DE60210772T2 - Verfahren zur herstellung von l-aminosäuren unter verwendung von stämmen der familie enterobacteriaceae - Google Patents

Verfahren zur herstellung von l-aminosäuren unter verwendung von stämmen der familie enterobacteriaceae Download PDF

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine

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Description

  • Technisches Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe L-Threonin, L-Valin, L-Methionin, L-Homoserin und L-Lysin, insbesondere L-Threonin, unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae, in denen wenigstens das hns-Gen verstärkt wird.
  • Stand der Technik
  • L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, finden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung Anwendung.
  • Es ist bekannt, dass L-Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen der Enterobacteriaceae, insbesondere Escherichia coli (E. coli) und Serratia marcescens, hergestellt werden. wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen, wie z.B. Rühren sowie Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien, wie z.B. die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform, durch z.B. Ionenaustauschchromatographie, oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.
  • Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite, wie z.B. das Threonin-Analogon α-Amino-β-Hydroxyvaleriansäure (AHV), oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und L-Aminosäuren, wie z.B. L-Threonin, produzieren.
  • Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung L-Aminosäuren produzierender Stämme der Familie Enterobacteriaceae eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die Produktion untersucht. Aus J.R. Landgraf et al., Biochemie (Paris), Bd. 76, Nr. 10-11, 1994, S. 1063–1070, ist bekannt, daß H-NS, das Produkt des hns-Gens, eine die Synthese von Isoleucin vermindernde Wirkung besitzt.
  • Aus der US-A-4 347 318 ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Threonin unter Verwendung von E. coli-Transformanten mit einem mit der L-Threonin-Synthese in Verbindung stehendes, aus einer gegen AHV resistenten E. coli-Mutante erhaltenes genetisches Material umfassenden Plasmid bekannt.
  • Aus M. Levinthal et al., Molecular and general genetics, Springer Verlag, Bd. 242, Nr. 6, 1994, S. 736–743, ist ein E. coli-Stamm mit einer zusätzlichen Kopie des hns-Gens auf einem transformierten Plasmid bekannt.
  • Aufgabe der Erfindung
  • Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe L-Threonin, L-Valin, L-Methionin, L-Homoserin und L-Lysin, insbesondere L-Threonin, bereitzustellen.
  • Kurze Beschreibung der Erfindung
  • Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe L-Threonin, L-Valin, L-Methionin, L-Homoserin und L-Lysin, insbesondere L-Threonin, unter Verwendung von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, die insbesondere bereits die genannten L-Aminosäuren produzieren und in denen die für das hns-Gen codierende Nukleotidsequenz verstärkt wird.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Werden im folgenden L-Aminosäuren oder Aminosäuren erwähnt, sind damit eine oder mehrere Aminosäuren einschließlich ihrer Salze, ausgewählt aus der Gruppe L-Threonin, L-Valin, L-Methionin, L-Homoserin und L-Lysin gemeint. Besonders bevorzugt ist L-Threonin.
  • Der Begriff „Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme oder Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA codiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor oder ein Gen oder Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym bzw. Protein mit einer hohen Aktivität codiert, und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
  • Durch Überexpression wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500%, bis zu maximal 1000% oder 2000%, bezogen auf die Aktivität oder Konzentration des Wildtyp-Proteins beziehungsweise die Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangsmikroorganismus, erhöht.
  • Das Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe L-Threonin, L-Valin, L-Methionin, L-Homoserin und L-Lysin, ist dadurch gekennzeichnet, daß man die folgenden Schritte durchführt:
    • a) eine Fermentation von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, die die genannte(n) L-Aminosäure(n) produzieren und in denen das hns-Gen aus Escherichia coli überexprimiert wird,
    • b) eine Anreicherung der L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen und
    • c) eine Isolierung der L-Aminosäure, wobei Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder die Biomasse insgesamt oder teilweise (≥ 0 bis 100%) im Produkt verbleiben.
  • Die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Mikroorganismen können L-Aminosäuren aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, gegebenenfalls Stärke, gegebenenfalls Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es handelt sich um Vertreter der Familie Enterobacteriaceae, ausgewählt aus den Gattungen Escherichia, Erwinia, Providencia und Serratia. Die Gattungen Escherichia und Serratia werden bevorzugt. Bei der Gattung Escherichia ist insbesondere die Art Escherichia coli und bei der Gattung Serratia insbesondere die Art Serratia marcescens zu nennen.
