-
Gebiet der
Erfindung
-
Diese
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren ausgewählt aus
der Gruppe L-Threonin, L-Valin, L-Methionin, L-Homoserin und L-Lysin,
insbesondere L-Threonin, unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae,
wobei mindestens das pgm-Gen
Enhancement aufweist.
-
Stand der
Technik
-
L-Aminosäuren, insbesondere
L-Threonin, werden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie,
in der Nahrungsmittelindustrie und speziell in der Tierernährung verwendet.
-
Es
ist bekannt, L-Aminosäuren
durch Fermentierung von Stämmen
der Enterobacteriaceae, insbesondere Escherichia coli (E. coli)
und Serratia marcescens, herzustellen. Wegen ihrer großen Bedeutung
wird fortlaufend daran gearbeitet, die Herstellungsverfahren zu
verbessern. Verbesserungen des Verfahrens können Fermentierungsmaßnahmen,
wie z. B. Rühren
und Sauerstoffzufuhr, oder die Zusammensetzung des Nährmediums,
wie z. B. der Zuckerkonzentration während der Fermentierung, oder
die Aufarbeitung zu der Produktform, durch z. B. Ionenaustauschchromatographie,
oder die innewohnenden Ausstoßeigenschaften
der Mikroorganismen selbst betreffen.
-
Verfahren
der Mutagenese, Selektion oder Mutantenselektion werden verwendet,
um die Ausstoßeigenschaften
dieser Mikroorganismen zu verbessern. Stämme, die resistent gegenüber Antimetaboliten
sind, wie z. B. dem Threoninanalogon α-Amino-β-hydroxyvaleriansäure (AHV),
oder die auxotroph für
Metabolite mit Regulierungsbedeutung sind und L-Aminosäure, wie
z. B. L-Threonin, produzieren, werden in dieser Weise erhalten.
-
Verfahren
der rekombinanten DNA-Technik sind seit einigen Jahren auch zur
Verbesserung des Stammes der Stämme
der Familie Enterobacteriaceae verwendet worden, die L-Aminosäuren produzieren,
indem individuelle Gene für
die Biosynthese von Aminosäuren
amplifiziert werden und die Wirkung auf die Produktion untersucht
wird. Es ist aus J. R. Landgraf et al., Biochimie (Paris), Band
76, Nr. 10–11,
1994, Seiten 1063–1070 bekannt,
dass verstärkte
Exprimierung von H-NS eine verringernde Auswirkung auf die Synthese
von Isoleucin hat.
-
US-A-4
347 318 offenbart ein Verfahren zur Produktion von L-Threonin unter
Verwendung von E. coli-Transformanten mit einem Plasmid, das genetisches
Material umfasst, welches die L-Threoninsynthese betrifft, das von
einem E. coli-Mutanten erhalten wurde, der gegenüber AHV resistent ist.
-
Koizumi
et al. (Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, Oktober 2000, Band
25, Seiten 213–217)
offenbart lediglich den Stamm E. coli NM522/pnK11/pNT55, der das
pgm-Gen in Plasmid pNT55 aufweist, und betrifft die Produktion von
fucosylierten Oligosacchariden.
-
Gegenstand
der Erfindung
-
Der
Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung neuer Maßnahmen
zur verbesserten fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren ausgewählt aus
der Gruppe L-Threonin,
L-Valin, L-Methionin, L-Homoserin und L-Lysin, insbesondere L-Threonin,
und die Bereitstellung geeigneter Mikroorganismen.
-
Zusammenfassung
der Erfindung
-
Die
Erfindung liefert ein Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren ausgewählt aus
der Gruppe L-Threonin, L-Valin,
L-Methionin, L-Homoserin und L-Lysin, insbeson dere L-Threonin, unter
Verwendung von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, die
insbesondere bereits diese L-Aminosäuren produzieren, und in denen
die Nukleotidsequenz, die das pgm-Gen codiert, Enhancement aufweist.
-
Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
-
Wenn
L-Aminosäuren
oder Aminosäuren
nachfolgend genannt sind, bedeutet dies eine oder mehrere Aminosäuren einschließlich ihrer
Salze ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus L-Threonin, L-Valin, L-Methionin, L-Homoserin
und L-Lysin. Besonders bevorzugt ist L-Threonin. Der Begriff "Enhancement" beschreibt in diesem
Zusammenhang den Anstieg der intrazellulären Aktivität von einem oder mehreren Enzymen
oder Proteinen bei einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende
DNA codiert sind, beispielsweise durch Erhöhung der Anzahl der Kopien
des Gens oder der Gene, unter Verwendung eines potenten Promoters
oder eines Gens oder Allels, das ein entsprechendes Enzym oder Protein
mit einer hohen Aktivität
codiert, und gegebenenfalls Kombinieren dieser Maßnahmen.
