DE10132945A1 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae - Google Patents
Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie EnterobacteriaceaeInfo
- Publication number
- DE10132945A1 DE10132945A1 DE10132945A DE10132945A DE10132945A1 DE 10132945 A1 DE10132945 A1 DE 10132945A1 DE 10132945 A DE10132945 A DE 10132945A DE 10132945 A DE10132945 A DE 10132945A DE 10132945 A1 DE10132945 A1 DE 10132945A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- gene
- gene coding
- threonine
- coding
- amino acids
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, in dem man folgende Schritte durchführt: DOLLAR A a) Fementation der die gewünschte L-Aminosäure produzierenden Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen man eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe dps, hns, lrp, pgm, fba, ptsG, ptsH, ptsI, crr, mopB, ahpC und ahpF oder dafür kodierende Nukleotidsequenzen abschwächt, insbesondere ausschaltet, DOLLAR A b) Anreicherung der L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Bakterien, und DOLLAR A c) Isolierung der L-Aminosäure.
Description
- Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae, in denen mindestens eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe dps, hns, lrp, pgm, fba, ptsG, ptsH, ptsI, crr, mopB, ahpC und ahpF, abgeschwächt wird (werden).
- L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, finden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung Anwendung.
- Es ist bekannt L-Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen der Enterobacteriaceae, insbesondere Escherichia coli (E. coli) und Serratia marcescens, herzustellen. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen, wie z. B. Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien wie z. B. die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform, durch z. B. Ionenaustauschchromatographie, oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.
- Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite wie z. B. das Threonin-Analogon α-Amino-β-Hydroxyvaleriansäure (AHV) oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und L-Aminosäuren wie z. B. L-Threonin produzieren.
- Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung L-Aminosäuren produzierender Stämme der Familie Enterobacteriaceae eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die Produktion untersucht.
- Die Erfinder haben sich die Aufgabe gestellt, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, bereitzustellen.
- Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, unter Verwendung von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, die insbesondere bereits L-Aminosäuren produzieren, und in denen mindestens eine oder mehrere der für die Gene dps, hns, lrp, pgm, fba, ptsG, ptsH, ptsI, crr, mopB, ahpC und ahpF kodierende(n) Nukleotidsequenz(en) abgeschwächt wird (werden).
- Werden im folgenden L-Aminosäuren oder Aminosäuren erwähnt, sind damit eine oder mehrere Aminosäuren einschließlich ihrer Salze, ausgewählt aus der Gruppe L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan und L-Arginin gemeint. Besonders bevorzugt ist L-Threonin.
- Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Enzym (Protein) oder Gen inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
- Durch die Maßnahmen der Abschwächung wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen auf 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration des Wildtyp- Proteins, beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus, herabgesenkt.
- Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte durchführt:
- a) Fermentation von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen mindestens eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe dps, hns, lrp, pgm, fba, ptsG, ptsH, ptsI, crr, mopB, ahpC und ahpF, abgeschwächt wird (werden),
- b) Anreicherung der entsprechenden L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, und
- c) Isolierung der gewünschten L-Aminosäure wobei gegebenenfalls Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder die Biomasse in ihrer Gesamtheit oder Anteilen (> 0 bis 100%) davon im Produkt verbleiben.
- Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können L-Aminosäuren aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, gegebenenfalls Stärke, gegebenenfalls Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es handelt sich um Vertreter der Familie Enterobacteriaceae, ausgewählt aus den Gattungen Escherichia, Erwinia, Providencia und Serratia. Die Gattungen Escherichia und Serratia werden bevorzugt. Bei der Gattung Escherichia ist insbesondere die Art Escherichia coli und bei der Gattung Serratia insbesondere die Art Serratia marcescens zu nennen.
