-
Gebiet der Erfindung
-
Diese
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren, ausgewählt aus
der Gruppe L-Valin, L-Homoserin, L-Lysin und L-Threonin, unter Verwendung
von Stämmen
der Familie Enterobacteriaceae, in denen das fadR-Gen überexprimiert
wird.
-
Stand der Technik
-
L-Aminosäuren, insbesondere
L-Threonin, finden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie,
in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung Anwendung.
-
Es
ist bekannt, dass L-Aminosäuren
durch Fermentation von Stämmen
der Enterobacteriaceae, insbesondere Escherichia coli (E. coli)
und Serratia marcescens, hergestellt werden. Wegen der grossen Bedeutung
wird ständig
an der Verbesserung des Herstellverfahrens gearbeitet. Verfahrensverbesserungen
können fermentationstechnische
Massnahmen, wie z. B. Rührung
und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien,
wie z. B. die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder
die Aufarbeitung zur Produktform, durch z. B. Ionenaustauschchromatographie,
oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus
selbst betreffen.
-
Zur
Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden
Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet.
Auf diese Weise erhält
man Stämme,
die resistent gegen Antimetabolite wie z. B. das Threonin-Analogon α-Amino-β-Hydroxyvaleriansäure (AHV)
oder auxotroph für
regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und L-Aminosäuren wie z. B. L-Threonin produzieren.
-
Seit
einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik
zur Stammverbesserung L-Aminosäuren produzierender
Stämme
der Familie Enterobacteriaceae eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene
amplifiziert und die Auswirkung auf die Produktion untersucht.
-
Aufgabe der Erfindung
-
Die
Erfinder haben sich die Aufgabe gestellt, neue Massnahmen zur verbesserten
fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, ausgewählt aus
der Gruppe L-Threonin,
L-Valin, L-Homoserin und L-Lysin bereitzustellen.
-
Kurze Darstellung der Erfindung
-
Gegenstand
der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung der
genannten L-Aminosäuren
unter Verwendung von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae,
die insbesondere bereits die genannten L-Aminosäuren produzieren, und in denen
das fadR-Gen oder für
das Genprodukt des genannten fadR-Gens kodierende Nukleotidsequenz(en) überexprimiert
wird (werden).
-
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
-
Werden
im folgenden L-Aminosäuren
oder Aminosäuren
erwähnt,
sind damit eine oder mehrere Aminosäuren einschliesslich ihrer
Salze, ausgewählt
aus der Gruppe L-Threonin, L-Valin, L-Homoserin, und L-Lysin gemeint.
Besonders bevorzugt ist L-Threonin.
-
Der
Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem
Zusammenhang die Erhöhung
der intrazellulären
Aktivität
eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus,
die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise
die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor
oder ein Gen oder Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym
bzw. Protein mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls
diese Massnahmen kombiniert.
-
Durch
die Massnahmen der Verstärkung,
insbesondere Überexpression,
wird die Aktivität
oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen um
mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder
500%, maximal bis 1000% oder 2000% bezogen auf die des Wildtyp-Proteins
beziehungsweise der Aktivität
oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus erhöht.
-
Die
Erfindung stellt ein zur Herstellung von L-Aminosäuren, ausgewählt aus
der Gruppe L-Threonin, L-Valin,
L-Homoserin und L-Lysin, bereit, bei dem man folgende Schritte durchführt:
- a) Fermentation von der die gewünschte L-Aminosäure produzierenden
Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen eine Überexprimierung
des fadR-Gens von Escherichia coli oder der für das fadR-Genprodukt kodierenden Nukleotidsequenzen
zu einer Erhöhung
der Aktivität
oder Konzentration des fadR-Proteins
um mindestens 10% bezogen auf die Aktivität oder Konzentration des Proteins
im Ausgangs-Mikroorganismus
führt,
- b) Anreicherung der gewünschten
L-Aminosäure
im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae
und
- c) Isolierung der gewünschten
L-Aminosäure
wobei gegebenenfalls Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder
die Biomasse in ihrer Gesamtheit oder Anteilen (> 0 bis 100%) davon im Produkt verbleiben.
-
Die
Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind,
können
die genannten L-Aminosäuren
aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, gegebenenfalls
Stärke,
gegebenenfalls Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen.