  • Geeignete, insbesondere L-Threonin produzierende Stämme der Gattung Escherichia, insbesondere der Art
    Escherichia coli, sind beispielsweise
    Escherichia coli TF427
    Escherichia coli H4578
    Escherichia coli KY10935
    Escherichia coli VNIIgenetika MG442
    Escherichia coli VNIIgenetika M1
    Escherichia coli VNIIgenetika 472T23
    Escherichia coli BKIIM B-3996
    Escherichia coli kat 13
    Escherichia coli KCCM-10132.
  • Geeignete L-Threonin produzierende Stämme der Gattung Serratia, insbesondere der Art Serratia marcescens, sind beispielsweise
    Serratia marcescens HNr21
    Serratia marcescens TLr156
    Serratia marcescens T-2000.
  • L-Threonin produzierende Stämme aus der Familie der Enterobacteriaceae besitzen bevorzugt unter anderem ein oder mehrere genetische bzw. phänotypische Merkmale, ausgewählt aus der Gruppe: Resistenz gegen α-Amino-β-Hydroxyvaleriansäure, Resistenz gegen Thialysin, Resistenz gegen Ethionin, Resistenz gegen α-Methylserin, Resistenz gegen Diaminobernsteinsäure, Resistenz gegen α-Aminobuttersäure, Resistenz gegen Borrelidin, Resistenz gegen Rifampicin, Resistenz gegen Valinanaloge, wie beispielsweise Valinhydroxamat, Resistenz gegen Purinanaloge, wie beispielsweise 6-Dimethylaminopurin, Bedarf an L-Methionin, gegebenenfalls teilweiser und kompensierbarer Bedarf an L-Isoleucin, Bedarf an meso-Diaminopimelinsäure, Auxotrophie bezüglich threoninhaltiger Dipeptide, Resistenz gegen L-Threonin, Resistenz gegen L-Homoserin, Resistenz gegen L-Lysin, Resistenz gegen L-Methionin, Resistenz gegen L-Glutaminsäure, Resistenz gegen L-Aspartat, Resistenz gegen L-Leucin, Resistenz gegen L-Phenylalanin, Resistenz gegen L-Serin, Resistenz gegen L-Cystein, Resistenz gegen L-Valin, Empfindlichkeit gegenüber Fluorpyruvat, defekte Threonin-Dehydrogenase, gegebenenfalls Fähigkeit zur Saccharoseverwertung, Verstärkung des Threonin-Operons, Verstärkung der Homoserin-Dehydrogenase I-Aspartatkinase I, vorzugsweise der feed-back-resistenten Form, Verstärkung der Homoserinkinase, Verstärkung der Threoninsynthase, Verstärkung der Aspartatkinase, gegebenenfalls der feed-back-resistenten Form, Ver stärkung der Aspartatsemialdehyd-Dehydrogenase, Verstärkung der Phosphoenolpyruvat-Carboxylase, gegebenenfalls der feed-back-resistenten Form, Verstärkung der Phosphoenolpyruvat-Synthase, Verstärkung der Transhydrogenase, Verstärkung des RhtB-Genprodukts, Verstärkung des RhtC-Genprodukts, Verstärkung des YfiK-Genprodukts, Verstärkung einer Pyruvat-Carboxylase und Abschwächung der Essigsäurebildung.
  • Es wurde gefunden, daß Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae nach Überexpression des hns-Gens in verbesserter Weise L-Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe L-Threonin, L-Valin, L-Methionin, L-Homoserin und L-Lysin, insbesondere L-Threonin, produzieren.
  • Im allgemeinen ist die Verwendung endogener Gene bevorzugt. Unter „endogenen Genen" oder „endogenen Nukleotidsequenzen" versteht man die in der Population einer Art vorhandenen Gene oder Nukleotidsequenzen.
  • Die Nukleotidsequenzen der Gene von Escherichia coli gehören zum Stand der Technik und können auch der von Blattner et al. (Science 277: 1453–1462 (1997)) veröffentlichten Genomsequenz von Escherichia coli entnommen werden.