- Geeignete, insbesondere L-Threonin produzierende Stämme der Gattung Escherichia, insbesondere der Art Escherichia coli sind beispielsweise
Escherichia coli TF427
Escherichia coli H4578
Escherichia coli KY10935
Escherichia coli VNIIgenetika MG442
Escherichia coli VNIIgenetika M1
Escherichia coli VNIIgenetika 472T23
Escherichia coli BKIIM B-3996
Escherichia coli kat 13
Escherichia coli KCCM-10132. - Geeignete L-Threonin produzierende Stämme der Gattung Serratia, insbesondere der Art Serratia marcescens sind beispielsweise
Serratia marcescens HNr21
Serratia marcescens TLr156
Serratia marcescens T2000. - L-Threonin produzierende Stämme aus der Familie der Enterobacteriaceae besitzen bevorzugt, unter anderen, ein oder mehrere der genetischen bzw. phänotypischen Merkmale ausgewählt aus der Gruppe: Resistenz gegen α-Amino-β- Hydroxyvaleriansäure, Resistenz gegen Thialysin, Resistenz gegen Ethionin, Resistenz gegen α-Methylserin, Resistenz gegen Diaminobernsteinsäure, Resistenz gegen α-Aminobuttersäure, Resistenz gegen Borrelidin, Resistenz gegen Rifampicin, Resistenz gegen Valin-Analoga wie beispielsweise Valinhydroxamat, Resistenz gegen Purinanaloga wie beispielsweise 6-Dimethylaminopurin, Bedürftigkeit für L-Methionin, gegebenenfalls partielle und kompensierbare Bedürftigkeit für L-Isoleucin, Bedürftigkeit für meso-Diaminopimelinsäure, Auxotrophie bezüglich Threonin-haltiger Dipeptide, Resistenz gegen L-Threonin, Resistenz gegen L-Homoserin, Resistenz gegen L-Lysin, Resistenz gegen L-Methionin, Resistenz gegen L-Glutaminsäure, Resistenz gegen L-Aspartat, Resistenz gegen L-Leucin, Resistenz gegen L-Phenylalanin, Resistenz gegen L-Serin, Resistenz gegen L-Cystein, Resistenz gegen L-Valin, Empfindlichkeit gegenüber Fluoropyruvat, defekte Threonin-Dehydrogenase, gegebenenfalls Fähigkeit zur Saccharose-Verwertung, Verstärkung des Threonin-Operons, Verstärkung der Homoserin-Dehydrogenase I-Aspartatkinase I bevorzugt der feed back resistenten Form, Verstärkung der Homoserinkinase, Verstärkung der Threoninsynthase, Verstärkung der Aspartatkinase, gegebenenfalls der feed back resistenten Form, Verstärkung der Aspartatsemialdehyd- Dehydrogenase, Verstärkung der Phosphoenolpyruvat- Carboxylase, gegebenenfalls der feed back resistenten Form, Verstärkung der Phosphoenolpyruvat-Synthase, Verstärkung der Transhydrogenase, Verstärkung des RhtB-Genproduktes, Verstärkung des RhtC-Genproduktes, Verstärkung des YfiK- Genproduktes, Verstärkung einer Pyruvat-Carboxylase, und Abschwächung der Essigsäurebildung.
- Es wurde gefunden, daß Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae nach Abschwächung, insbesondere Ausschaltung mindestens eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe dps, hns, lrp, pgm, fba, ptsG, ptsH, ptsI, crr, mopB, ahpC und ahpF, in verbesserter Weise L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin produzieren.
- Die Nukleotidsequenzen der Gene von Escherichia coli gehören zum Stand der Technik und können ebenfalls der von Blattner et al. (Science 277, 1453-1462 (1997)) publizierten Genomsequenz von Escherichia coli entnommen werden.
