ES2336655T3 - Proceso para la preparacion de l-aminoacidos que utiliza cepas de la familia enterobacteriaceas. - Google Patents
Proceso para la preparacion de l-aminoacidos que utiliza cepas de la familia enterobacteriaceas. Download PDFInfo
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Abstract
Un proceso para la preparación de L-aminoácidos, seleccionados del grupo L-treonina, L-homoserina, L-isoleucina, L-valina, L-metionina y L-lisina, en el cual se llevan a cabo los pasos siguientes: a)fermentación de microorganismos del género Escherichia que producen dichos aminoácidos y en los que el o los genes ahpC y/o ahpF están sobreexpresados, b)concentración del L-aminoácido deseado en el medio o en las células de los microorganismos.
Description
Proceso para la preparación de
L-aminoácidos que utiliza cepas de la familia
enterobacteriáceas.
Esta invención se refiere a un proceso para la
preparación de L-aminoácidos, seleccionados del
grupo L-homoserina, L-isoleucina,
L-valina, L-metionina,
L-lisina y L-treonina, que utiliza
cepas del género Escherichia en las que al menos uno o más de los
genes seleccionados del grupo constituido por ahpC y ahpF están
sobreexpresados.
Los L-aminoácidos, en particular
L-treonina, se utilizan en medicina humana y en la
industria de productos farmacéuticos, en la industria alimentaria y
muy particularmente en nutrición animal.
Se conoce el modo de preparar
L-aminoácidos por fermentación de cepas de
Enterobacteriáceas, en particular Escherichia coli (E. coli)
y Serratia marcescens. Debido a su gran importancia, se están
realizando continuamente trabajos a fin de mejorar los procesos de
preparación. Las mejoras del proceso pueden estar relacionadas con
medidas de fermentación, tales como v.g. agitación y suministro de
oxígeno, o con la composición de los medios nutrientes, tales como
v.g. la concentración de azúcar durante la fermentación, o con el
tratamiento de la forma del producto, mediante v.g. cromatografía
de intercambio iónico, o con las propiedades intrínsecas de
rendimiento del microorganismo propiamente dicho.
Se utilizan métodos de mutagénesis, selección y
selección de mutantes para mejorar las propiedades de producción de
estos microorganismos. De esta manera se obtienen cepas que son
resistentes a antimetabolitos, tales como v.g. el análogo de
treonina ácido
\alpha-amino-\beta-hidroxivalérico
(AHV), o son auxótrofas para metabolitos de importancia reguladora y
producen L-aminoácido, tales como v.g.
L-treonina.
Se han empleado también desde hace varios años
métodos de la técnica del DNA recombinante para mejorar la variedad
de cepas de la familia Enterobacteriáceas que producen
L-aminoácidos, por amplificación de los genes
individuales de biosíntesis de aminoácidos e investigación del
efecto sobre la producción.
El objeto de la invención es proporcionar nuevas
medidas para la preparación mejorada por fermentación de los
L-aminoácidos que se definen posteriormente, en
particular L-treonina.
La invención proporciona un proceso para la
preparación de los L-aminoácidos que se definen
posteriormente, que utiliza microorganismos del género Escherichia
que producen ya en particular dichos L-aminoácidos y
en el cual al menos una o más de las secuencias de nucleótidos que
codifican los genes ahpC y ahpF están sobreexpresadas.
En los casos en que se mencionan
L-aminoácidos o aminoácidos como dichos aminoácidos
en lo que sigue, esto significa uno o más aminoácidos, con
inclusión de sus sales, seleccionados del grupo constituido por
L-treonina, L-valina,
L-metionina, L-isoleucina,
L-lisina y L-homoserina. Se prefiere
particularmente L-treonina.
El término "intensificación" en este
contexto describe el aumento en la actividad intracelular de una o
más enzimas o proteínas en un microorganismo que están codificadas
por el DNA correspondiente, por ejemplo por aumento del número de
copias del gen o genes, que utiliza un promotor potente o un gen o
alelo que codifica una enzima o proteína correspondiente con
actividad alta, y opcionalmente combinación de estas medidas.
Por medidas de intensificación, en particular
sobreexpresión, la actividad o concentración de la proteína
correspondiente se incrementa en general al menos en un 10%, 25%,
50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% o 500%, hasta un máximo de
1000% o 2000%, basada en la de la proteína de tipo salvaje o la
actividad o concentración de la proteína en el microorganismo de
partida.