-
Mit Überexprimierung
wird die Aktivität
oder Anreicherung des entsprechenden Proteins allgemein um mindestens
10 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 % oder 500
%, bis zu maximal 1000 % oder 2000 % erhöht, bezogen auf diejenige des
Proteins vom Wildtyp oder die Aktivität oder Anreicherung des Proteins
in dem Ausgangsmikroorganismus.
-
Das
Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren ausgewählt aus der Gruppe L-Threonin,
L-Valin, L-Methionin, L-Homoserin und L-Lysin ist dadurch gekennzeichnet,
dass die folgenden Schritte durchgeführt werden:
- a)
Fermentation von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae,
die die genannte(n) L-Aminosäure(n) produzieren
und in denen das pgm-Gen aus Escherichia coli mittels Transformation überexprimiert wird,
- b) Anreicherung der L-Aminosäure
im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen und
- c) Isolierung der L-Aminosäure,
wobei Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder die Biomasse insgesamt
oder teilweise (≥ 0
bis 100 %) gegebenenfalls im Produkt verbleiben.
-
Mikroorganismen
der Familie Enterobacteriaceae, die L-Aminosäuren ausgewählt aus der Gruppe L-Threonin,
L-Valin, L-Methionin, L-Homoserin und L-Lysin produzieren und wobei
das pgm-Gen aus E. Coli und das thrABC-Operon, dessen Gene Aspartatkinase,
Homoserin-Dehydrogenase, Homoserinkinase und Threonin-Synthase codieren,
mittels Transformation überexprimiert
werden, sind auch Gegenstand der Erfindung.
-
Die
Mikroorganismen, die die vorliegende Erfindung bereitstellt, können diese
L-Aminosäuren
aus G1ucose, Sucrose, Lactose, Fructose, Maltose, Melassen, gegebenenfalls
Stärke,
gegebenenfalls Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen.
Sie sind auch Vertreter der Familie Enterobacteriaceae ausgewählt aus
den Gattungen Escherichia, Erwinia, Providencia und Serratia. Die
Gattungen Escherichia und Serratia sind bevorzugt. Von der Gattung
Escherichia sind die Spezies Escherichia coli und von der Gattung
Serratia die Spezies Serratia marcescens besonders zu erwähnen.
-
Geeignete
Stämme,
die insbesondere L-Threonin produzieren, von der Gattung Escherichia,
insbesondere der Spezies Escherichia coli, sind beispielsweise
Escherichia
coli TF427
Escherichia coli H4578
Escherichia coli KY10935
Escherichia
coli VNIIgenetika MG442
Escherichia coli VNIIgenetika M1
Escherichia
coli VNIIgenetika 472T23
Escherichia coli BKIIM B-3996
Escherichia
coli kat 13
Escherichia coli KCCM-10132.
-
Geeignete
L-Threonin produzierende Stämme
der Gattung Serratia, insbesondere der Spezies Serratia marcescens,
sind beispielsweise
Serratia marcescens HNr21
Serratia
marcescens TLr156
Serratia marcescens T2000.
