DE60224536T2

DE60224536T2 - Verfahren zur herstellung von l-aminosäuren unter verwendung von stämmen aus der familie der enterobacteriaceae

Info

Publication number: DE60224536T2
Application number: DE60224536T
Authority: DE
Inventors: Mechthild Rieping
Original assignee: Evonik Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2001-07-06
Filing date: 2002-06-14
Publication date: 2009-01-08
Anticipated expiration: 2022-06-15
Also published as: CA2453008A1; WO2003004670A3; EP1404838A2; EP1404858B1; US20040241813A1; WO2003004670A2; DE60235810D1; AU2002316983A1; WO2003004665A2; ATE415478T1; ATE449167T1; EP1404835A2; EP1404858A2; ES2318022T3; ES2336655T3; EP1404836B1; EP1404837A2; AU2002316982A1; EP1404856B1; ATE334220T1

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Threonin unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae, in denen man mindestens das Gen dps von E. coli überexprimiert.
Stand der Technik
L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, finden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierenährung Anwendung.
Es ist bekannt, L-Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen der Enterobacteriaceae, insbesondere Escherichia coli (E. coli) und Serratia marcescens, herzustellen. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen, wie z. B. Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien wie z. B. die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform, durch z. B. Ionenaustauschchromatographie, oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.
Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite wie z. B. das Threonin-Analogon α-Amino-β-hydroxyvaleriansäure (AHV) oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und L-Aminosäure wie z. B. L-Threonin produzieren.
Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung L- Aminosäuren produzierender Stämme der Familie Enterobacteriaceae eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die Produktion untersucht.
Der Stand der Technik wird durch die folgenden Dokumente repräsentiert:

D1: Kase et al: "Studies an L-Threonine fermentation part I. Produktion of L-Threonine by auxotrophic mutants of various Bacteria" Agricultural and Biological Chemistry, Japan Society for Bioscience, Biotechnology and Agrochemistry, JP, Bd. 35, Nr. 13, 1971, S. 2089–2096, SP000984541 ISSN: 0002-1369. Fünfzehn Bakterienstämme wurden mit ultraviolettem Licht oder N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin behandelt, um auxotrophe Mutanten zu gewinnen, die dann einem Screening auf ihre Fähigkeit zur Produktion von L-Threonin unterzogen wurden. Dabei erhielt man von jedem Stamm jeweils eine Reihe von Auxotrophen. Unter diesen fanden sich Produzenten großer Mengen an L-Threonin bei Aerobacter aerogenes, Serratia marcescens und Escherichia coli, den Mitgliedern der Familie Enterobacteriaceae.
D2: Azam Talukder Ali et al.: "Growth phase-dependent variation in protein composition of the Escherichia coli nucleoid". Journal of Bacteriology, Bd. 181, Nr. 20, Oktober 1999 (1999-10), S. 6361–6370, XP002236141 ISSN: 0021-9193. Die genomische DNA von Escherichia coli ist mit etwa 10 DNA-bindenden Strukturproteinen assoziiert, wobei alle zusammen ein Nukleoid bilden. Die Nukleoidproteine spielen neben ihrer strukturellen Rolle gewisse funktionelle Rollen bei der globalen Regulation solch essentieller DNA-Funktionen wie Replikation, Rekombination und Transkription. Dps wurde als hungerinduzierbares DNA-bindendes Protein in E. coli identifiziert. Hohe Dps-Niveaus werden auch unter Bedingungen von Ernährungs- und oxidativem Stress produziert.
D3: Aus der US 4 278 765 (Debabov Vladimir G. et al.), 14. Juli 1981 (1981-07-14) ist ein Verfahren zur Konstruktion von Aminosäuren produzierenden Stämmen bekannt, bei dem ein DNA-Chromosomenfragment eines Spendermikroorganismus, das die Synthese einer ausgewählten Aminosäure steuernde Gene mit einer die negative Regulation der Synthese dieser Aminosäure zerstörenden Mutation enthält, mit einem Vektor-DNA-Molekül unter Bildung eines DNA-Hybridmoleküls kombiniert wird. Dabei wird ein zur Bereitstellung der Amplifikation des DNA-Hybridmoleküls fähiges Vektor-DNA-Molekül eingesetzt.
D4: Die WO 98 04715 A (Archer Daniel Midland Co.), 5. Februar 1998 (1998-02-05) richtet sich auf ein Verfahren zur Produktion von L-Threonin, bei dem man die folgenden Schritte durchführt:
a) Kultivieren eines E. coli-Stamms in einem Medium; und
b) Isolieren von L-Threonin, das von den besagten E. coli produziert wird, wobei der E. coli-Stamm:
(i) auf dem Chromosom wenigstens ein Threonin-Operon (thr) in operativer Verknüpfung mit wenigstens einem nicht nativen Promotor enthält und
(ii) keine rekombinanten Plasmide mit einem oder mehreren, für eines oder mehrere der Threoninbiosynthese-Enzyme codierenden Genen benötigt, um Threonin zu produzieren.
D5: Shiio I et al.: "Threonine production by Dihydrodipicolinate Synthase-defective Mutants of Brevibacterium Flavum". Agricultural and Biological Chemistry, Japan, Society for Bioscience, Biotechnology and Agrochem. Tokyo, JP, Bd. 53, Nr. 1, 1989, S. 41–48, XP000049058 ISSN: 0002-1369. Hier werden Threonin produzierende Brevibacterium flavum-Mutanten beschrieben, denen zwar die Aktivität der Dihydrodipicolinat-Synthase (DPS) fehlte, die jedoch gegenüber einer Rückkopplungshemmung durch Threonin empfindliche Wildtyp-Homoserin-Dehydrogenase (HD) aufwiesen und die als gegenüber α-Amino-β-hydroxyvaleriansäure (AHV) resistente Stämme isoliert wurden.
D6: Chassagnole Christophe et al.: "An integrated study of threonine-pathway enzyme kinetics in Escherichia coli". Biochemical Journal, Bd. 356, Nr. 2, 1. Juni 2001 (2001-06-01), S. 415–423, XP002232684 ISSN: 0264-6021. Hier wurden die kinetischen Parameter der einzelnen Schritte des Threonin-Wegs von Aspartat aus in Escherichia coli unter einem einzigen Satz von Versuchsbedingungen, die unter dem Gesichtspunkt physiologischer Relevanz gewählt wurden, bestimmt.

