcacgc atggaaggaa agcccgtcga gggcttcaac 1620
cccagcagcg caagtttgct cacacggttt cttgcggtta aaccatccac cccatatgac 1680
acaacagtgc ttccaaaagt gtaa 1704
<210> 2
<211> 567
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ala Ser Pro Ala Leu Ile Ser Asp Thr Asp Gln Trp Lys Ala Leu
1 5 10 15
Gln Ala His Val Gly Ala Ile His Lys Thr His Leu Arg Asp Leu Met
20 25 30
Thr Asp Ala Asp Arg Cys Lys Ala Met Thr Ala Glu Phe Glu Gly Val
35 40 45
Tyr Leu Asp Tyr Ser Arg Gln Gln Ala Thr Thr Glu Thr Ile Asp Lys
50 55 60
Leu Phe Lys Leu Ala Glu Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Ile Asp Lys
65 70 75 80
Met Phe Lys Gly Glu Lys Ile Asn Thr Thr Glu Asn Arg Ser Val Leu
85 90 95
His Val Ala Leu Arg Ala Pro Arg Asp Ala Val Ile Asn Ser Asp Gly
100 105 110
Val Asn Val Val Pro Glu Val Trp Ala Val Lys Asp Lys Ile Lys Gln
115 120 125
Phe Ser Glu Thr Phe Arg Ser Gly Ser Trp Val Gly Ala Thr Gly Lys
130 135 140
Pro Leu Thr Asn Val Val Ser Val Gly Ile Gly Gly Ser Phe Leu Gly
145 150 155 160
Pro Leu Phe Val His Thr Ala Leu Gln Thr Asp Pro Glu Ala Ala Glu
165 170 175
Ala Ala Lys Gly Arg Gln Leu Arg Phe Leu Ala Asn Val Asp Pro Val
180 185 190
Asp Val Ala Arg Ser Ile Lys Asp Leu Asp Pro Ala Thr Thr Leu Val
195 200 205
Val Val Val Ser Lys Thr Phe Thr Thr Ala Glu Thr Met Leu Asn Ala
210 215 220
Arg Thr Ile Lys Glu Trp Ile Val Ser Ser Leu Gly Pro Gln Ala Val
225 230 235 240
Ser Lys His Met Ile Ala Val Ser Thr Asn Leu Lys Leu Val Lys Glu
245 250 255
Phe Gly Ile Asp Pro Asn Asn Ala Phe Ala Phe Trp Asp Trp Val Gly
260 265 270
Gly Arg Tyr Ser Val Cys Ser Ala Val Gly Val Leu Pro Leu Ser Leu
275 280 285
Gln Tyr Gly Phe Pro Ile Val Gln Lys Phe Leu Glu Gly Ala Ser Ser
290 295 300
Ile Asp Asn His Val His Thr Ser Ser Phe Glu Lys Asn Ile Pro Val
305 310 315 320
Leu Leu Gly Leu Leu Ser Val Trp Asn Val Ser Phe Leu Gly Tyr Pro
325 330 335
Ala Arg Ala Ile Leu Pro Tyr Cys Gln Ala Leu Glu Lys Leu Ala Pro
340 345 350
His Ile Gln Gln Leu Ser Met Glu Ser Asn Gly Lys Gly Val Ser Ile
355 360 365
Asp Gly Val Arg Leu Pro Phe Glu Ala Gly Glu Ile Asp Phe Gly Glu
370 375 380
Pro Gly Thr Asn Gly Gln His Ser Phe Tyr Gln Leu Ile His Gln Gly
385 390 395 400
Arg Val Ile Pro Cys Asp Phe Ile Gly Val Ile Lys Ser Gln Gln Pro
405 410 415
Val Tyr Leu Lys Gly Glu Thr Val Ser Asn His Asp Glu Leu Met Ser
420 425 430
Asn Phe Phe Ala Gln Pro Asp Ala Leu Ala Tyr Gly Lys Thr Pro Glu
435 440 445
Gln Leu His Ser Glu Lys Val Pro Glu Asn Leu Ile Pro His Lys Thr
450 455 460
Phe Gln Gly Asn Arg Pro Ser Leu Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Ser
465 470 475 480
Ala Tyr Glu Ile Gly Gln Leu Leu Ser Ile Tyr Glu His Arg Ile Ala
485 490 495
Val Gln Gly Phe Ile Trp Gly Ile Asn Ser Phe Asp Gln Trp Gly Val
500 505 510
Glu Leu Gly Lys Ser Leu Ala Ser Thr Val Arg Lys Gln Leu His Ala
515 520 525
Ser Arg Met Glu Gly Lys Pro Val Glu Gly Phe Asn Pro Ser Ser Ala
530 535 540
Ser Leu Leu Thr Arg Phe Leu Ala Val Lys Pro Ser Thr Pro Tyr Asp
545 550 555 560
Thr Thr Val Leu Pro Lys Val
565
<210> 3
<211> 1704
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggcgtcgc cggcgctcat ctccgacacc gaccagtgga aggccctcca ggcgcacgtc 60