-
Stämme der
Familie Enterobacteriaceae, die L-Threonin produzieren, haben vorzugsweise
ein oder mehrere genetische oder phänotypische Merkmale, die ausgewählt sind
aus der Gruppe bestehend aus: Resistenz gegen α-Amino-β-hydroxyvaleriansäure, Resistenz
gegen Thialysin, Resistenz gegen Ethionin, Resistenz gegen α-Methylserin, Resistenz
gegen Diaminobernsteinsäure,
Resistenz gegen α-Aminobuttersäure, Resistenz
gegen Borrelidin, Resistenz gegen Rifampicin, Resistenz gegen Valinanaloga,
wie beispielsweise Valinhydroxamat, Resistenz gegen Purinanaloga,
wie beispielsweise 6-Dimethylaminopurin,
einem Bedarf an L-Methionin, gegebenenfalls einem partiellen und
kompensierbaren Bedarf an L-Isoleucin, einem Bedarf an meso-Diaminopimelinsäure, Auxotrophie
in Bezug auf Threonin enthaltende Dipeptide, Resistenz gegen L-Threonin,
Resistenz gegen L-Homoserin, Resistenz gegen L-Lysin, Resistenz
gegen L-Methionin, Resistenz gegen L-Glutaminsäure, Resistenz gegen L-Aspartat,
Resistenz gegen L-Leucin, Resistenz gegen L-Phenylalanin, Resistenz
gegen L-Serin, Resistenz gegen L-Cystein, Resistenz gegen L-Valin,
Empfindlichkeit gegenüber
Fluorpyruvat, defekte Threonin-Dehydrogenase, gegebenenfalls eine
Fähigkeit
zur Ausnutzung von Sucrose, Enhancement des Threonin-Operons, Enhancement
der Homoserin-Dehydrogenase I-Aspartatkinase I, vorzugsweise der
rückkopplungsresistenten
Form, Enhancement der Homoserinkinase, Enhancement der Threonin-Synthase,
Enhancement der Aspartat-Kinase, gegebenenfalls der rückkopplungsresistenten
Form, Enhancement der Aspartatsemialdehyd-Dehydrogenase, Enhancement der Phosphoenolpyruvat-Carboxylase, gegebenenfalls
der rückkopplungsresistenten
Form, Enhancement der Phosphoenolpyruvat-Synthase, Enhancement der
Transhydrogenase, Enhancement des RhtB-Genprodukts, Enhancement der RhtC-Genprodukts,
Enhancement des YfiK-Genprodukts, Enhancement einer Pyruvat-Carboxylase
und Abschwächung
der Essigsäurebildung.
-
Es
ist gefunden worden, dass Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae
L-Aminosäuren
ausgewählt
aus der Gruppe L-Threonin, L-Valin, L-Methionin, L-Homoserin und
L-Lysin, insbesondere L-Threonin, nach Überexprimierung des pgm-Gens
in verbesserter Weise produzieren.
-
Bevorzugt
ist allgemein die Verwendung endogener Gene. "Endogene Gene" oder "endogene Nukleotidsequenzen" sind so zu verstehen,
dass die Gene oder Nukleotidsequenzen gemeint sind, die in der Population
einer Spezies vorhanden sind.
-
Die
Nukleotidsequenzen der Gene von Escherichia coli gehören zum
Stand der Technik und finden sich auch in der Genomsequenz von Escherichia
coli, die von Blattner et al. (Science 277: 1453–1462 (1997)) veröffentlicht
wurde.
-
Aus
dem Stand der Technik sind unter anderem ferner die folgenden Informationen über das
pgm-Gen bekannt:
-
Beschreibung: Phosphoglucomutase
-
- EC Nr.: 5.4.2.2
- Referenz: Lu und Kleckner, Journal of Bacteriology 176(18):
5847–5851
(1994) Brautaset et al.; Biotechnology and Bioengineering 58(2-3):
299–302
(1998)
- Accession-Nummer: AE000172
-
Die
Nukleinsäuresequenzen
finden sich in den Datenbanken des National Center for Biotechnology Information
(NCBI) der National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA), der
Nukleotidsequenzdatenbank der European Molecular Biologies Laboratories
(EMBL, Heidelberg, Deutschland, oder Cambridge, UK) oder der DNA-Datenbank
von Japan (DDBJ, Mishima, Japan).
-
Allele
des pgm-Gens, die aus der Degeneration des genetischen Codes oder
durch "Sense-Mutationen" der neutralen Funktion
resultieren, können
außerdem
auch verwendet werden.
-
Um
Enhancement zu erreichen, können
beispielsweise die Exprimierung der Gene oder die katalytischen
Eigenschaften der Proteine erhöht
werden. Die beiden Maßnahmen
können
gegebenenfalls kombiniert werden.
-
Um
eine Überexprimierung
zu erreichen, kann die Anzahl der Kopien der entsprechenden Gene
erhöht
werden, oder der Promoter und die Regulierungsregion oder die Ribosomenbindungsstelle
stromaufwärts von
dem Strukturgen kann mutiert werden. Exprimierungscassetten, die
stromaufwärts
von dem Strukturgen eingebaut werden, wirken in der gleichen Weise.
Es ist durch induzierbare Promotoren zudem möglich, die Exprimierung im
Verlauf der fermentativen Produktion von L-Threonin zu erhöhen. Die
Exprimierung wird in ähnlicher
Weise durch Maßnahmen
verbessert, um die Lebensdauer der m-RNA zu verlängern. Die Enzymaktivität weist
zudem auch Enhancement auf, indem der Abbau des Enzymproteins verhindert
wird. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden
mit einer unterschiedlichen Anzahl an Kopien vorhanden sein, oder
können
in das Chromosom integriert und in diesem amplifiziert werden.
