ES2328229T3 - Proceso para la preparacion de l-treonina utilizando cepas de la familia enterobacteriaceas que contienen genes succ y sucd intensificados. - Google Patents
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Abstract
Un proceso para la producción de L-aminoácidos, seleccionados del grupo L-treonina, L-valina, L-homoserina y L-lisina, en el que se realizan los pasos siguientes: a) fermentación de microorganismos modificados de la familia Enterobacteriáceas que producen dicho o dichos L-aminoácidos, b) concentración de dicho o dichos L-aminoácidos en el medio o en las células de los microorganismos, y c) aislamiento de dicho o dichos aminoácidos, en donde constituyentes del caldo de fermentación y/o la biomasa en su totalidad o porciones (> 0 a 100%) de la misma quedan opcionalmente en el producto, en donde el microorganismo modificado comparado con el microorganismo no modificado comprende un gen sucC sobreexpresado y un gen sucD sobreexpresado, los dos cuales codifican subunidades de succinil-CoA-sintetasa o secuencias de nucleótidos sobreexpresadas que codifican los productos génicos de dichos genes.
Description
Proceso para la preparación de
L-treonina utilizando cepas de la familia
Enterobacteriáceas que contienen genes sucC y sucD
intensificados.
Esta invención se refiere a un proceso para la
preparación de L-aminoácidos, en particular
L-treonina, utilizando cepas de la familia
Enterobacteriáceas en las cuales al menos están sobreexpresados los
genes sucC y sucD.
Los L-aminoácidos, en particular
L-treonina, se utilizan en medicina humana y en la
industria farmacéutica, en la industria alimentaria y muy
particularmente en la nutrición animal.
Es conocida la preparación de
L-aminoácidos por fermentación de cepas de
Enterobacteriáceas, en particular Escherichia coli (E.
coli) y Serratia marcescens. Debido a su gran
importancia, se están realizando continuamente trabajos para
mejorar los procesos de preparación. Las mejoras del proceso pueden
referirse a las condiciones de fermentación, tales como v.g.
agitación y suministro de oxígeno, o a la composición de los medios
nutrientes, tal como v.g. la concentración de azúcar durante la
fermentación, o la elaboración hasta la forma del producto,
mediante, v.g. cromatografía de cambio iónico, o las propiedades
intrínsecas de producción del microorganismo propiamente dicho.
Para mejorar las propiedades de producción de
estos microorganismos se utilizan métodos de mutagénesis, selección
y selección de mutantes. De este modo se obtienen cepas que son
resistentes a antimetabolitos, tales como v.g. el análogo de
treonina ácido
\alpha-amino-\beta-hidroxivalérico
(AHV) o son auxótrofas para metabolitos de importancia reguladora y
producen L-aminoácidos, tales como v.g.
L-treonina.
Se han empleado también desde hace varios años
métodos de la técnica del DNA recombinante para ampliar la variedad
de cepas de la familia Enterobacteriáceas que producen
L-aminoácidos, por amplificación de genes
individuales de la biosíntesis de aminoácidos e investigación del
efecto sobre la producción.
El objeto de la invención es proporcionar nuevas
medidas para la preparación mejorada por fermentación de
L-treonina, L-valina,
L-homoserina y L-lisina.
La invención proporciona un proceso para la
preparación fermentativa de dichos L-aminoácidos, en
particular L-treonina, utilizando microorganismos
de la familia Enterobacteriáceas que producen ya en particular
L-aminoácidos y en los cuales al menos están
sobreexpresados los genes sucC y sucD.
Donde se mencionan L-aminoácidos
o aminoácidos en lo que sigue, esto significa uno o más aminoácidos,
con inclusión de sus sales, seleccionados del grupo constituido por
L-treonina, L-valina,
L-homoserina y L-lisina. Se
prefiere particularmente L-treonina.
El término "intensificación" describe en
este contexto el aumento de la actividad intracelular de una o más
enzimas o proteínas en un microorganismo que están codificadas por
el DNA correspondiente, por ejemplo por aumento del número de
copias del gen o genes, utilizando un promotor potente o un gen o
alelo que codifica una enzima o proteína correspondiente con
actividad alta, y opcionalmente combinación de estas medidas.
Por medidas de intensificación, en particular
sobreexpresión, la actividad o concentración de la proteína
correspondiente se incrementa en general al menos en un 10%, 25%,
50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% o 500%, hasta un máximo de
1000% o 2000%, basada en la de la proteína de tipo salvaje o la
actividad o concentración de la proteína en el microorganismo de
partida.
El proceso comprende la realización de los pasos
siguientes:
- a)
- fermentación de microorganismos de la familia Enterobacteriáceas en los cuales los genes sucC y sucD, están sobreexpresados,
- b)
- concentración de dicho(s) L-aminoácido(s) en el medio o en las células de los microorganismos de la familia Enterobacteriáceas, y
- c)
- aislamiento de dicho o dichos L-aminoácidos, quedando opcionalmente en el producto constituyentes del caldo de fermentación y/o la biomasa en su totalidad o porciones (> 0 a 100%) de la misma.