Es handelt sich um Vertreter der Familie Enterobacteriaceae, ausgewählt aus
den Gattungen Escherichia, Erwinia, Providencia und Serratia. Die
Gattungen Escherichia und Serratia werden bevorzugt. Bei der Gattung
Escherichia ist insbesondere die Art Escherichia coli und bei der
Gattung Serratia insbesondere die Art Serratia marcescens zu nennen.
-
Geeignete,
insbesondere L-Threonin produzierende Stämme der Gattung Escherichia,
insbesondere der Art Escherichia coli sind beispielsweise
Escherichia
coli TF427
Escherichia coli H4578
Escherichia coli KY10935
Escherichia
coli VNIIgenetika MG442
Escherichia coli VNIIgenetika M1
Escherichia
coli VNIIgenetika 472T23
Escherichia coli BKIIM B-3996
Escherichia
coli kat 13
Escherichia coli KCCM-10132.
-
Geeignete
L-Threonin produzierende Stämme
der Gattung Serratia, insbesondere der Art Serratia marcescens sind
beispielsweise
Serratia marcescens HNr21
Serratia marcescens
TLr156
Serratia marcescens T2000.
-
L-Threonin
produzierende Stämme
aus der Familie der Enterobacteriaceae besitzen bevorzugt, unter anderen,
ein oder mehrere der genetischen bzw. phänotypischen Merkmale ausgewählt aus
der Gruppe: Resistenz gegen α-Amino-β-hydroxyvaleriansäure, Resistenz
gegen Thialysin, Resistenz gegen Ethionin, Resistenz gegen α-Methylserin,
Resistenz gegen Diaminobernsteinsäure, Resistenz gegen α-Aminobuttersäure, Resistenz
gegen Borrelidin, Resistenz gegen Rifampicin, Resistenz gegen Valin-Analoga
wie beispielsweise Valinhydroxamat, Resistenz gegen Purinanaloga
wie beispielsweise 6-Dimethylaminopurin,
Bedürftigkeit
für L-Methionin,
gegebenenfalls partielle und kompensierbare Bedürftigkeit für L-Isoleucin, Bedürftigkeit
für meso-Diaminopimelinsäure, Auxotrophie
bezüglich
Threoninhaltiger Dipeptide, Resistenz gegen L-Threonin, Resistenz
gegen L-Homoserin, Resistenz gegen L-Lysin, Resistenz gegen L-Methionin,
Resistenz gegen L-Glutaminsäure, Resistenz
gegen L-Aspartat, Resistenz gegen L-Leucin, Resistenz gegen L-Phenylalanin,
Resistenz gegen L-Serin, Resistenz gegen L-Cystein, Resistenz gegen
L-Valin, Empfindlichkeit gegenüber
Fluorpyruvat, defekte Threonin-Dehydrogenase, gegebenenfalls Fähigkeit
zur Saccharose-Verwertung, Verstärkung des
Threonin-Operons, Verstärkung
der Homoserin-Dehydrogenase I-Aspartatkinase I, bevorzugt der feed back
resistenten Form, Verstärkung
der Homoserinkinase, Verstärkung
der Threoninsynthase, Verstärkung der
Aspartatkinase, gegebenenfalls der feed back resistenten Form, Verstärkung der
Aspartatsemialdehyd-Dehydrogenase, Verstärkung der Phosphoenolpyruvat-Carboxylase,
gegebenenfalls der feed back resistenten Form, Verstärkung der
Phosphoenolpyruvat-Synthase,
Verstärkung
der Transhydrogenase, Verstärkung
des RhtB-Genproduktes, Verstärkung
des RhtC-Genproduktes,
Verstärkung
des YfiK-Genproduktes, Verstärkung
einer Pyruvat-Carboxylase und Abschwächung der Essigsäurebildung.
-
Es
wurde gefunden, dass Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae
nach Überexpression
des fadR-Gens in verbesserter Weise die genannten L-Aminosäuren, insbesondere
L-Threonin produzieren.