Aufgabe der Erfindung
Die Erfinder haben sich die Aufgabe gestellt, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von L-Threonin bereitzustellen.
Beschreibung der Erfindung
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Threonin unter Verwendung von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, die insbesondere bereits L-Aminosäuren produzieren und in denen man die für das Gen dps codierende Nukleolidsequenz überexprimiert.
Werden im folgenden L-Aminosäuren oder Aminosäuren erwähnt, ist damit L-Threonin einschließlich seiner Salze gemeint.
Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellularen Aktivität eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA codiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor oder ein Gen oder Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym bzw. Protein mit einer hohen Aktivität codiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
Durch die Maßnahmen der Verstärkung, insbesondere Überexpression, wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500%, maximal bis 1000% oder 2000% bezogen auf die des Wildtyp-Proteins beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus erhöht.
Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte durchführt:

a) Fermentation von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen man das Gen dps von E. coli überexprimiert,
b) Anreicherung von L-Threonin im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae und
c) Isolierung der genannten L-Aminosäure, wobei gegebenenfalls Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder die Biomasse in ihrer Gesamtheit oder Anteilen (> 0 bis 100%) davon im Produkt verbleiben.

Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können L-Aminosäuren aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, gegebenenfalls Stärke, gegebenenfalls Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es handelt sich um Vertreter der Familie Enterobacteriaceae, ausgewählt aus den Gattungen Escherichia, Erwinia, Providencia und Serratia. Die Gattungen Escherichia und Serratia werden bevorzugt. Bei der Gattung Escherichia ist insbesondere die Art Escherichia coli und bei der Gattung Serratia insbesondere die Art Serratia marcescens zu nennen.
Geeignete L-Threonin produzierende Stämme, insbesondere der Gattung Escherichia, insbesondere der Art
Escherichia coli sind beispielsweise
Escherichia coli TF427
Escherichia coli H4578
Escherichia coli KY10935
Escherichia coli VNIIgenetika MG442
Escherichia coli VNIIgenetika M1
Escherichia coli VNIIgenetika 472T23
Escherichia coli BKIIM B-3996
Escherichia coli kat 13
Escherichia coli KCCM-10132.
Geeignete L-Threonin produzierende Stämme der Gattung Serratia, insbesondere der Art Serratia marcescens sind beispielsweise
Serratia marcescens HNr21
Serratia marcescens TLr156
Serratia marcescens T2000.
L-Threonin produzierende Stämme aus der Familie der Enterobacteriaceae besitzen bevorzugt, unter anderen, ein oder mehrere der genetischen bzw. phänotypischen Merkmale ausgewählt aus der Gruppe: Resistenz gegen α-Amino-β-hydroxyvaleriansäure, Resistenz gegen Thialysin, Resistenz gegen Ethionin, Resistenz gegen α-Methylserin, Resistenz gegen Diaminobernsteinsäure, Resistenz gegen α-Aminobuttersäure, Resistenz gegen Borrelidin, Resistenz gegen Rifampicin, Resistenz gegen Valin-Analoga wie beispielsweise Valinhydroxamat, Resistenz gegen Purinanaloga wie beispielsweise 6-Dimethylaminopurin, Bedürftigkeit für L-Methionin, gegebenenfalls partielle und kompensierbare Bedürftigkeit für L-Isoleucin, Bedürftigkeit für meso-Diaminopimelinsäure, Auxotrophie bezüglich Threonin-haltiger Dipeptide, Resistenz gegen L-Threonin, Resistenz gegen L-Homoserin, Resistenz gegen L-Lysin, Resistenz gegen L-Methionin, Resistenz gegen L-Glutaminsäure, Resistenz gegen L-Aspartat, Resistenz gegen L-Leucin, Resistenz gegen L-Phenylalanin, Resistenz gegen L-Serin, Resistenz gegen L-Cystein, Resistenz gegen L-Valin, Empfindlichkeit gegenüber Fluorpyruvat, defekte Threonin-Dehydrogenase, gegebenenfalls Fähigkeit zur Saccharose-Verwertung, Verstärkung des Threonin-Operons, Verstärkung der Homoserin-Dehydrogenase I-Aspartatkinase I bevorzugt der feed back resistenten Form, Verstärkung der Homoserinkinase, Verstärkung der Threoninsynthase, Verstärkung der Aspartatkinase, gegebenenfalls der feed back resistenten Form, Verstärkung der Aspartatsemialdehyd-Dehydrogenase, Verstärkung der Phosphoenolpyruvat-Carboxylase, gegebenenfalls der feed back resistenten Form, Verstärkung der Phosphoenolpyruvat-Synthase, Verstärkung der Transhydrogenase, Verstärkung des RhtB-Genproduktes, Verstärkung des RhtC-Genproduktes, Verstärkung des YfiK-Genproduktes, Verstärkung einer Pyruvat-Carboxylase und Abschwächung der Essigsäurebildung.
