DE10210966A1 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, in dem man folgende Schritte durchführt: DOLLAR A a) Fermentation der die gewünschte L-Aminosäure produzierenden Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen man das mglB-Gen oder dafür kodierende Nukleotidsequenzen verstärkt, insbesondere überexprimiert, DOLLAR A b) Anreicherung der gewünschten L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Bakterien und DOLLAR A c) Isolierung der gewünschten L-Aminosäure.

Description

• Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae, in denen das mglB-Gen verstärkt wird.
• Stand der Technik
• L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, finden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung Anwendung.
• Es ist bekannt, dass L-Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen der Enterobacteriaceae, insbesondere Escherichia coli (E. coli) und Serratia marcescens, hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen, wie z. B. Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien wie z. B. die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform, durch z. B. Ionenaustauschchromatographie, oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.
• Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite wie z. B. das Threonin-Analogon α-Amino-β-Hydroxyvaleriansäure (AHV) oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und L-Aminosäuren wie z. B. L-Threonin produzieren.
• Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung L- Aminosäuren produzierender Stämme der Familie Enterobacteriaceae eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die Produktion untersucht.
Aufgabe der Erfindung
• Die Erfinder haben sich die Aufgabe gestellt, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von L- Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, bereitzustellen.
• Beschreibung der Erfindung
• Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, unter Verwendung von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, die insbesondere bereits L- Aminosäuren produzieren, und in denen die für das mglB-Gen kodierende Nukleotidsequenz verstärkt wird.
• Werden im folgenden L-Aminosäuren oder Aminosäuren erwähnt, sind damit eine oder mehrere Aminosäuren einschließlich ihrer Salze, ausgewählt aus der Gruppe L-Asparagin, L- Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L- Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L- Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan und L-Arginin gemeint. Besonders bevorzugt ist L-Threonin.
• Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor oder ein Gen oder Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym bzw. Protein mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
• Durch die Maßnahmen der Verstärkung, insbesondere Überexpression, wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500%, maximal bis 1000% oder 2000% bezogen auf die des Wildtyp- Proteins beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus erhöht.
• Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man folgende Schritte durchführt:
  