-
Die
Nukleotidsequenzen der Gene von Escherichia coli gehören zum
Stand der Technik und können ebenfalls
der von Blattner et al. (Science 277, 1453–1462 (1997)) publizierten
Genomsequenz von Escherichia coli entnommen werden. iclR-Gen
(kein Teil der Erfindung)
| Bezeichnung: | Regulator
des zentralen Intermediärstoffwechsels,
Repressor des aceBA-Operons
(IclR) |
| Referenz: | Sunnarborg
et al.; Journal of Bacteriology 172(5), 2642–2649 (1990); Cortay et al.;
EMBO Journal 10(3), 675–679
(1991) |
| Accession
No.: | AE000475 |
fadR-Gen
| Bezeichnung: | Regulator
des Fettsäure-
und Acetatstoffwechsels (FadR), |
| Referenz: | DiRusso;
Nucleic Acids Research 16 (16), 7995–8009 (1988); Raman et al.;
Journal of Biological chemistry 272(49):30645–30650 (1997) |
| Accession
No.: | AE000217 |
| Alternative
Gennamen: | dec,
ole, thdB |
-
Die
Nukleinsäuresequenzen
können
den Datenbanken des National Center for Biotechnology Information
(NCBI), der National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA), der
Nukleotidsequenz-Datenbank der European Molecular Biology Laboratories
(EMBL, Heidelberg, Deutschland bzw. Cambridge, UK) oder der DNA
Datenbank von Japan (DDBJ, Mishima, Japan) entnommen werden.
-
Die
in den angegebenen Textstellen beschriebenen Gene können erfindungsgemäss verwendet
werden. Weiterhin können
Allele der Gene verwendet werden, die sich aus der Degeneriertheit
des genetischen Codes oder durch funktionsneutrale Sinnmutationen
("sense mutations") ergeben.
-
Zur
Erzielung einer Verstärkung
können
beispielsweise die Expression der Gene oder die katalytischen Eigenschaften
der Proteine erhöht
werden. Gegebenenfalls können
beide Massnahmen kombiniert werden.
-
Zur
Erzielung einer Überexpression
kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die
Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle,
die sich stromaufwärts des
Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken
Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut
werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich die Expression im Verlaufe
der fermentativen L-Threonin-Produktion zu steigern. Durch Massnahmen
zur Verlängerung
der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert.
Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls
die Enzymaktivität
verstärkt.
Die Gene oder Genkonstrukte können
entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen
oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann
weiterhin eine Überexpression
der betreffenden Gene durch Veränderung
der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.
-
Anleitungen
hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Chang und Cohen (Journal
of Bacteriology 134:1141–1156
(1978)), bei Hartley und Gregori (Gene 13:347–353 (1981)), bei Amann und
Brosius (Gene 40:183–190
(1985)), bei de Broer et al. (Proceedings of the National Academy
of Sciences of the United States of America 80:21–25 (1983)),
bei LaVallie et al. (BIO/TECHNOLOGY 11, 187–193 (1993)), in
PCT/US 97/13359 , bei Llosa et al.
(Plasmid 26:222–224
(1991)), bei Quandt und Klipp (Gene 80:161–169 (1989)), bei Hamilton
et al. (Journal of Bacteriology 171:4617–4622 (1989), bei Jensen und
Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191–195 (1998) und in bekannten
Lehrbüchern
der Genetik und Molekularbiologie.
-
In
Enterobacteriaceae replizierbare Plasmidvektoren wie z. B. von pACYC184
abgeleitete Kloniervektoren (Bartolomé et al.; Gene 102, 75–78 (1991)),
pTrc99A (Amann et al.; Gene 69:301–315 (1988)) oder pSC101-Derivate (Vocke und
Bastia, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America 80 (21):6557–6561
(1983)) können
verwendet werden. In einem erfindungsgemässen Verfahren kann man einen
mit einem Plasmidvektor transformierten Stamm einsetzen, wobei der
Plasmidvektor das fadR-Gen oder für das Genprodukt des genannten
fadR-Gens kodierende Nukleotidsequenzen trägt.
-
Es
ist ebenfalls möglich,
Mutationen, die die Expression der jeweiligen Gene betreffen, durch
Sequenzaustausch (Hamilton et al.; Journal of Bacteriology 171,
4617–4622
(1989)), Konjugation oder Transduktion in verschiedene Stämme zu überführen.
-
Weiterhin
kann es für
die Produktion der genannten L-Aminosäuren, insbesondere
L-Threonin, mit Stämmen
der Familie Enterobacteriaceae vorteilhaft sein, zusätzlich zur Überexpression
des fadR-Gens ein oder mehrere Enzyme des bekannten Threonin-Biosyntheseweges
oder Enzyme des anaplerotischen Stoffwechsels oder Enzyme für die Produktion
von reduziertem Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat oder Enzyme der
Glykolyse oder PTS-Enzyme oder Enzyme des Schwefelstoffwechsels
zu überexprimieren.