Los microorganismos que proporciona la presente
invención pueden producir dichos L-aminoácidos a
partir de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas,
opcionalmente almidón, opcionalmente celulosa o a partir de
glicerol y etanol. Los mismos son representativos de la familia
Enterobacteriáceas seleccionados del género Escherichia, Erwinia,
Providencia y Serratia. Se prefieren los géneros Escherichia y
Serratia. Del genero Escherichia puede mencionarse en particular la
especie Escherichia coli, y del género Serratia la especie
Serratia marcescens.
Cepas adecuadas, que producen en particular
L-treonina, del género Escherichia, en particular de
la especie Escherichia coli, son, por ejemplo
Escherichia coli TF427
Escherichia coli H4578
Escherichia coli KY10935
Escherichia coli VNIIgenetika MG442
Escherichia coli VNIIgenetika M1
Escherichia coli VNIIgenetika 472T23
Escherichia coli BKIIM
B-3996
Escherichia coli kat 13
Escherichia coli
KCCM-10132.
\vskip1.000000\baselineskip
Cepas adecuadas productoras de
L-treonina del género Serratia, en particular de la
especie Serratia marcescens, son, por ejemplo
Serratia marcescens HNr21
Serratia marcescens TLr156
Serratia marcescens T2000.
\vskip1.000000\baselineskip
Las cepas de la familia Enterobacteriáceas que
producen L-treonina tienen preferiblemente, entre
otras, una o más características genéticas o fenotípicas
seleccionadas del grupo constituido por:
resistencia a ácido
\alpha-amino-\beta-hidroxivalérico,
resistencia a tialisina, resistencia a etionina, resistencia a
\alpha-metilserina, resistencia a ácido
diaminosuccínico, resistencia a ácido
\alpha-aminobutírico, resistencia a borrelidina,
resistencia a rifampicina, resistencia a análogos de valina tales
como, por ejemplo, hidroxamato de valina, resistencia a análogos de
purina tales como, por ejemplo,
6-dimetil-aminopurina, necesidad de
L-metionina, opcionalmente necesidad parcial y
compensable de L-isoleucina, necesidad de ácido
meso-diaminopimélico, auxotrofia con respecto a
dipéptidos que contienen treonina, resistencia a
L-treonina, resistencia a
L-homoserina, resistencia a
L-lisina, resistencia a L-metionina,
resistencia a ácido L-glutámico, resistencia a
L-aspartato, resistencia a
L-leucina, resistencia a
L-fenilalanina, resistencia a
L-serina, resistencia a L-cisteína,
resistencia a L-valina, sensibilidad a
fluoropiruvato, treonina-deshidrogenasa deficiente,
opcionalmente capacidad para utilización de sacarosa,
intensificación del operón treonina, intensificación de la
homoserina-deshidrogenasa
I-aspartato-quinasa I,
preferiblemente de la forma resistente a la realimentación,
intensificación de homoserina-quinasa,
intensificación de treonina-sintasa, intensificación
de aspartato-quinasa, opcionalmente de la forma
resistente a la realimentación, intensificación de
aspartato-semialdehído-deshidrogenasa,
intensificación de fosfoenolpiruvato-carboxilasa,
opcionalmente de la forma resistente a la realimentación,
intensificación de fosfoenolpiruvato-sintasa,
intensificación de transhidrogenasa, intensificación del producto
del gen RhtB, intensificación del producto del gen RhtC,
intensificación del producto del gen YfiK, intensificación de una
piruvato-carboxilasa y atenuación de la formación
de ácido acético.
Se ha encontrado que los microorganismos de la
familia Enterobacteriáceas producen dichos
L-aminoácidos, en particular
L-treonina, de manera incrementada después de
sobreexpresión de los genes sucC y sucD.
Las secuencias de nucleótidos de los genes de
Escherichia coli pertenecen a la técnica anterior y pueden
encontrarse también en la secuencia genómica de Escherichia
coli publicada por Blattner et al. (Science 277:
1453-1462 (1997)).
\newpage
La información siguiente, entre otras, acerca de
los genes sucC y sucD se conoce por la técnica anterior:
Las secuencias de ácido nucleico pueden
encontrarse en los bancos de datos del National Center for
Biotechnology Information (NCBI) de la National Library of Medicine
(Bethesda, MD, EEUU), el banco de datos de secuencias de
nucleótidos de los European Molecular Biologies Laboratories (EMBL,
Heidelberg, Alemania o Cambridge, Reino Unido) o el banco de datos
de DNA de Japón (DDBJ, Mishima, Japón).
Los genes descritos en las referencias de texto
mencionadas pueden utilizarse de acuerdo con la invención.
Adicionalmente, pueden utilizarse alelos de los genes que resultan
de la degeneración del código genético o debidos a "mutaciones
sentido" de función neutra.
Para lograr una intensificación, por ejemplo,
pueden aumentarse la expresión de los genes o las propiedades
catalíticas de las proteínas. Las dos medidas pueden combinarse
opcionalmente.