El proceso se caracteriza porque se llevan a
cabo los pasos siguientes:
- a)
- fermentación de microorganismos del género Escherichia que producen dichos aminoácidos y donde el o los genes ahpC y/o ahpF están sobreexpresados,
- b)
- concentración de dicho L-aminoácido en el medio o en las células de los microorganismos, y
- c)
- aislamiento de dicho L-aminoácido, quedando opcionalmente en el producto constituyentes del caldo de fermentación y/o la biomasa en su totalidad o porciones (> 0 a 100%) de los mismos.
Los microorganismos que proporciona la presente
invención pueden producir dichos L-aminoácidos a
partir de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas,
opcionalmente almidón, opcionalmente celulosa o a partir de
glicerol y etanol. Dichos microorganismos son representativos de la
familia Enterobacteriáceas seleccionados de los géneros
Escherichia, Erwinia, Providencia y Serratia. Se prefieren los
géneros Escherichia y Serratia. Del género Escherichia, deben
mencionarse en particular las especies Escherichia coli y del
género Serratia la especie Serratia marcescens.
Cepas adecuadas, que producen
L-treonina en particular, del género Escherichia, en
particular de la especie Escherichia coli, son, por
ejemplo
Escherichia coli TF427
Escherichia coli H4578
Escherichia coli KY10935
Escherichia coli VNIIgenetika MG442
Escherichia coli VNIIgenetika Ml
Escherichia coli VNIIgenetika 472T23
Escherichia coli BKIIM
B-3996
Escherichia coli kat 13
Escherichia coli
KCCM-10132.
\vskip1.000000\baselineskip
Cepas adecuadas productoras de
L-treonina del género Serratia, en particular de la
especie Serratia marcescens, son, por ejemplo
Serratia marcescens HNr21
Serratia marcescens TLr156
Serratia marcescens T2000.
\vskip1.000000\baselineskip
Las cepas de la familia Enterobacteriáceas que
producen L-treonina tienen preferiblemente, entre
otras cosas, una o más características genéticas o fenotípicas
seleccionadas del grupo constituido por: resistencia a ácido
\alpha-amino-\beta-hidroxivalérico,
resistencia a tialisina, resistencia a etionina, resistencia a
\alpha-metilserina, resistencia a ácido
diaminosuccínico, resistencia a ácido
\alpha-aminobutírico, resistencia a borrelidina,
resistencia a rifampicina, resistencia a análogos de valina, tales
como, por ejemplo, hidroxamato de valina, resistencia a análogos de
purina, tales como, por ejemplo,
6-dimetilaminopurina, una necesidad de
L-metionina, opcionalmente una necesidad parcial y
compensable de L-isoleucina, una necesidad de ácido
meso-diaminopimélico, auxotrofia con respecto a
dipéptidos que contienen treonina, resistencia a
L-treonina, resistencia a
L-homoserina, resistencia a
L-lisina, resistencia a L-metionina,
resistencia a ácido L-glutámico, resistencia a
L-aspartato, resistencia a
L-leucina, resistencia a
L-fenilalanina, resistencia a
L-serina, resistencia a L-cisteína,
resistencia a L-valina, sensibilidad a
fluoropiruvato, treonina-deshidrogenasa deficiente,
opcionalmente capacidad para utilización de sacarosa,
intensificación del operón treonina, mejora de la
homoserina-deshidrogenasa
I-aspartato-quinasa I,
preferiblemente de la forma resistente a la realimentación,
intensificación de la homoserina-quinasa,
intensificación de la treonina-sintasa,
intensificación de la aspartato-quinasa,
opcionalmente de la forma resistente a la realimentación,
intensificación de la
aspartato-semialdehido-deshidrogenasa,
intensificación de la
fosfoenol-piruvato-carboxilasa,
opcionalmente de la forma resistente a la realimentación,
intensificación de la
fosfoenol-piruvato-sintasa,
intensificación de la transhidrogenasa, intensificación del producto
del gen RhtB, intensificación del producto del gen RhtC,
intensificación del producto del gen YfiK, intensificación de una
piruvato-carboxilasa, y atenuación de la formación
de ácido acético.
Se ha encontrado que los microorganismos del
género Escherichia producen dichos L-aminoácidos, en
particular L-treonina, de forma mejorada después de
la sobreexpresión, de al menos uno o más de los genes seleccionados
del grupo constituido por ahpC y ahpF.
Por regla general se prefiere el uso de genes
endógenos. "Genes endógenos" o "secuencias de nucleótidos
endógenas" deben entenderse con el significado de los genes o
secuencias de nucleótidos presentes en la población de una
especie.
\newpage
Las secuencias de nucleótidos de los genes de
Escherichia coli pertenecen a la técnica anterior y pueden
encontrarse también en la secuencia del genoma de Escherichia
coli publicada por Blattner et al. (Science 277:
1453-1462 (1997)).
