DE60225011T2

DE60225011T2 - Verfahren zur herstellung von l-threonin durch enterobakteriaceae-stämmen mit verstärkter exprimierung des phoe-gens

Info

Publication number: DE60225011T2
Application number: DE60225011T
Authority: DE
Inventors: Mechthild Rieping
Original assignee: Evonik Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2001-07-18
Filing date: 2002-07-03
Publication date: 2009-02-05
Anticipated expiration: 2022-07-04
Also published as: WO2003008605A2; ES2328230T3; AU2002325293A1; ATE434663T1; AU2002345083A1; DK1407027T3; AU2002354852A1; DE60228715D1; WO2003008605A3; WO2003008610A3; US20050170472A1; AU2002319281A1; DE60232725D1; WO2003008609A2; WO2003008610A2; EP1407024B1; EP1407027A2; EP1407022A2; WO2003008606A2; EP1407025A2

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Threonin unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae, in denen mindestens das Gen phoE überexprimiert wird.
Stand der Technik
L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, finden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung Anwendung.
Es ist bekannt, L-Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen der Enterobacteriaceae, insbesondere Escherichia coli (E. coli) und Serratia marcescens, herzustellen. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen, wie z. B. Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien, wie z. B. die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform, durch z. B. Ionenaustauschchromatographie, oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.
Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite wie z. B. das Threonin-Analogon α-Amino-β-hydroxyvaleriansäure (AHV) oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und L-Aminosäuren wie z. B. L-Threonin produzieren.
Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung L- Aminosäuren produzierender Stämme der Familie Enterobacteriaceae eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die Produktion untersucht.
Aufgabe der Erfindung
Die Erfinder haben sich die Aufgabe gestellt, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von L-Threonin bereitzustellen.
Darstellung der Erfindung
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Threonin unter Verwendung von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, die insbesondere bereits L-Aminosäuren produzieren und in denen mindestens die für das Gen phoE kodierende Nukleotidsequenz überexprimiert wird.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Wird im folgenden L-Threonin erwähnt, so versteht sich das einschließlich seiner Salze.
Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor oder ein Gen oder Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym bzw. Protein mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
Durch die Maßnahmen der Überexpression wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500%, maximal bis 1000% oder 2000% bezogen auf die des Wildtyp-Proteins beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus erhöht.
Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte durchführt:

a) Fermentation von L-Threonin produzierenden modifizierten Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae,
b) Anreicherung des L-Threonins im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae und
c) Isolierung des L-Threonins, wobei gegebenenfalls Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder die Biomasse in ihrer Gesamtheit oder Anteilen (> 0 bis 100%) davon im Produkt verbleiben,

Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können L-Aminosäuren aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, gegebenenfalls Stärke, gegebenenfalls Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es handelt sich um Vertreter der Familie Enterobacteriaceae, ausgewählt aus den Gattungen Escherichia, Erwinia, Providencia und Serratia. Die Gattungen Escherichia und Serratia werden bevorzugt. Bei der Gattung Escherichia ist insbesondere die Art Escherichia coli und bei der Gattung Serratia insbesondere die Art Serratia marcescens zu nennen.
Geeignete, insbesondere L-Threonin produzierende Stämme der Gattung Escherichia, insbesondere der Art

Escherichia coli sind beispielsweise
Escherichia coli TF427
Escherichia coli H4578
Escherichia coli KY10935
Escherichia coli VNIIgenetika MG442
Escherichia coli VNIIgenetika M1
Escherichia coli VNIIgenetika 472T23
Escherichia coli BKIIM B-3996
Escherichia coli kat 13
Escherichia coli KCCM-10132.

Geeignete L-Threonin produzierende Stämme der Gattung Serratia, insbesondere der Art Serratia marcescens sind beispielsweise

Serratia marcescens HNr21
Serratia marcescens TLr156
Serratia marcescens T2000.