Para conseguir una sobreexpresión, puede
aumentarse el número de copias de los genes correspondientes, o
pueden mutarse el promotor y la región reguladora del sitio de
fijación de ribosoma aguas arriba del gen estructural. Casetes de
expresión que se incorporan aguas arriba del gen estructural actúan
del mismo modo. Con ayuda de promotores inducibles, es posible
aumentar adicionalmente la expresión en el curso de la producción de
L-treonina por fermentación. La expresión se mejora
análogamente por medidas para prolongar la vida del
m-RNA. Adicionalmente, la actividad enzimática se
aumenta también por prevención de la degradación de la proteína
enzimática. Los genes o constructos génicos pueden estar presentes
en plásmidos con un número variable de copias, o pueden integrarse
y amplificarse en el cromosoma. Como alternativa, puede conseguirse
adicionalmente una sobreexpresión de los genes en cuestión por
cambio de la composición de los medios y el procedimiento de
cultivo.
Instrucciones en este contexto pueden ser
encontradas por los expertos, inter alia, en Chang y Cohen
(Journal of Bacteriology 134: 1141-1156 (1978)), en
Hartley y Gregori (Gene 13: 347-353 (1981)), en
Amann y Brosius (Gene 40: 183-190 (1985)), en de
Broer et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences
of the United States of America 80: 21-25 (1983)),
en LaVallie et al. (BIO/TECHNOLOGY 11:
187-193 (1993)), en PCT/US97/13359, en Llosa et
al. (Plasmid 26: 222-224 (1991)), en Quandt y
Klipp (Gene 80: 161-169 (1989)), en Hamilton et
al. (Journal of Bacteriology 171: 4617-4622
(1989)), en Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58:
191-195 (1998)) y en libros de texto conocidos de
genética y biología molecular.
Pueden utilizarse vectores plasmídicos que son
capaces de replicación en Enterobacteriáceas, tales como v.g.
vectores de clonación derivados de pACYC184 (Bartolomé et
al.; Gene 102: 75-78 (1991)), pTrc99A (Amann
et al.; (Gene 69: 301-315 (1988)) o
derivados de pSC101 (Vocke y Bastia; Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America 80 (21):
6557-6561 (1983)). Una cepa transformada con un
vector plasmídico, donde el vector plasmídico lleva al menos uno o
más de los genes seleccionados del grupo constituido por sucC y
sucD, o secuencias de nucleótidos que codifican éstos, pueden
emplearse en un proceso de acuerdo con la invención.
Asimismo, es posible transferir mutaciones que
afectan a la expresión del gen particular en diversas cepas por
cambio de secuencia (Hamilton et al.; Journal of Bacteriology
171: 4617-4622 (1989)), conjugación o
transducción.
Adicionalmente, puede ser ventajosa para la
producción de L-treonina con cepas de la familia
Enterobacteriáceas, además de la sobreexpresión de los genes sucC y
sucD, la intensificación de una o más enzimas del camino conocido
de biosíntesis de la treonina o enzimas del metabolismo anaplerótico
o enzimas para la producción de
nicotinamida-adenina-dinucleótido-fosfato
reducido o enzimas de la glicólisis o enzimas PTS o enzimas del
metabolismo del azufre.
Así, por ejemplo, pueden sobreexpresarse al
mismo tiempo uno o más de los genes seleccionados del grupo
constituido por:
- \bullet
- el operón thrABC que codifica aspartato-quinasa, homoserina-deshidrogenasa, homoserina-quinasa y treonina-sintasa (US-A-4.278.765),
- \bullet
- el gen pyc de Corynebacterium glutamicum que codifica piruvato-carboxilasa (WO 99/18228),
- \bullet
- el gen pps que codifica fosfoenol-piruvato-sintasa (Molecular and General Genetics 231(2), 332-336 (1992)),
- \bullet
- el gen ppc que codifica fosfoenolpiruvato carboxilasa (Gene 31: 279-283 (1984)),
- \bullet
- los genes pntA y pntB que codifican transhidrogenasa (European Journal of Biochemistry 158, 647-653 (1986)),
- \bullet
- el gen rhtB que imparte resistencia a homoserina (EP-A-0 994 190),
- \bullet
- el gen mqo que codifica malato:quinona-oxidorreductasa (WO 02/06459),
- \bullet
- el gen rhtC que imparte resistencia a treonina (EP-A-1 013 765),
- \bullet
- el gen thrE de Corynebacterium glutamicum que codifica la proteína exportadora de treonina (WO 01/ 92545),
- \bullet
- el gen gdhA que codifica glutamato-deshidrogenasa (Nucleic Acids Research 11, 5257-5266 (1983); Gene 23, 199-209 (1983)),
- \bullet
