DE60213414T2 - Verfahren zur herstellung von l-threonin unter verwendung von stämmen der familie enterobacteriaceae - Google Patents

Verfahren zur herstellung von l-threonin unter verwendung von stämmen der familie enterobacteriaceae Download PDF

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung betrifft ein Verfahren für die Herstellung von L-Threonin unter Anwendung von Stämmen der Familie der Enterobacteriaceae, wobei mindestens das cysB-Gen und wahlweise eines oder mehrere der Gene des Cysteinbiosynthesewegs (cysteinbiosynthtischen wegs), die aus der Gruppe ausgewählt sind bestehend aus cysG, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysU, cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH, cysE und sbp überexprimiert ist bzw. sind.
  • STAND DER TECHNIK
  • L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, werden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und insbesondere bei der Tierernährung verwendet.
  • Es ist bekannt, dass L-Aminosäuren durch Fermentieren aus Stämmen von Enterobacteriaceae, insbesondere Escheridhia coli (E. coli) und Serratia marcescens hergestellt werden. Aufgrund ihrer großen Bedeutung werden ständig Arbeiten zum Verbessern der Herstellungsverfahren durchgeführt. Verbesserungen des Verfahrens können Fermentationsmaßnahmen, wie beispielsweise Rühren und Einspeisen von Sauerstoff, oder die Zusammensetzung des Nährstoffmediums, wie beispielsweise die Zuckerkonzentration während der Fermentation oder das Aufarbeiten zur Produktform beispielsweise durch Ionenaustauschchromatografie oder die intrinsischen Ausstoßeigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.
  • Verfahren zur Mutagenese, Selektion und Mutantenselektion werden zum Verbessern der Ausstoßeigenschaften dieser Mikroorganismen angewendet. Stämme, die gegen Antimetaboliten widerstandsfähig sind, wie beispielsweise das Threoninanalogon α-Amino-β- hydroxyvaleriansäure (AHV), oder für Metaboliten auxotroph sind, die eine Bedeutung bezüglich der Regulation aufweisen und L-Aminosäuren, wie beispielsweise L-Threonin, bilden, werden auf diese Weise erhalten.
  • Verfahren der rekombinanten DNA-Technik sind ebenfalls schon seit einigen Jahren zum Verbessern des Stamms der Stämme der Familie der Enterobacteriaceae, die L-Aminosäuren bilden, durch Amplifizieren einzelner Aminosäure-Biosynthesegene und Untersuchen der Wirkung auf die Herstellung angewendet worden.
  • AUFGABE DER ERFINDUNG
  • Der Gegenstand der Erfindung besteht darin, neue Maßnahmen für die verbesserte fermentative Herstellung von L-Threonin bereitzustellen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung bietet ein Verfahren für die fermentative Herstellung von L-Threonin unter anwendung von Mikroorganismen der Familie der Enterobacteriaceae, die insbesondere schon L-Aminosöuren bilden und wobei mindestens das cysB-Gen und wahlweise eine oder mehrere der Nukleoditdsequenz)en), die für die Gene des Cysteinbiosynthesewegs (cysteinbiosynthtischen Wegs) kodiert bzw. kodieren, die aus der Gruppe ausgewählt sind bestehend aus cysG, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysU, cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH, cysE und sbp überexprimiert ist bzw. sind.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren für die Herstellung von L-Threonin umfasst die folgenden Schritte:
    • a) Fermentieren der Mikroorganismen der Familie der Enterobacteriaceae, die L-Threonin erzeugen, und wobei das cysB-Gen und wahlweise ein oder mehrere Gene des Cysteinbiosynthesewegs, die aus der Gruppe ausgewählt sind bestehend aus cysG, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysD, cysP, cysD, cysN, cysC, cysD, cysI, cysN, cysE und sbp oder Nukleotidsequenzen, die für das Genprodukt der Gene kodieren, überexprimiert ist bzw. sind.
    • b) Konzentrieren von L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen und
    • c) Isolieren der L-Aminosäure, der Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder der Biomasse insgesamt oder von Teilen (> 0 bis 100%) derselben, die wahlweise im Produkt verbleiben.
  • GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Es wird die Verwendung endogener Gene bevorzugt. Unter "endogenen Genen" oder "endogenen Nukleotidsequenzen" sollten Gene oder Nukleotidsequenzen verstanden werden, die in der Population eienr Spezies vorliegen.
  • Wo L-Aminosäuren oder Aminosäuren im Folgenden erwähnt werden, umfasst dies ihre Salze, L-Threonin und L-lysine.
  • Der Begriff „Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität oder Konzentration eines oder mehrerer Enzyme oder Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert sind, beispielsweise durch Erhöhen der Anzahl von Kopien des Gens oder der Gene unter Anwendung eines potenten Promotors oder eines Gens oder Allels, das für ein entsprechendes Enzym oder Protein kodiert, das eine hohe Aktivität aufweist, und wahlweise Kombinieren dieser Maßnahmen.
  • Durch Verstärkungsmaßnahmen, insbesondere Überexpression, wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im Allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500% bis zu maximal 1000% oder 2000%, auf diejenige des Proteins vom Wildtyp oder die Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangsmikroorganismus bezogen, erhöht.
  • Das Verfahren umfasst das Durchführen der folgenden Schritte:
    • a) Fermentieren der Mikroorganismen der Familie der Enterobacteriaceae, wobei das cysB-Gen und wahlweise ein oder mehrere Gene des Cysteinbiosynthesewegs, die aus der Gruppe ausgewählt sind bestehend aus cysG, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysU, cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH, cysE und sbp überexprimiert ist bzw. sind,
    • b) Konzentrieren des L-Threonins im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen der Famulie der Enterobacteriaceae und
    • c) Isolieren der L-Aminosäure, der Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder der Biomasse insgesamt oder von Teilen (> 0 bis 100%) derselben, die wahlweise im Produkt verbleiben.
  • Die Mikroorganismen, die die vorliegende Erfindung bereitstellt, können L-Threonin aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melassen, wahlweise Stärke, wahlweise Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol bilden. Sie sind für die Familie der Enterobacteriaceae ausgewählt aus der Gattung Escherichia, Erwinia, Providnecia und Serratia repräsentativ. Die Gattungen Escherichia und Serratia serden bevorzugt. Von der Gattung Escherichia sind die Spezuies Escherichia coli und von der Gattung Serratia die Spezies Serratia marcenscens insbesondere zu erwähnen.
  • Geeignete Stämme der Gattung Escherichia, insbesondere der Spezies Escherichia coli, die L-Threonin bilden, sind beispielsweise
    Escherichia coli TF427
    Escherichia coli H4578
    Escherichia coli KY10935
    Escherichia coli VNIIgenetika MG442
    Escherichia coli VNIIgenetika M1
    Escherichia coli VNIIgenetika 472T23
    Escherichia coli BK11M B-3996
    Escherichia coli kat 13
    Escherichia coli KCCm-10132
  • Geeignete L-Threonin bildende Stämme der Gattung Serratia, insbesondere der Spezies Serratia marcescens, sind beispielsweise
    Serratia marcescens HNr21
    Serratia marcescens TLr156
    Serratia marcescens T2000
  • Stämme der Familie der Enterobacteriaceae, die L-Threonin bilden, weisen unter anderem ein oder mehrere genetische oder phänotypische Merkmale auf ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Widerstandsfähigkeit gegen α-Amino-β-hydroxyvaleriansäure, Widerstandsfähigkeit gegen Thialysin, Widerstandsfähigkeit gegen Ethionin, Widerstandsfähigkeit gegen α-Methylserin, Widerstandsfähigkeit gegen Diaminobernsteinsäure, Widerstandsfähigkeit gegen α-Aminobuttersäure, Widerstandsfähigkeit gegen Borrelidin, Widerstandsfähigkeit gegen Rifampicin, Widerstandsfähigkeit gegen Valinanaloge wie beispielsweise Valinhydroxamat, Widerstandsfähigkeit gegen Purinanaloge wie beispielsweise 6-Dimethylaminopurin, einer Notwendigkeit für L-Methionin, wahlweise einer teilweisen und kompensierbaren Notwendigkeit für L-Isoleucin, einer Notwendigkeit für Mesodiaminopimelinsäure, Auxotrophie bezüglich Threonin enthaltender Dipeptide, Widerstandsfähgikeit gegen L-Threonin, Widerstandsfähigkeit gegen L-Homoserin, Widerstandsfähigkeit gegen L-Lysin, Widerstandsfähigkeit gegen L-Methionin, Widerstandsfähigkeit gegen L-Glutaminsäure, Widerstandsfähigkeit gegen L-Aspartat, Widerstandsfähigkeit gegen L-Leucin, Widerstandsfähigkeit gegen L-Phenylalanin, Widerstandsfähigkeit gegen L-Serin, Widerstandsfähigkeit gegen L-Cystein, Widerstandsfähigkeit gegen L-Valin, Empfindlichkeit gegen Fluorpyruvat, defektiver Threonindehydrogenase, wahlweise einer Fähigkeit zur Saccharoseverwertung, Verbesserung des Threoninoperons, Verbesserung der Homoserindehydrogenase-I-aspartatkinase-I, bevorzugt der Feedbackresistenzform, Verbesserung der Homoserinkinase, Verbesserung der Threoninsynthase, Verbesserung der Aspartatkinase, wahlweise der Feedback-resistenten Form, Verbesserung der Aspartatsemialdehyddehydrogenase, Verbesserung der Phosphoenolpyruvatcarboxylase, wahlweise der Feedbackresistenten Form, Verbesserung der Phosphoenolpyruvatsynthase, Verbesserung der Transhydrogenase, Verbesserung des RhtB-Genprodukts, Verbesserung des RhtC-Genprodukts, Verbesserung des YfiK-Genprodukts, Verbesserung einer Pyruvatcarboxylase und Reduzierung der Essigsäurebildung.
