DE60210620T2

DE60210620T2 - Verfahren zur herstellung von l-aminosäuren unter verwendung von stämmen aus der familie der enterobacteriacea die ein attenuiertes aspa-gen enthalten

Info

Publication number: DE60210620T2
Application number: DE60210620T
Authority: DE
Inventors: Thomas Hermann
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2001-07-18
Filing date: 2002-07-03
Publication date: 2007-04-05
Anticipated expiration: 2022-07-04
Also published as: DE10135051A1; DE60210620D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere von L-Threonin, wobei Stämme aus der Familie der Enterobacteriaceae benutzt werden, in denen das aspA-Gen ausgeschaltet ist.
STAND DER TECHNIK
L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, werden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie, vor allem aber in der Tierernährung verwendet.
Es ist bekannt, dass man L-Aminosäuren durch Fermentation von Enterobacteriaceae-Stämmen, insbesondere von Escherichia coli (E. coli) und Serratia marcescens, herstellen kann. Aufgrund ihrer großen Bedeutung werden fortwährend Anstrengungen unternommen, um das Herstellungsverfahren zu verbessern. Die Verbesserungen des Verfahrens können Fermentationsmaßnahmen wie beispielsweise das Rühren oder die Sauerstoffzufuhr, oder die Zusammensetzung der Nährmedien wie beispielsweise die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zum Endprodukt beispielsweise mittels Ionenaustauschchromatographie, oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.
Um die Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen zu verbessern, werden Mutageneseverfahren, Selektion und Mutantenselektion benutzt. Auf diese Weise werden Stämme erhalten, die gegen Antimetaboliten wie bei spielsweise das Threoninanalogon α-Amino-β-hydroxyvaleriansäure (AHV) resistent sind oder die für Metaboliten, die gesetzlichen Bestimmungen unterliegen, auxotroph sind und die L-Aminosäure wie beispielsweise L-Threonin produzieren.
Seit einigen Jahren werden auch DNA-Rekombinationsverfahren angewendet, um den Ausgangsstamm der L-Aminosäuren produzierenden Stämme der Familie Enterobacteriaceae zu verbessern, und zwar durch Vervielfältigen individueller Biosynthesegene und Untersuchen der Auswirkungen auf die Produktion.
AUFGABE DER ERFINDUNG
Aufgabe der Erfindung ist es, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe L-Threonin, L-Valin, L-Methionin, L-Homoserin und L-Lysin, zu schaffen.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung schafft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung der oben genannten L-Aminosäuren, wobei Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae verwendet werden, insbesondere solche, die bereits L-Aminosäuren produzieren und in welchen die Nukleotidsequenz, die für das aspA-Gen codiert, ausgeschaltet ist.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wenn im Folgenden L-Aminosäuren oder Aminosäuren erwähnt werden, sind eine oder mehrere Aminosäuren, ein schließlich ihrer Salze, gemeint, ausgewählt aus einer Gruppe, die aus L-Threonin, L-Valin, L-Methionin, L-Homoserin und L-Lysin besteht. Threonin ist besonders bevorzugt.
In diesem Zusammenhang beschreibt der Begriff Hemmung die Ausschaltung der intrazellularen Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine), welche von der entsprechenden DNA codiert werden, in einem Mikroorganismus, zum Beispiel durch Verwendung eines schwachen Promotors oder eines Gens oder Allels, das für ein entsprechendes Enzyme mit geringer Aktivität codiert oder das entsprechende Enzym (Protein) oder Gen inaktiviert, wobei die Möglichkeit besteht, diese Maßnahmen zu kombinieren.
Im Allgemeinen wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins durch Hemmungsmaßnahmen auf 0 % der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Wildtyp oder der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangsmikroorganismus reduziert.
Das Verfahren umfasst das Ausführen folgender Schritte:

a) Fermentation der Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen das endogene aspA-Gen ausgeschaltet ist, wodurch aerobe Bedingungen aufrechterhalten werden,
b) Anreicherung der entsprechenden L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, und
c) Isolierung der gewünschten L-Aminosäure, der Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder der Biomasse insgesamt oder von Teilen (> 0 bis 100 %) davon, welche wahlweise im Produkt verbleiben können.