L-Threonin produzierende Stämme aus der Familie der Enterobacteriaceae besitzen bevorzugt, unter anderen, ein oder mehrere der genetischen bzw. phänotypischen Merkmale ausgewählt aus der Gruppe: Resistenz gegen α-Amino-β-hydroxyvaleriansäure, Resistenz gegen Thialysin, Resistenz gegen Ethionin, Resistenz gegen α-Methylserin, Resistenz gegen Diaminobernsteinsäure, Resistenz gegen α-Aminobuttersäure, Resistenz gegen Borrelidin, Resistenz gegen Rifampicin, Resistenz gegen Valin-Analoga wie beispielsweise Valinhydroxamat, Resistenz gegen Purinanaloga wie beispielsweise 6-Dimethylaminopurin, Bedürftigkeit für L-Methionin, gegebenenfalls partielle und kompensierbare Bedürftigkeit für L-Isoleucin, Bedürftigkeit für meso-Diaminopimelinsäure, Auxotrophie bezüglich Threoninhaltiger Dipeptide, Resistenz gegen L-Threonin, Resistenz gegen L-Homoserin, Resistenz gegen L-Lysin, Resistenz gegen L-Methionin, Resistenz gegen L-Glutaminsäure, Resistenz gegen L-Aspartat, Resistenz gegen L-Leucin, Resistenz gegen L-Phenylalanin, Resistenz gegen L-Serin, Resistenz gegen L-Cystein, Resistenz gegen L-Valin, Empfindlichkeit gegenüber Fluoropyruvat, defekte Threonin-Dehydrogenase, gegebenenfalls Fähigkeit zur Saccharose-Verwertung, Verstärkung des Threonin-Operons, Verstärkung der Homoserin-Dehydrogenase I-Aspartatkinase I, bevorzugt der feed back resistenten Form, Verstärkung der Homoserinkinase, Verstärkung der Threoninsynthase, Verstärkung der Aspartatkinase, gegebenenfalls der feed back resistenten Form, Verstärkung der Aspartatsemialdehyd-Dehydrogenase, Verstärkung der Phosphoenolpyruvat-Carboxylase, gegebenenfalls der feed back resistenten Form, Verstärkung der Phosphoenolpyruvat-Synthase, Verstärkung der Transhydrogenase, Verstärkung des RhtB-Genproduktes, Verstärkung des RhtC-Genproduktes, Verstärkung des YfiK-Genproduktes, Verstärkung einer Pyruvat-Carboxylase und Abschwächung der Essigsäurebildung.
Es wurde gefunden, daß Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae nach Überexpression des Gens phoE in verbesserter Weise L-Threonin produzieren.
Die Nukleotidsequenzen der Gene von Escherichia coli gehören zum Stand der Technik und können ebenfalls der von Blattner et al. (Science 277, 1453–1462 (1997)) publizierten Genomsequenz von Escherichia coli entnommen werden.
Unter anderem sind die folgenden Informationen aus dem Stand der Technik über das phoE-Gen bekannt:

Bezeichnung: Porenprotein E der äußeren Zellmembran
Referenz: Overbeeke et al.; Journal of Molecular Biology 163(4), 513–532 (1983); Cowan et al.; Nature 358 (6389): 727–733 (1992)
Accession No.: AE000132
Alternativer Genname: ompE

Die Nukleinsäuresequenzen können den Datenbanken des National Center for Biotechnology Information (NCBI) der National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA), der Nukleotidsequenz-Datenbank der European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Deutschland bzw. Cambridge, UK) oder der DNA Datenbank von Japan (DDBJ, Mishima, Japan) entnommen werden.
Die in den angegebenen Textstellen beschriebenen Gene können erfindungsgemäß verwendet werden. Weiterhin können Allele der Gene verwendet werden, die sich aus der Degeneriertheit des genetischen Codes oder durch funktionsneutrale Sinnmutationen ("sense mutations") ergeben.
Zur Erzielung einer Verstärkung können beispielsweise die Expression der Gene oder die katalytischen Eigenschaften der Proteine erhöht werden. Gegebenenfalls können beide Maßnahmen kombiniert werden.
Zur Erzielung einer Überexpression kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im Verlaufe der fermentativen L-Threonin-Produktion zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.
Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Chang und Cohen (Journal of Bacteriology 134: 1141–1156 (1978)), bei Hartley und Gregori (Gene 13: 347–353 (1981)), bei Amann und Brosius (Gene 40: 183–190 (1985)), bei de Broer et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 80: 21–25 (1983)), bei LaVallie et al. (BIO/TECHNOLOGY 11, 187–193 (1993)), in PCT/ US 97/13359 , bei Llosa et al. (Plasmid 26: 222–224 (1991)), bei Quandt und Klipp (Gene 80: 161–169 (1989)), bei Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 171: 4617–4622 (1989)), bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191–195 (1998)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.
In Enterobacteriaceae replizierbare Plasmidvektoren wie z. B. von pACYC184 abgeleitete Kloniervektoren (Bartolomé et al.; Gene 102, 75–78 (1991)), pTrc99A (Amann et al.; Gene 69: 301–315 (1988)) oder pSC101-Derivate (Vocke und Bastia, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80 (21): 6557–6561 (1983)) können verwendet werden. In einem erfindungsgemäßen Verfahren kann man einen mit einem Plasmidvektor transformierten Stamm einsetzen, wobei der Plasmidvektor mindestens das Gen phoE oder die dafür codierende Nucleotidsequenz trägt.
Es ist ebenfalls möglich, Mutationen, die die Expression des jeweiligen Gens betreffen, durch Sequenzaustausch (Hamilton et al., (Journal of Bacteriology 171, 4617–4622 (1989)), Konjugation oder Transduktion in verschiedene Stämme zu überführen.
Weiterhin kann es für die Produktion von L-Threonin mit Stämmen der Familie Enterobacteriaceae vorteilhaft sein, zusätzlich zur Überexpression des Gens phoE ein oder mehrere Enzyme des bekannten Threonin-Biosyntheseweges oder Enzyme des anaplerotischen Stoffwechsels oder Enzyme für die Produktion von reduziertem Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat oder Enzyme der Glykolyse oder PTS-Enzyme oder Enzyme des Schwefelstoffwechsels zu verstärken.
So können beispielsweise gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe

– das für die Aspartatkinase, die Homoserin-Dehydrogenase, die Homoserinkinase und die Threoninsynthase kodierende thrABC-Operon ( US-A-4,278,765 ),
– das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende pyc-Gen aus Corynebacterium glutamicum ( WO 99/18228 ), das für die Phosphoenolpyruvat-Synthase kodierende pps-Gen (Molecular and General Genetics 231(2): 332–336 (1992)),
– das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxylase kodierende ppc-Gen (Gene 31: 279–283 (1984)),
– die für die Transhydrogenase kodierenden Gene pntA und pntB (European Journal of Biochemistry 158: 647–653 (1986)),
– das Homoserinresistenz vermittelnde Gen rhtB aus Escherichia coli ( EP-A-0 994 190 ),
– das für die Malat: Chinon-Oxidoreduktase kodierende mqo-Gen ( WO 02/06459 ),
– das Threoninresistenz vermittelnde Gen rhtC aus Escherichia coli ( EP-A-1 013 765 ),
– das für das Threoninexportprotein kodierende thrE-Gen von Corynebacterium glutamicum ( WO 01/92545 ),
– das für die Glutamat-Dehydrogenase kodierende gdhA-Gen (Nucleic Acids Research 11: 5257–5266 (1983); Gene 23: 199–209 (1983)),
– das für das DNA-Bindeprotein HLP-II kodierende hns-Gen (Molecular and General Genetics 212: 199–202 (1988)),
– das für die Phosphoglukomutase kodierende pgm-Gen (Journal of Bacteriology 176: 5847–5851 (1994)),
– das für die Fructose-Biphosphataldolase kodierende fba-Gen (Biochemical Journal 257: 529–534 (1989)),
– das für die Phosphohistidinprotein-hexosephosphotransferase des Phosphotransferasesystem PTS des ptsHIcrr-Operons kodierende ptsH-Gen (Journal of Biological Chemistry 262: 16 241–16 253 (1987)),
– das für Enzym I des Phosphotransferase-Systems PTS kodierende ptsI-Gen des ptsHIcrr-Operons (Journal of Biological Chemistry 262: 16 241–16 253 (1987)),
– das für die glukosespezifische IIA-Komponente des Phosphotransferasesystems PTS kodierende crr-Gen des ptsHIcrr-Operons (Journal of Biological Chemistry 262: 16 241–16 253 (1987)),
– das für die glukosespezifische IIBC Komponente kodierende ptsG-Gen (Journal of Biological Chemistry 261: 16 398–16 403 (1986)),
– das für den Regulator des Leucin-Regulons kodierende lrp-Gen (Journal of Biological Chemistry 266: 10 768–10 774 (1991)),
– das für das Chaperon 10 kD kodierende mopB-Gen (Journal of Biological Chemistry 261: 12 414–12 419 (1986)), das auch unter der Bezeichnung groES bekannt ist,
– das für die kleine Untereinheit der Alkylhydroperoxidreduktase kodierende ahpC-Gen des ahpCF-Operons (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92: 7617–7621 (1995)),
– das für die große Untereinheit der Alkylhydroperoxidreduktase kodierende ahpF-Gen des ahpCF-Operons (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92: 7617–7621 (1995)),
– das für die Cystein-Synthase A kodierende cysK-Gen (Journal of Bacteriology 170: 3150–3157 (1988)),
– das für den Regulator des cys-Regulons kodierende cysB-Gen (Journal of Biological Chemistry 262: 5999–6005 (1987)),
– das für das Flavoprotein der NADPH-Sulfitreduktase kodierende cysJ-Gen des cysJIH-Operons (Journal of Biological Chemistry 264: 15 796–15 808 (1989), Journal of Biological Chemistry 264: 15 726–15 737 (1989)),
– das für das Hämoprotein der NADPH-Sulfitreduktase kodierende cysI-Gen des cysJIH-Operons (Journal of Biological Chemistry 264: 15 796–15 808 (1989), Journal of Biological Chemistry 264: 15 726–15 737 (1989)),
– das für die Adenylylsulfat-Reduktase kodierende cysH-Gen des cysJIH-Operons (Journal of Biological Chemistry 264: 15 796–15 808 (1989), Journal of Biological Chemistry 264: 15 726–15 737 (1989)),
– das für die fructosestimulierte Pyruvatkinase I kodierende pykF-Gen (Journal of Bacteriology 177 (19): 5719–5722 (1995)),
– das für die 6-Phosphofructokinase II kodierende pfkB-Gen (Gene 28 (3): 337–342 (1984)),
– das für die Transaldolase B kodierende talB-Gen (Journal of Bacteriology 177 (20): 5930–5936 (1995)),
– das für die Superoxid-Dismutase kodierende sodA-Gen (Journal of Bacteriology 155 (3): 1078–1087 (1983)),