  • Es hat sich gezeigt, dass Mikroorganismen der Familie der Enterobacteriaceae L-Threonin auf eine verbesserte Art nach der Überexpression des CysB-Gens und wahlweise mindestens eines oder mehrerer der Gene des Cysteinbiosynthesewegs, die aus der Gruppe ausgewählt sind bestehend aus cysG, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysU, cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH, cysE und sbp, bilden.
  • Die Nukleotidsequenzen der Gene von Escherichia coli gehören zum Stand der Technik (man vergleiche folgende Textliteraturstellen) und sind auch in der Genomsequenz von Escherichia coli zu finden, die von Blattner et al. veröffentlicht worden ist (Science 277: 1453–1462 (1997)). Die Gene und Aktivitäten des Cysteinbiosynthesewegs (cysteinbiosynthetischen Wegs) sind auch in Form einer Zusammenfassung von Kredich (In: Neidhardt (Verfasser), Escherichia coli and Salmonella (Escherichia coli und Salmonella), American Society for Microbiology, Washington, D.C., USA: 514–527 (1996)) beschrieben. cysG-Gen:
    Figure 00070001
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    Figure 00100001
    Figure 00110001
  • Die Nukleinsäuresequenzen sind in den Datenbanken des National Center for Biotechnology Information (NCBI) der National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA), der Nukleotidsequenzdatenbank der European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Deutschland, oder Cambridge, Großbritannien) oder der DNA-Databank of Japan (DDBJ, Mishima, Japan) zu finden.
  • Die Gene, die in den erwähnten Textliteraturangaben beschrieben sind, können erfindungsgemäß verwendet werden. Allele der Gene, die aus der Degeneration der genetischen Kode herrühren oder „Sensemutationen" der neutralen Funktion zuzuschreiben sind, können des Weiteren verwendet werden.
  • Um beispielsweise eine Verstärkung zu erreichen, können die Expression der Gene oder die katalytischen Eigenschaften der Proteine erhöht werden. Die beiden Maßnahmen können wahlweise kombiniert werden.
  • Um eine Überexpression zu erreichen, kann die Anzahl von Kopien der entsprechenden Gene erhöht werden, oder der Promotor und die Regulationsregion oder die Ribosombindungsstelle stromaufwärts vom strukturellen Gen kann mutiert werden. Die Expressionskassetten, die stromaufwärts vom strukturellen Gen eingearbeitet werden, wirken auf die gleiche Weise. Mit induzierbaren Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im Laufe der fermentativen L-Threoninerzeugung zu erhöhen. Die Expression wird auch durch Maßnahmen zum Verlängern des Lebens der m-RNA verbessert. Des weiteren wird die Enzymaktivität ebenfalls durch Verhindern des Abbaus des Enzymproteins verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit einer veränderlichen Anzahl von Kopien vorliegen oder sie können in die Chromosomen integriert und amplifiziert werden. Als Alternative kann eine Überexpression der in Frage kommenden Gene des Weiteren durch Ändern der Zusammensetzung des Mediums und des Kultiviervorgangs erreicht werden.
  • Anweisungen in dieser Beziehung können vom Fachmann unter anderem bei Chang und Cohen (Journal of Bacteriology 134: 1141–1156 (1978)), bei Hartley und Gregori (Gene 13: 347–353 (1981)), bei Amann und Brosius (Gene 40: 183–190 (1985)), bei de Broer et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 80: 21–25 (1983)), bei LaVallie et al. (BIO/TECHNOLOGY 11: 187–193 (1993)), in der PCT/US97/13359, bei Llosa et al. (Plasmid 26: 222–224 (1991)), bei Quandt und Klipp (Gene 80: 161–169 (1989)), bei Hamilton (Journal of Bacteriology 171: 4617–4622 (1989)), bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191–195 (1998)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie gefunden werden.
  • Plasmidvektoren, die in Enterobacteriaceae der Replikation fähig sind, wie beispielsweise klonbildende Vektoren, die von pACYC184-(Bartolomé et al.; Gene 102: 75–78 (1991)), pTrc99A-(Amann et al.; (Gene 69: 301–315 (1988)) oder pSC101-Derivaten (Vocke und Bastia, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80 (21): 6557–6561 (1983)) deriviert sind, können verwendet werden. Ein Stamm, der mit einem Plasmidvektor transformiert worden ist, wobei der Plasmidvektor mindestens das cysB-Gen und wahlweise eines oder mehrere der Gene trägt, die aus der Gruppe ausgewählt sind bestehend aus cysG, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysU, cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH, cysE und sbp oder Nukleotidsequenzen, die für diese kodieren, können bei einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.
  • Es ist auch möglich, Mutationen, die sich auf die Expression des spezifischen Gens in verschiedene Stämme durch Sequenzaustausch (Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 171:4617–4622 (1989)), Konjugation oder Transduktion auswirken, zu übertragen.
  • Es kann des Weiteren für die Bildung von L-Threonin mit Stämmen der Familie der Enterobacteriaceae vorteilhaft sein, ein oder mehrere Enzyme des bekannten Threoninbiosynthesewegs oder Enzyme mit anaplerotischem Stoffwechsel oder Enzyme für die Bildung von reduzier tem Nicotinamidadenindinukleotidphosphat oder Glycolyseenzyme oder PTS-Enzyme zusätzlich zur Überexpression des cysB-Gens und wahlweise eines oder mehrerer der Gene des Cysteinbiosynthesewegs zu verstärken, die aus der Gruppe ausgewählt sind bestehend aus cysG, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysU, cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH, cysE und sbp.
  • So können beispielsweise gleichzeitig ein oder mehrere der Gene, die aus der Gruppe ausgewählt werden bestehend aus
    • • dem thrABC-Operon, das für Aspartatkinase, Homoserindehydrogenase, Homoserinkinase und Threoninsynthase kodiert (US-A-4,278,765),
    • • dem pyc-Gen, das für Pyruvatcarboxylase kodiert (WO 99/18228),
    • • dem pps-Gen, das für Phosphoenolpyruvatsynthase kodiert (Molecular and General Genetics 231: 332–336 (1992)),
    • • dem ppc-Gen, das für Phosphoenolpyruvatcarboxylase kodiert (Gene 31: 279–283 (1984)),
    • • den pnta- und pntB-Genen, die für Transhydrogenase kodieren (European Journal of Biochemistry 158: 647–653 (1986)),
    • • dem rhtB-Gen, das Homoserin Resistenz verleiht (EP-A-0 994 190),
    • • dem mqo-Gen, das für Malat:Chinonoxidoreduktase kodiert (WO 02/06459),
    • • dem rhtC-Gen, das Threonin Resistenz verleiht (EP-A-1 013 765),
    • • dem thrE-Gen von Corynebacterium glutamicum, das für den Threoninexport kodiert (WO 01/92545),
    • • dem gdhA-Gen, das für Glutamatdehydrogenase kodiert (Nucleic Acids Research 11: 5257–5266 (1983); Gene 23: 199–209 (1983)),
    • • dem hns-Gen, das für das DNA-Bindungsprotein HLP-II kodiert (Molecular and General Genetics 212: 199–202 (1988)),
    • • dem pgm-Gen, das für Phosphoglukomutase kodiert (Journal of Bacteriology 176: 5847–5851 (1994)),
    • • dem fba-Gen, das für Fructosebiphosphataldolase kodiert (Biochemical Journal 257: 525–534 (1989)),
    • • dem ptsH-Gen des ptsHICRR-Operons, das für die Phosphohistidinproteinhexosephosphotransferase des Phosphotransferasesystems PTS kodiert (Journal of Biological Chemistry 262: 16241–16253 (1987)),
    • • dem ptsI-Gen, das für das ptsHIccr-Operon kodiert, das für das Enzym I des Phosphotransferasesystems PTS kodiert (Journal of Biological Chemistry 262: 16241–16253 (1987)),
    • • dem crr-Gen des ptsHIccr-Operons, das für die glukosespezifische IIA-Komponente des Transferasesystems PTS kodiert (Journal of Biological Chemistry 262: 16241–16253 (1987)),
    • • dem ptsG-Gen, das für die glukosespezifische IIBC-Komponente kodiert (Journal of Biological Chemistry 261: 16398–16403 (1986)),
    • • dem lpr-Gen, das für den Regulator des Leucinregulons kodiert (Journal of Biological Chemistry 266: 10768–10774 (1991)),
    • • dem mopB-Gen, das für 10 Kd-Chaperon kodiert (Journal of Biological Chemistry 261: 12414–12419 (1986)) und auch unter der Bezeichnung groES bekannt ist,
    • • dem ahpC-Gen des ahpCF-Operons, das für die kleine Unterheinheit von Alkylhydroperoxidreduktase kodiert (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 92: 7617–7621 (1995)),
    • • dem ahpF-Gen des ahpCF-Operons, das für die große Untereinheit der Alkylhydroperoxidreduktase kodiert (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 92: 7617–7621 (1995))
    überexprimiert werden.