Die Mikroorganismen, welche die vorliegende Erfindung bereitstellt, können die Aminosäuren aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Molasse, wahlweise aus Stärke sowie wahlweise aus Zellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es handelt sich um Vertreter der Familie Enterobacteriaceae aus den Gattungen Escherichia, Erwinia, Providencia und Serratia. Die Gattungen Escherichia und Serratia sind bevorzugt. Besonders erwähnt seien aus der Gattung Escherichia die Art Escherichia coli und aus der Gattung Serratia die Art Serratia marcescens.
Als geeignete Stämme, die insbesondere L-Threonin produzieren, sind aus der Gattung Escherichia, insbesondere aus der Art Escherichia coli, beispielsweise zu nennen
Escherichia coli TF427
Escherichia coli H4578
Escherichia coli KY10935
Escherichia coli VNIIgenetika MG442
Escherichia coli VNIIgenetika M1
Escherichia coli VNIIgenetika 472T23
Escherichia coli BKIIM B-3996
Escherichia coli kat 13
Escherichia coli KCCM-10132
Als geeignete L-Threonin produzierende Stämme aus der Gattung Serratia, insbesondere aus der Art Serratia marcescens, sind beispielsweise zu nennen
Serratia marcescens HNr21
Serratia marcescens TLr156
Serratia marcescens T2000
Stämme aus der Familie Enterobacteriaceae, die L-Threonin produzieren, weisen vorzugsweise, unter anderem, eines oder mehrere genetische oder phänotypische Eigenschaftsmerkmale auf, die aus einer Gruppe ausgewählt werden, die aus folgenden Elementen besteht: Resistenz gegen α-amino-β-hydroxyvaleriansäure, Resistenz gegen Thialysin, Resistenz gegen Ethionin, Resistenz gegen α-Methylserin, Resistenz gegen Diaminobernsteinsäure, Resistenz gegen α-Aminobuttersäure, Resistenz gegen Borrelidin, Resistenz gegen Rifampicin, Resistenz gegen Valinanaloga wie beispielsweise Valinhydroxamat, Resistenz gegen Purinanaloga wie beispielsweise 6-Dimethylaminopurin, Bedarf an L-Methionin, wahlweise ganz oder in Teilen kompensierbarer Bedarf an L-Isoleucin, Bedarf an meso-Diaminopimelinsäure, Auxotrophie hinsichtlich threoninhaltiger Dipeptide, Resistenz gegen L-Threonin, Resistenz gegen L-Homoserin, Resistenz gegen L-Lysin, Resistenz gegen L-Methionin, Resistenz gegen L-Glutaminsäure, Resistenz gegen L-Aspartat, Resistenz gegen L-Leucin, Resistenz gegen L-Phenylalanin, Resistenz gegen L-Serin, Resistenz gegen L-Cystein, Resistenz gegen L-valin, Empfindlichkeit gegen Fluorpyruvat, funktionsuntüchtige Threonindehydrogenase, wahlweise eine Fähigkeit zur Saccharoseverwertung, Verstärkung des Threoninoperons, Verstärkung der Homoserindehydrogenase I-Aspartatkinase I, vorzugsweise der rückkopplungsresistenten Form, Verstärkung der Homoserinkinase, wahlweise der rück kopplungsresistenten Form, Verstärkung der Threoninsynthase, Verstärkung der Aspartatkinase, wahlweise der rückkopplungsresistenten Form, Verstärkung der Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase, Verstärkung der Phosphoenolpyruvat-Carboxylase, wahlweise der rückkopplungsresistenten Form, Verstärkung der Phosphoenolpyruvat-Synthase, Verstärkung der Transhydrogenase, Verstärkung des RhtB-Genprodukts, Verstärkung des RhtC-Genprodukts, Verstärkung des YfiK-Genprodukts, Verstärkung einer Pyruvatcarboxylase und Hemmung der Essigsäurebildung.
Es wurde entdeckt, dass Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae die Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, nach Ausschaltung des aspA-Gens in verbesserter Weise herstellen.
Die Nukleotidsequenzen der Gene von Escherichia coli gehören zum Stand der Technik und können gleichfalls der von Blattner et al. veröffentlichten Genomsequenz von Escherichia coli entnommen werden (Science 277: 1453–1462 (1997)).