• a) Fermentation der die gewünschte L-Aminosäure produzierenden Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen man das mglB-Gen oder dafür kodierende Nukleotidsequenzen verstärkt, insbesondere überexprimiert,
• b) Anreicherung der gewünschten L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen, und
• c) Isolierung der gewünschten L-Aminosäure wobei gegebenenfalls Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder die Biomasse in ihrer Gesamtheit oder Anteilen (≥ 0 bis 100) davon im Produkt verbleiben.
• Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können L-Aminosäuren aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, gegebenenfalls Stärke, gegebenenfalls Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es handelt sich um Vertreter der Familie Enterobacteriaceae, ausgewählt aus den Gattungen Escherichia, Erwinia, Providencia und Serratia. Die Gattungen Escherichia und. Serratia werden bevorzugt. Bei der Gattung Escherichia ist insbesondere die Art Escherichia coli und bei der Gattung Serratia insbesondere die Art Serratia marcescens zu nennen.
• Geeignete, insbesondere L-Threonin produzierende Stämme der Gattung Escherichia, insbesondere der Art Escherichia coli sind beispielsweise
  Escherichia coli TF427
  Escherichia coli H4578
  Escherichia coli KY10935
  Escherichia coli VNIIgenetika MG442
  Escherichia coli VNIIgenetika M1
  Escherichia coli VNIIgenetika 472T23
  Escherichia coli BKIIM B-3996
  Escherichia coli kat 13
  Escherichia coli KCCM-10132.
• Geeignete L-Threonin produzierende Stämme der Gattung Serratia, insbesondere der Art Serratia marcescens sind beispielsweise
  Serratia marcescens HNr21
  Serratia marcescens TLr156
  Serratia marcescens T2000.
• L-Threonin produzierende Stämme aus der Familie der Enterobacteriaceae besitzen bevorzugt, unter anderen, ein oder mehrere der genetischen bzw. phänotypischen Merkmale ausgewählt aus der Gruppe: Resistenz gegen α-Amino-β- Hydroxyvaleriansäure, Resistenz gegen Thialysin, Resistenz gegen Ethionin, Resistenz gegen α-Methylserin, Resistenz gegen Diaminobernsteinsäure, Resistenz gegen α- Aminobuttersäure, Resistenz gegen Borrelidin, Resistenz gegen Rifampicin, Resistenz gegen Valin-Analoga wie beispielsweise Valinhydroxamat, Resistenz gegen Purinanaloga wie beispielsweise 6-Dimethylaminopurin, Bedürftigkeit für L-Methionin, gegebenenfalls partielle und kompensierbare Bedürftigkeit für L-Isoleucin, Bedürftigkeit für meso-Diaminopimelinsäure, Auxotrophie bezüglich Threonin-haltiger Dipeptide, Resistenz gegen L-Threonin, Resistenz gegen L-Homoserin, Resistenz gegen L-Lysin, Resistenz gegen L-Methionin, Resistenz gegen L- Glutaminsäure, Resistenz gegen L-Aspartat, Resistenz gegen L-Leucin, Resistenz gegen L-Phenylalanin, Resistenz gegen L-Serin, Resistenz gegen L-Cystein, Resistenz gegen L- Valin, Empfindlichkeit gegenüber Fluoropyruvat, defekte Threonin-Dehydrogenase, gegebenenfalls Fähigkeit zur Saccharose-Verwertung, Verstärkung des Threonin-Operons, Verstärkung der Homoserin-Dehydrogenase I-Aspartatkinase I bevorzugt der feed back resistenten Form, Verstärkung der Homoserinkinase, Verstärkung der Threoninsynthase, Verstärkung der Aspartatkinase, gegebenenfalls der feed back resistenten Form, Verstärkung der Aspartatsemialdehyd- Dehydrogenase, Verstärkung der Phosphoenolpyruvat- Carboxylase, gegebenenfalls der feed back resistenten Form, Verstärkung der Phosphoenolpyruvat-Synthase, Verstärkung der Transhydrogenase, Verstärkung des RhtB-Genproduktes, Verstärkung des RhtC-Genproduktes, Verstärkung des YfiK- Genproduktes, Verstärkung einer Pyruvat-Carboxylase, und Abschwächung der Essigsäurebildung.
• Es wurde gefunden, dass Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae nach Verstärkung, insbesondere Überexpression des mglB-Gens, in verbesserter Weise L- Aminosäuren, insbesondere L-Threonin produzieren.
• Die Nukleotidsequenzen der Gene von Escherichia coli gehören zum Stand der Technik (Siehe nachfolgende Textstellen) und können ebenfalls der von Blattner et al. (Science 277: 1453-1462 (1997)) publizierten Genomsequenz von Escherichia coli entnommen werden.
• Das mglB-Gen wird unter anderem durch folgende Angaben beschrieben:
  Bezeichnung: Periplasmatisches, Galaktose-bindendes Transportprotein, Rezeptor für Galaktose- Chemotaxis
  Referenz: Hogg et al.; Molecular and General Genetics 229(3): 453-459 (1991) Muller et al.; Molecular and General Genetics 185(3): 473-480 (1982)
  Accession No.: AE000304
• Die Nukleinsäuresequenzen können den Datenbanken des National Center for Biotechnology Information (NCBI) der National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA), der Nukleotidsequenz-Datenbank der European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Deutschland bzw. Cambridge, UK) oder der DNA Datenbank von Japan (DDBJ, Mishima, Japan) entnommen werden.
• Die in den angegebenen Textstellen beschriebenen Gene können erfindungsgemäß verwendet werden. Weiterhin können Allele der Gene verwendet werden, die sich aus der Degeneriertheit des genetischen Codes oder durch funktionsneutrale Sinnmutationen ("sense mutations") ergeben. Die Verwendung endogener Gene wird bevorzugt.
• Unter "endogenen Genen" oder "endogenen Nukleotidsequenzen" versteht man die in der Population einer Art vorhandenen Gene oder Allele beziehungsweise Nukleotidsequenzen.