Es wurde gefunden, daß Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae nach Überexpression des Gens dps von E. coli in verbesserter Weise L-Threonin produzieren. Diese Mikroorganismen sind ebenfalls Teil der Erfindung.
Allgemein ist die Verwendung endogener Gene bevorzugt. Unter "endogenen Genen" bzw. "endogenen Nukleotidsequenzen" versteht man die in der Population einer Spezies vorhandenen Gene bzw. Nukleotidsequenzen.
Die Nukleotidsequenzen der Gene von Escherichia coli gehören zum Stand der Technik und können ebenfalls der von Blattner et al. (Science 277, 1453–1462 (1997)) publizierten Genomsequenz von Escherichia coli entnommen werden.
Die folgenden Angaben zum dps-Gen sind unter anderem aus dem Stand der Technik bekannt:
Bezeichnung:
Globaler Regulator Dps, DNA-Bindeprotein
Referenz:
Almiron et al.; Genes & Development 6(12B), 2646–54 (1992); Azam et al.; Journal of Bacteriology, 181(20): 6361–6370 (1999)
Accession No.:
AE000183
Alternative Gennamen:
pexB, vtm
Die Nukleinsäuresequenzen können den Datenbanken des National Center for Biotechnology Information (NCBI) der National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA), der Nukleotidsequenz-Datenbank der European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Deutschland bzw. Cambridge, UK) oder der DNA Datenbank von Japan (DDBJ, Mishima, Japan) entnommen werden.
Weiterhin können Allele des Gens dps verwendet werden, die sich aus der Degeneriertheit des genetischen Codes oder durch funktionsneutrale Sinnmutationen ("sense mutations") ergeben.
Zur Erzielung einer Verstärkung können beispielsweise die Expression der Gene oder die katalytischen Eigenschaften der Proteine erhöht werden. Gegebenenfalls können beide Maßnahmen kombiniert werden.
Zur Erzielung einer Überexpression kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im Verlaufe der fermentativen L-Threonin-Produktion zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführang erreicht werden.
Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Chang und Cohen (Journal of Bacteriology 134: 1141–1156 (1978)), bei Hartley und Gregori (Gene 13: 347–353 (1981)), bei Amann und Brosius (Gene 40: 183–190 (1985)), bei de Broer et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 80: 21–25 (1983)), bei LaVallie et al. (BIO/TECHNOLOGY 11, 187–193 (1993)), in PCT/US97/13359 , bei Llosa et al. (Plasmid 26: 222–224 (1991)), bei Quandt und Klipp (Gene 80: 161–169 (1989)), bei Hamilton (Journal of Bacteriology 171: 4617–4622 (1989)), bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191–195 (1998)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.
In Enterobacteriaceae replizierbare Plasmidvektoren wie z. B. von pACYC184 abgeleitete Kloniervektoren (Bartolomé et al.; Gene 102, 75–78 (1991)), pTrc99A (Amann et al.; Gene 69: 301–315 (1988)) oder pSC101-Derivate (Vocke und Bastia, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80(21): 6557–6561 (1983)) können verwendet werden. In einem erfindungsgemäßen Verfahren kann man einen mit einem Plasmidvektor transformierten Stamm einsetzen, wobei der Plasmidvektor mindestens eine für das Gen dps codierende Nukleotidsequenz trägt.
Es ist ebenfalls möglich, Mutationen, die die Expression des jeweiligen Gens beeinflussen, durch Sequenzaustausch (Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 174, 4617–4622 (1989)), Konjugation oder Transduktion in verschiedene Stämme zu überführen.
Weiterhin kann es für die Produktion von L-Threonin mit Stämmen der Familie Enterobacteriaceae vorteilhaft sein, zusätzlich zur Überexpresion des Gens dps ein oder mehrere Enzyme des bekannten Threonin-Biosyntheseweges oder Enzyme des anaplerotischen Stoffwechsels oder Enzyme für die Produktion von reduziertem Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat zu überexprimieren.
So können beispielsweise gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe

– das für die Aspartatkinase, die Homoserin-Dehydrogenase, die Homoserinkinase und die Threoninsynthase codierende thrABC-Operon ( US-A-4,278,765 ),
– das für die Pyruvat-Carboxylase codierende pyc-Gen ( DE-A-198 31 609 ),
– das für die Phosphoenolpyruvat-Synthase codierende pps-Gen (Molecular and General Genetics 231(2): 332–336 (1992)),
– das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxylase codierende ppc-Gen (Gene 31: 279–283 (1984)),
– die für die Transhydrogenase codierenden Gene pntA und pntB (European Journal of Biochemistry 158: 647–653 (1986)),
– das Homoserinresistenz vermittelnde Gen rhtB ( EP-A-0 994 190 ),
– das für die Malat:Chinon Oxidoreduktase codierende mqo-Gen ( WO 02/06459 ),
– das Threoninresistenz vermittelnde Gen rhtC ( EP-A-1 013 765 ),
– das für das Threoninexportprotein codierende thrE-Gen von Corynebacterium glutamicum ( WO 01/92545 ), und
– das für die Glutamat-Dehydrogenase codierende gdhA-Gen (Nucleic Acids Research 11: 5257–5266 (1983); Gene 23: 199–209 (1983))
– das für den Regulator des Leucin-Lrp-Regulons und hochaffiner Transportsysteme verzweigtkettiger Aminosäuren codierende lrp-Gen (Journal of Biological Chemistry 266(17): 10768–10774 (1991), Accession No. AE000191),
– das für die Phosphohistidin-Protein-Hexose-Phosphotransferase des Phosphotransferase-Systems PTS codierende ptsH-Gen des ptsHIcrr-Operons (Journal of Biological Chemistry 262(33): 16241–16253 (1987), Accession No. AE000329),
– das für Enzym I des Phosphotransferase-Systems PTS codierende ptsI-Gen des ptsHIcrr-Operons (Journal of Biological Chemistry 262(33): 16241–16253 (1987), Accession No. AE000329),
– das für die glucosespezifische IIA-Komponente des Phosphotransferase-Systems PTS codierende crr-Gen des ptsHIcrr-Operons (Journal of Biological Chemistry 262(33): 16241–16253 (1987), Accession No. AE000329),