  • Zum hns-Gen sind unter anderem aus dem Stand der Technik die folgenden Informationen bekannt:
    Beschreibung: DNA-Bindungsprotein HLP-II (= HU, BH2, HD, NS); pleiotroper Regulator, histonähnliches Protein HN-S
    Referenz: Pon et al.; Molecular and General Genetics 212(2): 199–202 (1988) Bertin et al.; Biochimie 83(2): 235–241 (2001) Azam et al; Journal of Bacteriology 181(20): 6361–6370 (1999)
    Accession No.: AE000222
    Alternative Gennamen: bglY, cur, drc, drdX, drs, fimG, mysA, msyA, osmZ, pilG, topS, topX, virR, hnsA
  • Die Nukleinsäuresequenzen können den Datenbanken des National Center for Biotechnology Information (NCBI) der National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA), der Nukleotidsequenz-Datenbank der European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Deutschland bzw. Cambridge, UK) oder der DNA-Datenbank von Japan (DDBJ, Mishima, Japan) entnommen werden.
  • Weiterhin können Allele des hns-Gens verwendet werden, die sich aus der Degeneriertheit des genetischen Codes oder aufgrund funktionsneutraler Sinnmutationen („sense mutations") ergeben.
  • Zur Erzielung einer Verstärkung können beispielsweise die Expression der Gene oder die katalytischen Eigenschaften der Proteine gesteigert werden. Gegebenenfalls können beide Maßnahmen kombiniert werden.
  • Zur Erzielung einer Überexpression kann beispielsweise die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann der Promotor- und Regulationsbereich oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im Verlaufe der fermentativen L-Threonin-Produktion zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird auch durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit variierender Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.
  • Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Chang und Cohen (Journal of Bacteriology 134: 1141–1156 (1978)), bei Hartley und Gregori (Gene 13: 347–353 (1981)), bei Amann und Brosius (Gene 40: 183–190 (1985)), bei de Broer et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 80: 21–25 (1983)), bei LaVallie et al. (BIO/TECHNOLOGY 11: 187–193 (1993)), in der PCT/US97/13359, bei Llosa et al. (Plasmid 26: 222–224 (1991)), bei Quandt und Klipp (Gene 80: 161–169 (1989)), bei Hamilton (Journal of Bacteriology 171: 4617–4622 (1989)), bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191–195 (1998)) sowie in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.
  • In Enterobacteriaceae replizierbare Plasmidvektoren, wie z.B. von pACYC184 abgeleitete Kloniervektoren (Bartolomé et al.; Gene 102: 75–78 (1991)), pTrc99A (Amann et al.; Gene 69: 301–315 (1988)) oder pSC101-Derivate (Vocke und Bastia; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80(21): 6557–6561 (1983)), können verwendet werden. In einem erfindungsgemäßen Verfahren kann man einen mit einem Plasmidvektor transformierten Stamm einsetzen, wobei der Plasmidvektor mindestens eine für das hns-Gen codierende Nukleotidsequenz trägt.
  • Es ist ebenfalls möglich, Mutationen, welche die Expression des jeweiligen Gens betreffen, durch Sequenzaustausch (Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 171: 4617–4622 (1989)), Konjugation oder Transduktion in verschiedene Stämme zu überführen.
  • Weiterhin kann es für die Produktion der genannten L- Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, mit Stämmen der Familie Enterobacteriaceae vorteilhaft sein, zusätzlich zur Überexpression des hns-Gens ein oder mehrere Enzyme des bekannten Threonin-Biosyntheseweges oder Enzyme des anaplerotischen Stoffwechsels oder Enzyme für die Produktion von reduziertem Nicotinamid-Adenin-Dinukleotidphosphat überzuexprimieren.