-
So
können
beispielsweise gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus
der Gruppe
- – das für die Aspartatkinase, die Homoserin-Dehydrogenase, die
Homoserinkinase und die Threoninsynthase kodierende thrABC-Operon
( US-A-4,278,765 ),
- – das
für die
Pyruvat-Carboxylase kodierende pyc-Gen aus Corynebacterium glutamicum
( WO 99/18228 ),
- – das
für die
Phosphoenolpyruvat-Synthase kodierende pps-Gen (Molecular and General
Genetics 231(2):332–336
(1992)),
- – das
für die
Phosphoenolpyruvat-Carboxylase kodierende ppc-Gen (Gene 31:279–283 (1984)),
- – die
für die
Transhydrogenase kodierenden Gene pntA und pntB (European Journal
of Biochemistry 158:647–653
(1986)),
- – das
Homoserinresistenz vermittelnde Gen rhtB ( EP-A-0 994 190 ),
- – das
für die
Malat:Chinon Oxidoreduktase kodierende mqo-Gen (Journal of Bacteriology
182:6892–6899 (2000)),
- – das
Threoninresistenz vermittelnde Gen rhtC ( EP-A-1 013 765 ),
- – das
für das
Threoninexportprotein kodierende thrE-Gen von Corynebacterium glutamicum ( EP-A-1 085 096 ),
- – das
für die
Glutamat-Dehydrogenase kodierende gdhA-Gen (Nucleic Acids Research
11:5257–5266 (1983);
Gene 23:199–209
(1983)),
- – das
für das
DNA-Bindeprotein HLP-II kodierende hns-Gen (Molecular and General
Genetics 212:199–202 (1988)),
- – das
für die
Phosphoglucomutase kodierende pgm-Gen (Journal of Bacteriology 176:5847–5851 (1994)),
- – das
für die
Fructose Biphosphat Aldolase kodierende fba-Gen (Biochemical Journal
257:529–534
(1989)),
- – das
für die
Phosphohistidin-Protein-Hexose-Phosphotransferase
des Phosphotransferase-Systems, PTS, kodierende ptsH-Gen des ptsHIcrr-Operons
(Journal of Biological Chemistry 262:16241–16253 (1987)),
-
Die
Erfindung stellt ein zur Herstellung von L-Aminosäuren, ausgewählt aus
der Gruppe L-Threonin, L-Valin,
L-Homoserin und L-Lysin, bereit, bei dem man folgende Schritte durchführt:
- a) Fermentation von der die gewünschte L-Aminosäure produzierenden
Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen eine Überexprimierung
des fadR-Gens von Escherichia coli oder der für das fadR-Genprodukt kodierenden
Nukleotidsequenzen zu einer Erhöhung
der Aktivität
oder Konzentration des fadR-Proteins um mindestens 10% bezogen auf
die Aktivität
oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus führt,
- – das
für das
Enzym I des Phosphotransferase-Systems,
PTS, kodierende ptsI-Gen des ptsHIcrr-Operons (Journal of Biological Chemistry
262:16241–16253
(1987)),
- – das
für die
Glucose-spezifische IIA Komponente des Phosphotransferase-Systems,
PTS, kodierende crr- Gen
des ptsHIcrr-Operons (Journal of Biological Chemistry 262:16241–16253 (1987)),
- – das
für die
Glucose-spezifische IIBC Komponente kodierende ptsG-Gen (Journal
of Biological Chemistry 261:16398–16403 (1986)),
- – das
für den
Regulator des Leucin-Regulons kodierende lrp-Gen (Journal of Biological
Chemistry 266:10768–10774
(1991)),
- – das
für das
10 kD Chaperon kodierende mopB-Gen (Journal of Biological Chemistry
261:12414–12419 (1986)),
das auch unter der Bezeichnung groES bekannt ist,
- – das
für die
kleine Untereinheit der Alkyl-Hydroperoxid-Reduktase