• Zur Erzielung einer Verstärkung können beispielsweise die Expression der Gene oder die katalytischen Eigenschaften der Proteine erhöht werden. Gegebenenfalls können beide Maßnahmen kombiniert werden.
• Die Konzentration des Transportproteins, für das das Polynukleotid mglB kodiert, kann mit der von Richarme und Caldas (Journal of Biological Chemistry 272(25): 15607-15612 (1997)) beschriebenen Methode bestimmt werden.
• Zur Erzielung einer Überexpression kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich die Expression im Verlaufe der fermentativen L-Threonin-Produktion zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.
• Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Chang und Cohen (Journal of Bacteriology 134: 1141-1156 (1978)), bei Hartley und Gregori (Gene 13: 347-353 (1981)), bei Amann und Brosius (Gene 40: 183-190 (1985)), bei de Broer et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 80: 21-25 (1983)), bei LaVallie et al. (BIO/TECHNOLOGY 11: 187-193 (1993)), in PCT/US 97/13359, bei Llosa et al. (Plasmid 26: 222-224 (1991)), bei Quandt und Klipp (Gene 80: 161-169 (1989)), bei Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 171: 4617-4622 (1989)), bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191-195 (1998)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.
• In Enterobacteriaceae replizierbare Plasmidvektoren wie z. B. von pACYC184 abgeleitete Kloniervektoren (Bartolomé et al.; Gene 102: 75-78 (1991)), pTrc99A (Amann et al.; Gene 69: 301-315 (1988)) oder pSC101-Derivate (Vocke und Bastia, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80(21): 6557-6561 (1983)) können verwendet werden. In einem erfindungsgemäßen Verfahren kann man einen mit einem Plasmidvektor transformierten Stamm einsetzen, wobei der Plasmidvektor mindestens eine für das mglB-Gen kodierende Nukleotidsequenz trägt.
• Es ist ebenfalls möglich, Mutationen, die die Expression der jeweiligen Gene betreffen, durch Sequenzaustausch (Hamilton et al.; Journal of Bacteriology 171: 4617-4622 (1989)), Konjugation oder Transduktion in verschiedene Stämme zu überführen.
• Weiterhin kann es für die Produktion von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin mit Stämmen der Familie Enterobacteriaceae vorteilhaft sein, zusätzlich zur Verstärkung des mglB-Gens, ein oder mehrere Enzyme des bekannten Threonin-Biosyntheseweges oder Enzyme des anaplerotischen Stoffwechsels oder Enzyme für die Produktion von reduziertem Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid- Phosphat oder Enzyme der Glykolyse oder PTS-Enzyme oder Enzyme des Schwefelstoffwechsels zu verstärken. Die Verwendung endogener Gene wird im allgemeinen bevorzugt.
• So können beispielsweise gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe
  das für die Aspartatkinase, die Homoserin-Dehydrogenase, die Homoserinkinase und die Threoninsynthase kodierende thrABC-Operon (US-A-4,278,765);
  das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende pyc-Gen (DE- A-198 31 609);
  das für die Phosphoenolpyruvat-Synthase kodierende pps- Gen (Molecular and General Genetics 231(2): 332-336 (1992));
  das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxylase kodierende ppc-Gen (Gene 31: 279-283 (1984));
  die für die Transhydrogenase kodierenden Gene pntA und pntB (European Journal of Biochemistry 158: 647-653 (1986));
  das Homoserinresistenz vermittelnde Gen rhtB (EP-A-0 994 190);
  das für die Malat:Chinon Oxidoreduktase kodierende mqo- Gen (DE 100 34 833.5);
  das Threoninresistenz vermittelnde Gen rhtC (EP-A-1 013 765);
  das für den Threoninexport-Protein kodierende thrE-Gen von Corynebacterium glutamicum (DE 100 26 494.8);
  das für die Glutamat-Dehydrogenase kodierende gdhA-Gen (Nucleic Acids Research 11: 5257-5266 (1983); Gene 23: 199-209 (1983));
  das für das DNA-Bindeprotein HLP-II kodierende hns-Gen (Molecular and General Genetics 212: 199-202 (1988));
  das für die Phosphoglucomutase kodierende pgm-Gen (Journal of Bacteriology 176: 5847-5851 (1994));
  das für die Fructose Biphosphat Aldolase kodierende fba- Gen (Biochemical Journal 257: 529-534 (1989));
  das für die Phosphohistidin-Protein-Hexose- Phosphotransferase des Phosphotransferase-Systems PTS kodierende ptsH-Gen des ptsHIcrr-Operons (Journal of Biological Chemistry 262: 16241-16253 (1987));
  das für das Enzym I des Phosphotransferase-Systems PTS kodierende ptsI-Gen des ptsHIcrr-Operons (Journal of Biological Chemistry 262: 16241-16253 (1987));
  das für die Glucose-spezifische IIA Komponente des Phosphotransferase-Systems PTS kodierende crr-Gen des ptsHIcrr-Operons (Journal of Biological Chemistry 262: 16241-16253 (1987));
  das für die Glucose-spezifische IIBC Komponente kodierende ptsG-Gen (Journal of Biological Chemistry 261: 16398-16403 (1986));
  das für den Regulator des Leucin-Regulons kodierende lrp-Gen (Journal of Biological Chemistry 266: 10768-10774 (1991));
  das für den globalen Regulator Csr kodierende csrA-Gen (Journal of Bacteriology 175: 4744-4755 (1993));
  das für den Regulator des fad-Regulons kodierende fadR- Gen (Nucleic Acids Research 16: 7995-8009 (1988));
  das für den Regulator des zentralen Intermediärstoffwechsels kodierende iclR-Gen (Journal of Bacteriology 172: 2642-2649 (1990));