  • So können beispielsweise gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe:
    • • das für die Aspartatkinase, die Homoserin-Dehydrogenase, die Homoserinkinase und die Threoninsynthase codierende thrABC-Operon (US-A-4,278,765),
    • • das für die Pyruvat-Carboxylase codierende pyc-Gen (DE-A-19 831 609),
    • • das für die Phosphoenolpyruvat-Synthase codierende pps-Gen (Molecular and General Genetics 231(2): 332–336 (1992)),
    • • das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxylase codierende ppc-Gen (Gene 31: 279–283 (1984)),
    • • die für die Transhydrogenase codierenden Gene pntA und pntB (European Journal of Biochemistry 158: 647–653 (1986)),
    • • das Homoserinresistenz vermittelnde Gen rhtB (EP-A-0 994 190),
    • • das für die Malat:Chinon-Oxidoreduktase codierende mqo-Gen (WO 02/06459),
    • • das Threoninresistenz vermittelnde Gen rhtC (EP-A-1 013 765),
    • • das für das Threoninexport-Protein codierende thrE-Gen von Corynebacterium glutamicum (WO 01/92545),
    • • das für die Glutamat-Dehydrogenase codierende gdhA-Gen (Nucleic Acids Research 11: 5257–5266 (1983); Gene 23: 199–209 (1983)),
    • • das für den globalen Regulator Dps codierende dps-Gen (Genes & Development 6(12B): 2646–2654 (1992), Accession No. AE000183),
    • • das für den Regulator des Leucin-Lrp-Regulons und hochaffiner Transportsysteme für verzweigtkettige Aminosäuren codierende lrp-Gen (Journal of Biological Chemistry 266(17): 10768–10774 (1991), Accession No. AE000191),
    • • das für die Phosphoglucomutase codierende pgm-Gen (Journal of Bacteriology 176: 5847–5851 (1994), Accession No. AE000172),
    • • das für die Fructosebisphosphat-Aldolase codierende fba-Gen (Biochemical Journal 257: 529–534 (1989), Accession No. AE000376),
    • • das für die glucosespezifische Komponente IIBC des Phosphotransferasesystems PTS codierende ptsG-Gen (Journal of Biological Chemistry 261(35): 16398–16403 (1986), Accession No. AE000210),
    • • das für die Phosphohistidinprotein-Hexose-Phosphotransferase des Phosphotransferasesystems PTS codierende ptsH-Gen des ptsHIcrr-Operons (Journal of Biological Chemistry 262(33): 16241–16253 (1987), Accession No. AE000329),
    • • das für das Enzym I des Phosphotransferasesystems PTS codierende ptsI-Gen des ptsHIcrr-Operons
    • (Journal of Biological Chemistry 262(33): 16241–16253 (1987), Accession No. AE000329),
    • • das für die glucosespezifische Komponente IIA des Phosphotransferasesystems PTS codierende crr-Gen des ptsHIcrr-Operons (Journal of Biological Chemistry 262(33): 16241–16253 (1987), Accession No. AE000329),
    • • das für das Chaperon GroES codierende mopB-Gen (Journal of Biological Chemistry 261(26): 12414–12419 (1986), Accession No. AE000487),
    • • das für die kleine Untereinheit der Alkylhydroperoxid-Reduktase codierende ahpC-Gen des ahpCF-Operons (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 92(17): 7617–7621 (1995), Accession No. AE000166) und
    • • das für die grobe Untereinheit der Alkylhydroperoxid-Reduktase codierende ahpF-Gen des ahpCF-Operons (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 92(17): 7617–7621 (1995), Accession No. AE000166), überexprimiert werden.
  • Im allgemeinen ist die Verwendung endogener Gene bevorzugt.
  • Weiterhin kann es für die Produktion von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Verstärkung des hsn-Gens eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe:
    • • das für die Threonin-Dehydrogenase codierende tdh-Gen (Journal of Bacteriology 169: 4716–4721 (1987)),
    • • das für die Malat-Dehydrogenase (E.C. 1.1.1.37) codierende mdh-Gen (Archives in Microbiology 149: 36–42 (1987)),
    • • das Genprodukt des offenen Leserasters (orf) yjfA (Accession Number AAC77180 des National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA)),
    • • das Genprodukt des offenen Leserasters (orf) ytfP (Accession Number AAC77179 des National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA)),
    • • das für das Enzym Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase codierende pckA-Gen (Journal of Bacteriology 172: 7151–7156 (1990)),
    • • das für die Pyruvat-Oxidase codierende poxB-Gen (Nucleic Acids Research 14(13): 5449–5460 (1986)),
    • • das für das Enzym Isocitrat-Lyase codierende aceA-Gen (Journal of Bacteriology 170: 4528–4536 (1988)),
    • • das für den Regulator DgsA des Phosphotransferasesystems codierende dgsA-Gen (Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 59: 256–251 (1995)), das auch unter der Bezeichnung mlc-Gen bekannt ist,
    • • das für den Fructose-Repressor codierende fruR-Gen (Molecular and General Genetics 226: 332–336 (1991)), das auch unter der Bezeichnung cra-Gen bekannt ist, und
    • • das für den sigma38-Faktor codierende rpoS-Gen (WO 01/05939), das auch unter der Bezeichnung katF-Gen bekannt ist, auszuschalten oder deren Expression zu verringern.