Das aspA-Gen wird, unter anderem, durch folgende Angaben beschrieben:

Beschreibung: Aspartat-Ammonium-Lyase (Aspartase)
EC Nr.: 4.3.1.1
Referenz: Takagi et al.; Nucleic Acids Research 13(6): 2063–2074 (1985); Woods et al.; Biochemical Journal 237(2): 547–557 (1986); Falzone et al.; Biochemistry 27(26): 90899093 (1988); Jayasekera et al.; Biochemistry 36(30): 9145–9150 (1997)
Accession-Nr.: AE000486

Die Nukleinsäuresequenzen können den Datenbanken des National Center for Biotechnology Information (NCBI) der National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA), der Nukleotidsequenzen-Datenbank der European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Deutschland oder Cambridge, UK) oder der DNA-Databank of Japan (DDBJ, Mishima, Japan) entnommen werden.
Die Gene, die in den erwähnten Textreferenzen beschrieben sind, können gemäß der Erfindung benutzt werden. Weiterhin können Allele von Genen, die durch Degeneration des genetischen Codes oder durch "Sense-Mutationen" neutraler Funktion entstehen, benutzt werden.
Um eine Hemmung zu erreichen, können zum Beispiel die Expression des Gens oder die katalytischen Eigenschaften des Enzymproteins reduziert oder ausgeschaltet werden. Wahlweise können die beiden Maßnahmen kombiniert werden.
Die Reduzierung der Genexpression kann durch geeignete Kulturtechniken, durch Genmodifikation (Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression oder mittels der Antisense-RNA-Technik vonstatten gehen. Zu den Signalstrukturen der Genexpression gehören, zum Beispiel, Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Hemmer, Ribosombindungsstellen, das Startcodon sowie Terminatoren. Diesbezügliche Informationen findet der Fachmann, unter anderem, zum Beispiel bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191–195 (1998)), bei Carrier und Keasling (Biotechnology Progress 15: 58–64 (1999)), Franch und Gerdes (Current Opinion in Microbiology 3: 159–164 (2000)) sowie in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie, wie beispielsweise dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Ausgabe, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990).
Mutationen, die zu einer Änderung oder Reduzierung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind aus dem Stand der Technik bekannt. Als Beispiele wären die Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611–8617 (1997)), Yano et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95: 5511–5515 (1998)), Wente und Schachmann (Journal of Biological Chemistry 266: 20833–20839 (1991)) zu erwähnen. Zusammenfassende Beschreibungen können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie beispielsweise dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
Mögliche Mutationen sind Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen. In Abhängigkeit von den Auswirkungen des Aminosäureaustausches auf die Enzymaktivität werden die Mutationen als "Missense-Mutationen" oder "Nonsense-Mutationen" bezeichnet. Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar innerhalb eines Gens rufen "Mutationen durch Leserasterverschiebung" hervor, was dazu führt, dass die falschen Aminosäuren eingebaut oder die Translation vorzeitig unterbrochen wird. Wenn infolge der Mutation innerhalb des Codierungsbereiches ein Stopcodon gebildet wird, führt dies ebenfalls zu einer vorzeitigen Beendigung der Translation. Deletionen mehrerer Codons führt typischerweise zu einem vollständigen Verlust der Enzymaktivität. Die Anweisungen zur Erzeugung solcher Mutationen gehören zum Stand der Technik und können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie, wie beispielsweise dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Ausgabe, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
Geeignete Genmutationen, wie beispielsweise Deletionsmutationen, können in geeignete Stämme durch Ersetzen von Genen oder Allelen eingeführt werden.
Ein herkömmliches Verfahren zum Ersetzen von Genen ist das von Hamilton et al. beschriebene Verfahren (Journal of Bacteriology 171: 4617–4622 (1989)) unter Zuhilfenahme des konditional replizierenden pSC101-Derivats pMAK705. Andere nach dem Stand der Technik beschriebene Verfahren wie beispielsweise diejenigen nach Martinez-Morales et al. (Journal of Bacteriology 181: 1999, 7143–7148 (1999)) oder diejenigen nach Boyd et al. (Journal of Bacteriology 182: 842–847 (2000)) können gleichermaßen benutzt werden.