Weiterhin kann es für die Produktion von L-Threonin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Überexpression des Gens phoE eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe

– das für die Threonin-Dehydrogenase kodierende tdh-Gen (Journal of Bacteriology 169, 4716–4721 (1987)),
– das für die Malat-Dehydrogenase (E. C. 1.1.1.37) kodierende mdh-Gen (Archives in Microbiology 149, 36–42 (1987)),
– das Genprodukt des offenen Leserahmens (orf) yjfA (Accession Number AAC77180 des National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA)), das Genprodukt des offenen Leserahmens (orf) ytfP (Accession Number AAC77179 des National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA)),
– das für das Enzym Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende pckA-Gen (Journal of Bacteriology 172, 7151–7156 (1990)),
– das für die Pyruvat-Oxidase kodierende poxB-Gen (Nucleic Acids Research 14(13), 5449–5460 (1986)),
– das für das Enzym Isocitrat-Lyase kodierende aceA-Gen (Journal of Bacteriology 170, 4528–4536 (1988)),
– das für den DgsA-Regulator des Phosphotransferase-Systems kodierende dgsA-Gen (Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 59, 256–251 (1995)), das auch unter der Bezeichnung mlc-Gen bekannt ist,
– das für den Fructose-Repressor kodierende fruR-Gen (Molecular and General Genetics 226, 332–336 (1991)), das auch unter der Bezeichnung cra-Gen bekannt ist und
– das für den sigma³⁸-Faktor kodierende rpoS-Gen ( WO 01/05939 ), das auch unter der Bezeichnung katF-Gen bekannt ist,

Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Enzym (Protein) oder Gen inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
Durch die Maßnahmen der Abschwächung wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen auf 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration des Wildtyp-Proteins beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus herabgesenkt.
Weiterhin kann es für die Produktion von L-Threonin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Überexpression des Gens phoE unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).
Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können im batch-Verfahren (Satzkultivierung), im fed batch (Zulaufverfahren) oder im repeated fed batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozeßtechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.
Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und gegebenenfalls Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Stickstoffquelle können organische Stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten, wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur können basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt werden. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 25°C bis 45°C und vorzugsweise bei 30°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum an L-Threonin gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Die Analyse von L-Aminosäuren kann durch Anionenaustauschchromatographie mit anschließender Ninhydrin-Derivatisierung erfolgen, so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry 30, 1190–1206 (1958)) beschrieben, oder sie kann durch reversed Phase HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51: 1167–1174 (1979)) beschrieben.
Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur fermentativen Herstellung von L-Threonin.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Das verwendete Minimal-(M9) bzw. Vollmedium (LB) für Escherichia coli ist von J. H. Miller (A Short Course in Bacterial Genetics, (1992), Cold Spring Harbor Laboratory Press) beschrieben. Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli sowie alle Techniken in Verbindung mit Restriktion, Ligation sowie Behandlung mit Klenow und alkalischer Phosphatase werden nach dem Verfahren von Sambrook et al. (Molecular Cloning – A Laboratory Manual. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press) durchgeführt. Die Transformation von Escherichia coli wird, wenn nicht anders angegeben, nach dem Verfahren von Chung et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (1989) 86: 2172–2175) durchgeführt.
Die Inkubationstemperatur für die Herstellung von Stämmen und Transformanten liegt bei 37°C.
Beispiel 1
Konstruktion des Expressionsplasmids pTrc99AphoE Das phoE-Gen aus E. coli K12 wird unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) sowie synthetischer Oligonukleotide amplifiziert. Ausgehend von der Nukleotidsequenz des phoE-Gens in E. coli K12 Mg1655 (Accession Number AE000132, Blattner et al. (Science 277: 1453–1462 (1997)) werden PCR-Primer synthetisiert (MWG Biotech, Ebersberg, Deutschland). Die Sequenzen der Primer sind dabei so modifiziert, daß Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme entstehen. Die Erkennungssequenz für XbaI wird für den Primer phoE1 und die Erkennungssequenz für HindIII für den Primer phoE2 gewählt, wobei diese Stellen zur Kennzeichnung in den unten dargestellten Nukleotidsequenzen jeweils unterstrichen sind:
phoE1:
5'-CCGCTGAATATTCTAGAGTTAATTAAAATCAGG-3' (SEQ ID Nr. 1)
phoE2:
5'-CCGGAAGCTTCACATCCGGCAATATTC-3' (SEQ ID Nr. 2)