-
Alternativ
kann eine Überexprimierung
der in Frage kommenden Gene ferner erreicht werden, indem die Zusammensetzung
der Medien und das Kulturverfahren verändert werden.
-
Anweisungen
findet der Experte in diesem Zusammenhang unter anderem in Chang
und Cohen (Journal of Bacteriology 134: 1141–1156 (1978)), in Hartley und
Gregori (Gene 13: 347–353
(1981)), in Amann und Brosius (Gene 40: 183–190 (1985)), in de Broer et
al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America 80: 21–25
(1983)), in LaVallie et al. (BIO/TECHNOLOGY 11: 187–193 (1993)),
in PCT/US97/13359, in Llosa et al. (Plasmid 26: 222–224 (1991)),
in Quandt und Klipp (Gene 80: 161–169 (1989)), in Hamilton (Journal
of Bacteriology 171: 4617–4622
(1989)), in Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering
58: 191–195
(1998)) und in bekannten Lehrbüchern
der Gentechnologie und Molekularbiologie.
-
Plasmidvektoren,
die zur Replikation in Enterobacteriaceae in der Lage sind, wie
z. B. Klonierungsvektoren, die von pACYC184 (Bartolomé et al.;
Gene 102: 75–78
(1991)), pTrc99A (Amann et al.; Gene 69: 301–315 (1988)) oder pSC101-Derivaten
(Vocke and Bastia, Proceedings of the National Academy of Sciences
USA 80(21): 6557–6561
(1983)) abgeleitet sind, können
verwendet werden. Ein Stamm, der mit einem Plasmidvektor transformiert
ist, wobei der Plasmidvektor mindestens eine Nukleotidsequenz trägt, die
das pgm-Gen codiert, kann in einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.
-
Es
ist auch möglich,
Mutationen, die die Exprimierung des speziellen Gens beeinflussen,
durch Sequenzaustausch auf verschiedene Stämme zu übertragen (Hamilton et al.;
Journal of Bacteriology 171: 4617–4622 (1989)), Konjugation
oder Transduktion.
-
Es
kann ferner für
die Produktion der L-Aminosäuren,
insbesondere L-Threonin, mit Stämmen
der Familie Enterobacteriaceae, vorteilhaft sein, zusätzlich zu
der Überexprimierung
des pgm-Gens ein oder mehrere Enzyme des bekannten Threonin-Biosynthesestoffwechselwegs
oder Enzyme des anaplerotischen Metabolismus oder Enzyme für die Produktion
von reduziertem Nicotinamid-Adenindinukleotidphosphat zu überexprimieren.
-
Beispielsweise
können
ein oder mehrere der Gene ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus
- • dem für Aspartatkinase,
Homoserin-Dehydrogenase, Homoserinkinase und Threonin-Synthase codierenden
thrABC-Operon (US-A-4 278 765),
- • dem
für die
Pyruvat-Carboxylase codierenden pyc-Gen, (DE-A-19 831 609),
- • dem
für die
Phosphoenolpyruvat-Synthase codierenden pps-Gen (Molecular and General
Genetics 231(2): 332–336
(1992)),
- • dem
für die
Phosphoenolpyruvat-Carboxylase codierenden ppc-Gen (Gene 31: 279–283 (1984)),
- • den
für Transhydrogenase
codierenden Genen pntA und pntB (European Journal of Biochemistry
158: 647–653
(1986)),
- • dem
Homoserin-Resistenz verleihenden rhtB-Gen (EP-A-0 994 190),
- • dem
für die
Malat:Chinon-Oxidoreduktase codierenden mqo-Gen (WO 02/06459),
- • dem
Threonin-Resistenz verleihenden rhtC-Gen (EP-A-1 013 765),
- • dem
das Threonin-Exportprotein codierenden thrE-Gen von Corynebacterium glutamicum (WO-A-01/92545),
- • dem
für die
Glutamat-Dehydrogenase codierenden gdhA-Gen (Nucleic Acids Research
11: 5257–5266 (1983);
Gene 23: 199–209
(1983)),
- • dem
für den
globalen Regulator Dps codierenden dps-Gen (Genes & Development 6(12B):
2646–2654 (1992),
Accession-Nummer AE000183),
- • dem
für den
Regulator des Leucin-Regulons Lrp und Hochaffinitäts-Transportsysteme
von verzweigtkettigen Aminosäuren
codierenden lrp-Gen (Journal of Biological Chemistry 266(17): 10768–10774 (1991), Accession-Nr.