La información siguiente acerca del gen ahpC y
del gen aphF se conoce, entre otras cosas, por la técnica
anterior:
Gen ahpC:
- Descripción:
- Subunidad C22 de la alquil-hidroperóxido-reductasa; destoxificación de hidroperóxidos
- N.º EC:
- 1.6.4.-
- Referencia:
- Ferrante et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 92(17) : 7617-7621 (1995) Poole and Ellis; Biochemistry 35(1): 56-64 (1996) Nishiyama et al.; Journal of Bacteriology 183(8):2431-2438 (2001)
- N.º de Acceso:
- AE000166
\vskip1.000000\baselineskip
Gen ahpF:
- Descripción:
- Subunidad F52a de la alquil-hidroperóxido-reductasa; destoxificación de hidroperóxidos
- Referencia:
- Ferrante et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 92(17): 7617-7621 (1995) Poole and Ellis; Biochemistry 35(1): 56-64 (1996) Poole et al.; European Journal of Biochemistry 267(20): 6126-6133 (2000)
- N.º de Acceso:
- AE000166
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias de ácido nucleico pueden
encontrarse en los bancos de datos del National Center for
Biotechnology Information (NCBI) de la National Library of Medicine
(Bethesda, MD, EE.UU.), el banco de datos de secuencias de
nucleótidos de los European Molecular Biologies Laboratories (EMBL,
Heidelberg, Alemania o Cambridge, Reino Unido) o el banco de datos
de DNA de Japón (DDBJ, Mishima, Japón).
Adicionalmente pueden utilizarse alelos de al
menos uno o más de los genes seleccionados del grupo conformado por
ahpC y ahpF que son resultado de la degeneración del código genético
o debidos a "mutaciones de sentido" de función neutra.
Para conseguir una intensificación, pueden
incrementarse por ejemplo, la expresión de los genes o de las
propiedades catalíticas de las proteínas. Las dos medidas pueden
combinarse opcionalmente.
Para conseguir una sobreexpresión, puede
incrementarse el número de copias de los genes correspondientes, o
pueden mutarse el promotor y la región de regulación o el sitio de
fijación de ribosoma aguas arriba del gen estructural. Casetes de
expresión que se incorporan aguas arriba del gen estructural actúan
del mismo modo. Por medio de promotores inducibles, es posible
adicionalmente aumentar la expresión en el curso de la producción
de L-treonina por fermentación. La expresión se
mejora análogamente por medidas para prolongar la vida del
m-RNA. Adicionalmente, la actividad enzimática se
mejora también por prevención de la degradación de la proteína
enzimática. Los genes o constructos génicos pueden estar presentes
en plásmidos con un número mayor de copias, o pueden estar
integrados y amplificarse en el cromosoma. Como alternativa, puede
conseguirse adicionalmente una sobreexpresión de los genes en
cuestión por cambio de la composición de los medios y el
procedimiento de cultivo.
Instrucciones en este contexto pueden ser
encontradas por el experto, entre otros lugares, en Chang y Cohen
(Journal of Bacteriology 134: 1141-1156 (1978)), en
Hartley y Gregori (Gene 13: 347-353 (1981)), en
Amann y Brosius (Gene 40: 183-190 (1985)), en de
Broer et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences
of the United States of America 80: 21-25 (1983)),
en LaVallie et al. (BIO/TECHNOLOGY 11:
187-193 (1993)), en el documento PCT/US 97/13359,
en Llosa et al. (Plasmid 26: 222-224 (1991)),
en Quandt y Klipp (Gene 80: 161-169 (1989)), en
Hamilton (Journal of Bacteriology 171: 4617-4622
(1989)), en Jensen y Hammer (Biotecnology and Bioengineering 58:
191-195 (1998)) y en libros de texto conocidos de
genética y biología molecular.
Pueden utilizarse vectores de plásmidos que son
capaces de replicación en Enterobacteriáceas, tales como v.g.
vectores de clonación derivados de pACYC184 (Bartolomé et
al.; Gene 102: 75-78 (1991)), pTrc99A (Amann et
al.; Gene 69: 301-315 (1988)) o derivados de pSC101
(Vocke y Bastia, Proceedings of the National Academy of Sciences
EE.UU. 80(21): 6557-6561 (1983)). Una cepa
transformada con un vector de plásmido, en la cual el vector de
plásmido lleva al menos uno o más de los genes seleccionados del
grupo conformado por aphC y ahpF o secuencias de nucleótidos que los
codifican, puede emplearse en un proceso de acuerdo con la
invención.