- el gen hns que codifica la proteína de fijación de DNA HLP-II (Molecular and General Genetics 212: 199-202 (1988)),
- \bullet
- el gen pgm que codifica fosfoglucomutasa (Journal of Bacteriology 176: 5847-5851 (1994)),
- \bullet
- el gen fba que codifica fructosa-bisfosfato-aldolasa (Biochemical Journal 257: 529-534 (1989)),
- \bullet
- el gen ptsH del operón ptsHIcrr que codifica la fosfohistidina-protein-hexosa-fosfotransferasa del sistema de fosfotransferasa PTS (Journal of Biological Chemistry 262: 16241-16253 (1987)),
- \bullet
- el gen ptsI del operón ptsHIcrr que codifica la enzima I del sistema de fosfotransferasa PTS (Journal of Biological Chemistry 262: 16241-16253 (1987)),
- \bullet
- el gen crr del operón ptsHIcrr que codifica el componente IIA específico de glucosa del sistema de fosfotransferasa PTS (Journal of Biological Chemistry 262: 16241-16253 (1987)),
- \bullet
- el gen ptsG que codifica el componente IIBC específico de glucosa (Journal of Biological Chemistry 261: 16398-16403 (1986)),
- \bullet
- el gen lrp que codifica el regulador del regulón leucina (Journal of Biological Chemistry 266: 10768-10774 (1991)),
- \bullet
- el gen mopB que codifica la chaperona de 10 Kd (Journal of Biological Chemistry 261: 12414-12419 (1986)), y es conocido también por el nombre groES,
- \bullet
- el gen ahpC del operón ahpCF que codifica la subunidad pequeña de alquil-hidroperóxido-reductasa (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92: 7617-7621 (1995)),
- \bullet
- el gen ahpF del operón ahpCF que codifica la subunidad grande de alquil-hidroperóxido-reductasa (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92: 7617-7621 (1995)),
- \bullet
- el gen cysK que codifica cisteína-sintasa A (Journal of Bacteriology 170: 3150-3157 (1988)),
- \bullet
- el gen cysB que codifica el regulador del regulón cys Journal of Biological Chemistry 262: 5999-6005 (1987)),
- \bullet
- el gen cysJ del operón cysJIH que codifica la flavoproteína de la NADPH-sulfito-reductasa (Journal of Biological Chemistry 264: 15796-15808 (1989), Journal of Biological Chemistry 264: 15726-15737 (1989)),
- \bullet
- el gen cysI del operón cysJIH que codifica la hemoproteína de la NADPH-sulfito-reductasa (Journal of Biological Chemistry 264: 15796-15808 (1989), Journal of Biological Chemistry 264: 15726-15737 (1989)),
- \bullet
- el gen cysH del operón cysJIH que codifica adenilil-sulfato-reductasa (Journal of Biological Chemistry 264: 15796-15808 (1989), Journal of Biological Chemistry 264: 15726-15737 (1989)),
- \bullet
- el gen phoE que codifica la proteína E de la membrana exterior de la célula (Journal of Molecular Biology 163 (4): 513-532 (1983)),
- \bullet
- el gen malE que codifica la proteína periplásmica de fijación del transporte de maltosa (Journal of Biological Chemistry 259 (16): 10606-10613 (1984)),
- \bullet
- el gen pykF que codifica piruvato-quinasa I estimulada por fructosa (Journal of Bacteriology 177 (19): 5719-5722 (1995)),
- \bullet
- el gen pfkB que codifica 6-fosfofructoquinasa II (Gene 28 (3): 337-342 (1984)),
- \bullet
- el gen talB que codifica transaldolasa B (Journal of Bacteriology 177 (20): 5930-5936 (1995)),
- \bullet
- el gen rseA del operón rseABC que codifica una proteína de membrana con actividad anti-sigmaE (Molecular Microbiology 24 (2): 355-371 (1997)),
- \bullet
- el gen rseC del operón rseABC que codifica un regulador global del factor sigmaE (Molecular Microbiology 24 (2): 355-371 (1997)),
- \bullet
- el gen sodA que codifica superóxido-dismutasa (Journa1 of Bacteriology 155 (3): 1078-1087 (1983)),
- \bullet
- el gen phoB del operón phoBR que codifica el regulador positivo PhoB del regulón pho (Journal of Molecular Biology 190 (1): 37-44 (1986)),
- \bullet
- el gen phoR del operón phoBR que codifica la proteína sensora del regulón pho (Journal of Molecular Biology 192 (3): 549-556 (1986)),
- \bullet
- el gen sucA del operón sucABCD que codifica la subunidad descarboxilasa de 2-cetoglutarato-deshidrogenasa (European Journal of Biochemistry 141 (2): 351-359 (1984)) y
- \bullet
- el gen sucB del operón sucABCD que codifica la subunidad dihidrolipoiltranssuccinasa E2 de 2-cetoglutarato-deshidrogenasa (European Journal of Biochemistry 141 (2): 361-374 (1984)).