kodierende akpC-Gen des ahpCF-Operons (Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America 92:7617–7621 (1995))
- – das
für die
große
Untereinheit der Alkyl-Hydroperoxid-Reduktase
kodierende ahpF-Gen des ahpCF-Operons (Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America 92:7617–7621 (1995)),
- – das
für die
Cystein-Synthase A kodierende cysK-Gen (Journal of Bacteriology
170:3150–3157
(1988))
- – das
für den
Regulator des cys-Regulons kodierende cysB-Gen (Journal of Biological
Chemistry 262:5999–6005
(1987)),
- – das
für das
Flavoprotein der NADPH-Sulfit-Reduktase
kodierende cysJ-Gen des cysJIH-Operons (Journal of Biological Chemistry
264:15796–15808 (1989),
Journal of Biological Chemistry 264:15726–15737 (1989))
- – das
für das
Hämoprotein
der NADPH-Sulfit-Reduktase kodierende cysI-Gen des cysJIH-Operons
(Journal of Biological Chemistry 264:15796–15808 (1989), Journal of Biological
Chemistry 264:15726–15737 (1989)),
- – das
für die
Adenylylsulfat-Reduktase kodierende cysH-Gen des cysJIH-Operons
(Journal of Biological Chemistry 264:15796–15808 (1989), Journal of Biological
Chemistry 264:15726–15737
(1989)),
- – das
für den
positiven Regulator PhoB des pho-Regulons
kodierende phoB-Gen des phoBR-Operons (Journal of Molecular Biology
190(1):37–44
(1986)),
- – das
für das
Sensorprotein des pho-Regulons kodierende phoR-Gen des phoBR-Operons
(Journal of Molecular Biology 192(3):549–556 (1986)),
- – das
für Protein
E der äußeren Zellmembran
kodierende phoE-Gen (Journal of Molecular Biology 163(4):513–532 (1983)),
- – das
für das
periplasmatische Bindeprotein des Maltosetransports kodierende malE-Gen
(Journal of Biological Chemistry 259(16):10606–10613 (1984)),
- – das
für die
durch Fructose stimulierte Pyruvatkinase I kodierende pykF-Gen (Journal
of Bacteriology 177(19):5719–5722
(1995)),
- – das
für die
6-Phosphofructokinase II kodierende pfkB-Gen (Gene 28(3):337–342 (1984)),
- – das
für die
Transaldolase B kodierende talB-Gen (Journal of Bacteriology 177(20):5930–5936 (1995)),
- – das
für ein
Membranprotein mit Anti-SigmaE-Aktivität kodierende
rseA-Gen des rseABC-Operons (Molecular Microbiology 24(2):355–371 (1997)),
- – das
für einen
globalen Regulator des SigmaE-Faktors
kodierende rseC-Gen des rseABC-Operons (Molecular Microbiology 24(2):355–371 (1997)),
das für
die Superoxid-Dismutase kodierende sodA-Gen (Journal of Bacteriology 155(3):1078–1087 (1983)),
- – das
für die
Decarboxylase-Untereinheit der 2-Ketoglutarat-Dehydrogenase
kodierende sucA-Gen des sucABCD-Operons (European Journal of Biochemistry
141(2):351–359
(1984)),
- – das
für die
Dihydrolipolytranssuccinase-E2-Untereinheit
der 2-Ketoglutaratdehydrogenase kodierende sucB-Gen des sucABCD-Operons
(European Journal of Biochemistry 141(2):361–374 (1984)),
- – das
für die β-Untereinheit
der Succinyl-CoA-Synthetase
kodierende sucC-Gen des sucABCD-Operons (Biochemistry 24(22):6245–6252 (1985))
und
- – das
für die α-Untereinheit
der Succinyl-COA-Synthetase
kodierende sucD-Gen des sucABCD-Operons (Biochemistry 24(22):6245–6252 (1985)),
überexprimiert
werden.