  das für das 10 Kd Chaperon kodierendes mopB-Gen (Journal of Biological Chemistry 261: 12414-12419 (1986)), das auch unter der Bezeichnung groES bekannt ist;
  das für die kleine Untereinheit der Alkyl Hydroperoxid Reduktase kodierende ahpC-Gen des ahpCF-Operons (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 92: 7617-7621 (1995))
  das für die große Untereinheit der Alkyl Hydroperoxid Reduktase kodierende ahpF-Gen des ahpCF-Operons (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 92: 7617-7621 (1995))
  das für die Cystein-Synthase A kodierende cysK-Gen (Journal of Bacteriology 170: 3150-3157 (1988))
  das für den Regulator des cys-Regulons kodierende cysB- Gen (Journal of Biological Chemistry 262: 5999-6005 (1987));
  das für das Flavoprotein der NADPH-Sulfit-Reduktase kodierende cysJ-Gen des cysJIH-Operons (Journal of Biological Chemistry 264: 15796-15808 (1989), Journal of Biological Chemistry 264: 15726-15737 (1989))
  das für das Hämoprotein der NADPH-Sulfit-Reduktase kodierende cysI-Gen des cysJIH-Operons (Journal of Biological Chemistry 264: 15796-15808 (1989), Journal of Biological Chemistry 264: 15726-15737 (1989)) und
  das für die Adenylylsulfat-Reduktase kodierende cysH-Gen des cysJIH-Operons (Journal of Biological Chemistry 264: 15796-15808 (1989), Journal of Biological Chemistry 264: 15726-15737 (1989))
  verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.
• Weiterhin kann es für die Produktion von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Verstärkung des mglB-Gens, eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe
  das für die Threonin-Dehydrogenase kodierende tdh-Gen (Journal of Bacteriology 169: 4716-4721 (1987));
  das für die Malat-Dehydrogenase (E.C. 1.1.1.37) kodierende mdh-Gen (Archives in Microbiology 149: 36-42 (1987));
  das Genprodukt des offenen Leserahmens (orf) yjfA (Accession Number AAC77180 des National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA));
  das Genprodukt des offenen Leserahmens (orf) ytfP (Accession Number AAC77179 des National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA));
  das für das Enzym Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende pckA-Gen (Journal of Bacteriology 172: 7151-7156 (1990));
  das für die Pyruvat-Oxidase kodierende poxB-Gen (Nucleic Acids Research 14 (13): 5449-5460 (1986));
  das für das Enzym Isocitrat-Lyase kodierende aceA-Gen (Journal of Bacteriology 170: 4528-4536 (1988));
  das für den DgsA-Regulator des Phosphotransferase- Systems kodierende dgsA-Gen (Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 59: 256-251 (1995)), das auch unter der Bezeichnung mlc-Gen bekannt ist;
  das für den Fructose-Repressor kodierende fruR-Gen (Molecular and General Genetics 226: 332-336 (1991)); das auch unter der Bezeichnung cra-Gen bekannt ist, und
  das für den Sigma³⁸-Faktor kodierende: rpoS-Gen (WO 01/05939), das auch unter der Bezeichnung katF-Gen bekannt ist;
  abzuschwächen, insbesondere auszuschalten oder die Expression zu verringern.
• Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Enzym (Protein) oder Gen inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
• Durch die Maßnahmen der Abschwächung wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen auf 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration des Wildtyp- Proteins, beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus, herabgesenkt.
• Weiterhin kann es für die Produktion von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Verstärkung des mglB-Gens, unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).
• Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können im batch-Verfahren (Satzkultivierung), im fed batch (Zulaufverfahren) oder im repeated fed batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
• Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen.
• Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) enthalten.
• Als Kohlenstoffquelle können Zucker und. Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und gegebenenfalls Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
• Als Stickstoffquelle können organische Stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Amoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
• Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten, wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.
• Die Fermentation wird im allgemeinen bei einem pH-Wert von 5,5 bis 9,0, insbesondere 6,0 bis 8,0, durchgeführt. Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoffhaltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 25°C bis 45°C und vorzugsweise bei 30°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum an L- Aminosäuren bzw. L-Threonin gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
• Die Analyse von L-Aminosäuren kann durch Anionenaustauschchromatographie mit anschließender Ninhydrin Derivatisierung erfolgen, so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry 30: 1190-1206 (1958)) beschrieben, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51: 1167-1174 (1979)) beschrieben.
• Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, wie beispielsweise L- Threonin, L-Isoleucin, L-Valin, L-Methionin, L-Homoserin und L-Lysin, insbesondere L-Threonin.