\newpage
Es también posible transferir mutaciones que
afectan a la expresión del gen particular en diversas cepas por
intercambio de secuencias (Hamilton et al., Journal of
Bacteriology 171: 4617-4622 (1989)), conjugación o
transducción.
Adicionalmente, puede ser ventajoso para la
producción de dichos L-aminoácidos, en particular
L-treonina, sobreexpresar con cepas del género
Escherichia una o más enzimas del camino conocido de biosíntesis de
la treonina o enzimas del metabolismo anaplerótico o enzimas para
la producción de nicotinamida-adenina
dinucleótido-fosfato, además de la intensificación
de uno o más de los genes seleccionados del grupo conformado por
ahpC y ahpF.
Así, por ejemplo, pueden sobreexpresarse uno o
más de los genes seleccionados del grupo constituido por
- \bullet
- el operón thrABC que codifica aspartato-quinasa, homoserina-deshidrogenasa, homoserina-quinasa y treonina-sintasa (documento US-A-4.278.765),
- \bullet
- el gen pyc que codifica piruvato-carboxilasa (documento DE-A-19 831 609),
- \bullet
- el gen pps que codifica fosfoenol-piruvato-sintasa (Molecular and General Genetics 231(2): 332-336 (1992)),
- \bullet
- el gen ppc que codifica fosfoenol-piruvato-carboxilasa (Gene 31: 279-283 (1984)),
- \bullet
- los genes pntA y pntB que codifican transhidrogenasa (European Journal of Biochemistry 158: 647-653 (1986)),
- \bullet
- el gen rhtB que imparte resistencia a la homoserina (documento EP-A-0 994 190),
- \bullet
- el gen mqo que codifica malato:quinona-oxidorreductasa (documento WO 02/06459),
- \bullet
- el gen rhtC que imparte resistencia a la treonina (documento EP-A-1 013 765),
- \bullet
- el gen thrE de Corinebacterium glutamicum que codifica la proteína de exportación de treonina (documento WO 01/92545),
- \bullet
- el gen gdhA que codifica glutamato-deshidrogenasa (Nucleic Acids Research 11: 5257-5266 (1983); Gene 23: 199-209 (1983)),
- \bullet
- el gen dps que codifica el regulador global Dps (Genes & Development 6(12B): 2646-2654 (1992), No. de Acceso AE000183),
- \bullet
- el gen hns que codifica la proteína HLp-II de unión a DNA (Molecular and General Genetics 212(2): 199-202 (1988), N.º de Acceso AE000222),
- \bullet
- el gen lrp que codifica el regulador del regulón de leucina Lrp y sistemas de transporte de alta afinidad de aminoácidos de cadena ramificada (Journal of Biological Chemistry 266(17): 10768-10774 (1991), No. de Acceso AE000191),
- \bullet
- el gen pgm que codifica fosfoglucomutasa (Journal of Bacteriology 176: 5847-5851 (1994), No. de Acceso AE000172),
- \bullet
- el gen fba que codifica fructosa-bisfosfato-aldolasa (Biochemical Journal 257: 529-534 (1989), No. de Acceso AE000376),
- \bullet
- el gen ptsG que codifica el componente IIBC específico de glucosa del sistema de fosfotransferasa PTS (Journal of Biological Chemistry 261 (35): 16398-16403 (1986), No. de Acceso AE000210),
- \bullet
- el gen ptsH del operón ptsHIcrr que codifica la proteína fosfohistidina hexosa-fosfotransferasa del sistema de fosfotransferasa PTS (Journal of Biological Chemistry 262(33): 16241-16253 (1987), No. de Acceso AE000329),
- \bullet
- el gen ptsI del operón ptsHIcrr que codifica la enzima I del sistema de fosfotransferasa PTS (Journal of Biological Chemistry 262(33): 16241-16253 (1987), No. de Acceso AE000329),
- \bullet
- el gen crr del operón ptsHIcrr que codifica el componente IIA específico de glucosa del sistema de fosfotransferasa PTS (Journal of Biological Chemistry 262(33): 16241-16253 (1987), No. de Acceso AE000329),
- \bullet
- el gen mopB que codifica la chaperona GroES (Journal of Biological Chemistry 261(26): 12414-12419 (1986), No. de Acceso AE000487).
\vskip1.000000\baselineskip
Por lo general se prefiere el uso de genes
endógenos.