  • Es kann des Weiteren für die Herstellung von L-Threonin vorteilhaft sein, wenn, zusätzlich zur Überexpression des cysB-Gens und wahlweise eines oder mehrerer der Gene, die aus der Gruppe ausgewählt sind bestehend aus cysG, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysU, cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH, cysE und sbp, eines oder mehrere der Gene, die aus der Gruppe ausgewählt sind bestehend aus
    • • dem tdh-Gen, das für Threonindehydrogenase kodiert (Ravnikar und Somerville (Journal of Bacteriology 169: 4716–4721 (1987)),
    • • dem mdh-Gen, das für Malatdehydrogenase kodiert (E.C. 1.1.1.37) (Vogel et al. (Archives in Microbiology 149: 36–42 (1987)),
    • • dem Genprodukt des offenen Leserasters (orf) yjfA (Zugangsnummer AAC77180 des National Center für Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA)),
    • • dem Genprodukt des offenen Leserasters (orf) ytfP (Zugangsnummer AAC77179 des National Center für Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA))
    • • dem pckA-Gen, das für das Enzym Phosphoenolpyruvatcarboxykinase kodiert (Medina et al. (Journal of Bacteriology 172: 7151–7156 (1990)),
    • • dem poxB-Gen, das für Pyruvatoxidase kodiert (Grabau und Cronan (Nucleic Acids Research 14 (13), 5449–5460 (1986)),
    • • dem aceA-Gen, das für das Enzym Isocitratlyase kodiert (Matsuoko and McFadden (Journal of Bacteriology 170, 4528–4536 (1988)),
    • • dem dgsA-Gen, das für den DgsA-Regulator des Phosphotransferasesystems kodiert (Hosono et al. (Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 59: 256–251 (1995)) und auch unter der Bezeichnung des mlc-Gens bekannt ist,
    • • dem fruR-Gen, das für den Fruktoserepressor kodiert (Jahreis et al. (Molecular and General Genetics 226: 332–336 (1991)) und auch unter der Bezeichnung cra-Gen bekannt ist,
    • • dem rpoS-Gen, das für den Sigma38-Faktor kodiert (WO 01/05939) und auch unter der Bezeichnung katF-Gen bekannt ist,
    eliminiert wird.
  • Der Begriff „Milderung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Reduzierung oder Eliminierung der intrazellulären Aktivität oder Konzentration eines oder mehrerer Enzyme oder Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, beispielsweise unter Anwendung eines schwachen Promotors oder eines Gens oder Allels, der bzw. das für ein entsprechendes Enzym oder Protein mit einer geringen Aktivität kodiert oder das entsprechende Enzym oder Protein oder Gen inaktiviert und wahlweise Kombinieren dieser Maßnahmen.
  • Durch Milderungsmaßnahmen wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im Allgemeinen auf 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration des Proteins vom Wildtyp oder der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangsorganismus reduziert.
  • Es kann des Weiteren für die Herstellung von L-Threonin vorteilhaft sein, wenn zusätzlich zur Überexpression des cysB-Gens und eines oder mehrerer der Gene des Cysteinbiosynthesewegs, die aus der Gruppe ausgewählt werden bestehend aus cysG, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysU, cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH, cysE und sbp, unerwünschte Nebenreaktionen eliminiert werden (Nakayama: „Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms" (Züchten von Aminosäure bildenden Mikroorganismen), in: Overproduction of Microbial Products (Überproduktion von mikrobiellen Produkten), Kumphanzl, Sikyta, Vanek (Verfasser), Academic Press, London, Großbritannien, 1982).
  • Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können im Chargenverfahren (chargenweise Kultur), im Speisechargenverfahren (Speisungsverfahren) oder wiederholten Speisechargenverfahren (wiederholten Einspeisungsverfahren) hergestellt werden. Eine Zusammenfassung bekannter Züchtungsverfahren ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1984)) oder in dem Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
  • Das zu verwendende Kulturmedium muss den Erfordernissen der spezifischen Stämme auf geeignete Weise entsprechen. Beschreibungen von Kulturmedien für verschiedene Mikroorganismen sind im Handbuch „Manual of Methods for General Bacteriology (Handbuch der Verfahren für die allgemeine Bakteriologie)" der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) beschrieben.
  • Zucker und Kohlehydrate, wie beispielsweise Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melassen, Stärke und wahlweise Cellulose, Öle und Fette, wie beispielsweise Sojabohnenöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosnussfett, Fettsäuren, wie beispielsweise Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole, wie beispielsweise Glycerin und Ethanol, und organische Säuren, wie beispielsweise Essigsäure, können als Kohlenstoffquelle verwendet werden. Diese Substanzen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
  • Organische stickstoffhaltige Verbindungen, wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maiseinweichflüssigkeit, Sojabohnenmehl und Harnstoff, oder anorganische Verbindungen, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat, können als Stickstoffquelle verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
  • Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden natriumhaltigen Salze können als Phosphorquelle verwendet werden. Das Kulturmedium muss des Weiteren Salze von Metallen wie beispielsweise Magnesiumsulfat oder Eisensulfat umfassen, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wachstumssubstanzen, wie beispielsweise Aminosäuren und Vitamine, zusätzlich zu den oben erwähnten Substanzen verwendet werden. Geeignete Vorläufer können des Weiteren dem Kulturmedium zugegeben werden. Die erwähnten Ausgangssubstanzen können der Kultur in Form einer einzigen Charge zugegeben werden, oder sie können während des Züchtens auf geeignete Weise eingespeist werden.
  • Grundverbindungen wie beispielsweise Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak oder wässriges Ammoniak oder Säureverbindungen, wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure, können auf geeignete Weise zum Regulieren des pH-Werts der Kultur verwendet werden. Schaumverhinderungsmittel, wie beispielsweise Fettsäurepolyglycolester, können zum Regulieren der Schaumentwicklung verwendet werden. Geeignete Substanzen, die eine selektive Wirkung besitzen, wie beispielsweise Antibiotika, können dem Medium zum Aufrechterhalten der Beständigkeit von Plasmiden zugegeben werden. Um aerobe Bedingungen beizubehalten, werden Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasmischungen, wie beispielsweise Luft, in die Kultur eingeführt. Die Temperatur der Kultur beträgt gewöhnlich 25°C bis 45°C und bevorzugt 30°C bis 40°C. Das Züchten wird fortgeführt, bis ein Maximum des erwünschten Produkts gebildet ist. Dieses Ziel wird gewöhnlich innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
  • Die Analyse von L-Aminosäuren kann durch Anionenaustauschchromatografie mit darauffolgender Ninhydrinderivation, wie von Spackman et al. (Analytical Chemistry 30: 1190–1206 (1958)) beschrieben, durchgeführt werden oder sie kann durch Umkehrphasen-HPLC, wie beispielsweise von Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51: 1167–1174 (1979)) beschrieben, stattfinden.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren. wird für die fermentative Herstellung von L-Threonin verwendet.
  • Die für Escherichia coli verwendeten minimalen (M9) und kompletten Medien (LB) sind von J. H. Miller (A short course in bacterial genetics (Ein kurzer Kurs der Bakteriengenetik) (1992), Cold Spring Harbor Laboratory Press) beschrieben worden. Die Isolierung von Plasmid-DNA von Escherichia coli und alle Restriktions-, Ligations-, Klenow- und Alkaliphosphatasebehandlungstechniken werden der Methode von Sambrook et al. gemäß (Molecular cloning – A Laboratory Manual (Molekulares Klonen – Ein Laborhandbuch) (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press) durchgeführt. Es sei denn, es wird etwas anderes beschrieben, so wird die Transformation von Escherichia coli der Methode von Chung et al. gemäß (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (1989) 86: 2172–2175) durchgeführt.
  • Die Inkubationstemperatur für die Herstellung von Stämmen und Transformanten beträgt 37°C.
  • Beispiel 1
  • Herstellung von L-Threonin unter Anwendung des cysB-Gens.
  • 1a) Konstruktion des Expressionsplasmids pTrc99AcysB
  • Das cysB-Gen von E. coli K12 wird unter Anwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) und synthetischer Oligonukleotide amplifiziert. Ausgehend von der Nukleotidsequenz des cysB-Gens in E. coli K12 MG1655 (Zugangsnummer AE000225, Blattner et al. (Science 277: 1453–1462 (1997)), werden PCR-Primer synthetisiert (MWG Biotech, Ebersberg, Deutschland):
    cysB1: 5'-GCGTCTAAGTGGATGGTTTAAC-3' (SEQ ID NO: 1)
    cysB2: 5'-GGTGCCGAAAATAACGCAAG-3' (SEQ ID NO: 2)
  • Die chromosomale E. coli K12 MG1655-DNA, die für die PCR verwendet wird, wird den Anweisungen des Herstellers gemäß mit „Quiagen Genomic-Spitzen 100/G" (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Ein DNA-Fragment einer Größe von etwa 1000 bp kann mit den spezifischen Primern unter normalen PCR-Bedingungen (Innis et al. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications (PCR-Protokolle, eine Anleitung zu Methoden und Anwendungen), Academic Press) mit Pfu-DNA-Polymerase (Promega Corporation, Madison, USA) amplifiziert werden. Das PCR-Produkt wird den Anweisungen des Herstellers gemäß mit dem Vektor pCR-Blunt II-TOPO (Zero Blunt TOPO PCR Klonierkit, Invitrogen, Groningen, Niederlande) ligiert und in den E. coli Stamm TOP10 transformiert.