Es ist ebenfalls möglich, Mutationen in bestimmten Genen oder Mutationen, welche die Expression bestimmter Gene beeinflussen, durch Konjugation oder Transduktion auf die verschiedenen Stämme zu übertragen.
Darüber hinaus kann es für die Herstellung der L-Aminosäuren, insbesondere des L-Threonins, mit Stämmen der Familie Enterobacteriaceae vorteilhaft sein, zusätzlich zur Ausschaltung des aspA-Gens eines oder mehrere Enzyme des bekannten Biosynthesewegs für Threonin oder Enzyme des anaplerotischen Stoffwechsels oder Enzyme zur Herstellung von reduziertem Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat oder Enzyme der Glycolyse oder PTS-Enzyme oder Enzyme des Schwefelstoffwechsels zu verstärken.
In diesem Zusammenhang beschreibt der Begriff "Verstärkung" die Zunahme der intrazellularen Aktivität eines oder mehrerer Enzyme oder Proteine, welche von der entsprechenden DNA codiert werden, in einem Mikroorganismus, zum Beispiel durch Erhöhung der Anzahl der Kopien des Gens oder der Gene, durch Verwendung eines leistungsfähigen Promotors oder eines Gens, das für ein entsprechendes Enzyme oder Protein mit hoher Aktivität codiert, wobei die Möglichkeit besteht, diese Maßnahmen zu kombinieren.
Im Allgemeinen wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins durch Verstärkungsmaßnahmen, insbesondere durch Überexpression, um mindestens 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 % oder 500 %, bis hin zu einem Maximum von 1000 % oder 2000 % gegenüber derjenigen des Proteins im Wildtyp oder gegenüber der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangsmikroorganismus erhöht.
So können, zum Beispiel, gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, die aus einer Gruppe ausgewählt wurden, die aus

• dem thrABC-Operon, welches für Aspartatkinase, Homoserinedehydrogenase, Homoserinekinase und Threoninsynthase codiert (US-A-4,278,765),
• dem pyc-Gen von Corynebacterium glutamicum, welches für Pyruvatcarboxylase codiert (WO 99/18228),
• dem pps-Gen, welches für Phosphoenolpyruvat-Synthase codiert (Molecular and General Genetics 231(2): 332-336 (1992)),
• dem ppc-Gen, welches für Phosphoenolpyruvat-Carboxylase codiert (Gene 31: 279–283 (1984)),
• den pntA- und pntB-Genen, welche für Transhydrogenase codieren (European Journal of Biochemistry 158: 647-653 (1986)),
• dem rhtB-Gen, welches Resistenz gegen Homoserin verleiht (EP-A-0 994 190),
• dem mqo-Gen, welches für Malat:Chinon-Oxidoreduktase codiert (WO 02/06459),
• dem rhtC-Gen, welches Resistenz gegen Threonin verleiht (EP-A-1 013 765),
• dem thrE-Gen von Corynebacterium glutamicum, welches für das Threonin-Exportprotein codiert (WO 01/92545),
• dem gdhA-Gen, welches für Glutamatdehydrogenase codiert (Nucleic Acids Research 11: 5257–5266 (1983); Gene 23: 199–209 (1983)),
• dem hns-Gen, welches für das DNA-bindende Protein HLP-II codiert (Molecular and General Genetics 212: 199–202 (1988)),
• dem pgm-Gen, welches für Phosphoglucomutase codiert (Journal of Bacteriology 176: 5847–5851 (1994)),
• dem fba-Gen, welches für Fructosebiphosphat-Aldolase codiert (Biochemical Journal 257: 529–534 (1989)),
• dem ptsH-Gen des ptsHIcrr-Operons, welches für die Phosphohistidinprotein-Hexose-Phosphotransferase des Phosphotransferasesystems PTS codiert (Journal of Biological Chemistry 262: 16241–16253 (1987)),
• dem ptsI-Gen des ptsHIcrr-Operons, welches für das Enzym I des Phosphotransferasesystems PTS codiert (Journal of Biological Chemistry 262: 16241–16253 (1987)),
• dem crr-Gen des ptsHIcrr-Operons, welches für die glucosespezifische IIA-Komponente des Phosphotransferasesystems PTS codiert (Journal of Biological chemistry 262: 1624116253 (1987)).