Adicionalmente, puede ser ventajoso para la
producción de dichos L-aminoácidos, en particular
L-treonina, además de la intensificación de uno o
más de los genes seleccionados del grupo conformado por ahpC y ahpF,
atenuar, en particular eliminar uno o más de los genes seleccionados
del grupo constituido por
- \bullet
- el gen tdh que codifica treonina-deshidrogenasa (Journal of Bacteriology 169: 4716-4721 (1987)),
- \bullet
- el gen mdh que codifica malato-deshidrogenasa (E.C.1.1.1.37) (Archives in Microbiology 149: 36-42 (1987)),
- \bullet
- el producto génico del marco de lectura abierto (orf) yjfA (Número de Acceso AAC77180 del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.)),
- \bullet
- el producto génico del marco de lectura abierto (orf) ytfP (número de acceso AAC77179 del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.)),
- \bullet
- el gen pckA que codifica la enzima fosfoenol-piruvato-carboxiquinasa (Journal of Bacteriology 172: 7151-7156 (1990)),
- \bullet
- el gen poxB que codifica piruvato-oxidasa (Nucleic Acids Research 14(13): 5449-5460 (1986)),
- \bullet
- el gen aceA que codifica la enzima isocitrato-liasa (Journal of Bacteriology 170: 4528-4536 (1988)),
- \bullet
- el gen dgsA que codifica el regulador DgsA del sistema de fosfotransferasa (Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 59: 256-251 (1995)) y es conocido también bajo el nombre del gen mlc,
- \bullet
- el gen fruR que codifica el represor de fructosa (Molecular and General Genetics 226: 332-336 (1991)) y es conocido también bajo el nombre del gen cra, y
- \bullet
- el gen rpoS que codifica el factor sigma^{38} (documento WO 01/05939) y es conocido también bajo el nombre del gen katF.
\vskip1.000000\baselineskip
En este contexto, el término "atenuación"
describe la reducción o eliminación de la actividad intracelular de
una o más enzimas (proteínas) en un microorganismo que son
codificadas por el DNA correspondiente, por ejemplo por utilización
de un promotor débil o un gen o alelo que codifica una enzima
correspondiente con una actividad baja o desactiva la enzima
(proteína) o gen correspondiente, y combinación opcional de estas
medidas.
Por medidas de atenuación, la actividad o
concentración de la proteína correspondiente se reduce en general a
0 hasta 75%, 0 a 50%, 0 a 25%, 0 a 10% o 0 a 5% de la actividad o
concentración de la proteína de tipo salvaje o de la actividad o
concentración de la proteína en el microorganismo de partida.
Adicionalmente, puede ser ventajoso para la
producción de dichos L-aminoácidos, en particular
L-treonina, además de la sobreexpresión de uno o
más de los genes seleccionados del grupo conformado por ahpC y ahpF,
eliminar reacciones secundarias indeseables (Nakayama: "Breeding
of Amino Acid Producing Microorganisms" en: Overproduction of
Microbial Products, Krumphanzl, Sikita, Vanek (compiladores),
Academic Press, Londres, Reino Unido, 1982).
Los microorganismos producidos de acuerdo con la
invención pueden cultivarse en el proceso por lotes (cultivo de
lotes), el proceso de realimentación (proceso de alimentación) o el
proceso de realimentación repetida (proceso de realimentación
repetitivo). Un sumario de métodos de cultivo conocidos se describe
en el libro de texto publicado por Chmiel (Bioprozestechnik 1.
Einführung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess Technology 1.
Introduction to Bioprocess Technology (Gustav Fischer Verlag,
Stuttgart, 1991)) o en el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren
und periphere Einrichtungen [Bioreactors and Peripheral Equipment]
(Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).
El medio de cultivo a utilizar debe cumplir los
requisitos de las cepas particulares de manera adecuada.
Descripciones de medios de cultivo para diversos microorganismos se
contienen en el manual "Manual of Methods for General
Bacteriology" de la American Society for Bacteriology (Washington
D.C., EE.UU., 1981).
Como fuente de carbono pueden utilizarse
azúcares y carbohidratos, tales como p. ej. glucosa, sacarosa,
lactosa, fructosa, maltosa, melazas, almidón y opcionalmente
celulosa, aceites y grasas, tales como p. ej. aceite de soja,
aceite de girasol, aceite de cacahuete y aceite de coco, ácidos
grasos tales como v.g. ácido palmítico, ácido esteárico y ácido
linoleico, alcoholes, tales como p. ej. glicerol y etanol, y ácidos
orgánicos tales como v.g. ácido acético. Estas sustancias pueden
utilizarse individualmente o como una mezcla.
Como fuente de nitrógeno pueden utilizarse
compuestos orgánicos nitrogenados, tales como peptonas, extracto de
levadura, extracto de carne, extracto de malta, licor de maceración
de maíz, harina de soja y urea, o compuestos inorgánicos, tales
como sulfato de aluminio, cloruro de amonio, fosfato de amonio,
carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno
pueden utilizarse individualmente o como una mezcla.