  • Die Auswahl plasmidtragender Zellen erfolgt auf LB-Agar, dem 50 μg/ml Kanamycin zugegeben werden. Nach dem Isolieren der Plasmid-DNA wird der Vektor pCR-Blunt II-TOPO-cysB mit den Restriktionsenzymen HindIII und XbaI gespalten und nach der Trennung in 0,8% Agarosegel wird das cysB-Fragment mit Hilfe des QIAquick Gelextraktions-Kits (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Der Vektor pTrc99A (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) wird mit den Enzymen HindIII und XbaI gespalten und die Ligation wird durchgeführt, wobei das cysB-Fragment isoliert ist. Der E. coli-Stamm XL1-Blau MRF' (Stratagene, La Jolla, USA) wird mit der Ligationscharge transformiert und plasmidtragende Zellen werden auf LB-Agar ausgewählt, dem 50 μg/ml Ampicillin zugegeben worden sind. Das erfolgreiche Klonieren lässt sich nach der Plasmid-DNA-Isolierung durch Kontrollspaltung mit den Enzymen ScaI und SmaI beweisen. Das Plasmid wird pTrc99ACysB genannt (1).
  • 1b) Herstellung von L-Threonin mit dem Stamm MG442/pTrc99AcysB
  • Der L-Threonin bildende E. coli Stamm MG442 ist in der Patentbeschreibung US-A-4,278,765 beschrieben und als CMIM B-1628 bei der Russischen Nationalsammlung für industrielle Mikroorganismen (VKPM, Moskau, Russland) hinterlegt.
  • Der Stamm MG442 wird mit dem in Beispiel Ia beschriebenen Expressionsplasmid pTrc99AcysB und mit dem Vektor pTrc99A transformiert und plasmidtragende Zellen werden auf LB-Agar mit 50 μg/ml Ampicillin ausgewählt. Die Stämme MG442/pTrc99AcysB und MG442/pTrc99A werden auf diese Weise gebildet. Ausgewählte einzelne Kolonien werden dann noch weiter auf Minimalmedium mit der folgenden Zusammensetzung multipliziert: 3,5 g/l Na2HPO4·2H2O, 1,5 g/l KH2PO4, 1 g/l NH4Cl, 0,1 g/l MgSO4·7H2O, 2 g/l Glukose, 20 g/l Agar, 50 mg/l Ampicillin. Die Bildung von L-Threonin wird in chargenweisen Kulturen von 10 ml überprüft, die in Erlenmeierkolben von 100 ml gehalten wurden. Dazu werden 10 ml Vorkulturmedium folgender Zusammensetzung: 2 g/l Hefeextrakt, 10 g/l (NH4)2SO4, 1 g/l KH2PO4, 0,5 g/l MgSO4·7H2O, 15 g/l CaCO3, 20 g/l Glukose, 50 mg/l Ampicillin inokuliert und die Charge wird 16 Stunden lang bei 37°C und 180 UpM in einem ESR-Brutschrank von Kühner AG (Birsfelden, Schweiz) inkubiert.
  • Portionen von 250 μl dieser Vorkultur werden dann in 10 ml Produktionsmedium (25 g/l (NH4)2SO4, 2 g/l KH2PO4, 1 g/l MgSO4·7H2O, 0,03 g/l FeSO4·7H2O, 0,018 g/l MnSO4·1H2O, 30 g/l CaCO3, 20 g/l Glukose, 50 mg/l Ampicillin) transinokuliert und die Charge wird 48 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Zur vollständigen Induktion der Expression des cysB-Gens werden 100 mg/l Isopropylβ-D-thiogalactopyranosid (IPTG) in parallelen Chargen zugegeben. Die Bildung von L-Threonin durch den Ausgangsstamm MG442 wird auf die gleiche Weise untersucht, jedoch erfolgt kein Zusatz von Ampicillin zum Medium. Nach der Inkubation wird die optische Dichte (OD) der Kultursuspension mit einem LP2W-Photometer von Dr. Lange (Düsseldorf, Deutschland) bei einer Messwellenlänge von 660 nm bestimmt.
  • Die Konzentration des gebildeten L-Threonins wird dann in der überstehenden steril filtrierten Kulturflüssigkeit mit einem Aminosäureanalysator von Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatografie und Postsäulenreaktion mit Ninhydrinerfassung bestimmt.
  • Die Ergebnisse des Versuchs sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
    Figure 00240001
  • Beispiel 2
  • Herstellung von L-Threonin unter Anwendung des cysK-Gens.
  • 2a) Konstruktion des Expressionsplasmids pTrc99AcysK
  • Das cysK-Gen von E. coli K12 wird unter Anwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) und synthetischer Oligonukleotide amplifiziert. Ausgehend von der Nukleotidsequenz des cysK-Gens in E. coli K12 MG1655 (Zugangsnummer AE000329, Blattner et al. (Science 277: 1453–1462 (1997)), werden PCR-Primer synthetisiert (MWG Biotech, Ebersberg, Deutschland):
    cysK1: 5'-CAGTTAAGGACAGGCCATGAG-3' (SEQ ID NO: 3)
    cysK2: 5'-GCTGGCATTACTGTTGCAATTC-3' (SEQ ID NO: 4)
  • Die chromosomale E. coli K12 MG1655-DNA, die für die PCR verwendet wird, wird den Anweisungen des Herstellers gemäß mit „Quiagen Genomic-Spitzen 100/G" (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Ein DNA-Fragment einer Größe von etwa 1000 bp kann mit den spezifischen Primern unter normalen PCR-Bedingungen (Innis et al. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications (PCR-Protokolle, eine Anleitung zu Methoden und Anwendungen), Academic Press) mit Pfu-DNA-Polymerase (Promega Corporation, Madison, USA) amplifiziert werden. Das PCR-Produkt wird den Anweisungen des Herstellers gemäß mit dem Vektor pCR-Blunt II-TOPO (Zero Blunt TOPO PCR Klonierkit, Invitrogen, Groningen, Niederlande) ligiert und in den E. coli Stamm TOP10 transformiert.
  • Die Auswahl plasmidtragender Zellen erfolgt auf LB-Agar, dem 50 μg/ml Kanamycin zugegeben werden. Nach dem Isolieren der Plasmid-DNA wird der Vektor pCR-Blunt II-TOPO-cysK mit den Restriktionsenzymen SpeI und XbaI gespalten und nach der Trennung in 0,8% Agarosegel wird das cysK-Fragment mit Hilfe des QIAquick Gelextraktions-Kits (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Der Vektor pTrc99A (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) wird mit dem Enzym XbaI gespalten und die Ligation wird durchgeführt, wobei das cysK-Fragment isoliert ist. Der E. coli-Stamm XL1-Blau MRF' (Stratagene, La Jolla, USA) wird mit der Ligationscharge transformiert und plasmidtragende Zellen werden auf LB-Agar ausgewählt, dem 50 μg/ml Ampicillin zugegeben worden sind. Das erfolgreiche Klonieren lässt sich nach der Plasmid-DNA-Isolierung durch Kontrollspaltung mit den Enzymen Hind III und PvuII beweisen. Das Plasmid wird pTrc99AcysK genannt (2).
  • 2b) Herstellung von L-Threonin mit dem Stamm MG442/pTrc99AcysK
  • Der L-Threonin bildende E. coli Stamm MG442 ist in der Patentbeschreibung US-A-4,278,765 beschrieben und als CMIM B-1628 bei der Russischen Nationalsammlung für industrielle Mikroorganismen (VKPM, Moskau, Russland) hinterlegt.
  • Der Stamm MG442 wird mit dem in Beispiel 2a beschriebenen Expressionsplasmid pTrc99AcysKB und mit dem Vektor pTrc99A transformiert und plasmidtragende Zellen werden auf LB-Agar mit 50 μg/ml Ampicillin ausgewählt. Die Stämme MG442/pTrc99AcysK und MG442/pTrc99A werden auf diese Weise gebildet. Ausgewählte einzelne Kolonien werden dann noch weiter auf Minimalmedium mit der folgenden Zusammensetzung multipliziert: 3,5 g/l Na2HPO4·2H2O, 1,5 g/l KH2PO4, 1 g/l NH4Cl, 0,1 g/l MgSO4·7H2O, 2 g/l Glukose, 20 g/l Agar, 50 mg/l Ampicillin. Die Bildung von L-Threonin wird in chargenweisen Kulturen von 10 ml überprüft, die in Erlenmeierkolben von 100 ml gehalten wurden. Dazu werden 10 ml Vorkulturmedium folgender Zusammensetzung: 2 g/l Hefeextrakt, 10 g/l (NH4)2SO4, 1 g/l KH2PO4, 0, 5 g/l MgSO4·7H2O, 15 g/l CaCO3, 20 g/l Glukose, 50 mg/l Ampicillin inokuliert und die Charge wird 16 Stunden lang bei 37°C und 180 UpMin einem ESR-Brutschrank von Kühner AG (Birsfelden, Schweiz) inkubiert.
  • Portionen von 250 μl dieser Vorkultur werden dann in 10 ml Produktionsmedium (25 g/l (NH4)2SO4, 2 g/l KH2PO4, 1 g/l MgSO4·7H2O, 0,03 g/l FeSO4·7H2O, 0,018 g/l MnSO4·1H2O, 30 g/l CaCO3, 20 g/l Glukose, 50 mg/l Ampicillin) transinokuliert und die Charge wird 48 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die Bildung von L-Threonin durch den Ausgangsstamm MG442 wird auf die gleiche Weise untersucht, jedoch erfolgt kein Zusatz von Ampicillin zum Medium. Nach der Inkubation wird die optische Dichte (OD) der Kultursuspension mit einem LP2W-Photometer von Dr. Lange (Düsseldorf, Deutschland) bei einer Messwellenlänge von 660 nm bestimmt.
  • Die Konzentration des gebildeten L-Threonins wird dann in der überstehenden steril filtrierten Kulturflüssigkeit mit einem Aminosäureanalysator von Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatografie und Postsäulenreaktion mit Ninhydrinerfassung bestimmt.