  • Der Begriff „Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität oder Konzentration eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA codiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität codiert bzw. das entsprechende Enzym (Protein) oder Gen inaktiviert, und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
  • Durch die Maßnahmen der Abschwächung wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen auf 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration des Wildtyp-Proteins, beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangsmikroorganismus, gesenkt.
  • Weiterhin kann es für die Produktion der genannten L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, vorteilhaft sein, zusätzlich zur Überexpression des hns-Gens unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).
  • Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können im batch-Verfahren (Satzkultivierung), im fed batch-Verfahren (Zulaufverfahren) oder im repeated fed batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
  • Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) enthalten.
  • Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate, wie z.B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und gegebenenfalls Cellulose, Öle und Fette, wie z.B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren, wie z.B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole, wie z.B. Glycerin und Ethanol, sowie organische Säuren, wie z.B. Essigsäure, verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Gemisch verwendet werden.
  • Als Stickstoffquelle können organische stickstoffhaltige Verbindungen, wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff, oder anorganische Verbindungen, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Gemisch verwendet werden.
  • Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden natriumhaltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten, wie z.B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe, wie Aminosäuren und Vitamine, zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden.
  • Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.
  • Zur pH-Kontrolle der Kultur können basische Verbindungen, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser, oder saure Verbindungen, wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure, in geeigneter Weise eingesetzt werden. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie z.B. Fettsäurepolyglycolester, eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, z.B. Antibiotika, hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasmischungen, wie z.B. Luft, in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 25°C bis 45°C und vorzugsweise bei 30°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum an L-Aminosäuren bzw. L-Threonin gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
  • Die Analyse von L-Aminosäuren kann durch Anionenaustauschchromatographie mit anschließender Ninhydrin-Derivatisierung, wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry 30: 1190–1206 (1958)) beschrieben, oder durch Umkehrphasen-HPLC, wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51: 1167–1174 (1979)) beschrieben, erfolgen.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe L-Threonin, L-Valin, L-Methionin, L-Homoserin und L-Lysin, insbesondere L-Threonin.
  • Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
  • Verwendete Minimal- (M9) und Vollmedien (LB) für Escherichia coli sind von J.H. Miller (A Short Course in Bacterial Genetics (1992), Cold Spring Harbor Laboratory Press) beschrieben. Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli sowie alle Techniken zur Restriktion, Ligation, Klenow- und alkalische Phosphatasebehandlung werden nach den Verfahren von Sambrook et al. (Molecular Cloning – A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press) durchgeführt. Die Transformation von Escherichia coli wird, wenn nicht anders beschrieben, nach Chung et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 86: 2172–2175 (1989)) durchgeführt.
  • Die Bebrütungstemperatur bei der Herstellung von Stämmen und Transformanten beträgt 37°C.
  • Beispiel 1
  • Konstruktion des Expressionsplasmids pTrc99Ahns
  • Das hns-Gen aus E. coli K12 wird unter Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) sowie synthetischen Oligonukleotiden amplifiziert. Ausgehend von der Nukleotidsequenz des hns-Gens in E. coli K12 MG1655 (Accession Number AE000222), Blattner et al. (Science 277: 1453–1462 (1997)), werden PCR-Primer synthetisiert (MWG Biotech, Ebersberg, Deutschland):
    hns1: 5'-GTTTGAGATTACTACAATGAGCG-3' (SEQ ID No. 1)
    hns2: 5'-GCAAGTGCAATCTACAAAAG-3' (SEQ ID No. 2)
  • Die für die PCR eingesetzte chromosomale DNA von E. coli K12 MG1655 wird nach Herstellerangaben mit „Qiagen Genomic-tips 100/G" (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Ein ca. 450 by grosses DNA-Fragment kann mit den spezifischen Primern unter Standard-PCR-Bedingungen (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) mit der Pfu-DNA-Polymerase (Promega Corporation, Madison, USA) amplifiziert werden. Das PCR-Produkt wird dem Vektor pCR-Blunt II-TOPO (Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, Invitrogen, Groningen, Niederlande) den Herstellerangaben entsprechend ligiert und in den E. coli-Stamm TOP10 transformiert. Die Selektion plasmidtragender Zellen erfolgt auf LB-Agar, der mit 50 μg/ml Kanamycin versetzt ist. Nach der Plasmid-DNA-Isolierung wird der Vektor pCR-Blunt II-TOPO-hns mit den Restriktionsenzymen HindIII und XbaI gespalten und das hns-Fragment nach Auftrennung im 0,8%igen Agarosegel mit Hilfe des QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Der Vektor pTrc99A (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) wird mit den Enzymen HindIII und XbaI geschnitten und mit dem isolierten hns-Fragment ligiert. Der E. coli-Stamm XL1Blue MRF' (Stratagene, La Jolla, USA) wird mit dem Ligationsansatz transformiert, und plasmidtragende Zellen werden auf LB-Agar, der mit 50 μg/ml Ampicillin versetzt ist, selektioniert. Die erfolgreiche Klonierung kann nach Plasmid-DNA-Isolierung durch Kontrollspaltung mit den Enzymen HpaI, SmaI und StyI nachgewiesen werden. Das Plasmid wird mit pTrc99Ahns (1) bezeichnet.