Como fuente de fósforo pueden utilizarse ácido
fosfórico, dihidrogeno-fosfato de potasio o
hidrógeno-fosfato de dipotasio o las sales
correspondientes que contienen sodio. El medio de cultivo debe
comprender adicionalmente sales de metales, tales como v.g. sulfato
de magnesio o sulfato de hierro, que son necesarios para el
crecimiento. Finalmente, además de las sustancias arriba
mencionadas pueden emplearse sustancias esenciales para el
crecimiento, tales como aminoácidos y vitaminas. Adicionalmente,
pueden añadirse al medio de cultivo precursores adecuados. Las
sustancias de partida mencionadas pueden añadirse al cultivo en la
forma de un solo lote, o pueden incorporarse durante el cultivo de
manera adecuada.
Compuestos básicos, tales como hidróxido de
sodio, hidróxido de potasio, amoniaco o amoniaco acuoso, o
compuestos ácidos, tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico,
pueden emplearse de manera adecuada para controlar el pH del
cultivo. Pueden emplearse antiespumantes, tales como v.g.
poliglicerol-ésteres de ácidos grasos, para controlar el desarrollo
de espuma. Sustancias adecuadas que tienen una acción selectiva,
v.g. antibióticos, pueden añadirse al medio para mantener la
estabilidad de los plásmidos. Para mantener condiciones aerobias,
se introducen en el cultivo oxígeno o mezclas gaseosas que contienen
oxígeno, tales como v.g. aire. La temperatura del cultivo es
usualmente 25ºC a 45ºC, y preferiblemente 30ºC a 40ºC. El cultivo se
continúa hasta que se ha formado una cantidad máxima de
L-aminoácidos o L-treonina. Este
objetivo se alcanza usualmente en el transcurso de 10 horas a 160
horas.
El análisis de L-aminoácidos
puede realizarse por cromatografía de intercambio de aniones con
derivación de ninhidrina subsiguiente, como ha sido descrito por
Spackman et al. (Analytical Chemistry 30:
1190-1206 (1958), o el mismo puede tener lugar por
HPLC en fase inversa como ha sido descrito por Lindroth et
al. (Analytical Chemistry 51: 1167-1174
(1979)).
El proceso de acuerdo con la invención se
utiliza para la preparación de L-aminoácidos por
fermentación, seleccionados del grupo L-treonina,
L-isoleucina, L-valina,
L-metionina, L-homoserina y
L-lisina, en particular
L-treonina.
La presente invención se explica con mayor
detalle a continuación con ayuda de ejemplos de realización.
El medio mínimo (M9) y el medio completo (LB)
utilizados para Escherichia coli han sido descritos por J.H.
Miller (A Short Course in Bacterial Genetics (1992), Cold Spring
Harbor Laboratory Press). El aislamiento del DNA plasmídico de
Escherichia coli y todas las técnicas de restricción,
ligación, Klenow y tratamiento con fosfatasa alcalina se llevan a
cabo por el método de Sambrook et al. (Molecular Cloning - A
Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). A no
ser que se describa otra cosa, la transformación de Escherichia
coli se lleva a cabo por el método de Chung et al.
(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America (1989) 86:2172-2175).
La temperatura de incubación para la preparación
de las cepas y los transformantes es 37ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Los genes ahpC y ahpF de E. coli K12 se
amplifican empleando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y
oligonucleótidos sintéticos. A partir de las secuencias de
nucleótidos de los genes ahpC y ahpF en E. coli K12 MG1655
(Número de Acceso AE000166, Blattner et al. (Science 277:
1453-1462 (1997)), se sintetizan iniciadores PCR
(NWG Biotech, Ebersberg, Alemania). Las secuencias de los cebadores
se modifican de modo que se formen los sitios de reconocimiento
para las enzimas de restricción. La secuencia de reconocimiento para
XbaI se selecciona para el cebador ahpCF1 y la secuencia de
reconocimiento para HindIII para el cebador ahpCF2, las cuales están
subrayadas en la secuencia de nucleótidos que se muestra a
continuación:
| ahpCF1: | 5'–GCATCTAGACGATAACACGGAGGAAG-3' | (SEQ ID No. 1) |
| ahpCF2: | 5'-GCTAAGCTTTTGCAGGTGAATC-3' | (SEQ ID No. 2) |
\vskip1.000000\baselineskip
El DNA cromosómico de E. coli K12 MG1655
empleado para la PCR se aísla de acuerdo con las instrucciones del
fabricante con "Qiagen Genomic-tips 100/G"
(QIAGEN, Hilden, Alemania). Un fragmento de DNA de aprox. 2400 pb
de tamaño puede amplificarse con los iniciadores específicos en
condiciones PCR estándar (Innis et al. (1990) PCR Protocols.