AE000191),
- • dem
für das
DNA bindende Protein HLP-II codierenden hns-Gen (Molecular and General
Genetics 212(2): 199–202
(1988), Accession-Nr. AE000222),
- • dem
für die
Fructosebisphosphat-Aldolase codierenden fba-Gen (Biochemical Journal
257: 529–534 (1989),
Accession-Nr. AE000376),
- • dem
für die
glucosespezifische Komponente IIBC des Phosphotransferasesystems
PTS codierenden ptsG-Gen (Journal of Biological Chemistry 261(35):
16398–16403
(1986), Accession-Nr. AE000210),
- • dem
für die
Phosphohistidinprotein-Hexose-Phosphotransferase des Phosphotransferasesystems
PTS codierenden ptsH-Gen des ptsHIcrr-Operons (Journal of Biological
Chemistry 262(33): 16241–16253 (1987),
Accession-Nr. AE000329),
- • dem
für das
Enzym I des Phosphotransferasesystems PTS codierenden ptsI-Gen des
ptsHIcrr-Operons (Journal of Biological Chemistry 262(33): 16241–16253 (1987),
Accession-Nr. AE000329),
- • dem
für die
glucosespezifische IIA-Komponente des Phosphotransferasesystems
PTS codierenden crr-Gen des ptsHIcrr-Operons (Journal of Biological
Chemistry 262(33): 16241–16253
(1987), Accession-Nr. AE000329),
- • dem
für das
Chaperon GroES codierenden mopB-Gen, (Journal of Biological Chemistry
261(26): 12414–12419
(1986), Accession-Nr. AE000487),
- • dem
für die
kleine Untereinheit der Alkylhydroperoxid-Reduktase codierenden
ahpC-Gen des ahpCF-Operons (Proceedings of the National Academy
of Sciences USA 92(17): 7617–7621
(1995), Accession-Nr. AE000166),
- • dem
für die
große
Untereinheit der Alkylhydroperoxid-Reduktase codierenden ahpF-Gen
des ahpCF-Operons (Proceedings of the National Academy of Sciences
USA 92(17): 7617–7621
(1995), Accession-Nr. AE000166),
mittels Transformation überexprimiert
werden.
-
Bevorzugt
ist allgemein die Verwendung endogener Gene.
-
Es
kann für
die Produktion der L-Aminosäuren,
insbesondere L-Threonin, zusätzlich
zu der Überexprimierung
des pgm-Gens vorteilhaft sein, wenn ein oder mehrere der Gene ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus
- • dem für die Threonin-Dehydrogenase
codierenden tdh-Gen (Journal of Bacteriology 169: 4716–4721 (1987)),
- • dem
für die
Malat-Dehydrogenase codierenden mdh-Gen (E.C. 1.1.1.37) (Archives in Microbiology
149: 36–42
(1987)),
- • dem
Genprodukt des offenen Leserasters (orf) yjfA (Accession-Nummer
ARC77180 des National Center for Biotechnology Information (NCBI,
Bethesda, MD, USA)),
- • dem
Genprodukt des offenen Leserasters (orf) ytfP (Accession-Nummer
AAC77179 des National Center for Biotechnology Information (NCBI,
Bethesda, MD, USA)),
- • dem
für das
Enzym Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase codierenden pckA-Gen (Journal
of Bacteriology 172: 7151–7156
(1990)),
- • dem
für die
Pyruvat-Oxidase codierenden poxB-Gen (Nucleic Acids Research 14(13):
5449–5460
(1986)),
- • dem
für das
Enzym Isocitrat-Lyase codierenden aceA-Gen (Journal of Bacteriology
170: 4528–4536 (1988)),
- • dem
für den
Regulator DgsA des Phosphotransferasesystems codierenden dgsA-Gen
(Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 59: 256–251 (1995)),
das auch unter dem Namen mlc-Gen bekannt ist,
- • dem
für den
Fructose-Repressor codierende fruR-Gen (Molecular and General Genetics
226: 332–336 (1991)),
das auch unter dem Namen cra-Gen bekannt ist, und
- • dem
für den
sigma38-Faktor codierenden rpoS-Gen (WO
01/05939), das auch unter dem Namen katF-Gen bekannt ist,
ausgeschaltet
ist bzw. sind oder ihre Exprimierung herabgesetzt ist bzw. sind.