• dem ptsG-Gen, welches für die glucosespezifische IIBC-Komponente codiert (Journal of Biological Chemistry 261: 16398–16403 (1986)),
• dem lrp-Gen, welches für den Regulator des Leucinregulons codiert (Journal of Biological Chemistry 266: 10768–10774 (1991)),
• dem mopB-Gen, welches für das 10-Kd-Chaperon codiert (Journal of Biological Chemistry 261: 12414–12419 (1986)) und auch unter dem Namen groES bekannt ist,
• dem ahpC-Gen des ahpCF-Operons, welches für die kleine Untereinheit von Alkylhydroperoxid-Reductase codiert (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92: 7617-7621 (1995)),
• dem ahpF-Gen des ahpCF-Operons, welches für die große Untereinheit von Alkylhydroperoxid-Reductase codiert (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 92: 7617–7621 (1995)),
• dem cysK-Gen, welches für Cysteinsynthase A codiert (Journal of Bacteriology 170: 3150–3157 (1988)),
• dem cysB-Gen, welches für den Regulator des cys-Regulons codiert (Journal of Biological Chemistry 262: 5999–6005 (1987)),
• dem cysJ-Gen des cysJIH-Operons, welches für das Flavoprotein von NADPH-Sulfit-Reduktase codiert (Journal of Biological Chemistry 264: 15796–15808 (1989), Journal of Biological Chemistry 264: 15726-15737 (1989)),
• dem cysI-Gen des cysJIH-Operons, welches für das Hämoprotein von NADPH-Sulfit-Reduktase codiert (Journal of Biological Chemistry 264: 15796–15808 (1989). Journal of Biological Chemistry 264: 15726- 15737 (1989)) und
• dem cysH-Gen des cysJIH-Operons, welches für Adenylylsulfat-Reduktase codiert (Journal of Biological Chemistry 264: 15796–15808 (1989), Journal of Biological Chemistry 264: 15726–15737 (1989)) besteht, insbesondere durch Überexpression verstärkt werden.

Im Allgemeinen wird die Verwendung von endogenen Genen bevorzugt. Unter "endogenen Genen" oder "endogenen Nukleotidsequenzen" sind die Gene oder Nukleotidsequenz zu verstehen, die im Bestand einer Art vorkommen.
Darüber hinaus kann es für die Herstellung der L-Aminosäuren, insbesondere des L-Threonins, vorteilhaft sein, zusätzlich zur Ausschaltung des endogenen aspA-Gens, eines oder mehrere Gene auszuschalten, die aus der Gruppe ausgewählt wurden, die aus

• dem tdh-Gen, welches für Threonindehydrogenase codiert (Journal of Bacteriology 169: 4716–4721 (1987)),
• dem mdh-Gen, welches für Malatdehydrogenase codiert (E.C. 1.1.1.37) (Archives in Microbiology 149: 36–42 (1987)),
• dem Genprodukt des offenen Leserasters (orf) yjfA (Accession-Nr. AAC77180 des National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA)),
• dem Genprodukt des offenen Leserasters (orf) ytfP (Accession-Nr. AAC77179 des National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA)),
• dem pckA-Gen, welches für das Enzym Phosphoenolpyruvat-Carboxylase codiert (Journal of Bacteriology 172: 7151–7156 (1990)),
• dem poxB-Gen, welches für Pyruvatoxidase codiert (Nucleic Acids Research 14(13): 5449–5460 (1986)),
• dem aceA-Gen, welches für das Enzym Isocitratlyase codiert (Journal of Bacteriology 170: 4528–4536 (1988)),
• dem dgsA-Gen, welches für den DgsA-Regulator des Phosphotransferasesystems codiert (Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 59: 256–261 (1995)) und auch unter dem Namen mlc-Gen bekannt ist,
• dem fruR-Gen, welches für den Fructoserepressor codiert (Molecular and General Genetics 226: 332–336 (1991)) und auch unter dem Namen cra-Gen bekannt ist,
• dem rpoS-Gen, welches für den sigma³⁸-Faktor codiert (WO 01/05939) und auch unter dem Namen katF-Gen bekannt ist,
• dem aceB-Gen, welches für Malatsynthase A codiert (Nucleic Acids Research 16(19): 9342 (1988),
• dem aceK-Gen, welches für Isocitratdehydrogenase-Kinase/Phosphatase codiert (Journal of Bacteriology 170(1): 89–97 (1988)) und
• dem ugpB-Gen besteht, welches für das periplasmatische Bindungsprotein des sn-Glycerin-3-phosphat-Transportsystems codiert (Molecular Microbiology 2(6) : 767–775 (1988))

Darüber hinaus kann es für die Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere von L-Threonins, vorteilhaft sein, zusätzlich zur Ausschaltung des endogenen aspA-Gens, unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (Hrsg.), Academic Press, London UK, 1982).