A Guide to Methods and Applications, Academic Press) con
Pfu-DNA polimerasa (Promega Corporation, Madison,
EE.UU.). El producto PCR se escinde con las enzimas de restricción
XbaI y HindIII y, se liga con el vector pTrc99A (Pharmacia Biotech,
Uppsala, Suecia) que ha sido digerido con las enzimas XbaI y
HindIII. La cepa de E. coli XL1-Blue MRF'
(Stratagene, La Jolla, EE.UU.) se transforma con el lote de ligación
y las células portadoras del plásmido se seleccionan sobre agar LB,
al que se añaden 50 \mug/ml ampicilina. La clonación con éxito
puede demostrarse después del aislamiento del DNA plasmídico por
escisión controlada con las enzimas EcoRI y MluI. El plásmido se
designa pTrc99AahpCF (Figura 1).
La cepa de E. coli MG442 productora de
L-treonina se describe en la memoria descriptiva de
patente US-A-4.278.765 y ha sido
depositada como CMIM B-1628 en la Russian National
Collection for Industrial Microorganisms (VKPM, Moscú, Rusia).
La cepa MG442 se transforma con el plásmido de
expresión pTrc99AahpCF descrito en el Ejemplo 1 y con el vector
pTrc99A, y las células portadoras del plásmido se seleccionan sobre
agar LB con 50 \mug/ml ampicilina. De esta manera se producen las
cepas MG442/pTrc99AahpCF y MG442/pTrc99A. Las colonias individuales
seleccionadas se multiplican adicionalmente después sobre medio
mínimo con la composición siguiente: 3,5 g/l
Na_{2}HPO_{4}*2H_{2}O, 1,5 g/l KH_{2}PO_{4}, 1 g/l
NH_{4}Cl, 0,1 g/l MgSO_{4}*7H_{2}O, 2 g/l glucosa, 20 g/l
agar, 50 mg/l ampicilina. La formación de
L-treonina se comprueba en cultivos de lote de 10 ml
contenidos en matraces cónicos de 100 ml. Para esto se inoculan, 10
ml de medio de precultivo con la composición siguiente: 2 g/l
extracto de levadura, 10 g/l (NH_{4})_{2}SO_{4}, 1 g/l
KH_{2}PO_{4}, 0,5 g/l MgSO_{4}*7H_{2}O, 15 g/l CaCO_{3},
20 g/l glucosa, 50 mg/l ampicilina y el lote se incuba durante 16
horas a 37ºC y 180 rpm en una incubadora ESR de Kühner AG
(Birsfelden, Suiza).
Porciones de 250 \mul de este precultivo se
transinoculan en 10 ml de medio de producción (25 g/l
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 2 g/l KH_{2}PO_{4}, 1 g/l
MgSO_{4}*7H_{2}O, 0,03 g/l FeSO_{4}*7H_{2}O, 0,018 g/l
MnSO_{4}*1H_{2}O, 30 g/l CaCO_{3}, 20 g/l glucosa, 50 mg/l
ampicilina) y el lote se incuba durante 48 horas a 37ºC. La
formación de L-treonina por la cepa de partida
MG442 se investiga de la misma manera, pero sin adición alguna de
ampicilina al medio. Después de la incubación, la densidad óptica
(DO) de la suspensión de cultivo se determina con un fotómetro LP2W
del Dr. Lange (Düsseldorf, Alemania) para una longitud de onda de
medida de 660 nm.
La concentración de L-treonina
formada se determina luego en el sobrenadante de cultivo filtrado en
condiciones estériles con un analizador de aminoácidos de
Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) por
cromatografía de intercambio iónico y reacción
post-columna con detección por ninhidrina.
El resultado del experimento se muestra en la
Tabla 1.
\bullet Figura 1: mapa del plásmido
pTrc99AahpCF que contiene los genes ahpC y ahpF.