\newpage
Adicionalmente, puede ser ventajosa para la
producción de L-treonina, además de la
sobreexpresión de los genes sucC y sucD, la eliminación de uno o
más de los genes seleccionados del grupo constituido por:
- \bullet
- el gen tdh que codifica treonina-deshidrogenasa (Journal of Bacteriology 169, 4716-4721 (1987)),
- \bullet
- el gen mdh que codifica malato-deshidrogenasa (E.C.1.1.1.37) (Archives in Microbiology 149, 36-42 (1987)),
- \bullet
- el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) yjfA (Número de Acceso AAC77180 del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.),
- \bullet
- el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) ytfP (Número de Acceso AAC77179 del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.),
- \bullet
- el gen pckA que codifica la enzima fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa (Journal of Bacteriology 172: 7151-7156 (1990)),
- \bullet
- el gen poxB que codifica piruvato-oxidasa (Nucleic Acids Research 14(13): 5449-5460 (1986)),
- \bullet
- el gen aceA que codifica la enzima isocitrato-liasa (Journal of Bacteriology 170: 4528-4536 (1988)),
- \bullet
- el gen dgsA que codifica el regulador DgsA del sistema de fosfotransferasa (Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 59: 256-251 (1995))) que es conocido también como el gen mlc,
- \bullet
- el gen fruR que codifica el represor fructosa (Molecular and General Genetics 226: 332-336 (1991)), y es conocido también con el nombre de gen cra y
- \bullet
- el gen rpoS que codifica el factor sigma^{38} (WO 01/05939), y es conocido también con el nombre de gen katF.
\vskip1.000000\baselineskip
En este contexto, el término "atenuación"
describe la reducción o eliminación de la actividad intracelular de
una o más enzimas (proteínas) en un microorganismo que están
codificadas por el DNA correspondiente, por ejemplo por utilización
de un promotor débil o un gen o alelo que codifica una enzima
correspondiente con una actividad baja o desactiva la enzima
(proteína) correspondiente o gen, y opcionalmente combinación de
estas medidas.
Por medidas de atenuación, la actividad o
concentración de la proteína correspondiente se reduce en general a
0 hasta 75%, 0 a 50%, 0 a 25%, 0 a 10% o 0 a 5% de la actividad o
concentración de la proteína de tipo salvaje o de la actividad o
concentración de la proteína en el microorganismo de partida.
Adicionalmente, puede ser ventajoso para la
producción de dichos L-aminoácidos, en particular
L-treonina, además de la sobreexpresión de los
genes sucC y sucD, eliminar reacciones secundarias indeseables
(Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms",
en: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek
(eds.), Academic Press, Londres, Reino Unido, 1982).
Los microorganismos producidos de acuerdo con la
invención pueden cultivarse en el proceso de lotes (cultivo
discontinuo), el proceso de lote alimentado (proceso de
alimentación), o el proceso de realimentación repetida (proceso de
alimentación repetitivo). Un sumario de métodos de cultivo conocidos
se describe en el libro de texto de Chmiel (Bioprozesstechnik 1.
Einführung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess Technology 1.
Introduction to Bioprocess Technology (Gustav Fischer Verlag,
Stuttgart, 1991)) o en el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren
und periphere Einrichtungen [Bioreactors and Peripheral Equipment]
(Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).
El medio de cultivo a utilizar debe satisfacer
los requerimientos de las cepas particulares de manera adecuada.
Descripciones de medios de cultivo para diversos microorganismos se
contienen en el libro de texto "Manual of Methods for General
Bacteriology" de la American Society for Bacteriology (Washington
D.C., EEUU, 1981).
Azúcares y carbohidratos, tales como v.g.
glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, almidón y
opcionalmente celulosa, aceites y grasas, tales como v.g. aceite de
soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y aceite de coco,
ácidos grasos tales como v.g. ácido palmítico, ácido esteárico y
ácido linoleico, alcoholes, tales como v.g. glicerol y etanol, y
ácidos orgánicos, tales como v.g. ácido acético pueden utilizarse
como la fuente de carbono. Estas sustancias pueden utilizarse
individualmente o como una mezcla.
Compuestos orgánicos nitrogenados, tales como
peptonas, extractos de levadura, extracto de carne, extracto de
malta, licor de maceración de maíz, harina de semilla de soja y
urea, o compuestos inorgánicos, tales como sulfato de amonio,
cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato
de amonio, pueden utilizarse como la fuente de nitrógeno. Las
fuentes de nitrógeno pueden utilizarse individualmente o en forma de
mezcla.
Ácido fosfórico, dihidrogenofosfato de potasio o
hidrogenofosfato dipotásico o las sales correspondientes que
contienen sodio pueden utilizarse como la fuente de fósforo. El
medio de cultivo debe comprender adicionalmente sales de metales,
tales como v.g. sulfato de magnesio o sulfato de hierro, que son
necesarias para el crecimiento. Finalmente, sustancias esenciales
para el crecimiento, tales como aminoácidos y vitaminas, pueden
emplearse además de las sustancias arriba mencionadas.
Adicionalmente, pueden añadirse al medio de cultivo precursores
adecuados. Las sustancias de partida mencionadas pueden añadirse al
cultivo en la forma de un lote simple, o pueden alimentarse durante
el cultivo de manera adecuada.