Die Mikroorganismen, die gemäß der Erfindung hergestellt werden, können chargenweise (Chargenkultur), mit Medienzufuhr ("Fed-Batch"-Verfahren) oder mit wiederholter Medienzufuhr ("Repetitive-Fed-Batch"-Verfahren) kultiviert werden. Eine beschreibende Kurzdarstellung bekannter Kulturverfahren kann dem Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder dem Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) entnommen werden.
Das zu verwendende Kulturmedium muss den Anforderungen der jeweiligen Stämme in geeigneter Weise entsprechen. Beschreibungen von Kulturmedien für verschiedene Mikroorganismen können dem Handbuch "Manual of methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) entnommen werden.
Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlenhydrate wie beispielsweise Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Molasse, Stärke und wahlweise Zellulose, Öle und Fette wie beispielsweise Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie beispielsweise Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie beispielsweise Glycerin und Ethanol sowie organische Säuren wie beispielsweise Essigsäure verwendet werden. Diese Substanzen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Organische stickstoffhaltige Verbindungen wie etwa Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser (CSL), Sojamehl und Harnstoff, oder anorganische Verbindungen wie etwa Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat können als Stickstoffquelle verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden natriumhaltigen Salze können als Phosphorquelle verwendet werden. Darüber hinaus muss das Kulturmedium für das Wachstum nötige Metallsalze wie beispielsweise Magnesiumsulfat oder Eisensulfat umfassen. Schließlich können essentielle Wachstumssubstanzen wie etwa Aminosäuren und Vitamine zusätzlich au den oben genannten Substanzen eingesetzt werden. Darüber hinaus können geeignete Vorläufersubstanzen dem Kulturmedium zugesetzt werden. Die erwähnten Startsubstanzen können der Kultur in Form einer einzigen Charge zugesetzt werden oder während der Kultivierung in geeigneter Weise zugeführt werden.
Basische Verbindungen wie etwa Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak oder wässrige Ammoniaklösung, oder saure Verbindungen wie etwa Phosphorsäure oder Schwefelsäure können in geeigneter Weise eingesetzt werden, um den pH-Wert der Kultur zu steuern. Schaumverhüter wie beispielsweise Fettsäurepolyglykolester können zur Steuerung der Schaumentwicklung verwendet werden. Geeignete Substanzen mit selektiver Wirkung, zum Beispiel Antibiotika, können dem Medium zugesetzt werden, um die Stabilität der Plasmide aufrechtzuerhalten. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasmischungen wie beispielsweise Luft in die Kultur eingeleitet. Die Temperatur der Kultur beträgt üblicherweise zwischen 25 °C und 45 °C und vorzugsweise zwischen 30 °C und 40 °C. Die Kultivierung wird fortgesetzt bis ein Maximum an L-Aminosäuren oder L-Threonin gebildet wurde. Dieses Ziel wird üblicherweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Die Analyse von L-Aminosäuren kann mittels Anionenaustauschchromatographie mit anschließender Ninhydrinderivatisierung wie von Spackman et al. (Analytical Chemistry 30: 1190–1206 (1958)) beschrieben oder mittels Umkehrphasen-HPLC wie von Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51: 1167–1174 (1979)) beschrieben durchgeführt werden.
Das Verfahren gemäß der Erfindung wird zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren wie beispielsweise L-Threonin, L-Isoleucin, L-Valin, L-Methionin, L- Homoserin und L-Lysin benutzt, insbesondere für L-Threonin.