  • Die Ergebnisse des Versuchs sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
    Figure 00270001
  • Beispiel 3
  • Herstellung von L-Threonin unter Anwendung des cysM-Gens.
  • 3a) Konstruktion des Expressionsplasmids pTrc99AcysM
  • Das cysM-Gen von E. coli K12 wird unter Anwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) und synthetischer Oligonukleotide amplifiziert. Ausgehend von der Nukleotidsequenz des cysM-Gens in E. coli K12 MG1655 (Zugangsnummer AE000329, Blattner et al. (Science 277: 1453–1462 (1997)), werden PCR-Primer synthetisiert (MWG Biotech, Ebersberg, Deutschland). Die Sequenzen der Primer werden so modifiziert, dass Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme gebildet werden. Die Erkennungssequenz für XbaI wird für den cysM1-Primer gewählt und die Erkennungssequenz für HindIII für den cysM2-Primer, die durch Unterstreichen der unten gezeigten Nukleotidsequenz hervorgehoben werden:
    cysM1: 5'-CGCATCAGTCTAGACCACGTTAGGATAG-3' (SEQ ID NO: 5)
    cysM2: 5'-CATCAGTCTCCGAAGCTTTTAATCC-3' (SEQ ID NO: 6)
  • Die chromosomale E. coli K12 MG1655-DNA, die für die PCR verwendet wird, wird den Anweisungen des Herstellers gemäß mit „Quiagen Genomic-Spitzen 100/G" (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Ein DNA-Fragment einer Größe von etwa 950 bp kann mit den spezifischen Primern unter normalen PCR-Bedingungen (Innis et al. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications (PCR-Protokolle, eine Anleitung zu Methoden und Anwendungen), Academic Press) mit Pfu-DNA-Polymerase (Promega Corporation, Madison, USA) amplifiziert werden. Das PCR-Produkt wird den Anweisungen des Herstellers gemäß mit dem Vektor pCR-Blunt II-TOPO (Zero Blunt TOPO PCR Klonierkit, Invitrogen, Groningen, Niederlande) ligiert und in den E. coli Stamm TOP10 transformiert.
  • Die Auswahl plasmidtragender Zellen erfolgt auf LB-Agar, dem 50 μg/ml Kanamycin zugegeben werden. Nach dem Isolieren der Plasmid-DNA wird der Vektor pCR-Blunt II-TOPO-cysM mit den Restriktionsenzymen HindIII und XbaI gespalten und nach der Trennung in 0,8% Agarosegel wird das cysM-Fragment mit Hilfe des QIAquick Gelextraktions-Kits (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Der Vektor pTrc99A (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) wird mit den Enzymen HindIII und XbaI gespalten und die Ligation wird durchgeführt, woei das cysM-Fragment isoliert ist. Der E. coli-Stamm XL1-Blau MRF' (Stratagene, La Jolla, USA) wird mit der Ligationscharge transformiert und plasmidtragende Zellen werden auf LB-Agar ausgewählt, dem 50 μg/ml Ampicillin zugegeben worden ist. Das erfolgreiche Klonieren lässt sich nach der Plasmid-DNA-Isolierung durch Kontrollspaltung mit den Enzymen EcoRV, Eco91I, PauI und SspI beweisen. Das Plasmid wird pTrc99AcysM genannt (3).
  • 3b) Herstellung von L-Threonin mit dem Stamm MG442/pTrc99AcysM
  • Der L-Threonin bildende E. coli Stamm MG442 ist in der Patentbeschreibung US-A-4,278,765 beschrieben und als CMIM B-1628 bei der Russischen Nationalsammlung für industrielle Mikroorganismen (VKPM, Moskau, Russland) hinterlegt.
  • Der Stamm MG442 wird mit dem in Beispiel 3a beschriebenen Expressionsplasmid pTrc99AcysM und mit dem Vektor pTrc99A transformiert und plasmidtragende Zellen werden auf LB-Agar mit 50 μg/ml Ampicillin ausgewählt. Die Stämme MG442/pTrc99AcysM und MG442/pTrc99A werden auf diese Weise gebildet. Ausgewählte einzelne Kolonien werden dann noch weiter auf Minimalmedium mit der folgenden Zusammensetzung multipliziert: 3,5 g/l Na2HPO4·2H2O, 1,5 g/l KH2PO4, 1 g/l NH4Cl, 0, 1 g/l MgSO4·7H2O, 2 g/l Glukose, 20 g/l Agar, 50 mg/l Ampicillin. Die Bildung von L-Threonin wird in chargenweisen Kulturen von 10 ml überprüft, die in Erlenmeierkolben von 100 ml gehalten wurden. Dazu werden 10 ml Vorkulturmedium folgender Zusammensetzung: 2 g/l Hefeextrakt, 10 g/l (NH4)2SO4, 1 g/l KH2PO4, 0,5 g/l MgSO4·7H2O, 15 g/l CaCO3, 20 g/l Glukose, 50 mg/l Ampicillin inokuliert und die Charge wird 16 Stunden lang bei 37°C und 180 UpM einem ESR-Brutschrank von Kühner AG (Birsfelden, Schweiz) inkubiert.
  • Portionen von 250 μl dieser Vorkultur werden dann in 10 ml Produktionsmedium (25 g/l (NH4)2SO4, 2 g/l KH2PO4, 1 g/l MgSO4·7H2O, 0,03 g/l FeSO4·7H2O, 0,018 g/l MnSO4·1H2O, 30 g/l CaCO3, 20 g/l Glukose, 50 mg/l Ampicillin) transinokuliert und die Charge wird 48 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die Bildung von L-Threonin durch den Ausgangsstamm MG442 wird auf die gleiche Weise untersucht, jedoch erfolgt kein Zusatz von Ampicillin zum Medium. Nach der Inkubation wird die optische Dichte (OD) der Kultursuspension mit einem LP2W- Photometer von Dr. Lange (Düsseldorf, Deutschland) bei einer Messwellenlänge von 660 nm bestimmt.
  • Die Konzentration des gebildeten L-Threonins wird dann in der überstehenden steril filtrierten Kulturflüssigkeit mit einem Aminosäureanalysator von Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatografie und Postsäulenreaktion mit Ninhydrinerfassung bestimmt.
  • Die Ergebnisse des Versuchs sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3
    Figure 00300001
  • Beispiel 4
  • Herstellung von L-Threonin unter Anwendung der cysP-, cysU-, cysW- und cysA-Gene.
  • 4a) Konstruktion des Expressionsplasmids pTrc99AcysPUWA
  • Die cysP-, cysU-, cysW- und cysA-Gene von E. coli K12 wird unter Anwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) und synthetischer Oligonukleotide amplifiziert. Ausgehend von den Nukleotidsequenzen der cysP-, cysU-, cysW- und cysA-Gene in E. coli K12 MG1655 (Zugangsnummer AE000329 und AE000330, Blattner et al. (Science 277: 1453–1462 (1997)), werden PCR-Primer synthetisiert (MWG Biotech, Ebersberg, Deutschland). Die Sequenzen der Primer werden so modifiziert, dass Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme gebildet werden. Die Erkennungssequenz für XbaI wird für den cysPUWA1-Primer gewählt und die Erkennungssequenz für HindIII für den cysPUWa2- Primer, die durch Unterstreichen der unten gezeigten Nukleotidsequenz hervorgehoben werden:
    cysPUWA1: 5'-GTCTCTAGATAAATAAGGGTGCGCRATGGC-3' (SEQ ID NO: 7)
    cysPUWA2: 5'-CCGGGCGTTTAAGCTTCACTCAACC-3' (SEQ ID NO: 8)
  • Die chromosomale E. coli K12 MG1655-DNA, die für die PCR verwendet wird, wird den Anweisungen des Herstellers gemäß mit „Quiagen Genomic-Spitzen 100/G" (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Ein DNA-Fragment einer Größe von etwa 3900 bp kann mit den spezifischen Primern unter normalen PCR-Bedingungen (Innis et al. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications (PCR-Protokolle, eine Anleitung zu Methoden und Anwendungen), Academic Press) mit Pfu-DNA-Polymerase (Promega Corporation, Madison, USA) amplifiziert werden. Das PCR-Produkt wird mit den Restriktionsenzymen XbaI und HindIII gespalten und mit dem Vektor pTrc99A (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden), der mit den Enzymen XbaI und HindIII digeriert worden ist, ligiert. Der E. coli Stamm XL1-Blau MRF' (Stratagene, La Jolla, USA) wird mit der Ligationscharge transformiert und plasmidtragende Zellen werden auf LB-Agar, dem 50 μg/ml Ampicillin zugegeben worden sind, ausgewählt. Das erfolgreiche Klonieren kann nach der Plasmid-DNA-Isolierung durch Kontrollspaltung mit den Enzymen BamHI, EcoRV, MluI, NdeI und SspI bewiesen werden. Das Plasmid wird pTrc99AcysPUWA genannt (4).
  • 4b) Herstellung von L-Threonin mit dem Stamm MG442/pTrc99AcysPUWA
  • Der L-Threonin bildende E. coli Stamm MG442 ist in der Patentbeschreibung US-A-4,278,765 beschrieben und als CMIM B-1628 bei der Russischen Nationalsammlung für industrielle Mikroorganismen (VKPM, Moskau, Russland) hinterlegt.