-
Der
Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem
Zusammenhang die Reduktion oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität von einem
oder mehreren Enzymen (Proteinen) bei einem Mikroorganismus, die durch
die entsprechende DNA codiert sind, beispielsweise durch Verwendung
eines schwachen Promoters oder eines Gens oder Allels, das ein entsprechendes
Enzym oder Protein mit einer niedrigen Aktivität codiert oder das entsprechende
Enzym (Protein) oder Gen inaktiviert, und gegebenenfalls Kombinieren
dieser Maßnahmen.
-
Durch
abschwächende
Maßnahmen
wird die Aktivität
oder Anreicherung des entsprechenden Proteins allgemein auf 0 bis
75 %, 0 bis 50 %, 0 bis 25 %, 0 bis 10 % oder 0 bis 5 % der Aktivität oder Anreicherung des
Proteins vom Wildtyp oder der Aktivität oder Anreicherung des Proteins
in dem Ausgangsmikroorganismus herabgesetzt.
-
Es
kann ferner für
die Produktion der L-Aminosäuren,
insbesondere L-Threonin, zusätzlich
zu der Überexprimierung
des pgm-Gens vorteilhaft sein, wenn unerwünschte Nebenreaktionen eliminiert
werden (Nakayama: "Breeding
of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products,
Krumphanzl, Sikyta, Vanek (Herausgeber), Academic Press, London,
UK, 1982).
-
Die
erfindungsgemäß produzierten
Mikroorganismen können
in dem Chargenverfahren (Chargenkultur), der gefütterten Charge (Fütterungsverfahren)
oder dem wiederholt gefütterten
Chargenverfahren (repetitivem Fütterungsverfahren)
kultiviert werden. Eine Zusammenfassung bekannter Kulturverfahren
ist in dem Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in
die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess Technology 1. Introduction
to Bioprocess Technology (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))
oder in dem Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen
[Bioreactors and Peripheral Equipment] (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden,
1994)) beschrieben.
-
Das
zu verwendende Kulturmedium muss den Anforderungen der speziellen
Stämme
in geeigneter Weise genügen.
Beschreibungen von Kulturmedien für verschiedene Mikroorganismen
sind in dem Handbuch "Manual
of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology
(Washington D.C., USA, 1981) enthalten.
-
Zucker
und Kohlehydrate, wie z. B. Glucose, Sucrose, Lactose, Fructose,
Maltose, Melassen, Stärke und
gegebenenfalls Cellulose, Öle
und Fette, wie z. B. Sojaöl,
Sonnenblumenöl,
Erdnussöl
und Kokosfett, Fettsäuren,
wie z. B. Palmitinsäure,
Stearinsäure
und Linolsäure,
Alkohole, wie z. B. Glycerin und Ethanol, und organische Säuren, wie
z. B. Essigsäure,
können
als Kohlenstoffquelle verwendet werden. Diese Substanzen können individuell
oder als Mischung verwendet werden.
-
Organische
stickstoffhaltige Verbindungen, wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt,
Malzextrakt, Maiseinweichflüssigkeit,
Sojabohnenmehl und Harnstoff, oder anorganische Verbindungen, wie
Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat
und Ammoniumnitrat, können
als Stickstoffquelle verwendet werden. Die Stickstoffquellen können individuell
oder als Mischung verwendet werden.
-
Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat
oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden natriumhaltigen
Salze können
als Phosphorquelle verwendet werden. Das Kulturmedium muss ferner
Salze von Metallen umfassen, wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat,
die zum Wachstum erforderlich sind. Schließlich können zusätzlich zu den oben genannten
Substanzen essentielle Wachstumssubstanzen verwendet werden, wie
Aminosäuren
und Vitamine. Geeignete Vorläufer
können
dem Medium außerdem
zugesetzt werden. Die genannten Ausgangssub stanzen können der
Kultur in Form einer einzelnen Charge zugesetzt werden, oder können während der
Kultur in geeigneter Weise eingespeist werden.
-
Basische
Verbindungen, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak oder
wässriges
Ammoniak, oder saure Verbindungen, wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure, können in
geeigneter Weise verwendet werden, um den pH-Wert der Kultur zu kontrollieren. Antischaummittel,
wie z. B. Fettsäurepolyglykolester,
können
zur Kontrolle der Schaumentwicklung verwendet werden. Geeignete
Substanzen mit einer selektiven Wirkung, z. B. Antibiotika, können dem
Medium zugefügt
werden, um die Stabilität
des Plasmids aufrechtzuerhalten. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten,
werden in die Kultur Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasmischungen,
wie z. B. Luft, eingebracht. Die Temperatur der Kultur ist üblicherweise
25°C bis
45°C und
vorzugsweise 30°C
bis 40°C.