-
Weiterhin
kann es für
die Produktion der genannten L-Aminosäuren, insbesondere
L-Threonin, vorteilhaft sein, zusätzlich zur Überexpression des fadR-Gens
eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe
- – das
für die
Threonin-Dehydrogenase kodierende tdh-Gen (Journal of Bacteriology 169, 4716–4721 (1987)),
- – das
für die
Malat-Dehydrogenase (E. C. 1.1.1.37) kodierende mdh-Gen (Archives
in Microbiology 149, 36–42
(1987)),
- – der
offene Leserahmen (orf) yjfA (Accession Number AAC77180 des National
Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA)),
- – der
offene Leserahmen (orf) ytfP (Accession Number AAC77179 des National
Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA)),
- – das
für das
Enzym Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende pckA-Gen (Journal
of Bacteriology 172, 7151–7156
(1990)),
- – das
für die
Pyruvat-Oxidase kodierende poxB-Gen (Nucleic Acids Research 14(13),
5449–5460
(1986)),
- – das
für das
Enzym Isocitrat-Lyase kodierende aceA-Gen (Journal of Bacteriology 170, 4528–4536 (1988)),
- – das
für den
DgsA-Regulator des Phosphotransferase-Systems kodierende dgsA-Gen (Bioscience,
Biotechnology and Biochemistry 59, 256–251 (1995)), das auch unter
der Bezeichnung mlc-Gen bekannt ist,
- – das
für den
Fructose-Repressor kodierende fruR-Gen (Molecular and General Genetics
226, 332–336 (1991)),
das auch unter der Bezeichnung cra-Gen bekannt ist,
- – das
für den
Sigma38-Faktor kodierende rpoS-Gen ( WO 01/05939 ), das auch
unter der Bezeichnung katF-Gen bekannt ist,
- – das
für die
Aspartatammonium-Lyase (Aspartase) kodierende aspA-Gen (Nucleic
Acids Research 13(6):2063–2074
(1985)) und
- – das
für die
Malat-Synthase A kodierende aceB-Gen (Nucleic Acids Research 16(19):9342
(1988))
abzuschwächen,
insbesondere auszuschalten oder die Expression zu verringern.
-
Der
Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem
Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines
oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die
entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen
schwachen Promotor oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes
Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende
Enzym (Protein) oder Gen inaktiviert und gegebenenfalls diese Massnahmen
kombiniert.
-
Durch
die Massnahmen der Abschwächung
wird die Aktivität
oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen auf
0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration
des Wildtyp-Proteins beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins
im Ausgangs-Mikroorganismus,
herabgesenkt.
-
Weiterhin
kann es für
die Produktion der genannten L-Aminosäuren, insbesondere
L-Threonin, vorteilhaft sein, zusätzlich zur Überexpression des fadR-Gens unerwünschte Nebenreaktionen
auszuschalten (Nakayama: "Breeding
of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products,
Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).
-
Die
erfindungsgemäss
hergestellten Mikroorganismen können
im batch-Verfahren, im fed batch oder im repeated fed batch-Verfahren
kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden
ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in
die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))
oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg
Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) zu finden.
-
Das
zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der
jeweiligen Stämme
genügen.
Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind
im Handbuch "Manual of
Methods for General Bacteriology" der
American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.
-
Als
Kohlenstoffquelle können
Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose,
Fructose, Maltose, Melasse, Stärke
und gegebenenfalls Cellulose, Öle
und Fette wie z. B. Sojaöl,
Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett,
Fettsäuren
wie z. B. Palmitinsäure,
Stearinsäure
und Linolsäure,
Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie
z. B. Essigsäure
verwendet werden. Diese Stoffe können
einzeln oder als Mischung verwendet werden.
-
Als
Stickstoffquelle können
organische Stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt,
Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder
anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat,
Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden.
-
Die
Stickstoffquellen können
einzeln oder als Mischung verwendet werden.
-
Als
Phosphorquelle können
Phosphorsäure,
Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die
entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium
muss weiterhin Salze von Metallen enthalten, wie z. B. Magnesiumsulfat
oder Eisensulfat, die für
das Wachstum notwendig sind. Schliesslich können auch essentielle Wuchsstoffe
wie Aminosäuren
und Vitamine zusätzlich
zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium
können überdies
geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe
können
zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in
geeigneter Weise während
der Kultivierung zugefüttert
werden.
-
Zur
pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid,
Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen
wie Phosphorsäure
oder Schwefelsäure
in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung
können
Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester
eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden
können
dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z. B. Antibiotika
hinzugefügt
werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff
oder sauerstoffhaltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur
eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 25°C bis 45°C und vorzugsweise
bei 30°C
bis 40°C.
Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum an L-Aminosäuren bzw.
L-Threonin gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb
von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
-
Die
Analyse von L-Aminosäuren
kann durch Anionenaustauschchromatographie mit anschliessender Ninhydrin- Derivatisierung erfolgen,
so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, 1190–1206 (1958)) beschrieben,
oder sie kann durch reversed Phase HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth
et al. (Analytical Chemistry 51:1167–1174 (1979)) beschrieben.
-
Das
erfindungsgemässe
Verfahren dient zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, ausgewählt aus
der gruppe L-Threonin, L-Valin, L-Homoserin und L-Lysin, insbesondere
L-Threonin.