dps-Gen:
Bezeichnung:
Globaler Regulator, Hungerbedingungen, DNA Bindeprotein
Referenz:
Almiron et al.; Genes & Development 6(12B), 2646-54 (1992)
Accession No.:
AE000183
Alternative Gennamen:
pexB, vtm
hns-Gen:
Bezeichnung:
DNA-Bindeprotein HLP-II (HU, BH2, HD, NS); Pleiotroper Regulator (Histon-artiges Protein)
Referenz:
Pon et al.; Molecular and General Genetics 212(2), 199-202 (1988)
Accession No.:
AE000222
Alternative Gennamen:
bglY, cur, drc, drdX, drs, fimG, mysA, osmZ, pilG, topX, virR
lrp-Gen:
Bezeichnung:
Regulator für das Leucin-Regulon und hochaffine Transportsysteme verzweigtkettiger Aminosäuren (leucine-responsive regulatory protein)
Referenz:
Willins et al.; Journal of Biological Chemistry 266(17), 10768-74 (1991)
Accession No.:
AE000191
Alternative Gennamen:
ihb, livR, lss, lstR, oppl, rblA, mbf
pgm-Gen:
Bezeichnung:
Phosphoglucomutase
EC-Nr.:
5.4.2.2
Referenz:
Lu und Kleckner, Journal of Bacteriology 176: 5847-5851 (1994)
Accession No.:
AE000172
fba-Gen:
Bezeichnung:
Fructose Bisphosphat Aldolase (Klasse II)
EC-Nr.:
4.1.2.13
Referenz:
Alefounder et al., Biochemical Journal 257: 529-34 (1989)
Accession No.:
AE000376
Alternative Gennamen:
fda, ald
ptsG-Gen:
Bezeichnung:
PTS System, Glucose-spezifische IIBC- Komponente
Referenz:
Erni und Zanolari; Journal of Biological Chemistry 261(35), 16398-403 (1986)
Accession No.:
AE000210
Alternative Gennamen:
CR, car, cat, gpt, umg
ptsH-Gen:
Bezeichnung:
PTS-System, Phosphohistidin-Protein-Hexose Phosphotransferase
EC-Nr.:
2.7.1.69
Referenz:
Saffen et al.; Journal of Biological Chemistry 262(33), 16241-53 (1987)
Accession No.:
AE000329
Alternative Gennamen:
ctr, hpr
ptsI-Gen:
Bezeichnung:
PEP-Protein PTS Enzym I
EC-Nr.:
2.7.3.9
Referenz:
Saffen et al.; Journal of Biological Chemistry 262(33), 16241-53 (1987)
Accession No.:
AE000329
Alternative Gennamen:
ctr
crr-Gen:
Bezeichnung:
PTS System, Glucose-spezifische IIA Komponente (Phosphocarrier Protein für Glucose)
Referenz:
Saffen et al.; Journal of Biological Chemistry 262(33), 16241-53 (1987)
Accession No.:
AE000329
Alternative Gennamen:
gsr, iex, tgs, tre
mopB-Gen:
Bezeichnung:
GroES, 10 Kd Chaperon, bindet an Hsp60 in Gegenwart von Mg-ATP, suppremiert die ATPase-Aktivität
Referenz:
Chandrasekhar et al.; Journal of Biological Chemistry 261(26), 12414-9 (1986)
Accession No.:
AE000487
Alternative Gennamen:
groE, groES, hdh, tabB
ahpC-Gen:
Bezeichnung:
Alkyl Hydroperoxid Reductase, C22 Untereinheit; Detoxifizierung von Hydroperoxiden
EC-Nr.:
1.6.4.-
Referenz:
Ferrante et al.; Proceedings of the National Acadamy of Sciences USA 92(17): 7617-21 (1995)
Accession No.:
AE000166
ahpF-Gen:
Bezeichnung:
Alkyl Hydroperoxid Reductase, F52a Untereinheit; Detoxifizierung von Hydroperoxiden
Referenz:
Ferrante et al.; Proceedings of the National Acadamy of Sciences USA 92(17): 7617-21 (1995)
Accession No.:
AE000166 - Die Nukleinsäuresequenzen können den Datenbanken des National Center for Biotechnology Information (NCBI) der National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA), der Nukleotidsequenz-Datenbank der European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Deutschland bzw. Cambridge, UK) oder der DNA Datenbank von Japan (DDBJ, Mishima, Japan) entnommen werden.
- Die in den angegebenen Textstellen beschriebenen Gene können erfindungsgemäß verwendet werden. Weiterhin können Allele der Gene verwendet werden, die sich aus der Degeneriertheit des genetischen Codes oder durch funktionsneutrale Sinnmutationen ("sense mutations") ergeben.
- Zur Erzielung einer Abschwächung können beispielsweise die Expression der Gene oder die katalytischen Eigenschaften der Enzymproteine herabgesetzt bzw. ausgeschaltet werden. Gegebenenfalls können beide Maßnahmen kombiniert werden.