Das Kultivieren wird fortgesetzt, bis sich ein Maximum an L-Aminosäuren oder L-Threonin
gebildet hat. Dieses Ziel ist üblicherweise
in 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
-
Die
Analyse der L-Aminosäuren
kann durch Anionenaustauschchromatographie mit nachfolgender Ninhydrin-Derivatisierung
durchgeführt
werden, wie von Spackman et al. (Analytical Chemistry 30: 1190–1206 (1958)
beschrieben wurde, oder kann durch Reverse-Phase-HPLC erfolgen,
wie von Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51: 1167–1174 (1979))
beschrieben.
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren
wird zur verbesserten fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren ausgewählt aus
der Gruppe L-Threonin, L-Valin, L-Methionin, L-Homoserin und L-Lysin,
insbesondere L-Threonin, verwendet.
-
Die
vorliegende Erfindung wird nachfolgend mit Hilfe von Ausführungsbeispielen
detaillierter erläutert.
-
Die
verwendeten minimalen (M9) und vollständigen Medien (LB) für Escherichia
coli sind von J. H. Miller (A Short Course in Bacterial Genetics
(1992), Cold Spring Harbor Laboratory Press) beschrieben worden. Die
Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli und alle Techniken
der Restriktion, Ligierung, Klenow und Behandlung mit alkalischer
Phosphatase wurden nach dem Verfahren von Sambrook et al. durchgeführt (Molecular
Cloning – A
Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). Wenn
nicht anders beschrieben, wurde die Transformation von Escherichia
coli nach dem Verfahren von Chung et al. (Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America (1989) 86: 2172–2175) durchgeführt.
-
Die
Inkubationstemperatur für
die Herstellung der Stämme
und Transformanten betrug 37°C.
-
Beispiel 1
-
Konstruktion
des Exprimierungsplasmids pTrc99Apgm Das pgm-Gen von E. coli K12
wurde unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) und synthetischen
Oligonukleotiden amplifiziert. Ausgehend von der Nukleotidsequenz
des pgm-Gens in E. coli K12 MG1655 (Accession-Nummer AE000172, Blattner et al. (Science
277: 1453–1462
(1997)), wurden PCR-Primer synthesiert (MWG Biotech, Ebersberg,
Deutschland):
pgm1: 5' – CGTTGCAGRCAAAGGACAAAGC – 3' (SEQ ID Nr. 1)
pgm2:
5' – GCGACCGCCCTTTTTTTATTAAATGTG – 3' (SEQ ID Nr. 2)
-
Die
chromosomale K12 MG1655 DNA von E. coli, die für die PCR verwendet wurde,
wurde gemäß den Anweisungen
des Herstellers mit "Qiagen
Genomic-tips 100/G" (QIAGEN,
Hilden, Deutschland) isoliert. Ein DNA-Frag ment von ungefähr 1700
bp Größe kann
mit den spezifischen Primern unter Standard-PCR-Bedingungen (Innis
et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications,
Academic Press) mit Pfu-DNA-Polymerase (Promega Corporation, Madison,
USA) amplifiziert werden. Das PCR-Produkt wurde mit dem Vektor pCR-Blunt
II-TOPO (Zero Blunt
TOPO PCR Cloning Kit, Invitrogen, Groningen, Niederlande) gemäß den Anweisungen
des Herstellers ligiert und in den Stamm E. coli TOP10 transformiert.
Die Selektion auf Plasmid tragende Zellen wurde mit LB-Agar durchgeführt, dem
50 μg/l
Kanamycin zugesetzt worden waren. Nach Isolierung der Plasmid-DNA
wurde der Vektor pCR-Blunt II-TOPO-pgm mit den Restriktionsenzymen SpeI
und XbaI gespalten und nach der Trennung in 0,8 % Agarosegel mit
Hilfe des QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden, Deutschland)
das pgm-Fragment isoliert. Der Vektor pTrc99A (Pharmacia Biotech,
Uppsala, Schweden) wurde mit dem Enzym XbaI gespalten und mit dem
isolierten pgm-Fragment ligiert. Der Stamm E. coli XL1-Blue MRF' (Stratagene, La
Jolla, USA) wurde mit der Ligierungscharge transformiert, und Plasmid
tragende Zellen wurden auf LB-Agar selektiert, dem 50 μg/ml Ampicillin
zugesetzt wurden. Erfolgreiches Klonen kann nach Plasmid-DNA-Isolierung
durch Kontrollspaltung mit den Enzymen EcoRV und PvuII gezeigt werden. Das
Plasmid wird als pTrc99Apgm bezeichnet (1).