Claims (8)

1. Verfahren zur fermentativen Herstellung von L- Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, dadurch gekennzeichnet, dass man folgende Schritte durchführt:

a) Fermentation der die gewünschte L-Aminosäure produzierenden Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen man das mglB-Gen oder dafür kodierende Nukleotidsequenzen verstärkt, insbesondere überexprimiert,

b) Anreicherung der gewünschten L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen, und

c) Isolierung der gewünschten L-Aminosäure wobei gegebenenfalls Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder die Biomasse in ihrer Gesamtheit oder Anteilen (≥ 0 bis 100) davon im. Produkt verbleiben.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Mikroorganismen einsetzt, in denen man zusätzlich weitere Gene des Biosyntheseweges der gewünschten L-Aminosäure verstärkt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Mikroorganismen einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung der gewünschten L-Aminosäure verringern.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Expression des (der) Polynukleotids (e), das (die) für das mglB-Gen kodiert (kodieren), erhöht.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die regulatorischen und/oder katalytischen Eigenschaften des Polypeptids (Proteins) verbessert oder erhöht, für das das Polynukleotid mglB kodiert.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Herstellung von L-Aminosäuren Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae fermentiert, in denen man zusätzlich gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe:

1. 6.1 das für die Aspartatkinase, die Homoserin- Dehydrogenase, die Homoserinkinase und die Threoninsynthase kodierende thrABC-Operon,