  • Beispiel 2
  • Herstellung von L-Threonin mit dem Stamm MG442/pTrc99Ahns
  • Der L-Threonin produzierende E. coli Stamm MG442 ist in der Patentschrift US-A- 4,278,765 beschrieben und bei der Russischen Nationalsammlung für industrielle Mikroorganismen (VKPM, Moskau, Russland) als CMIM B-1628 hinterlegt.
  • Der Stamm MG442 wird mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Expressionsplasmid pTrc99Ahns und mit dem Vektor pTrc99A transformiert, und plasmidtragende Zellen werden auf LB Agar mit 50 μg/ml Ampicillin selektioniert. Auf diese Weise erhält man die Stämme MG442/pTrc99Ahns und MG442/pTrc99A. Ausgewählte Einzelkolonien werden anschließend auf Minimalmedium mit der folgenden Zusammensetzung: 3,5 g/l Na2HPO4·2H2O, 1,5 g/l KH2PO4, 1 g/l NH4Cl, 0,1 g/l MgSO4·7H2O, 2 g/l Glucose, 20 g/l Agar, 50 mg/l Ampicillin, weiter vermehrt. Die Bildung von L-Threonin wird in batch-Kulturen von 10 ml, die in 100 ml Erlenmeyerkolben enthalten sind, überprüft. Dazu werden 10 ml Vorkulturmedium der folgenden Zusammensetzung: 2 g/l Hefeextrakt, 10 g/l (NH4)2SO4, 1 g/l KH2PO4, 0,5 g/l MgSO4·7H2O, 15 g/l CaCO3, 20 g/l Glucose, 50 mg/l Ampicillin, beimpft, und der Ansatz wird 16 Stunden bei 37°C und 180 rpm auf einem ESR-Inkubator der Firma Kühner AG (Birsfelden, Schweiz) inkubiert. Je 250 μl dieser Vorkultur werden in 10 ml Produktionsmedium (25 g/l (NH4)2SO4, 2 g/l KH2PO4, 1 g/l MgSO4·7H2O, 0, 03 g/l FeSO4·7H2O, 0, 018 g/l MnSO4·1H2O, 30 g/l CaCO3, 20 g/l Glucose, 50 mg/l Ampicillin) überimpft, und der Ansatz wird 48 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Bildung von L-Threonin durch den Ausgangsstamm MG442 wird in der gleichen Weise untersucht, wobei jedoch keine Zugabe von Ampicillin zum Medium erfolgt. Nach der Inkubation wird die optische Dichte (OD) der Kultursuspension mit einem LP2W-Photometer der Firma Dr. Lange (Düsseldorf, Deutschland) bei einer Meßwellenlänge von 660 nm bestimmt.
  • Anschließend wird die Konzentration an gebildetem L-Threonin im sterilfiltrierten Kulturüberstand mit einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) mittels Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenreaktion mit Ninhydrindetektion bestimmt.
  • In Tabelle 1 ist das Ergebnis des Versuchs dargestellt.