- Die Verringerung der Genexpression kann durch geeignete Kulturführung, durch genetische Veränderung (Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression oder auch durch Antisense-RNA Technik erfolgen. Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann unter anderem beispielsweise bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191-195 (1998)), bei Carrier und Keasling (Biotechnology Progress 15, 58-64 (1999)), Franch und Gerdes (Current Opinion in Microbiology 3, 159-164 (2000)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie beispielsweise dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990).
- Mutationen, die zu einer Veränderung bzw. Herabsetzung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind aus dem Stand der Technik bekannt. Als Beispiele seien die Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Yano et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95, 5511-5515 (1998)), Wente und Schachmann (Journal of Biological Chemistry 266, 20833-20839 (1991)) genannt. Zusammenfassende Darstellungen können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
- Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen in Betracht. In Abhängigkeit von der Wirkung des Aminosäureaustausches auf die Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen ("missense mutations") oder Nichtsinnmutationen ("nonsense mutations") gesprochen. Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar in einem Gen führen zu Rasterverschiebungsmutationen ("frame shift mutations"), die dazu führen, daß falsche Aminosäuren eingebaut werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Entsteht als Folge der Mutation ein Stop-Kodon im Kodierbereich, so führt dies ebenfalls zu einem vorzeitigen Abbruch der Translation. Deletionen von mehreren Kodonen führen typischerweise zu einem vollständigen Ausfall der Enzymaktivität. Anleitungen zur Erzeugung derartiger Mutationen gehören zum Stand der Technik und können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
- Geeignete Mutationen in den Genen wie beispielsweise Deletionsmutationen können durch Gen- bzw. Allelaustausch in geeignete Stämme eingebaut werden.
- Eine gebräuchliche Methode ist die von Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 174, 4617-4622 (1989)) beschriebene Methode des Genaustauschs mit Hilfe eines konditional replizierenden pSC101-Derivates pMAK705. Andere im Stand der Technik beschriebene Methoden wie beispielsweise die von Martinez-Morales et al. (Journal of Bacteriology 1999, 7143-7148 (1999)) oder die von Boyd et al. (Journal of Bacteriology 182, 842-847 (2000)) können gleichfalls benutzt werden.
- Es ist ebenfalls möglich, Mutationen in den jeweiligen Genen oder Mutationen, die die Expression der jeweiligen Gene betreffen, durch Konjugation oder Transduktion in verschiedene Stämme zu überführen.
- Weiterhin kann es für die Produktion von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin mit Stämmen der Familie Enterobacteriaceae vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe dps, hns, lrp, pgm, fba, ptsG, ptsH, ptsI, crr, mopB, ahpC und ahpF, ein oder mehrere Enzyme des bekannten Threonin-Biosyntheseweges oder Enzym(e) des anaplerotischen Stoffwechsels oder Enzyme für die Produktion von reduziertem Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat zu verstärken.
- Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor oder ein Gen verwendet, das für ein entsprechendes Enzym bzw. Protein mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
- Durch die Maßnahmen der Verstärkung, insbesondere Überexpression, wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500%, maximal bis 1000% oder 2000% bezogen auf die des Wildtyp- Proteins beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus erhöht.