Los datos de longitud deben entenderse como
datos aproximados. Las abreviaturas y designaciones utilizadas
tienen el significado siguiente:
- \bullet
- Amp: Gen de resistencia a la ampicilina
- \bullet
- lacI: Gen para la proteína represora del promotor trc
- \bullet
- Ptrc: Región del promotor trc, inducible por IPTG
- \bullet
- ahpC: Región codificante del gen ahpC
- \bullet
- ahpF: Región codificante del gen ahpF
- \bullet
- 5S: Región 5S de rRNA
- \bullet
- rrnBT: Región del terminador rRNA
Las abreviaturas para las enzimas de restricción
tienen el significado siguiente:
- \bullet
- EcoRI: Endonucleasa de restricción de Escherichia coli RY13
- \bullet
- HindIII: Endonucleasa de restricción de Haemophilus influenzae
- \bullet
- MluI: Endonucleasa de restricción de Micrococcus luteus IFO 12992
- \bullet
- XbaI: Endonucleasa de restricción de Xanthomonas campestris
<110> Degussa AG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proceso para la preparación de
L-aminoácidos que utiliza cepas de la familia
Enterobacteriáceas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 020105 BT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ahpCF1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcatctagac gataacacgg aggaag
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ahpCF2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctaagcttt tgcaggtgaa tc
\hfill22
Claims (34)
1. Un proceso para la preparación de
L-aminoácidos, seleccionados del grupo
L-treonina, L-homoserina,
L-isoleucina, L-valina,
L-metionina y L-lisina, en el cual
se llevan a cabo los pasos siguientes:
- a)
- fermentación de microorganismos del género Escherichia que producen dichos aminoácidos y en los que el o los genes ahpC y/o ahpF están sobreexpresados,
- b)
- concentración del L-aminoácido deseado en el medio o en las células de los microorganismos.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que se aíslan dichos -aminoácidos.
3. Proceso de acuerdo con la reivindicación 2,
en el que los constituyentes de la fermentación y/o de la biomasa
permanecen completamente o en porciones (\geq 0 a 100%) en el
producto.
4. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que aumenta la expresión de uno o más polinucleótidos que
codifican los productos génicos de los genes ahpC o ahpF.
5. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que la sobreexpresión se consigue aumentando el número de
copias de dichos genes.
6. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1,
en el cual microorganismos del género Escherichia se fermentan, en
el cual se sobreexpresan adicionalmente al mismo tiempo uno o más de
los genes seleccionados del grupo constituido por:
- 6.1
- el operón thrABC que codifica aspartato-quinasa, homoserina-deshidrogenasa, homoserina-quinasa y treonina-sintasa,
- 6.2
- el gen pyc que codifica piruvato-carboxilasa,
- 6.3
- el gen pps que codifica fosfoenol-piruvato-sintasa,
- 6.4
- el gen ppc que codifica fosfoenol-piruvato-carboxilasa,
- 6.5
- los genes pntA y pntB que codifican transhidrogenasa,
- 6.6
- el gen rhtB que imparte resistencia a la homoserina,
- 6.7
- el gen mqo que codifica malato:quinona-óxido-reductasa,
- 6.8
- el gen rhtC que imparte resistencia a la treonina,
- 6.9
- el gen thrE que codifica la proteína de exportación de treonina,
- 6.10
- el gen gdhA que codifica glutamato-deshidrogenasa,
- 6.11
- el gen lrp que codifica el regulador del regulón Lrp de leucina,
- 6.12
- el gen ptsH que codifica la proteína fosfohistidina hexosa-fosfotransferasa,
- 6.13
- el gen ptsI que codifica la enzima I del sistema de la fosfotransferasa,
- 6.14
- el gen crr que codifica el componente IIA específico de glucosa,
- 6.15
- el gen dps que codifica el regulador global Dps.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1,
en el cual para la preparación de L-aminoácidos
microorganismos del género Escherichia se fermentan, en el cual se
atenúan, en particular se eliminan, adicionalmente al mismo tiempo
uno o más de los genes seleccionados del grupo constituido por:
- 7.1
- el gen tdh que codifica treonina-deshidrogenasa,
- 7.2
- el gen mdh que codifica malato-deshidrogenasa,
- 7.3
- el producto génico del marco de lectura abierto (orf) yjfA,
- 7.4
- el producto génico del marco de lectura abierto (orf) ytfP,
- 7.5
- el gen pckA que codifica fosfoenol-piruvato-carboxiquinasa,
- 7.6
- el gen poxB que codifica piruvato-oxidasa,
- 7.7
- el gen aceA que codifica isocitrato-liasa,
- 7.8
- el gen dgsA que codifica el regulador DgsA del sistema de la fosfotransferasa,
- 7.9
- el gen fruR que codifica el tepresor de fructosa,
- 7.10
- el gen rpoS que codifica el factor sigma^{38}.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Microorganismos del género Escherichia, que
producen L-aminoácidos, seleccionados del grupo
L-treonina, L-valina,
L-metionina, L-homoserina,
L-isoleucina y L-lisina, en los que
los genes ahpC y/o ahpF, y uno o más de los genes de acuerdo con la
reivindicación 6, se sobreexpresan aumentando el número de copias de
dichos genes.
9. Microoganismos de acuerdo con la
reivindicación 8, en el cual los microorganismos proceden de la
especie
E. coli.
E. coli.
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