ggcgcgatcc acaagacgca cctgcgcgac ctcatgacgg acgccgaccg atgcaaggca 120
atgacggcgg aattcgaagg cgtctacctg gactactcga ggcagcaggc caccacggag 180
accatcgaca agctgttcaa gctggcagag gctgcaaagc tcaaggagaa gattgacaag 240
atgtttaaag gcgaaaagat aaataccact gagaacagat cagtgctcca tgtggctcta 300
agggctccaa gagacgcagt cataaacagt gacggtgtga atgtggtccc cgaagtttgg 360
gctgttaagg ataaaatcaa gcagttttca gagactttca gaagtggctc atgggttggg 420
gcaactggga aaccattgac aaatgttgtc tcggtcggga ttggtggtag cttccttgga 480
cctctgtttg tgcatacggc tctccagact gacccggaag cagcggaagc tgccaaaggc 540
cgacaactga gatttcttgc aaatgttgat ccagttgatg ttgcacggag catcaaagat 600
ttagatcctg caaccactct tgttgtggtt gtctcaaaga ccttcacgac agctgaaaca 660
atgttaaatg ctcgaactat caaggagtgg attgtctctt ctcttggacc tcaggctgtt 720
tccaaacaca tgattgctgt cagtactaat cttaagcttg tcaaggagtt cggaattgac 780
cctaacaacg cttttgcgtt ttgggactgg gttggcggcc gctatagtgt ttgcagtgct 840
gtcggtgttc tgcccttatc tcttcagtat ggatttccaa ttgttcagaa atttctggag 900
ggtgcttcta gcattgacaa tcatgtccat acatcttcat ttgagaaaaa tatacctgta 960
ctccttggtt tgttgagtgt gtggaatgtt tcatttctcg gatatccggc tagggcaata 1020
ttgccatact gtcaagcact tgagaaacta gcaccacata ttcagcagct tagcatggag 1080
agtaatggaa agggtgtctc cattgatggt gttcgacttc catttgaggc tggtgaaatt 1140
gattttggtg aacctggaac aaacgggcaa cacagcttct atcaattaat ccatcaggga 1200
agagttattc cttgtgattt tattggcgtc ataaaaagcc agcagcccgt ttacctgaaa 1260
ggggaaactg ttagcaatca tgatgagttg atgtccaatt tctttgctca gcctgatgcg 1320
cttgcctatg ggaagactcc tgagcaatta cacagcgaga aagttcccga aaatcttatc 1380
cctcacaaga cttttcaggg caaccggcca tcactgagtt tcttgctgtc ttcgttatct 1440
gcctatgaga ttggacagct tttatccatc tatgagcacc ggatcgcagt tcagggtttc 1500
atatggggaa tcaactcgtt tgaccagtgg ggagtggagc tgggcaagtc actggcttct 1560
gaagtgagga aacagttgca tgcatcacgc atggaaggaa agcccgtcga gggcttcaac 1620
cccagcgcgg caagtttgct cacacggttt cttgcggtta aaccatccac cccatatgac 1680
acaacagtgc ttccaaaagt gtaa 1704
<210> 4
<211> 567
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Ala Ser Pro Ala Leu Ile Ser Asp Thr Asp Gln Trp Lys Ala Leu
1 5 10 15
Gln Ala His Val Gly Ala Ile His Lys Thr His Leu Arg Asp Leu Met
20 25 30
Thr Asp Ala Asp Arg Cys Lys Ala Met Thr Ala Glu Phe Glu Gly Val
35 40 45
Tyr Leu Asp Tyr Ser Arg Gln Gln Ala Thr Thr Glu Thr Ile Asp Lys
50 55 60
Leu Phe Lys Leu Ala Glu Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Ile Asp Lys
65 70 75 80
Met Phe Lys Gly Glu Lys Ile Asn Thr Thr Glu Asn Arg Ser Val Leu
85 90 95
His Val Ala Leu Arg Ala Pro Arg Asp Ala Val Ile Asn Ser Asp Gly
100 105 110
Val Asn Val Val Pro Glu Val Trp Ala Val Lys Asp Lys Ile Lys Gln
115 120 125
Phe Ser Glu Thr Phe Arg Ser Gly Ser Trp Val Gly Ala Thr Gly Lys
130 135 140
Pro Leu Thr Asn Val Val Ser Val Gly Ile Gly Gly Ser Phe Leu Gly
145 150 155 160
Pro Leu Phe Val His Thr Ala Leu Gln Thr Asp Pro Glu Ala Ala Glu
165 170 175
Ala Ala Lys Gly Arg Gln Leu Arg Phe Leu Ala Asn Val Asp Pro Val
180 185 190
Asp Val Ala Arg Ser Ile Lys Asp Leu Asp Pro Ala Thr Thr Leu Val
195 200 205