- So können beispielsweise gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe
- - das für die Aspartatkinase, die Homoserin-Dehydrogenase, die Homoserinkinase und die Threoninsynthase kodierende thrABC-Operon (US-A-4,278,765),
- - das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende pyc-Gen (DE-A-198 31 609),
- - das für die Phosphoenolpyruvat-Synthase kodierende pps- Gen (Molecular and General Genetics 231: 332 (1992)),
- - das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxylase kodierende ppc-Gen (Gene 31: 279-283 (1984)),
- - die für die Transhydrogenase kodierenden Gene pntA und pntB (European Journal of Biochemistry 158: 647-653 (1986)),
- - das Homoserinresistenz vermittelnde Gen rhtB (EP-A-0 994 190),
- - das für die Malat : Chinon Oxidoreduktase kodierende mqo- Gen (DE 100 34 833.5),
- - das Threoninresistenz vermittelnde Gen rhtC (EP-A-1 013 765),
- - das für den Threoninexport kodierende thrE-Gen von Corynebacterium glutamicum (DE 100 26 494.8), und
- - das für die Glutamat-Dehydrogenase kodierende gdhA-Gen (Nucleic Acids Research 11: 5257-5266 (1983); Gene 23: 199-209 (1983))
- Weiterhin kann es für die Produktion von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe dps, hns, lrp, pgm, fba, ptsG, ptsH, ptsI, crr, mopB, ahpC und ahpF, eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe
- - das für die Threonin-Dehydrogenase kodierende tdh-Gen (Ravnikar und Somerville, Journal of Bacteriology 169, 4716-4721 (1987)),
- - das für die Malat-Dehydrogenase (E. C. 1.1.1.37) kodierende mdh-Gen (Vogel et al., Archives in Microbiology 149, 36-42 (1987)),
- - das Genprodukt des offenen Leserahmens (orf) yjfA (Accession Number AAC77180 des National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA),
- - das Genprodukt des offenen Leserahmens (orf) ytfP (Accession Number AAC77179 des National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA),
- - das für das Enzym Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende pckA-Gen (Medina et al. (Journal of Bacteriology 172, 7151-7156 (1990)),
- - das für die Pyruvat-Oxidase kodierende poxB-Gen (Grabau und Cronan (Nucleic Acids Research 14 (13), 5449-5460 (1986)),
- - das für das Enzym Isocitrat-Lyase kodierende aceA-Gen (Matsuoko und McFadden, Journal of Bacteriology 170, 4528-4536 (1988)),
- - das für den DgsA-Regulator des Phosphotransferase- Systems kodierende dgsA-Gen (Hosono et al., Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 59, 256-251 (1995)), das auch unter der Bezeichnung mlc-Gen bekannt ist, und
- - das für den Fructose-Repressor kodierende fruR-Gen (Jahreis et al., Molecular and General Genetics 226, 332-336 (1991)), das auch unter der Bezeichnung cra-Gen bekannt ist,
- Weiterhin kann es für die Produktion von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe dps, hns, lrp, pgm, fba, ptsG, ptsH, ptsl, crr, mopB, ahpC und ahpF, unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).
- Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können im batch-Verfahren (Satzkultivierung), im fed batch (Zulaufverfahren) oder im repeated fed batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
- Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.
- Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und gegebenenfalls Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
- Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
- Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten, wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.
- Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff-haltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 25°C bis 45°C und vorzugsweise bei 30°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum an L-Aminosäuren bzw. L-Threonin gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
- Die Analyse von L-Aminosäuren kann durch Anionenaustauschchromatographie mit anschließender Ninhydrin-Derivatisierung erfolgen, so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) beschrieben.
- Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, wie beispielsweise L-Threonin, L-Isoleucin, L-Valin, L-Methionin, L-Homoserin und L-Lysin, insbesondere L-Threonin.
Claims (7)
1. Verfahren zur fermentativen Herstellung von
L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, dadurch
gekennzeichnet, daß man folgende Schritte
durchführt:
a) Fermentation der die gewünschte L-Aminosäure
produzierenden Mikroorganismen der Familie
Enterobacteriaceae, in denen man eines oder mehrere
der Gene, ausgewählt aus der Gruppe dps, hns, lrp,
pgm, fba, ptsG, ptsH, ptsI, crr, mopB, ahpC und
ahpF, oder dafür kodierende Nukleotidsequenzen
abschwächt, insbesondere ausschaltet,
b) Anreicherung der gewünschten L-Aminosäure im Medium
oder in den Zellen der Mikroorganismen, und
c) Isolierung der gewünschten L-Aminosäure wobei
gegebenenfalls Bestandteile der Fermentationsbrühe
und/oder die Biomasse in ihrer Gesamtheit oder
Anteilen (> 0 bis 100%) davon im Produkt
verbleiben.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen
einsetzt, in denen man zusätzlich weitere Gene des
Biosyntheseweges der gewünschten L-Aminosäure
verstärkt.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen
einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest
teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung der
gewünschten L-Aminosäure verringern.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß man die Expression des
(der) Polynukleotides(e), das (die) für eines oder
mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe dps, hns,
lrp, pgm, fba, ptsG, ptsH, ptsI, crr, mopB, ahpC und
ahpF, kodiert (kodieren) abschwächt, insbesondere
ausschaltet.
5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß man die
regulatorischen und/oder katalytischen Eigenschaften
der Polypeptide (Proteine) verringert, für die die
Polynukleotide dps, hns, lrp, pgm, fba, ptsG, ptsH,
ptsI, crr, mopB, ahpC, und ahpF kodieren.