Compuestos básicos, tales como hidróxido de
sodio, hidróxido de potasio, amoniaco o amoniaco acuoso, o
compuestos ácidos, tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico,
pueden emplearse de manera adecuada para controlar el pH del
cultivo. Antiespumantes, tales como v.g. ésteres poliglicólicos de
ácidos grasos, pueden emplearse para controlar el desarrollo de
espuma. Sustancias adecuadas que tienen una acción selectiva, v.g.
antibióticos, pueden añadirse al medio para mantener la estabilidad
de los plásmidos. Para mantener condiciones aerobias, se introducen
en el cultivo oxígeno o mezclas gaseosas que contienen oxígeno,
tales como v.g. aire. La temperatura del cultivo es usualmente 25ºC
a 45ºC, y preferiblemente 30ºC a 40ºC. El cultivo se continúa hasta
que se ha formado un máximo de L-aminoácidos o
L-treonina. Esta meta se alcanza usualmente dentro
de 10 horas a 160 horas.
El análisis de L-aminoácidos
puede realizarse por cromatografía de intercambio aniónico con
derivación de ninhidrina subsiguiente, como se describe por
Spackman et al. (Analytical Chemistry 30:
1190-1206 (1958)), o puede tener lugar por HPLC en
fase inversa como ha sido descrito por Lindroth et al.
(Analytical Chemistry 51: 1167-1174 (1979)).
El proceso de acuerdo con la invención se
utiliza para la preparación fermentativa de
L-aminoácidos, tales como, por ejemplo,
L-treonina, L-valina,
L-homoserina y L-lisina, en
particular L-treonina.
La presente invención se explica con mayor
detalle a continuación con ayuda de ejemplos de realización.
El medio mínimo (M9) y medio completo (LB) para
Escherichia coli utilizados han sido descritos por J.H.
Miller (A Short Course in Bacterial Genetics (1992), Cold Spring
Harbor Laboratory Press). El aislamiento de DNA plasmídico de
Escherichia coli y todas las técnicas de restricción,
ligación, Klenow y tratamiento con fosfatasa alcalina se llevan a
cabo por el método de Sambrook et al. (Molecular Cloning - A
Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). A no
ser que se indique otra cosa, la transformación de Escherichia
coli se lleva a cabo por el método de Chung et al.
(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America 86: 2172-2175 (1989)).
La temperatura de incubación para la preparación
de cepas y transformantes es 37ºC.
Los genes sucC y sucD de E. coli K12 se
amplifican utilizando la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y
oligonucleótidos sintéticos. Partiendo desde la secuencia de
nucleótidos de los genes sucC y sucD en E. coli K12 MG1655
(Número de Acceso AE000176, Blattner et al. (Science
277:1453-1462 (1997)), se sintetizan iniciadores
PCR (MWG Biotech, Ebersberg, Alemania). Las secuencias de los
iniciadores se modifican de tal manera que se forman sitios de
reconocimiento para enzimas de restricción. La secuencia de
reconocimiento para XbaI se selecciona para el iniciador sucCD1 y
la secuencia para HindIII para el iniciador sucCD2, que están
marcadas por subrayado en las secuencias de nucleótidos que se
muestran a continuación:
El DNA cromosómico de E. coli K12 MG1655
empleado para la PCR se aísla de acuerdo con las instrucciones del
fabricante con "Qiagen Genomic-tips 100/G"
(QIAGEN, Hilden, Alemania). Un fragmento de DNA de aproximadamente
2100 pb de tamaño puede amplificarse con los iniciadores específicos
en condiciones PCR estándar (Innis et al. (1990) PCR
Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press) con
DNA-polimerasa Pfu (Promega Corporation, Madison,
EE.UU.).
El producto PCR se escinde con las enzimas de
restricción XbaI y HindIII y se liga con el vector pTrc99A
(Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia), que se ha digerido con las
enzimas XbaI y HindIII. La cepa de E. coli
XL1-BlueMRF' (Stratagene, La Jolla, EE.UU.) se
transforma con el lote de ligación y las células portadoras del
plásmido se seleccionan en agar LB, al que se añaden 50 \mug/ml
de ampicilina. La clonación satisfactoria puede demostrarse después
de aislamiento del DNA plasmídico por restricción de control con las
enzimas EcoRV, HpaI y SspI. El plásmido se designa pTrc99AsucCD
(Figura 1).
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa de E. coli MG442 productora de
L-treonina se describe en la memoria descriptiva de
patente US-A-4278765 y está
depositada como CMIM B-1628 en la Colección Nacional
Rusa de Microorganismos Industriales (VKPM, Moscú, Rusia).