  • Der Stamm MG442 wird mit dem in Beispiel 4a beschriebenen Expressionsplasmid pTrc99AcysPUWA und mit dem Vektor pTrc99A transformiert und plasmidtragende Zellen werden auf LB-Agar mit 50 μg/ml Ampicillin ausgewählt. Die Stämme MG442/pTrc99AcysPUWA und MG442/pTrc99A werden auf diese Weise gebildet. Ausgewählte einzelne Kolonien werden dann noch weiter auf Minimalmedium mit der folgenden Zusammensetzung multipliziert: 3,5 g/l Na2HPO4·2H2O, 1,5 g/l KH2PO4, 1 g/l NH4Cl, 0,1 g/l MgSO4·7H2O, 2 g/l Glukose, 20 g/l Agar, 50 mg/l Ampicillin. Die Bildung von L-Threonin wird in chargenweisen Kulturen von 10 ml überprüft, die in Erlenmeierkolben von 100 ml gehalten wurden. Dazu werden 10 ml Vorkulturmedium folgender Zusammensetzung: 2 g/l Hefeextrakt, 10 g/l (NH4)2SO4, 1 g/l KH2PO4, 0,5 g/l MgSO4·7H2O, 15 g/l CaCO3, 20 g/l Glukose, 50 mg/l Ampicillin inokuliert und die Charge wird 16 Stunden lang bei 37°C und 180 UpMin einem ESR-Brutschrank von Kühner AG (Birsfelden, Schweiz) inkubiert.
  • Portionen von 250 μl dieser Vorkultur werden dann in 10 ml Produktionsmedium (25 g/l (NH4)2SO4, 2 g/l KH2PO4, 1 g/l MgSO4·7H2O, 0,03 g/l FeSO4·7H2O, 0,018 g/l MnSO4·1H2O, 30 g/l CaCO3, 20 g/l Glukose, 50 mg/l Ampicillin) transinokuliert und die Charge wird 48 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Für die komplette Induktion der Expression der cysPUWA-Gene werden 100 mg/l Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) in parallelen Chargen zugegeben. Die Bildung von L-Threonin durch den Ausgangsstamm MG442 wird auf die gleiche Weise untersucht, jedoch erfolgt kein Zusatz von Ampicillin zum Medium. Nach der Inkubation wird die optische Dichte (OD) der Kultursuspension mit einem LP2W-Photometer von Dr. Lange (Düsseldorf, Deutschland) bei einer Messwellenlänge von 660 nm bestimmt.
  • Die Konzentration des gebildeten L-Threonins wird dann in der überstehenden steril filtrierten Kulturflüssigkeit mit einem Aminosäureanalysator von Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatografie und Postsäulenreaktion mit Ninhydrinerfassung bestimmt.
  • Die Ergebnisse des Versuchs sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4
    Figure 00330001
  • Beispiel 5
  • Herstellung von L-Threonin unter Anwendung der cysD-, cysN-, und cysC-Gene.
  • 5a) Konstruktion des Expressionsplasmids pTrc99AcysDNC
  • Die cysD-, cysN-, und cysC-Gene von E. coli K12 werden unter Anwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) und synthetischer Oligonukleotide amplifiziert. Ausgehend von den Nukleotidsequenzen der cysD-, cysN-, und cysC-Gene in E, coli K12 MG1655 (Zugangsnummer AE000358, Blattner et al. (Science 277: 1453–1462 (1997)), werden PCR-Primer synthetisiert (MWG Biotech, Ebersberg, Deutschland). Die Sequenzen der Primer werden so modifiziert, dass Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme gebildet werden. Die Erkennungssequenz für XbaI wird für den cysDNC1-Primer gewählt und die Erkennungssequenz für HindIII für den cysDNC2-Primer, die durch Unterstreichen der unten gezeigten Nukleotidsequenz hervorgehoben werden:
    cysDNC1: 5'-GCAAGAAAATAGCGGTCTAGATAAGGAACG-3' (SEQ ID NO: 9)
    cysDNC2: 5'-CATGGAAAGCTTGTGGTGTCTCAGG-3' (SEQ ID NO: 10)
  • Die chromosomale E. coli K12 MG1655 DNA, die für die PCR verwendet wird, wird den Anweisungen des Herstellers gemäß mit „Quiagen Genomic-Spitzen 100/G" (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Ein DNA-Fragment einer Größe von etwa 3000 bp kann mit den spezifischen Primern unter normalen PCR-Bedingungen (Innis et al. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications (PCR-Protokolle, eine Anleitung zu Methoden und Anwendungen), Academic Press) mit Pfu-DNA-Polymerase (Promega Corporation, Madison, USA) amplifiziert werden. Das PCR-Produkt wird mit den Restriktionsenzymen XbaI und HindIII gespalten und mit dem Vektor pTrc99A (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden), der mit den Enzymen XbaI und HindIII digeriert worden ist, ligiert. Der E. coli Stamm XL1-Blau MRF' (Stratagene, La Jolla, USA) wird mit der Ligationscharge transformiert und plasmidtragende Zellen werden auf LB-Agar, dem 50 μg/ml Ampicillin zugegeben worden sind, ausgewählt. Das erfolgreiche Klonieren kann nach der Plasmid-DNA-Isolierung durch Kontrollspaltung mit den Enzymen EcoRV, HincII, NruI, PvuI und ScaI bewiesen werden. Das Plasmid wird pTrc99AcysDNC genannt (5).
  • 5b) Herstellung von L-Threonin mit dem Stamm MG442/pTrc99AcysDNC
  • Der L-Threonin bildende E. coli Stamm MG442 ist in der Patentbeschreibung US-A-4,278,765 beschrieben und als CMIM B-1628 bei der Russischen Nationalsammlung für industrielle Mikroorganismen (VKPM, Moskau, Russland) hinterlegt.
  • Der Stamm MG442 wird mit dem in Beispiel 5a beschriebenen Expressionsplasmid pTrc99AcysDNC und mit dem Vektor pTrc99A transformiert und plasmidtragende Zellen werden auf LB-Agar mit 50 μg/ml Ampicillin ausgewählt. Die Stämme MG442/pTrc99AcysDNC und MG442/pTrc99A werden auf diese Weise gebildet. Ausgewählte einzelne Kolonien werden dann noch weiter auf Minimalmedium mit der folgenden Zusammensetzung multipliziert: 3,5 g/l Na2HPO4·2H2O, 1,5 g/l KH2PO4, 1 g/l NH4Cl, 0,1 g/l MgSO4·7H2O, 2 g/l Glukose, 20 g/l Agar, 50 mg/l Ampicillin. Die Bildung von L-Threonin wird in chargenweisen Kulturen von 10 ml überprüft, die in Erlenmeierkolben von 100 ml gehalten wurden. Dazu werden 10 ml Vorkulturmedium folgender Zusammensetzung: 2 g/l Hefeextrakt, 10 g/l (NH4)2SO4, 1 g/l KH2PO4, 0,5 g/l MgSO4·7H2O, 15 g/l CaCO3, 20 g/l Glukose, 50 mg/l Ampicillin inokuliert und die Charge wird 16 Stunden lang bei 37°C und 180 UpMin einem ESR-Brutschrank von Kühner AG (Birsfelden, Schweiz) inkubiert.
  • Portionen von 250 μl dieser Vorkultur werden dann in 10 ml Produktionsmedium (25 g/l (NH4)2SO4, 2 g/l KH2PO4, 1 g/l MgSO4·7H2O, 0,03 g/l FeSO4·7H2O, 0,018 g/l MnSO4·1H2O, 30 g/l CaCO3, 20 g/l Glukose, 50 mg/l Ampicillin) transinokuliert und die Charge wird 48 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die Bildung von L-Threonin durch den Ausgangsstamm MG442 wird auf die gleiche Weise untersucht, jedoch erfolgt kein Zusatz von Ampicillin zum Medium. Nach der Inkubation wird die optische Dichte (OD) der Kultursuspension mit einem LP2W-Photometer von Dr. Lange (Düsseldorf, Deutschland) bei einer Messwellenlänge von 660 nm bestimmt.
  • Die Konzentration des gebildeten L-Threonins wird dann in der überstehenden steril filtrierten Kulturflüssigkeit mit einem Aminosäureanalysator von Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ione naustauschchromatografie und Postsäulenreaktion mit Ninhydrinerfassung bestimmt.
  • Die Ergebnisse des Versuchs sind in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5
    Figure 00360001
  • Beispiel 6
  • Herstellung von L-Threonin unter Anwendung der cysJ- und cysI-Gene.
  • 6a) Konstruktion des Expressionsplasmids pTrc99AcysJI
  • Die cysJ- und cysI-Gene von E. coli K12 werden unter Anwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) und synthetischer Oligonukleotide amplifiziert. Ausgehend von der Nukleotidsequenz der cysJ- und cysI-Gene in E. coli K12 MG1655 (Zugangsnummer AE000360, Blattner et al. (Science 277: 1453–1462 (1997)), werden PCR-Primer synthetisiert (MWG Biotech, Ebersberg, Deutschland):
    cysJI1: 5'-CTGGAACATAACGACGCATGAC-3' (SEQ ID NO: 11)
    cysJI: 5'-GACCGGGCTGATGGTTAATCC-3' (SEQ ID NO: 12)
  • Die chromosomale E. coli K12 MG1655-DNA, die für die PCR verwendet wird, wird den Anweisungen des Herstellers gemäß mit „Quiagen Genomic-Spitzen 100/G" (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Ein DNA-Fragment einer Größe von etwa 3550 bp kann mit den spezifischen Primern unter normalen PCR-Bedingungen (Innis et al. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications (PCR-Protokolle, eine Anleitung zu Methoden und Anwendungen), Academic Press) mit Pfu-DNA-Polymerase (Promega Corporation, Madison, USA) amplifiziert werden. Das PCR-Produkt wird den Anweisungen des Herstellers gemäß mit dem Vektor pCR-Blunt II-TOPO (Zero Blunt TOPO PCR Klonierkit, Invitrogen, Groningen, Niederlande) ligiert und in den E. coli Stamm TOP10 transformiert.