Val Val Val Ser Lys Thr Phe Thr Thr Ala Glu Thr Met Leu Asn Ala
210 215 220
Arg Thr Ile Lys Glu Trp Ile Val Ser Ser Leu Gly Pro Gln Ala Val
225 230 235 240
Ser Lys His Met Ile Ala Val Ser Thr Asn Leu Lys Leu Val Lys Glu
245 250 255
Phe Gly Ile Asp Pro Asn Asn Ala Phe Ala Phe Trp Asp Trp Val Gly
260 265 270
Gly Arg Tyr Ser Val Cys Ser Ala Val Gly Val Leu Pro Leu Ser Leu
275 280 285
Gln Tyr Gly Phe Pro Ile Val Gln Lys Phe Leu Glu Gly Ala Ser Ser
290 295 300
Ile Asp Asn His Val His Thr Ser Ser Phe Glu Lys Asn Ile Pro Val
305 310 315 320
Leu Leu Gly Leu Leu Ser Val Trp Asn Val Ser Phe Leu Gly Tyr Pro
325 330 335
Ala Arg Ala Ile Leu Pro Tyr Cys Gln Ala Leu Glu Lys Leu Ala Pro
340 345 350
His Ile Gln Gln Leu Ser Met Glu Ser Asn Gly Lys Gly Val Ser Ile
355 360 365
Asp Gly Val Arg Leu Pro Phe Glu Ala Gly Glu Ile Asp Phe Gly Glu
370 375 380
Pro Gly Thr Asn Gly Gln His Ser Phe Tyr Gln Leu Ile His Gln Gly
385 390 395 400
Arg Val Ile Pro Cys Asp Phe Ile Gly Val Ile Lys Ser Gln Gln Pro
405 410 415
Val Tyr Leu Lys Gly Glu Thr Val Ser Asn His Asp Glu Leu Met Ser
420 425 430
Asn Phe Phe Ala Gln Pro Asp Ala Leu Ala Tyr Gly Lys Thr Pro Glu
435 440 445
Gln Leu His Ser Glu Lys Val Pro Glu Asn Leu Ile Pro His Lys Thr
450 455 460
Phe Gln Gly Asn Arg Pro Ser Leu Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Ser
465 470 475 480
Ala Tyr Glu Ile Gly Gln Leu Leu Ser Ile Tyr Glu His Arg Ile Ala
485 490 495
Val Gln Gly Phe Ile Trp Gly Ile Asn Ser Phe Asp Gln Trp Gly Val
500 505 510
Glu Leu Gly Lys Ser Leu Ala Ser Glu Val Arg Lys Gln Leu His Ala
515 520 525
Ser Arg Met Glu Gly Lys Pro Val Glu Gly Phe Asn Pro Ser Ala Ala
530 535 540
Ser Leu Leu Thr Arg Phe Leu Ala Val Lys Pro Ser Thr Pro Tyr Asp
545 550 555 560
Thr Thr Val Leu Pro Lys Val
565
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcctccgcgg tggtatggcc aagaagagcg tgggcgac 38
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccggggtacc tcatacggtc accgacctcg tcat 34
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgggcaagtc actggcttct gaagtgagga aac 33
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agaagccagt gacttgccca gctccactcc 30
Claims (9)
1.一种蛋白质，其特征在于，该蛋白质是由6-磷酸葡萄糖异构酶蛋白的第521位氨基酸由苏氨酸突变为谷氨酸，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
2.一种基因，其特征在于，所述基因为编码权利要求1所述的蛋白质的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
4.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒中含有权利要求2或3所述的基因。
5.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求2或3所述的基因或权利要求4所述的表达盒。
6.一种宿主，其特征在于，所述宿主中含有权利要求2或3所述的基因或者权利要求4所述的表达盒或者权利要求5所述的重组载体，所述宿主为宿主菌株。
7.权利要求1所述的蛋白质的用途，其特征在于，所述用途包括如下F～K中的至少一种：
F、作为6-磷酸葡萄糖异构酶的用途；
G、催化6-磷酸果糖转化为6-磷酸葡萄糖的用途；
H、催化6-磷酸葡萄糖转化为6-磷酸果糖的用途；
I、以6-磷酸果糖为原料制备6-磷酸葡萄糖酸的用途；
J、促进植物淀粉的合成的用途；
K、提高植物光合效力的用途。
8.权利要求2或3所述的基因，或者权利要求4所述的表达盒，或者权利要求5所述的重组载体，或者权利要求6所述的宿主，在制备6-磷酸葡萄糖异构酶产品中的用途。
9.权利要求1所述的蛋白质的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：培养权利要求6所述的宿主，破碎，纯化。
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Applications Claiming Priority (1)
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2022
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