La cepa MG442 se transforma con el plásmido de
expresión pTrc99AsucCD descrito en el Ejemplo 1 y con el vector
pTrc99A, y las células portadoras del plásmido se seleccionan en
agar LB con 50 \mug/ml de ampicilina. De este modo se forman las
cepas MG442/pTrc99AsucCD y MG442/pTrc99A. Se multiplican luego
adicionalmente las colonias individuales seleccionadas en medio
mínimo con la composición siguiente: 3,5 g/l
Na_{2}HPO_{4}*2H_{2}O, 1,5 g/l KH_{2}PO_{4}, 1 g/l
NH_{4}Cl, 0,1 g/l MgSO_{4}*7H_{2}O, 2 g/l glucosa, 20 g/l
agar, y 50 mg/l ampicilina. La formación de
L-treonina se comprueba en cultivos discontinuos de
10 ml contenidos en matraces cónicos de 100 ml. Para esto, se
inoculan 10 ml del medio de precultivo de la composición siguiente:
2 g/l extracto de levadura, 10 g/l (NH_{4})_{2}SO_{4},
1 g/l KH_{2}PO_{4}, 0,5 g/l MgSO_{4}*7H_{2}O, 15 g/l
CaCO_{3}, 20 g/l glucosa, y 50 mg/l ampicilina y el lote se incuba
durante 16 horas a 37ºC y 180 rpm en una incubadora ESR de Kühner
AG (Birsfelden, Suiza).
Porciones de 250 \mul de este precultivo se
transinoculan en 10 ml de medio de producción (25 g/l
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 2 g/l KH_{2}PO_{4}, 1 g/l
MgSO_{4}*7H_{2}O, 0,03 g/l FeSO_{4}*7H_{2}O, 0,018 g/l
MnSO_{4}*1H_{2}O, 30 g/l CaCO_{3}, 20 g/l glucosa, 50 mg/l
ampicilina) y el lote se incuba durante 48 horas a 37ºC. La
formación de L-treonina por la cepa de partida
MG442 se investiga del mismo modo, pero sin que tenga lugar adición
alguna de ampicilina al medio. Después de la incubación, se
determina la densidad óptica (DO) de la suspensión de cultivo con
un fotómetro LP2W del Dr. Lange (Düsseldorf, Alemania) a una
longitud de onda de medida de 660 nm.
La concentración de L-treonina
formada se determina luego en el sobrenadante de cultivo filtrado en
condiciones estériles con un analizador de aminoácidos de
Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) por
cromatografía de intercambio iónico y reacción
post-columna con detección por ninhidrina.
El resultado del experimento se muestra en la
Tabla 1.
Figura 1: Mapa del plásmido pTrc99AsucCD que
contiene los genes sucC y sucD.
Los datos de longitud deben entenderse como
datos aproximados. Las abreviaturas y designaciones utilizadas
tienen el significado siguiente:
- \bullet
- Amp: resistencia a ampicilina
- \bullet
- lacI: gen para la proteína represora del promotor trc
- \bullet
- Ptrc: región promotora trc, inducible por IPTG
- \bullet
- sucC: región codificante del gen sucC
- \bullet
- sucD: región codificante del gen sucD
- \bullet
- 5S: región de rRNA 5S
- \bullet
- rrnBT: región terminadora de rRNA
Las abreviaturas para las enzimas de restricción
tienen el significado siguiente
- \bullet
- EcoRV: endonucleasa de restricción de Escherichia coli B946
- \bullet
- HindIII: endonucleasa de restricción de Haemophilus influenzae
- \bullet
- HpaI: endonucleasa de restricción de Haemophilus parainfluenzae
- \bullet
- SspI: endonucleasa de restricción de Sphaerotilus species ATCC 13925
- \bullet
- XbaI: endonucleasa de restricción de Xanthomonas campestris
<110> Degussa AG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proceso para la preparación de
L-aminoácidos utilizando cepas de las familia
Enterobacteriáceas que contienen un gen sucC o sucD
intensificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 010293BT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sucCD1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sucCD2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
Claims (51)
1. Un proceso para la producción de
L-aminoácidos, seleccionados del grupo
L-treonina, L-valina,
L-homoserina y L-lisina, en el que
se realizan los pasos siguientes:
- a)
- fermentación de microorganismos modificados de la familia Enterobacteriáceas que producen dicho o dichos L-aminoácidos,
- b)
- concentración de dicho o dichos L-aminoácidos en el medio o en las células de los microorganismos, y
- c)
- aislamiento de dicho o dichos aminoácidos, en donde constituyentes del caldo de fermentación y/o la biomasa en su totalidad o porciones (> 0 a 100%) de la misma quedan opcionalmente en el producto,
en donde el microorganismo
modificado comparado con el microorganismo no modificado comprende
un gen sucC sobreexpresado y un gen sucD sobreexpresado, los dos
cuales codifican subunidades de
succinil-CoA-sintetasa o secuencias
de nucleótidos sobreexpresadas que codifican los productos génicos
de dichos
genes.
2. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde se produce L-treonina por fermentación de
microorganismos de la familia Enterobacteriáceas en la cual se
sobreexpresa(n) adicionalmente al mismo tiempo uno o más de
los genes seleccionados del grupo constituido por:
- 2.1
- el operón thrABC que codifica aspartato-quinasa, homoserina-deshidrogenasa, homoserina-quinasa y treonina-sintasa,
- 2.2
- el gen pyc que codifica piruvato-carboxilasa,
- 2.3
- el gen pps que codifica fosfoenol-piruvato-sintasa,
- 2.4
- el gen ppc que codifica fosfoenolpiruvato carboxilasa,
- 2.5
- los genes pntA y pntB que codifican transhidrogenasa,
- 2.6
- el gen rhtB de Escherichia coli que codifica una proteína que imparte resistencia a homoserina,
- 2.7
- el gen mqo que codifica malato:quinona-oxidorreductasa,
- 2.8
- el gen rhtC de Escherichia coli que codifica una proteína que imparte resistencia a treonina,
- 2.9
- el gen thrE que codifica la proteína exportadora de treonina,
- 2.10
- el gdhA gen que codifica glutamato-deshidrogenasa
- 2.11
- el gen hns que codifica la proteína de fijación de DNA HLP-II,
- 2.12
- el gen pgm, que codifica fosfoglucoisomerasa,
- 2.13
- el gen fba que codifica fructosa-bisfosfato-aldolasa,
- 2.14
- el gen ptsH que codifica la fosfohistidina-protein-hexosa-fosfotransferasa,
- 2.15
- el gen ptsI que codifica la enzima I del sistema de fosfotransferasa,
- 2.16
- el gen crr que codifica el componente IIA específico de glucosa,
- 2.17
- el gen ptsG que codifica el componente IIBC específico de glucosa,
- 2.18
- el gen lrp, que codifica el regulador del regulón leucina,
- 2.19
- el gen mopB, que codifica la chaperona de 10 kD,
- 2.20
- el gen ahpC, que codifica la subunidad pequeña de alquil-hidroperóxido-reductasa,
- 2.21
- el gen ahpF, que codifica la subunidad grande de alquil-hidroperóxido-reductasa,
- 2.22
- el gen cysK, que codifica cisteína-sintasa A,
- 2.23
- el gen cysB, que codifica el regulador del regulón cys,
- 2.24
- el gen cysJ, que codifica la flavoproteína de la NADPH-sulfito-reductasa,
- 2.25
- el gen cysI, que codifica la hemoproteína de la NADPH-sulfito-reductasa,
- 2.26
- el gen cysH, que codifica adenilil-sulfato-reductasa,
- 2.27
- el gen phoE que codifica la proteína E de la membrana exterior de la célula,
- 2.28
- el gen malE, que codifica la proteína periplásmica de fijación del transporte de maltosa,
- 2.29
- el gen pykF, que codifica piruvato-quinasa I estimulada por fructosa,
- 2.30
- el pfkB gene que codifica 6-fosfofructoquinasa II,
- 2.31
- el gen talB que codifica transaldolasa B,
- 2.32
- el gen rseA, que codifica una proteína de membrana que actúa como regulador negativo de la actividad de sigmaE,
- 2.33
- el gen rseC, que codifica un regulador global del factor sigmaE,
- 2.34
- el gen sodA, que codifica superóxido-dismutasa,
- 2.35
- el gen phoB que codifica el regulador positivo PhoB del regulón pho, y
- 2.36
- el gen phoR que codifica la proteína sensora del regulón pho.
3. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1 ó
2, en donde se produce L-treonina por fermentación
de microorganismos de la familia Enterobacteriáceas en la cual se
elimina(n) al mismo tiempo uno o más de los genes
seleccionados del grupo constituido por:
- 3.1
- el gen tdh que codifica treonina-deshidrogenasa,
- 3.2
- el gen mdh que codifica malato-deshidrogenasa,
- 3.3
- el producto génico del marco de lectura abierto (orf) yjfA de E. coli, cuando dicho organismo es Escherichia coli,
- 3.4
- el producto génico del marco de lectura abierto (orf) ytfP de E. coli, cuando dicho organismo es Escherichia coli,
- 3.5
- el gen pckA que codifica fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa,
- 3.6
- el gen poxB que codifica piruvato-oxidasa,
- 3.7
- el gen aceA que codifica isocitrato-liasa,
- 3.8
- el gen dgsA que codifica el regulador DgsA del sistema de fosfotransferasa,
- 3.9
- el gen fruR que codifica el represor fructosa, y
- 3.10
- el gen rpoS que codifica el factor sigma^{38}.
4. Microorganismos recombinantes del género
Escherichia, que producen L-treonina, y en donde al
menos:
a) el operón thrABC, cuyos genes codifican
aspartato-quinasa,
homoserina-deshidrogenasa,
homoserina-quinasa y
treonina-sintasa, y
b) los genes sucC y sucD, los dos cuales
codifican subunidades de
succinil-CoA-sintetasa, o secuencias
de nucleótidos que codifican los productos génicos de dichos
genes,
están sobreexpresados.
5. Microorganismos de acuerdo con la
reivindicación 4, en donde los microorganismos se originan de la
especie E. coli.
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