-
Die
vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen
näher erläutert.
-
Das
verwendete Minimal-(M9) bzw. Vollmedium (LB) für Escherichia coli ist von
J. H. Miller (A Short Course in Bacterial Genetics (1992), Cold
Spring Harbor Laboratory Press) beschrieben. Die Isolierung von Plasmid-DNA
aus Escherichia coli sowie alle Techniken in Verbindung mit Restriktion,
Ligation sowie Behandlung mit Klenow und alkalischer Phosphatase
wurden nach dem Verfahren von Sambrook et al. (Molecular Cloning – A Laboratory
Manual. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press) durchgeführt. Die
Transformation von Escherichia coli wurde, wenn nicht anders angegeben,
nach dem Verfahren von Chung et al. (Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America (1989) 86:2172–2175) durchgeführt.
-
Die
Inkubationstemperatur für
die Herstellung von Stämmen
und Transformanten liegt bei 37°C.
-
Beispiel 1
-
Herstellung von L-Threonin unter Verwendung
des fadR-Gens
-
1a) Konstruktion des Expressionsplasmids
pTrc99AfadR
-
Das
fadR-Gen aus E. coli K12 wird unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion
(PCR) sowie synthetischer Oligonukleotide amplifiziert. Ausgehend
von der Nukleotidsequenz des fadR-Gens in E. coli K12 MG1655 (Accession
Number AE000217, Blattner et al. (Science 277:1453–1462 (1997))
werden PCR-Primer synthetisiert (MWG Biotech, Ebersberg, Deutschland).
Die Sequenzen der Primer werden dabei so modifiziert, daß Erkennungsstellen
für Restriktionsenzyme
entstehen. Die Erkennungssequenz für XbaI wird für den Primer
fadR3 und die Erkennungssequenz für HindIII für den Primer fadR4 gewählt, wobei
diese Sequenzen zur Kennzeichnung in den unten dargestellten Nukleotidsequenzen
jeweils unterstrichen sind:
-
-
-
Die
für die
PCR eingesetzte chromosomale DNA von E. coli K12 MG1655 wird nach
Herstellerangaben mit "Qiagen
Genomic-tips 100/G" (QIAGEN,
Hilden, Deutschland) isoliert. Ein ungefähr 800 Bp großes DNA-Fragment
lässt sich
mit den spezifischen Primern unter Standard-PCR-Bedingungen (Innis et al. (1990) PCR
Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press)
mit Pfu-DNA-Polymerase
(Promega Corporation, Madison, USA) amplifizieren. Das PCR-Produkt
wird mit dem Vektor pCR-Blunt
II-TOPO (Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, Invitrogen, Groningen,
Niederlande) nach den Anweisungen des Herstellers ligiert und in
den Stamm E. coli TOP10 transformiert. Die Selektion plasmidhaltiger
Zellen erfolgt auf LB-Agar, der mit 50 μg/ml Kanamycin versetzt wurde.
Nach Plasmid-DNA-Isolierung wird der Vektor pCR-Blunt II-TOPO-fadR
mit den Restriktionsenzymen HindIII und XbaI geschnitten, und nach
Trennung in einem 0,8%-igen Agarosegel wird das fadR-Fragment mit
Hilfe des QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert.
Der Vektor pTrc99A (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) wird mit
den Enzymen HindIII und XbaI geschnitten und mit dem isolierten
fadR-Fragment ligiert. Der E. coli-Stamm XL1-Blue MRF' (Stratagene, La Jolla,
USA) wird mit dem Ligationsansatz transformiert, und plasmidhaltige
Zellen werden auf LB-Agar, der mit 50 μg/ml Ampicillin versetzt wurde,
selektioniert. Die erfolgreiche Klonierung kann nach Plasmid-DNA-Isolierung
durch Kontrollspaltung mit den Enzymen AccI, HincII und SspI überprüft werden.
Das Plasmid erhält
die Bezeichnung pTrc99AfadR (1).
-
1b) Herstellung von L-Threonin mit dem
Stamm MG442/pTrc99AfadR
-
Der
L-Threonin produzierende E. coli-Stamm MG442 ist in der Patentschrift
US-A-4,278,765 beschrieben
und wurde bei der Russian National Collection of Industrial Microorganisms
(VKPM, Moskau, Russland) als CMIM B-1628 hinterlegt.