  • Die Auswahl plasmidtragender Zellen erfolgt auf LB-Agar, dem 50 μg/ml Kanamycin zugegeben werden. Nach dem Isolieren der Plasmid-DNA wird der Vektor pCR-Blunt II-TOPO-cysJI mit den Restriktionsenzymen HindIII und XbaI gespalten und nach der Trennung in 0,8% Agarosegel wird das cysJI-Fragment mit Hilfe des QIAquick Gelextraktions-Kits (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Der Vektor pTrc99A (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) wird mit den Enzymen HindIII und XbaI gespalten und die Ligation wird durchgeführt, wobei das cysJI-Fragment isoliert ist. Der E. coli-Stamm XL1-Blau MRF' (Stratagene, La Jolla, USA) wird mit der Ligationscharge transformiert und plasmidtragende Zellen werden auf LB-Agar ausgewählt, dem 50 μg/ml Ampicillin zugegeben worden ist. Das erfolgreiche Klonieren lässt sich nach der Plasmid-DNA-Isolierung durch Kontrollspaltung mit den Enzymen AccI, ClaI und SphI beweisen. Das Plasmid wird pTrc99AcysJI genannt (6).
  • 6b) Herstellung von L-Threonin mit dem Stamm MG442/pTrc99AcysJI
  • Der L-Threonin bildende E. coli Stamm MG442 ist in der Patentbeschreibung US-A-4,278,765 beschrieben und als CMIM B-1628 bei der Russischen Nationalsammlung für industrielle Mikroorganismen (VKPM, Moskau, Russland) hinterlegt.
  • Der Stamm MG442 wird mit dem in Beispiel 6a beschriebenen Expressionsplasmid pTrc99AcysJI und mit dem Vektor pTrc99A transformiert und plasmidtragende Zellen werden auf LB-Agar mit 50 μg/ml Ampicillin ausgewählt. Die Stämme MG442/pTrc99AcysJI und MG442/pTrc99A werden auf diese Weise gebildet. Ausgewählte einzelne Kolonien werden dann noch weiter auf Minimalmedium mit der folgenden Zusammensetzung multipliziert: 3,5 g/l Na2HPO4·2H2O, 1,5 g/l KH2PO4, 1 g/l NH4Cl, 0,1 g/l MgSO4·7H2O, 2 g/l Glukose, 20 g/l Agar, 50 mg/l Ampicillin. Die Bildung von L-Threonin wird in chargenweisen Kulturen von 10 ml überprüft, die in Erlenmeierkolben von 100 ml gehalten wurden. Dazu werden 10 ml Vorkulturmedium folgender Zusammensetzung: 2 g/l Hefeextrakt, 10 g/l (NH4)2SO4, 1 g/l KH2PO4, 0,5 g/l MgSO4·7H2O, 15 g/l CaCO3, 20 g/l Glukose, 50 mg/l Ampicillin inokuliert und die Charge wird 16 Stunden lang bei 37°C und 180 UpMin einem ESR-Brutschrank von Kühner AG (Birsfelden, Schweiz) inkubiert.
  • Portionen von 250 μl dieser Vorkultur werden dann in 10 ml Produktionsmedium (25 g/l (NH4)2SO4, 2 g/l KH2PO4, 1 g/l MgSO4·7H2O, 0,03 g/l FeSO4·7H2O, 0,018 g/l MnSO4·1H2O, 30 g/l CaCO3, 20 g/l Glukose, 50 mg/l Ampicillin) transinokuliert und die Charge wird 48 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die Bildung von L-Threonin durch den Ausgangsstamm MG442 wird auf die gleiche Weise untersucht, jedoch erfolgt kein Zusatz von Ampicillin zum Medium. Nach der Inkubation wird die optische Dichte (OD) der Kultursuspension mit einem LP2W-Photometer von Dr. Lange (Düsseldorf, Deutschland) bei einer Messwellenlänge von 660 nm bestimmt.
  • Die Konzentration des gebildeten L-Threonins wird dann in der überstehenden steril filtrierten Kulturflüssigkeit mit einem Aminosäureanalysator von Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatografie und Postsäulenreaktion mit Ninhydrinerfassung bestimmt.
  • Die Ergebnisse des Versuchs sind in Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6
    Figure 00390001
  • Beispiel 7
  • Herstellung von L-Threonin unter Anwendung des cysH-Gens.
  • 7a) Konstruktion des Expressionsplasmids pTrc99AcysH
  • Das cysH-Gen von E. coli K12 wird unter Anwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) und synthetischer Oligonukleotide amplifiziert. Ausgehend von der Nukleotidsequenz des cysH-Gens in E. coli K12 MG1655 (Zugangsnummer AE000360, Blattner et al. (Science 277: 1453–1462 (1997)), werden PCR-Primer synthetisiert (MWG Biotech, Ebersberg, Deutschland):
    CysH1: 5'-GGCAAACAGTGAGGAATCTATG-3' (SEQ ID NO: 13)
    cysH2: 5'-GTCCGGCAATATTTACCCTTC-3' (SEQ ID NO: 14)
  • Die chromosomale E. coli K12 MG1655 DNA, die für die PCR verwendet wird, wird den Anweisungen des Herstellers gemäß mit „Quiagen Genomic-Spitzen 100/G" (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Ein DNA-Fragment einer Größe von etwa 800 bp kann mit den spezifischen Primern unter normalen PCR-Bedingungen (Innis et al. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications (PCR-Protokolle, eine Anleitung zu Methoden und Anwendungen), Academic Press) mit Pfu-DNA-Polymerase (Promega Corporation, Madison, USA) amplifiziert werden. Das PCR-Produkt wird den Anweisungen des Herstellers gemäß mit dem Vektor pCR-Blunt II-TOPO (Zero Blunt TOPO PCR Klonierkit, Invitrogen, Groningen, Niederlande) ligiert und in den E. coli Stamm TOP10 transformiert.
  • Die Auswahl plasmidtragender Zellen erfolgt auf LB-Agar, dem 50 μg/ml Kanamycin zugegeben werden. Nach dem Isolieren der Plasmid-DNA wird der Vektor pCR-Blunt II-TOPO-cysH mit den Restriktionsenzymen HindIII und XbaI gespalten und nach der Trennung in 0,8% Agarosegel wird das cysH-Fragment mit Hilfe des QIAquick Gelextraktions-Kits (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Der Vektor pTrc99A (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) wird mit den Enzymen HindIII und XbaI gespalten und die Ligation wird durchgeführt, wobei das cysH-Fragment isoliert ist. Der E. coli-Stamm XL1-Blau MRF' (Stratagene, La Jolla, USA) wird mit der Ligationscharge transformiert und plasmidtragende Zellen werden auf LB-Agar ausgewählt, dem 50 μg/ml Ampicillin zugegeben worden ist. Das erfolgreiche Klonieren lässt sich nach der Plasmid-DNA-Isolierung durch Kontrollspaltung mit den Enzymen HincII und MluI beweisen. Das Plasmid wird pTrc99AcysH genannt (7).
  • 7b) Herstellung von L-Threonin mit dem Stamm MG442/pTrc99AcysH
  • Der L-Threonin bildende E. coli Stamm MG442 ist in der Patentbeschreibung US-A-4,278,765 beschrieben und als CMIM B-1628 bei der Russischen Nationalsammlung für industrielle Mikroorganismen (VKPM, Moskau, Russland) hinterlegt.
  • Der Stamm MG442 wird mit dem in Beispiel 7a beschriebenen Expressionsplasmid pTrc99AcysH und mit dem Vektor pTrc99A transformiert und plasmidtragende Zellen werden auf LB-Agar mit 50 μg/ml Ampicillin ausgewählt. Die Stämme MG442/pTrc99AcysH und MG442/pTrc99A werden auf diese Weise gebildet. Ausgewählte einzelne Kolonien werden dann noch weiter auf Minimalmedium mit der folgenden Zusammensetzung multipliziert: 3,5 g/l Na2HPO4·2H2O, 1,5 g/l KH2PO4, 1 g/l NH4Cl, 0,1 g/l MgSO4·7H2O, 2 g/l Glukose, 20 g/l Agar, 50 mg/l Ampicillin. Die Bildung von L-Threonin wird in chargenweisen Kulturen von 10 ml überprüft, die in Erlenmeierkolben von 100 ml gehalten wurden. Dazu werden 10 ml Vorkulturmedium folgender Zusammensetzung: 2 g/l Hefeextrakt, 10 g/l (NH4)2SO4, 1 g/l KH2PO4, 0,5 g/l MgSO4·7H2O, 15 g/l CaCO3, 20 g/l Glukose, 50 mg/l Ampicillin inokuliert und die Charge wird 16 Stunden lang bei 37°C und 180 UpMin einem ESR-Brutschrank von Kühner AG (Birsfelden, Schweiz) inkubiert.
  • Portionen von 250 μl dieser Vorkultur werden dann in 10 ml Produktionsmedium (25 g/l (NH4)2SO4, 2 g/l KH2PO4, 1 g/l MgSO4·7H2O, 0,03 g/l FeSO4·7H2O, 0,018 g/l MnSO4·1H2O, 30 g/l CaCO3, 20 g/l Glukose, 50 mg/l Ampicillin) transinokuliert und die Charge wird 48 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die Bildung von L-Threonin durch den Ausgangsstamm MG442 wird auf die gleiche Weise untersucht, jedoch erfolgt kein Zusatz von Ampicillin zum Medium. Nach der Inkubation wird die optische Dichte (OD) der Kultursuspension mit einem LP2W-Photometer von Dr. Lange (Düsseldorf, Deutschland) bei einer Messwellenlänge von 660 nm bestimmt.