-
Beispiel 2
-
Herstellung von L-Threonin
mit dem Stamm MG442/pTrc99Apgm
-
Der
L-Threonin produzierende Stamm E. Coli MG442 ist in der Patentschrift
von US-A-4 278 765 beschrieben und als CMIM B-1628 in der Russian
National Collection for Industrial Microorganisms (VKPM, Moskau,
Russland) hinterlegt.
-
Der
Stamm MG442 wurde mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Expressionsplasmid
pTrc99Apgm und mit dem Vektor pTrc99A transformiert, und Plasmid
tragende Zellen wurden auf LB-Agar mit 50 μg/ml Ampicillin selektiert.
Auf diese Weise wurden die Stämme
MG442/pTrc99Apgm und MG442/pTrc99A gebildet. Selektierte individuelle
Kolonien wurden danach weiter auf minimalem Medium mit der folgenden
Zusammensetzung multipliziert: 3,5 g/l Na2HPO4·2H2O, 1,5 g/l KH2PO4, 1 g/l NH4Cl, 0,1
g/l MgSO4·7H2O,
2 g/l Glucose, 20 g/l Agar, 50 mg/l Ampicillin. Die Bildung von
L-Threonin wurde in Chargenkulturen von 10 ml überprüft, die in 100 ml Erlenmeierkolben
enthalten waren. Hierzu wurden 10 ml Vorkulturmedium mit der folgenden
Zusammensetzung: 2 g/l Hefeextrakt, 10 g/l (NH4)2SO4, 1 g/l KH2PO4, 0,5 g/l MgSO4·7H2O, 15 g/l CaCO3,
20 g/l Glucose, 50 mg/l Ampicillin inokuliert, und die Charge wurde
16 Stunden bei 37°C
und 180 UpM in einem ESR-Inkubator von Kühner AG (Birsfelden, Schweiz)
inkubiert. 250 μl
Portionen dieser Vorkultur wurden in 10 ml Produktionsmedium (25
g/l (NH4)2SO4, 2 g/l KH2PO4, 1 g/l MgSO4·7H2O, 0,03 g/l FeSO4·7H2O, 0,018 g/l MnSO4·1H2O, 30 g/l CaCO3,
20 g/l Glucose, 50 mg/l Ampicillin) transinokuliert, und die Charge
wurde 48 Stunden bei 37°C
inkubiert. Die Bildung von L-Threonin in dem Ausgangsstamm MG442
wurde in der gleichen Weise untersucht, dem Medium wurde jedoch
kein Ampicillin zugesetzt. Nach der Inkubation wurde die optische
Dichte (OD) der Kultursuspension mit einem LP2W Photometer von Dr.
Lange (Düsseldorf,
Deutschland) bestimmt, wobei bei einer Wellenlänge von 660 nm gemessen wurde.
-
Die
Konzentration des gebildeten L-Threonins wurde danach in dem steril
filtrierten Kulturüberstand mit
einem Aminosäurenanalysegerät von Eppendorf-BioTronik
(Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Detektion
mit nach der Säule
erfolgender Umsetzung mit Ninhydrin bestimmt.
-
Das
Ergebnis des Experiments ist in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle
1
-
Kurze Beschreibung der
Figur:
-
1:
Karte des Plasmids pTrc99Apgm, welches das pgm-Gen enthält.
-
Die
Längendaten
sind als Näherungsdaten
zu verstehen. Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben
die folgende Bedeutung:
- • Amp: Ampicillinresistenzgen
- • lacI:
Gen für
das Repressorprotein des trc-Promotors
- • Ptrc:trc-Promotorregion,
IPTG-induzierbar
- • pgm:
Codierbereich des pgm-Gens
- • 5S:
5S rRNA-Region
- • rrnBT:
rRNA-Terminatorregion
-
Die
Abkürzungen
für die
Restriktionsenzyme haben die folgende Bedeutung
-
- • EcoRV:
Restriktions-Endonuclease aus Escherichia coli B946
- • PvuII:
Restriktions-Endonuclease aus Proteus vulgaris
- • SpeI:
Restriktions-Endonuclease aus Sphaerotilus species ATCC 13923
- • XbaI:
Restriktions-Endonuclease aus Xanthomonas campestris
-