6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß man zur Herstellung
von L-Aminosäuren Mikroorganismen der Familie
Enterobacteriaceae fermentiert, in denen man zusätzlich
gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt
aus der Gruppe:
verstärkt, insbesondere überexprimiert.
1. 6.1 das für die Aspartatkinase, die Homoserin-
Dehydrogenase, die Homoserinkinase und die
Threoninsynthase kodierende thrABC-Operon,
2. 6.2 das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende pyc-
Gen,
3. 6.3 das für die Phosphoenolpyruvat-Synthase
kodierende pps-Gen,
4. 6.4 das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxylase
kodierende ppc-Gen,
5. 6.5 die für die Transhydrogenase kodierenden Gene
pntA und pntB,
6. 6.6 das Homoserinresistenz vermittelnde Gen rhtB,
7. 6.7 das für die Malat : Chinon Oxidoreduktase
kodierende mqo-Gen,
8. 6.8 das Threoninresistenz vermittelnde Gen rhtc,
9. 6.9 das für den Threoninexport kodierende thrE-Gen,
und
10. 6.10 das für die Glutamat-Dehydrogenase kodierende
gdhA-Gen
7. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß man zur Herstellung
von L-Aminosäuren Mikroorganismen der Familie
Enterobacteriaceae fermentiert, in denen man zusätzlich
gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt
aus der Gruppe:
abschwächt, insbesondere ausschaltet oder die
Expression verringert.
1. 7.1 das für die Threonin-Dehydrogenase kodierende
tdh-Gen,
2. 7.2 das für die Malat-Dehydrogenase kodierende mdh-
Gen,
3. 7.3 das Genprodukt des offenen Leserahmens (orf)
yjfA,
4. 7.4 das Genprodukt des offenen Leserahmens (orf)
ytfP,
5. 7.5 das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase
kodierende pckA-Gen,
6. 7.6 das für die Pyruvat-Oxidase kodierende poxB-
Gen,
7. 7.7 das für die Isocitrat-Lyase kodierende aceA-
Gen,
8. 7.8 das für den DgsA-Regulator des
Phosphotransferase-Systems kodierende dgsA-Gen,
und
9. 7.9 das für den Fructose-Repressor kodierende fruR-
Gen,
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE10132945A DE10132945A1 (de) | 2001-07-06 | 2001-07-06 | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
PCT/EP2002/005169 WO2003004662A2 (en) | 2001-07-06 | 2002-05-10 | Process for the preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family |
AU2002312898A AU2002312898A1 (en) | 2001-07-06 | 2002-05-10 | Process for the preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family |
US10/186,999 US20030017556A1 (en) | 2001-07-06 | 2002-07-03 | Process for the preparation of L-amino acids using strains of the enterobacteiaceae family |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE10132945A DE10132945A1 (de) | 2001-07-06 | 2001-07-06 | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE10132945A1 true DE10132945A1 (de) | 2003-01-16 |
Family
ID=7690932
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE10132945A Withdrawn DE10132945A1 (de) | 2001-07-06 | 2001-07-06 | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20030017556A1 (de) |
AU (1) | AU2002312898A1 (de) |
DE (1) | DE10132945A1 (de) |
WO (1) | WO2003004662A2 (de) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003004671A2 (en) * | 2001-07-06 | 2003-01-16 | Degussa Ag | Process for the preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family |
DE10132946A1 (de) * | 2001-07-06 | 2003-01-16 | Degussa | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobactericeae |
RU2004137719A (ru) * | 2004-12-23 | 2006-06-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий семейства enterobacteriaceae |
RU2005101111A (ru) * | 2005-01-19 | 2006-06-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий семейства enterobacteriaceae |
EP1848810A1 (de) * | 2005-02-18 | 2007-10-31 | Ajinomoto Co., Inc. | Verfahren zur herstellung einer l-aminosäure unter verwendung eines bakteriums der familie enterobacteriaceae mit abgeschwächter expression des bola-gens |
CN101365797A (zh) * | 2005-06-20 | 2009-02-11 | 阿彻-丹尼尔斯-米德兰公司 | 用于改良生产天冬氨酸衍生的氨基酸及化学品的改变的乙醛酸支路 |
WO2007119576A1 (en) * | 2006-03-23 | 2007-10-25 | Ajinomoto Co., Inc. | A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family |