Die für die PCR eingesetzte chromosomale DNA von E. coli K12 MG1655 wird nach Herstellerangaben mit "Qiagen Genomic-tips 100/G" (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Ein ungefähr 1100 Bp großes DNA-Fragment lässt sich mit den spezifischen Primern unter Standard-PCR-Bedingungen (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) mit Pfu-DNA-Polymerase (Promega Corporation, Madison, USA) amplifizieren. Das PCR-Produkt wird mit dem Vektor pCR- Blunt II-TOPO (Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, Invitrogen, Groningen, Niederlande) nach den Anweisungen des Herstellers ligiert und in den Stamm E. coli TOP10 transformiert. Die Selektion plasmidhaltiger Zellen erfolgt auf LB-Agar, der mit 50 μg/ml Kanamycin versetzt ist. Nach Plasmid-DNA-Isolierung wird der Vektor mit den Restriktionsenzymen HindIII und XbaI geschnitten, und nach Trennung in einem 0,8%-igen Agarosegel wird das phoE-Fragment mit Hilfe des QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert.
Der Vektor pTrc99A (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) wird mit den Enzymen HindIII und XbaI geschnitten und anschließend mit dem isolierten phoE-Fragment ligiert. Der E. coli-Stamm XL1-Blue MRF' (Stratagene, La Jolla, USA) wird mit dem Ligationsansatz transformiert, und plasmidhaltige Zellen werden auf LB-Agar, der mit 50 μg/ml Ampicillin versetzt ist, selektioniert. Die erfolgreiche Klonierung kann nach Plasmid-DNA-Isolierung durch Kontrollspaltung mit den Enzymen SspI und MluI nachgewiesen werden. Das Plasmid erhält die Bezeichnung pTrc99AphoE (1).
Beispiel 2
Herstellung von L-Threonin mit dem Stamm MG442/pTrc99AphoE
Der L-Threonin produzierende E. coli-Stamm MG442 ist in der Patentschrift US-A-4,278,765 beschrieben und bei der Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM, Moskau, Russland) als CMIM B-1628 hinterlegt.
Der Stamm MG442 wird mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Expressionsplasmid pTrc99AphoE sowie mit dem Vektor pTrc99A transformiert, und plasmidhaltige Zellen werden auf LB-Agar mit 50 μg/ml Ampicillin selektioniert. Auf diese Weise erhält man die Stämme MG442/pTrc99AphoE und MG442/pTrc99A. Ausgewählte Einzelkolonien werden anschließend auf Minimalmedium mit der folgenden Zusammensetzung weiter vermehrt: 3,5 g/l Na₂HPO₄·2H₂O, 1,5 g/l KH₂PO₄, 1 g/l NH₄Cl, 0,1 g/l MgSO₄·7H₂O, 2 g/l Glucose, 20 g/l Agar, 50 mg/l Ampicillin. Die Bildung von L-Threonin wird in Batch-Kulturen von 10 ml, die in 100-ml-Erlenmeyerkolben angesetzt werden, überprüft. Hierzu werden jeweils 10 ml Vorkulturmedium in der folgenden Zusammensetzung beimpft: 2 g/l Hefeextrakt, 10 g/l (NH₄)₂SO₄, 1 g/l KH₂PO₄, 0,5 g/l MgSO₄·7H₂O, 15 g/l CaCO₃, 20 g/l Glucose, 50 mg/l Ampicillin; der Ansatz wird dann 16 Stunden bei 37°C und 180 UpM auf einem ESR-Inkubator der Firma Kühner AG (Birsfelden, Schweiz) inkubiert.
Je 250 μl dieser Vorkulturen werden dann in 10 ml Produktionsmedium (25 g/l (NH₄)₂SO₄, 2 g/l KH₂PO₄, 1 g/l MgSO₄·7H₂O, 0,03 g/l FeSO₄·7H₂O, 0,018 g/l MnSO₄·1H₂O, 30 g/l CaCO₃, 20 g/l Glucose, 50 mg/l Ampicillin) überimpft, und der Ansatz wird 48 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Bildung von L-Threonin durch den Ausgangsstamm MG442 wird in gleicher Weise überprüft, wobei jedoch keine Zugabe von Ampicillin zum Medium erfolgt. Nach der Inkubation wird die optische Dichte (CD) der Kultursuspension mit einem LP2W-Photometer der Firma Dr. Lange (Düsseldorf, Deutschland) bei einer Messwellenlänge von 660 nm bestimmt.
Anschließend wird die Konzentration an gebildetem L-Threonin im steril filtrierten Kulturüberstand mit einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) mittels Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenreaktion mit Ninhydrinnachweis bestimmt.
In Tabelle 1 ist das Ergebnis des Versuchs dargestellt. Tabelle 1