2. 6.2 das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende pyc- Gen,

3. 6.3 das für die Phosphoenolpyruvat-Synthase kodierende pps-Gen,

4. 6.4 das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxylase kodierende ppc-Gen,

5. 6.5 die für die Transhydrogenase kodierenden Gene pntA und pntB,

6. 6.6 das Homoserinresistenz vermittelnde Gen rhtB,

7. 6.7 das für die Malat:Chinon Oxidoreduktase kodierende mqo-Gen,

8. 6.8 das Threoninresistenz vermittelnde Gen rhtC,

9. 6.9 das für den Threoninexport-Protein kodierende thrE-Gen,

10. 6.10 das für die Glutamat-Dehydrogenase kodierende gdhA-Gen,

11. 6.11 das für das DNA-Bindeprotein HLP-II kodierende hns-Gen,

12. 6.12 das für die Phosphoglucomutase kodierende pgm- Gen,

13. 6.13 das für die Fructose Biphosphat Aldolase kodierende fba-Gen,

14. 6.14 das für die Phosphohistidin-Protein-Hexose- Phosphotransferase kodierende ptsH-Gen,

15. 6.15 das für das Enzym I des Phosphotransferase- Systems kodierende ptsI-Gen,

16. 6.16 das für die Glucose-spezifische IIA Komponente kodierende crr-Gen,

17. 6.17 das für die Glucose-spezifische IIBC Komponente kodierende ptsG-Gen,

18. 6.18 das für den Regulator des Leucin-Regulons kodierende lrp-Gen,

19. 6.19 das für den globalen Regulator Csr kodierende csrA-Gen,

20. 6.20 das für den Regulator des fad-Regulons kodierende fadR-Gen,

21. 6.21 das für den Regulator des zentralen Intermediärstoffwechsels kodierende iclR-Gen,

22. 6.22 das für das 10 Kd Chaperon kodierende mopB-Gen,

23. 6.23 das für die kleine Untereinheit der Alkyl Hydroperoxid Reduktase kodierende ahpC-Gen,

24. 6.24 das für die große Untereinheit der Alkyl Hydroperoxid Reduktase kodierende ahpF-Gen,

25. 6.25 das für die Cystein-Synthase A kodierende cysK- Gen,

26. 6.26 das für den Regulator des cys-Regulons kodierende cysB-Gen,

27. 6.27 das für das Flavoprotein der NADPH-Sulfit- Reduktase kodierende cysJ-Gen,

28. 6.28 das für das Hämoprotein der NADPH-Sulfit- Reduktase kodierende cysI-Gen, und

29. 6.29 das für die Adenylylsulfat-Reduktase kodierende cysH-Gen

verstärkt, insbesondere überexprimiert.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Herstellung von L-Aminosäuren Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae fermentiert, in denen man zusätzlich gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe:

1. 7.1 das für die Threonin-Dehydrogenase kodierende tdh-Gen,

2. 7.2 das für die Malat-Dehydrogenase kodierende mdh- Gen,

3. 7.3 das Genprodukt des offenen Leserahmens (orf) yjfA,

4. 7.4 das Genprodukt des offenen Leserahmens (orf) ytfP,

5. 7.5 das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende pckA-Gen,

6. 7.6 das für die Pyruvat-Oxidase kodierende poxB- Gen,

7. 7.7 das für die Isocitrat-Lyase kodierende aceA- Gen,

8. 7.8 das für den DgsA-Regulator des Phosphotransferase-Systems kodierende dgsA-Gen,

9. 7.9 das für den Fructose-Repressor kodierende fruR- Gen, und

10. 7.10 das für den Sigma³⁸-Faktor kodierende rpoS-Gen

abschwächt, insbesondere ausschaltet oder die Expression verringert.

8. Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, insbesondere der Gattung Escherichia, in denen das mglB-Gen oder dafür kodierende Nukleotidsequenzen verstärkt, insbesondere überexprimiert, vorliegt.