CN109852572B (zh) * | 2019-01-28 | 2021-05-28 | 江南大学 | 一种敲除大肠杆菌pts系统提高l-苏氨酸产量的方法 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5939307A (en) * | 1996-07-30 | 1999-08-17 | The Archer-Daniels-Midland Company | Strains of Escherichia coli, methods of preparing the same and use thereof in fermentation processes for l-threonine production |
US7132272B2 (en) * | 1999-10-05 | 2006-11-07 | Degussa Ag | Nucleotide sequence encoding corynebacterium glutamicum leucine response regulatory protein |
DE10046623A1 (de) * | 2000-09-20 | 2002-03-28 | Degussa | Neue für das dps-Gen kodierende Nukleotidsequenzen |
WO2003004671A2 (en) * | 2001-07-06 | 2003-01-16 | Degussa Ag | Process for the preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family |
-
2001
- 2001-07-06 DE DE10132945A patent/DE10132945A1/de not_active Withdrawn
-
2002
- 2002-05-10 WO PCT/EP2002/005169 patent/WO2003004662A2/en not_active Application Discontinuation
- 2002-05-10 AU AU2002312898A patent/AU2002312898A1/en not_active Abandoned
- 2002-07-03 US US10/186,999 patent/US20030017556A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2002312898A1 (en) | 2003-01-21 |
WO2003004662A3 (en) | 2004-01-29 |
US20030017556A1 (en) | 2003-01-23 |
WO2003004662A2 (en) | 2003-01-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE60225288T2 (de) | Verfahren zur herstellung von l-aminosäuren unter verwendung von stämmen aus der familie der enterobacteriaceae die ein attenuiertes ugpb-gen enthalten | |
DE60224536T2 (de) | Verfahren zur herstellung von l-aminosäuren unter verwendung von stämmen aus der familie der enterobacteriaceae | |
DE60225011T2 (de) | Verfahren zur herstellung von l-threonin durch enterobakteriaceae-stämmen mit verstärkter exprimierung des phoe-gens | |
DE602004010896T2 (de) | Verfahren zur herstellung von l-aminosäuren unter verwendung von stämmen der enterobacteriaceae familie welche das galp gen, das für ein galaktose-proton-symporter kodiert, überexprimieren | |
EP1776451B1 (de) | Verfahren zur herstellung von l-aminosäuren unter verwendung von stämmen der familie enterobacteriaceae | |
DE60213414T2 (de) | Verfahren zur herstellung von l-threonin unter verwendung von stämmen der familie enterobacteriaceae | |
DE10116518A1 (de) | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae | |
EP1719814A1 (de) | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae | |
DE60225353T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren mit Hilfe von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae, die ein verstärktes fadR-Gen enthalten. | |
DE102004003411A1 (de) | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae | |
DE10316109A1 (de) | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae | |
DE10132945A1 (de) | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae | |
EP1719818B1 (de) | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae mit verstärkter Expression von ytfQ-ORF | |
DE102004003410A1 (de) | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae | |
DE10303571A1 (de) | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae | |
DE10244581A1 (de) | Aminosäure produzierende Bakterien und Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren | |
DE60213415T2 (de) | Verfahren zur herstellung von l-aminosäuren unter verwendung von stämmen der familie enterobacteriaceae | |
DE60210620T2 (de) | Verfahren zur herstellung von l-aminosäuren unter verwendung von stämmen aus der familie der enterobacteriacea die ein attenuiertes aspa-gen enthalten | |
DE10135053A1 (de) | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae | |
DE10157721A1 (de) | Verfahren zur fermentativen Herstellung von nicht aromatischen L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae | |
DE10231115A1 (de) | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterbacteriaceae | |
EP2267145A1 (de) | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae | |
DE10210967A1 (de) | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae | |
DE10210960A1 (de) | Verfahren zur fermentativen Hestellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae | |
DE102006041167A1 (de) | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
ON | Later submitted papers | ||
8139 | Disposal/non-payment of the annual fee |