Stamm OD (660 nm) L-Threonin (g/l)

MG442 5,6 1,4

MG442/pTrc99A 3,8 1,3

MG442/pTrc99AphoE 3,3 2,4
Kurze Beschreibung der Figur:
1: Karte des das phoE-Gen enthaltenden Plasmids pTrc99AphoE
Längenangaben sind als ungefähre Werte aufzufassen. Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben die folgende Bedeutung:

Amp:: Ampicillinresistenz-Gen
lacI:: Gen für das Repressorprotein des trc-Promotors
Ptrc:: trc-Promotorbereich, IPTG-induzierbar
phoE:: Kodierender Bereich des phoE-Gens
5S:: 5S-rRNA-Bereich
rrnBT:: rRNA-Terminatorbereich

Die Abkürzungen für die Restriktionsenzyme haben die folgende Bedeutung:

HindIII:: Restriktionsendonuklease aus Haemophilus influenzae
MluI:: Restriktionsendonuklease aus Micrococcus luteus IFO 12992
SspI:: Restriktionsendonuklease aus Sphaerotilus species ATCC 13925
XbaI:: Restriktionsendonuklease aus Xanthomonas campestris

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Herstellung von L-Threonin, bei dem man folgende Schritte durchführt: a) Fermentation von L-Threonin produzierenden modifizierten Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, b) Anreicherung von L-Threonin im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen und c) Isolierung des L-Threonins, wobei gegebenenfalls Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder die Biomasse in ihrer Gesamtheit oder Anteilen (> 0 bis 100%) davon im Produkt verbleiben, wobei der modifizierte Mikroorganismus gegenüber dem unmodifizierten Mikroorganismus ein überexprimiertes phoE-Gen oder überexprimierte Nukleotidsequenzen umfaßt, die für das Genprodukt des genannten Gens, ein Porenprotein E der äußeren Zellmembran, kodieren.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man zur Herstellung von L-Threonin Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae fermentiert, in denen man zusätzlich gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe: 2.1 das für die Aspartatkinase, die Homoserin-Dehydrogenase, die Homoserinkinase und die Threoninsynthase kodierende thrABC-Operon, 2.2 das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende pyc-Gen, 2.3 das für die Phosphoenolpyruvat-Synthase kodierende pps-Gen, 2.4 das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxylase kodierende ppc-Gen, 2.5 die für die Transhydrogenase kodierenden Gene pntA und pntB, 2.6 das für ein Homoserinresistenz vermittelndes Protein kodierende Gen rhtB von Escherichia coli, 2.7 das für die Malat: Chinon Oxidoreduktase kodierende mqo-Gen, 2.8 das für ein Threoninresistenz vermittelndes Protein kodierende Gen rhtC von Escherichia coli, 2.9 das für das Threoninexportprotein kodierende thrE-Gen, 2.10 das für die Glutamat-Dehydrogenase kodierende gdhA-Gen, 2.11 das für das DNA-Bindeprotein HLP-II kodierende hns-Gen, 2.12 das für die Phosphoglukoisomerase kodierende pgm-Gen, 2.13 das für die Fructose-Bisphosphataldolase kodierende fba-Gen, 2.14 das für die Phosphohistidinproteinhexosephosphotransferase kodierende ptsH-Gen, 2.15 das für Enzym I des Phosphotransferase-Systems kodierende ptsI-Gen, 2.16 das für die glukosespezifische IIA-Komponente kodierende crr-Gen, 2.17 das für die glukosespezifische IIBC Komponente kodierende ptsG-Gen, 2.18 das für den Regulator des Leucin-Regulons kodierende lrp-Gen, 2.19 das für das Chaperon 10 kD kodierende mopB-Gen, 2.20 das für die kleine Untereinheit der Alkylhydroperoxidreduktase kodierende ahpC-Gen, 2.21 das für die große Untereinheit der Alkylhydroperoxidreduktase kodierende ahpF-Gen, 2.22 das für die Cystein-Synthase A kodierende cysK-Gen, 2.23 das für den Regulator des cys-Regulons kodierende cysB-Gen, 2.24 das für das Flavoprotein der NADPH-Sulfitreduktase kodierende cysJ-Gen, 2.25 das für das Hämoprotein der NADPH-Sulfitreduktase kodierende cysI-Gen, 2.26 das für die Adenylylsulfat-Reduktase kodierende cysH-Gen, 2.27 das für die fructosestimulierte Pyruvatkinase I kodierende pykF-Gen, 2.28 das für die 6-Phosphofructokinase II kodierende pfkB-Gen, 2.29 das für die Transaldolase B kodierende talB-Gen und 2.30 das für die Superoxid-Dismutase kodierende sodA-Gen, überexprimiert.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem man zur Herstellung von L-Threonin Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae fermentiert, in denen man zusätzlich gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe: 3.1 das für die Threonin-Dehydrogenase kodierende tdh-Gen, 3.2 das für die Malat-Dehydrogenase kodierende mdh-Gen, 3.3 falls es sich bei dem genannten Mikroorganismus um Escherichia coli handelt, das Genprodukt des offenen Leserahmens (orf) yjfA von E. coli, 3.4 falls es sich bei den genannten Mikroorganismus um Escherichia coli handelt, das Genprodukt des offenen Leserahmens (orf) ytfP von E. coli, 3.5 das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende pckA-Gen, 3.6 das für die Pyruvat-Oxidase kodierende poxB-Gen, 3.7 das für die Isocitrat-Lyase kodierende aceA-Gen, 3.8 das für den DgsA-Regulator des Phosphotransferase-Systems kodierende dgsA-Gen, 3.9 das für den Fructose-Repressor kodierende fruR-Gen, 3.10 das für den Faktor Sigma³⁸ kodierende rpoS-Gen, ausschaltet.
L-Threonin produzierende Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen zumindest: a) das für die Aspartatkinase, die Homoserin-Dehydrogenase, die Homoserinkinase und die Threoninsynthase kodierende thrABC-Operon, und b) das phoE-Gen oder für das phoE-Genprodukt kodierende Nukleotidsequenzen überexprimiert sind.
Mikroorganismen nach Anspruch 4, bei denen die Mikroorganismen aus der Gattung Escherichia stammen.
Mikroorganismen nach Anspruch 5, bei denen die Mikroorganismen aus der Art E. coli stammen.