  • Die Konzentration des gebildeten L-Threonins wird dann in der überstehenden steril filtrierten Kulturflüssigkeit mit einem Aminosäureanalysator von Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatografie und Postsäulenreaktion mit Ninhydrinerfassung bestimmt.
  • Die Ergebnisse des Versuchs sind in Tabelle 7 gezeigt. Tabelle 7
    Figure 00420001
  • Kurze Beschreibung der Figuren:
  • 1: Karte des das cysB-Gen enthaltenden Plasmids pTrc99AcysB.
  • 2: Karte des das cysK-Gen enthaltenden Plasmids pTrc99AcysK.
  • 3: Karte des das cysM-Gen enthaltenden Plasmids pTrc99AcysM.
  • 4: Karte des die cysP-, cysD-, cysW- und cysA-Gene enthaltenden Plasmids pTrc99AcysPUWA.
  • 5: Karte des die cysD-, cysN- und cysC-Gene enthaltenden Plasmids pTrc99AcysDNC.
  • 6: Karte des die cysD- und cysI-Gene enthaltenden Plasmids pTrc99AcysJI.
  • 7: Karte des das cysH-Gen enthaltenden Plasmids pTrc99AcysH.
  • Die Längendaten müssen als ungefähre Daten aufgefasst werden. Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben folgende Bedeutung:
    • • Amp: Ampicillinresistenzgen
    • • lacI: Gen für das Repressorprotein des trc-Promotors
    • • Ptrc: trc-Promotorregion, durch IPTG induzierbar
    • • cysB: Kodierregion des cysB-Gens
    • • cysK: Kodierregion des cysK-Gens
    • • cysM: Kodierregion des cysM-Gens
    • • cysP: Kodierregion des cysP-Gens
    • • cysU: Kodierregion des cysU-Gens
    • • cysW: Kodierregion des cysW-Gens
    • • cysA: Kodierregion des cysA-Gens
    • • cysD: Kodierregion des cysD-Gens
    • • cysN: Kodierregion des cysN-Gens
    • • cysC: Kodierregion des cysC-Gens
    • • cysD: Kodierregion des cysD-Gens
    • • cysI: Kodierregion des cysI-Gens
    • • cysN: Kodierregion des cysN-Gens
    • • 5S: 5S rRNA-Region
    • • rrnBT: rRNA-Terminatorregion
  • Die Abkürzungen für die Restriktionsenzyme haben folgende Bedeutung:
    • • AccI: Restriktionsendonuklease von Acinetobacter calcoaceticus
    • • BamHI: Restriktionsendonuklease von Bacillus amyloliquefaciens H
    • • BstEII: Restriktionsendonuklease von Bacillus stearothermophilus ATCC 12980
    • • ClaI: Restriktionsendonuklease von Caryophannon latum
    • • EcoRI: Restriktionsendonuklease von Escherichia coli RY13
    • • EcoRV: Restriktionsendonuklease von Escherichia coli B946
    • • HincII: Restriktionsendonuklease von Haemophilus influenzae Rc
    • • HindIII: Restriktionsendonuklease von Haemophilus influenzae
    • • MluI: Restriktionsendonuklease von Micrococcus luteus IFO 12992
    • • NdeI: Restriktionsendonuklease von Neisseria dentrificans
    • • NruI: Restriktionsendonuklease von Norcadia ruba (ATCC 15906)
    • • PauI: Restriktionsendonuklease von Parococcus alcaliphilus
    • • PvuI: Restriktionsendonuklease von Proteus vulgaris (ATCC 13315)
    • • PvuII: Restriktionsendonuklease von Proteus vulgaris (ATCC 13315)
    • • ScaI: Restriktionsendonuklease von Streptomyces caespitosus
    • • SmaI: Restriktionsendonuklease von Serratia marcescens
    • • SpeI: Restriktionsendonuklease von Sphaerotilus species ATCC 13923
    • • SphI: Restriktionsendonuklease von Streptomyces phaeochromogenes
    • • SspI: Restriktionsendonuklease von Sphaerotilus species ATCC 13925
    • • XbaI: Restriktionsendonuklease von Xanthomonas campestris
  • Sequenzprotokol
  • Verfahren für die Herstellung von L-Aminosäuren unter Anwendung der Stämme der Familie der Enterobacteriaceae
    PatentIn-Version
    artificial sequence = Künstliche Sequenz
    Primer
  • Figure 00470001
  • Figure 00480001
  • Figure 00490001

Claims (7)

  1. Verfahren für die Herstellung von L-Threonin, das das Durchführen der folgenden Schritte umfasst: a) Fermentieren von Mikroorganismen der Familie der Enterobacteriaceae, die L-Threonin erzeugen, und wobei mindestens das cysB-Gen des Cysteinbiosynthesewegs oder die Nukleotidsequenzen, die für das Genprodukt des Gens kodieren, überexprimiert ist bzw. sind, b) Konzentrieren von L-Threonin im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen und c) Isolieren der L-Aminosäure, der Bestandteile der Fermentationsbrühen und/oder der Biomasse insgesamt oder von Teilen (> 0 bis 100%) derselben, die wahlweise im Produkt verbleiben.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Polynukleotid bzw. die Polynukleotide, das bzw. die für ein oder mehrere der Genprodukte der Cysteinbiosynthesegene kodiert bzw. kodieren, die aus der Gruppe ausgewählt sind bestehend aus cysG, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysD, cysP, cysD, cysN, cysC, cysD, cysI, cysN, cysE und sbp überexprimiert ist bzw. sind.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei für die Herstellung von L-Threonin Mikroorganismen der Familie der Enterobacteriaceae fermentiert werden, wobei zusätzlich gleichzeitig ein oder mehrere der Gene, die aus der Gruppe ausgewählt werden bestehend aus: a) dem thrABC-Operon, das für Aspartatkinase, Homoserindehydrogenase, Homoserinkinase und Threoninsynthase kodiert, b) dem pyc-Gen, das für Pyruvatcarboxylase kodiert, c) dem pps-Gen, das für Phosphoenolpyruvatsynthase kodiert, d) dem ppc-Gen, das für Phosphoenolpyruvatcarboxylase kodiert, e) den pnta- und pntB-Genen, die für Transhydrogenase kodieren, f) dem rhtB-Gen, das Homoserin Resistenz verleiht, g) dem mqo-Gen, das für Malat:Chinonoxidoreduktase kodiert h) dem rhtC-Gen, das Threonin Resistenz verleiht, i) dem thrE-Gen, das für Threoninexportprotein kodiert, j) dem gdhA-Gen, das für Glutamatdehydrogenase kodiert, k) dem hns-Gen, das für das DNA-Bindungsprotein HLP-II kodiert, l) dem pgm-Gen, das für Phosphoglukomutase kodiert, m) dem fba-Gen, das für Fruktosebiphosphataldolase kodiert, n) dem ptsH-Gen, das für das Phosphohistidinprotein Hexosephosphotransferase kodiert, o) dem ptsI-Gen, das für das Enzym I des Phosphotransferasesystems kodiert, p) dem crr-Gen, das für die glukosespezifische IIA-Komponente kodiert, q) dem ptsG-Gen, das für die glukosespezifische IIBC-Komponente kodiert, r) dem lpr-Gen, das für den Regulator des Leucinregulons kodiert, s) dem mopB-Gen, das für 10 Kd-Chaperon kodiert, t) dem ahpC-Gen, das für die kleine Untereinheit von Alkylhydroperoxidreduktase kodiert, u) dem ahpF-Gen, das für die große Untereinheit der Alkylhydroperoxidreduktase kodiert, überexprimiert ist bzw. sind.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei für die Herstellung von L-Threonin Mikroorganismen der Familie der Enterobacteriaceae fermentiert werden, wobei zusätzlich gleichzeitig ein oder mehrere der Gene, die aus der Gruppe ausgewählt werden bestehend aus: a) dem tdh-Gen, das für Threonindehydrogenase kodiert, b) dem mdh-Gen, das für Malatdehydrogenase kodiert, c) dem Genprodukt des offenen Leserasters (orf) yjfA, d) dem Genprodukt des offenen Leserasters (orf) yjfP e) dem pckA-Gen, das für Phosphoenolpyruvatcarboxykinase kodiert, f) dem poxB-Gen, das für Pyruvatoxidase kodiert, g) dem aceA-Gen, das für Isocitratlyase kodiert, h) dem dgsA-Gen, das für den DgsA-Regulator des Phosphotransferasesystems kodiert, i) dem fruR-Gen, das für den Fruktoserepressor kodiert, j) dem rpoS-Gen, das für den Sigma38-Faktor kodiert, eliminert wird oder werden.
  5. L-Threonin erzeugende Mikroorganismen der Familie der Enterobacteriaceae, wobei mindestens das thrABC-Operon, welche Gene für Aspartatkinase, Homoserindehydrogenase, Homoserinkinase und Threoninsynthase kodieren, und das cysB-Gen überexprimiert sind.
  6. Mikroorganismen nach Anspruch 5, wobei die Mikroorganismen aus der Gattung Escherichia stammen.
  7. Mikroorganismen nach Anspruch 5, wobei die Mikroorganismen aus der Spezies E. coli stammen.
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