  • Tabelle 1
    Figure 00190001
  • Kurze Beschreibung der Figur:
  • 1: Karte des das hns-Gen enthaltenden Plasmides pTrc99Ahns
  • Längenangaben sind als ca.-Angaben aufzufassen. Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben folgende Bedeutung:
    • • Amp: Ampicillinresistenz-Gen
    • • lac I: Gen für das Repressorprotein des trc-Promotors
    • • Ptrc: trc-Promotorbereich, IPTG-induzierbar • hns: Codierender Bereich des hns-Gens
    • • 5S: 5S-rRNA-Bereich
    • • rrnBT: rRNA-Terminator-Bereich
  • Die Abkürzungen für die Restriktionsenzyme haben folgende Bedeutung:
    • • HindIII: Restriktionsendonuklease aus Haemophilus influenzae
    • • HpaI: Restriktionsendonuklease aus Haemophilus parainfluenzae
    • • SmaI: Restriktionsendonuklease aus Serratia marcescens
    • • StyI: Restriktionsendonuklease aus Salmonella typhi
    • • XbaI: Restriktionsendonuklease aus Xanthomonas campestris
  • SEQUENCE PROTOCOL
    Figure 00210001

Claims (5)

  1. Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe L-Threonin, L-Valin, L-Methionin, L-Homoserin und L-Lysin, bei dem man die folgenden Schritte durchführt: a) eine Fermentation von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, die die genannte(n) L-Aminosäure(n) produzieren und in denen das hns-Gen aus Escherichia coli überexprimiert wird, b) eine Anreicherung der L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen und c) eine Isolierung der L-Aminosäure, wobei Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder die Biomasse insgesamt oder teilweise (≥ 0 bis 100%) im Produkt verbleiben.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei man Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae fermentiert, in denen zudem gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe: 2.1. das für Aspartatkinase, Homoserin-Dehydrogenase, Homoserinkinase und Threonin-Synthase codierende thrABC-Operon, 2.2. das für die Pyruvat-Carboxylase codierende pyc-Gen, 2.3. das für die Phosphoenolpyruvat-Synthase codierende pps-Gen, 2.4. das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxylase codierende ppc-Gen, 2.5. die für Transhydrogenase codierenden Gene pntA und pntB, 2.6. das Homoserin-Resistenz verleihende rhtB-Gen, 2.7. das für die Malat:Chinon-Oxidoreduktase codierende mqo-Gen, 2.8. das Threonin-Resistenz verleihende rhtC-Gen, 2.9. das für das Threonin-Export-Protein codierende thrE-Gen, 2.10. das für die Glutamat-Dehydrogenase codierende gdhA-Gen, 2.11. das für den globalen Regulator Dps codierende dps-Gen, 2.12. das für den Regulator des Leucin-Lrp-Regulons codierende lrp-Gen, 2.13. das für die Phosphoglucomutase codierende pgm-Gen, 2.14. das für die Fructosebisphosphat-Aldolase codierende fba-Gen, 2.15. das für die glucosespezifische Komponente IIBC codierende ptsG-Gen, 2.16. das für die Phosphohistidinprotein-Hexose-Phosphotransferase codierende ptsH-Gen, 2.17. das für Enzym I des Phosphotransferasesystems codierende ptsI-Gen, 2.18. das für die glucosespezifische Komponente IIA codierende crr-Gen, 2.19. das für das Chaperon GroES codierende mopB-Gen, 2.20. das für die kleine Untereinheit der Alkylhydroperoxid-Reduktase codierende ahpC-Gen, 2.21. das für die große Untereinheit der Alkylhydroperoxid-Reduktase codierende ahpF-Gen, überexprimiert wird bzw. werden.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei man Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae fermentiert, in denen zudem gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe: 3.1. das für die Threonin-Dehydrogenase codierende tdh-Gen, 3.2. das für die Malat-Dehydrogenase codierende mdh-Gen, 3.3. das Genprodukt des offenen Leserasters (orf) yjfA, 3.4. das Genprodukt des offenen Leserasters (orf) ytfP, 3.5. das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase codierende pckA-Gen, 3.6. das für die Pyruvat-Oxidase codierende poxB-Gen, 3.7. das für die Isocitrat-Lyase codierende aceA-Gen, 3.8. das für den. Regulator DgsA des Phosphotransferasesystems codierende dgsA-Gen, 3.9. das für den Fructose-Repressor codierende fruR-Gen, 3.10. das für den sigma38-Faktor codierende rpoS-Gen, ausgeschaltet ist bzw. sind.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Mikroorganismen aus der Gattung Escherichia stammen.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die Mikroorganismen aus der Spezies E. coli stammen.
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