-
Der
Stamm MG442 wird mit dem in Beispiel 1a beschriebenen Expressionsplasmid
pTrc99AfadR sowie mit dem Vektor pTrc99A transformiert, und plasmidhaltige
Zellen werden auf LB-Agar mit 50 μg/ml
Ampicillin selektioniert. Auf diese Weise erhält man die Stämme MG442/pTrc99AfadR
und MG442/pTrc99A. Ausgewählte
Einzelkolonien werden anschließend
auf Minimalmedium mit der folgenden Zusammensetzung weiter vermehrt:
3,5 g/l Na2HPO4·2H2O,
1,5 g/l KH2PO4, 1 g/l NH4Cl, 0,1 g/l MgSO4·7H2O, 2 g/l Glucose, 20 g/l Agar,
50 mg/l Ampicillin. Die Bildung von L-Threonin wird in Batch-Kulturen von 10 ml,
die in 100-ml-Erlenmeyerkolben angesetzt werden, überprüft. Hierzu
werden jeweils 10 ml Vorkulturmedium in der folgenden Zusammensetzung
beimpft: 2 g/l Hefeextrakt, 10 g/l (NH4)2SO4, 1 g/l KH2PO4, 0,5
g/l MgSO4·7H2O,
15 g/l CaCO3, 20 g/l Glucose, 50 mg/l Ampicillin; der Ansatz wird
dann 16 Stunden bei 37°C
und 180 UpM auf einem ESR-Inkubator der Firma Kühner AG (Birsfelden, Schweiz)
inkubiert.
-
Je
250 μl dieser
Vorkulturen werden dann in 10 ml Produktionsmedium (25 g/l (NH4)2SO4,
2 g/l KH2PO4, 1 g/l MgSO4·7H2O,
0,03 g/l FeSO4·7H2O,
0,018 g/l MnSO4·1H2O,
30 g/l CaCO3, 20 g/l Glucose, 50 mg/l Ampicillin) überimpft,
und der Ansatz wird 48 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Bildung von
L-Threonin durch den Ausgangsstamm MG442 wird in gleicher Weise überprüft, wobei
jedoch keine Zugabe von Ampicillin zum Medium erfolgt. Nach der
Inkubation wird die optische Dichte (OD) der Kultursuspension mit
einem LP2W-Photometer der Firma Dr. Lange (Düsseldorf, Deutschland) bei
einer Messwellenlänge
von 660 nm bestimmt.
-
Anschließend wird
die Konzentration an gebildetem L-Threonin im steril filtrierten
Kulturüberstand
mit einem Aminosäureanalysator
der Firma Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) mittels Ionenaustauschchromatographie
und Nachsäulenreaktion
mit Ninhydrinnachweis bestimmt.
-
In
Tabelle 1 ist das Ergebnis des Versuchs dargestellt. Tabelle 1
| Stamm | OD
(600 nm) | L-Threonin
(g/l) |
| MG442 | 5,6 | 1,4 |
| MG442/pTrc99A | 3,8 | 1,3 |
| MG442/pTrc99AfadR | 4,0 | 1,6 |
-
Kurze Beschreibung der Figur:
-
1:
Karte des das fadR-Gen enthaltenden Plasmids pTrc99AfadR
-
Längenangaben
sind als ungefähre
Werte aufzufassen. Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben
die folgende Bedeutung:
| • Amp: | Ampicillinresistenz-Gen |
| • lacI: | Gen
für das
Repressorprotein des trc-Promotors |
| • Ptrc: | trc-Promotorbereich,
IPTG-induzierbar |
| • fadR: | Kodierender
Bereich des fadR-Gens |
| • 5S: | 5S-rRNA-Bereich |
| • rrnBT: | rRNA-Terminatorbereich |
-
Die
Abkürzungen
für die
Restriktionsenzyme haben die folgende Bedeutung:
| • AccI: | Restriktionsendonuklease
aus Acinetobacter calcoaceticus |
| • HincII: | Restriktionsendonuklease
aus Haemophilus influenzae Rc |
| • HindIII: | Restriktionsendonuklease
aus Haemophilus influenzae |
| • SspI: | Restriktionsendonuklease
aus Sphaerotilus species ATCC 13925 |
| • XbaI: | Restriktionsendonuklease
aus Xanthomonas campestris |
SEQUENZPROTOKOLL