Weiterhin kann es für die Produktion von L-Threonin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Überexpression des Gens dps eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe

– das für die Threonin-Dehydrogenase codierende tdh-Gen (Journal of Bacteriology 169, 4716–4721 (1987)),
– das für die Malat-Dehydrogenase (E. C. 1.1.1.37) codierende mdh-Gen (Vogel et al., Archives in Microbiology 149, 36–42 (1987)),
– das für das Enzym Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase codierende pckA-Gen (Journal of Bacteriology 172, 7151–7156 (1990)),
– das für die Pyruvat-Oxidase codierende poxB-Gen (Nucleic Acids Research 14(13), 5449–5460 (1986)),
– das für das Enzym Isocitrat-Lyase codierende aceA-Gen (Journal of Bacteriology 170, 4528–4536 (1988)),
– das für den DgsA-Regulator des Phosphotransferase-Systems codierende dgsA-Gen (Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 59, 256–251 (1995)), das auch unter der Bezeichnung mlc-Gen bekannt ist,
– das für den Fructose-Repressor codierende fruR-Gen (Molecular and General Genetics 226, 332–336 (1991)), das auch unter der Bezeichnung cra-Gen bekannt ist, und
– das für den Faktor sigma³⁸ ( WO 01/05939 ) codierende und auch unter dem Namen katF-Gen bekannte rpoS-Gen,

Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA codiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität codiert bzw. das entsprechende Enzym (Protein) oder Gen inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
Durch die Maßnahmen der Abschwächung wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen auf 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration des Wildtyp-Proteins, beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus, herabgesenkt.
Weiterhin kann es für die Produktion von L-Threonin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Verstärkung des Gens dps unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK; 1982).
Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können im batch-Verfahren (Satzkultivierung), im fed batch-(Zulaufverfahren) oder im repeated fed batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikro organismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C. USA, 1981) enthalten.
Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und gegebenenfalls Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten, wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur können basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt werden. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoffhaltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 25°C bis 45°C und vorzugsweise bei 30°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum an L-Aminosäuren bzw. L-Threonin gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Die Analyse von L-Aminosäuren kann durch Anionenaustauschchromatographie mit anschließender Ninhydrin-Derivatisierung erfolgen, so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30: 1190–1206 (1958)) beschrieben, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51: 1167–1174 (1979)) beschrieben.
Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur fermentativen Herstellung von L-Threonin.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Das verwendete Minimal-(M9) bzw. Vollmedium (LB) für Escherichia coli ist von J. H. Miller (A Short Course in Bacterial Genetics (1992), Cold Spring Harbor Laboratory Press) beschrieben. Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli sowie alle Techniken in Verbindung mit Restriktion, Ligation sowie Behandlung mit Klenow und alkalischer Phosphatase werden nach dem Verfahren von Sambrook et al. (Molecular Cloning – A Laboratory Manual. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press) durchgeführt. Die Transformation von Escherichia coli wird, wenn nicht anders angegeben, nach dem Verfahren von Chung et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (1989) 86: 2172–2175) durchgeführt.
Die Inkubationstemperatur für die Herstellung von Stämmen und Transformanten liegt bei 37°C.
Beispiel 1
Konstruktion des Expressionsplasmids pTrc99Adps
Das dps-Gen aus E. coli K12 wird unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) sowie synthetischer Oligonukleotide amplifiziert. Ausgehend von der Nukleotidsequenz des dps-Gens in E. coli K12 Mg1655 (Accession Number AE000183, Blattner et al. (Science 277: 1453–1474 (1997)) werden PCR-Primer synthetisiert (MWG Biotech, Ebersberg, Deutschland). Die Sequenzen der Primer sind dabei so modifiziert, daß Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme entstehen. Die Erkennungssequenz für XbaI wird für den Primer dps5 und die Erkennungssequenz für HindIII für den Primer dps6 gewählt, wobei diese Stellen zur Kennzeichnung in den unten dargestellten Nukleotidsequenzen jeweils unterstrichen sind: dps5:
dps6:
Die für die PCR eingesetzte chromosomale DNA von E. coli K12 MG1655 wird nach Herstellerangaben mit "Qiagen Genomic-tips 100/G" (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Ein ungefähr 550 Bp großes DNA-Fragment lässt sich mit den spezifischen Primern unter Standard-PCR-Bedingungen (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) mit Pfu-DNA-Polymerase (Promega Corporation, Madison, USA) amplifizieren. Das PCR-Produkt wird mit den Restriktionsenzymen XbaI und HindIII geschnitten und mit dem Vektor pTrc99A (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden), der mit den Enzymen XbaI und HindIII verdaut wurde, ligiert.
Der E. coli-Stamm Xl1-Blue MRF' (Stratagene, La Jolla, USA) wird mit dem Ligationsansatz transformiert, und plasmidhaltige Zellen werden auf LB-Agar, der mit 50 μg/ml Ampicillin versetzt ist, selektioniert. Die erfolgreiche Klonierung kann nach Plasmid-DNA-Isolierung durch Kontrollspaltung mit den Enzymen SspI, StyI, HinfI und HincII nachgewiesen werden. Das Plasmid erhält die Bezeichnung pTrc99Adps (1).
Beispiel 2
Herstellung von L-Threonin mit dem Stamm MG442/pTrc99Adps
Der L-Threonin produzierende E. coli-Stamm MG442 ist in der Patentschrift US-A-4,278,765 beschrieben und bei der Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM, Moskau, Russland) als CMIM B-1628 hinterlegt.
Der Stamm MG442 wird mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Expressionsplasmid pTrc99Adps sowie mit dem Vektor pTrc99A transformiert, und plasmidhaltige Zellen werden auf LB-Agar mit 50 μg/ml Ampicillin selektioniert. Auf diese Weise erhält man die Stämme MG442/pTrc99Adps und MG442/pTrc99A. Ausgewählte Einzelkolonien werden anschließend auf Minimalmedium mit der folgenden Zusammensetzung: 3,5 g/l Na₂HPO₄·2H₂O, 1,5 g/l KH₂PO₄, 1 g/l NH₄Cl, 0,1 g/l MgSO₄·7H₂O, 2 g/l Glucose, 20 g/l Agar, 50 mg/l Ampicillin, weiter vermehrt. Die Bildung von L-Threonin wird in Batch-Kulturen von 10 ml, die in 100-ml-Erlenmeyerkolben angesetzt werden, überprüft. Hierzu werden jeweils 10 ml Vorkulturmedium in der folgenden Zusammensetzung: 2 g/l Hefeextrakt, 10 g/l (NH₄)₂SO₄, 1 g/l KH₂PO₄, 0,5 g/l MgSO₄·7H₂O, 15 g/l CaCO₃, 20 g/l Glucose, 50 mg/l Ampicillin beimpft, und der Ansatz wird 16 Stunden bei 37°C und 180 UpM auf einem ESR-Inkubator der Firma Kühner AG (Birsfelden, Schweiz) inkubiert. Je 250 μl dieser Vorkulturen werden dann in 10 ml Produktionsmedium (25 g/l (NH₄)₂SO₄, 2 g/l KH₂PO₄, 1 g/l MgSO₄·7H₂O, 0,03 g/l FeSO₄·7H₂O, 0,018 g/l MnSO₄·1H₂O, 30 g/l CaCO₃, 20 g/l Glucose, 50 mg/l Ampicillin) überimpft, und der Ansatz wird 48 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Bildung von L-Threonin durch den Ausgangsstamm MG442 wird in gleicher Weise überprüft, wobei jedoch keine Zugabe von Ampicillin zum Medium erfolgt. Nach der Inkubation wird die optische Dichte (OD) der Kultursuspension mit einem LP2W-Photometer der Firma Dr. Lange Co. (Düsseldorf, Deutschland) bei einer Messwellenlänge von 660 nm bestimmt.
Anschließend wird die Konzentration an gebildetem L-Threonin im steril filtrierten Kulturüberstand mit einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) mittels Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenreaktion mit Ninhydrinnachweis bestimmt.
In Tabelle 1 ist das Ergebnis des Versuchs dargestellt. Tabelle 1

Stamm OD (600 nm) L-Threonin (g/l)

MG442 5,6 1,4

MG442/pTrc99A 3,8 1,3

MG442/pTrc99Adps 3,4 2,2
Kurze Beschreibung der Figur:
1: Karte des das dps-Gen enthaltenden Plasmids pTrc99Adps
Längenangaben sind als ungefähre Werte aufzufassen. Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben die folgende Bedeutung:

• Amp: Ampicillinresistenz-Gen
• lacI: Gen für das Repressorprotein in den trc-Promotoren
• Ptrc: trc-Promotorbereich, IPTG-induzierbar
• dps: Codierender Bereich der dps-Gene
• 5S: 5S-rRNA-Bereich
• rrnBT: rRNA-Terminatorbereich

Die Abkürzungen für die Restriktionsenzyme haben die folgende Bedeutung:

• HincII: Restriktionsendonuklease aus Haemophilus influenzae R_c
• HinfI: Restriktionsendonuklease aus Haemophilus influenzae R_f
• HindIII: Restriktionsendonuklease aus Haemophilus influenzae
• SspI: Restriktionsendonuklease aus Sphaerotilus species ATCC 13925
• StyI: Restriktionsendonuklease aus Salmonella typhi
• XbaI: Restriktionsendonuklease aus Xanthomonas campestris

Claims

Verfahren zur Herstellung von L-Threonin, bei dem man folgende Schritte durchführt: a) Fermentation der die genannte L-Aminosäure produzierenden Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen man das für den globalen Regulator Dps codierende Gen dps von E. coli überexprimiert, wobei man zur Überexprimierung die Kopienzahl des dps-Gens erhöht, b) Anreicherung der genannten L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen und c) Isolierung der genannten L-Aminosäure, wobei gegebenenfalls Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder die Biomasse in ihrer Gesamtheit oder Anteilen (> 0 bis 100%) davon im Produkt verbleiben.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man die Kopienzahl des für den globalen Regulator Dps codierenden Polynukleotids dadurch erhöht, dass man die genannten Mikroorganismen mit einem das dps-Gen und einen induzierbaren Promotor enthaltenden Vektor transformiert und die genannten Mikroorganismen L-Threonin produzieren.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man zur Herstellung von L-Threonin Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae fermentiert, in denen man zusätzlich gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe: 3.1 das für die Aspartatkinase, die Homoserin-Dehydrogenase, die Homoserinkinase und die Threoninsynthase codierende thrABC-Operon, 3.2 das für die Pyruvat-Carboxylase codierende pyc-Gen, 3.3 das für die Phosphoenolpyruvat-Synthase codierende pps-Gen, 3.4 das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxylase codierende ppc-Gen, 3.5 die für die Transhydrogenase codierenden Gene pntA und pntB, 3.6 das Homoserinresistenz vermittelnde Gen rhtB, 3.7 das für die Malat:Chinon Oxidoreduktase codierende mqo-Gen, 3.8 das Threoninresistenz vermittelnde Gen rhtC, 3.9 das für das Threoninexportprotein codierende thrE-Gen, 3.10 das für die Glutamat-Dehydrogenase codierende gdhA-Gen, 3.11 das für den Regulator des Leucin-Lrp-Regulons codierende lrp-Gen, 3.12 das für die Phosphohistidin-Protein-Hexose-Phosphotransferase codierende ptsH-Gen, 3.13 das für Enzym I des Phosphotransferasesystems codierende ptsI-Gen, 3.14 das für die glucosespezifische IIA-Komponente codierende crr-Gen überexprimiert.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man zur Herstellung von L-Threonin Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae fermentiert, in denen man zusätzlich gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe: 4.1 das für die Threonin-Dehydrogenase codierende tdh-Gen, 4.2 4.3 4.4 das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase codierende pckA-Gen, 4.5 das für die Pyruvat-Oxidase codierende poxB-Gen, 4.6 das für die Isocitrat-Lyase codierende aceA-Gen, 4.7 das für den DgsA-Regulator des Phosphotransferase-Systems codierende dgsA-Gen, 4.8 das für den Fructose-Repressor codierende fruR-Gen, 4.9 das für den Faktor sigma³⁸ codierende rpoS-Gen, ausschaltet.
Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen die das für den globalen Regulator Dps codierende dps-Gen von E. coli überexprimiert ist, wobei die Überexprimierung durch Erhöhen der Kopienzahl des dps-Gens erreicht wird und die L-Threonin produzieren.
Mikroorganismen nach Anspruch 5 der Gattung Escherichia.
Mikroorganismen nach Anspruch 5 der Art Escherichia coli.