Gemäß dem Budapester Vertrag wurde am 8. September 2000 eine Reinkultur des Escherichia coli K12-Stamms DH5α/pMAK705 unter dem Zeichen DSM 13720 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Deutschland) hinterlegt.
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Die Isolierung der Plasmid-DNA aus Escherichia coli sowie sämtliche Restriktionstechniken, die Ligation, die Klenowbehandlung und Behandlung mit alkalischer Phosphatase werden nach dem Verfahren von Sambrook et al. (Molecular Cloning – A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press) durchgeführt. Wenn nicht anders beschrieben, wird die Transformation von Escherichia coli nach dem Verfahren von Chung et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 86: 2172–2175 (1989)) durchgeführt.
Für die Herstellung von Stämmen und Transformanten beträgt die Bebrütungstemperatur 37 °C. Beim replacement-Verfahren nach Hamilton et al. werden Temperaturen von 30 °C und 44 °C verwendet.
Beispiel 1
Erstellung der Deletionsmutation des aspA-Gens.
Mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und unter Verwendung synthetischer Oligonukleotide werden Teile der Genregionen, die strangaufwärts und strangabwärts des aspA-Gens liegen, und Teile der 5'- und 3'-Regionen des aspA-Gens von Escherichia coli K12 verstärkt. Beginnend mit der Nukleotidsequenz des aspA-Gens und Sequenzen, die sich strangaufwärts und strangabwärts in E. Coli K12 MG1655 (SEQ ID Nr. 1, Accession Nr. AE000486 und AE000487) befinden, werden die folgenden PCR-Primer synthetisiert (MWG Biotech, Ebersberg, Deutschland):
aspA5'-1: 5' – GCTGCATCAGCACGAAATTC – 3' (SEQ ID Nr. 3)
aspA5'-2: 5' – CCATTACCATACCGCGAACA – 3' (SEQ ID Nr. 4)
aspA3'-1: 5' – TGGCAGCAGAAGCAGGTCAG – 3' (SEQ ID Nr. 5)
aspA3'-2: 5' – TAGTCCAGACCGCCAGCAAC – 3' (SEQ ID Nr. 6)
Gemäß den Anweisungen des Herstellers wird die für die PCR verwendete chromosomale DNA von E. coli K12 MG1655 mittels "Qiagen Genomic-tips 100/G" (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Ein etwa 650 bp großes DNA-Fragment aus der 5'-Region der aspA-Genregion (aspA5' genannt) und eine etwa 700 bp großes DNA-Fragment aus der 3'-Region der aspA-Genregion (aspA3' genannt) können mit spezifischen Primern unter PCR-Standardbedingungen (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) mit Taq-DNA-Polymerase (Gibco-BRL, Eggenstein, Deutschland) verstärkt werden. Die PCR-Produkte werden gemäß den Anweisungen des Herstellers mit dem Vektor pCR2.1-TOPO (TOPO TA Cloning Kit, Invitrogen, Groningen, Niederlande) ligiert und in den E. Coli-Stamm TOP10F' transformiert. Die Selektion der plasmidtragenden Zellen findet auf LB-Agar statt, welchem 50 μg/ml Ampillicin zugesetzt wurden. Nach Isolierung der Plasmid-DNA wird der Vektor pCR2.1-TOPOaspA3' mit den Restriktionsenzymen XbaI und Ec1136II gespalten. Nach Abtrennung in 0,8%igem Agarosegel mit Hilfe des QIAquick Gel Extraction Kits (QIAGEN, Hilden, Deutschland) wird das aspA3'-Fragment isoliert. Nach Isolierung der Plasmid-DNA wird der Vektor pCR2.1-TOPOaspA5' mit den Enzymen EcoRV und XbaI gespalten und mit dem isolierten aspA3'-Fragment ligiert. Der E. Coli-Stamm DH5α wird mit der Ligationscharge transformiert, und plasmidtragende Zellen werden auf LB-Agar selektiert, welchem 50 μg/ml Ampillicin zugesetzt wurden. Nach Isolierung der Plasmid-DNA werden diejenigen Plasmide, in welchen die in SEQ ID Nr. 7 dargestellte mutagene DNA-Sequenz geklont ist, durch Kontrollspaltung mit den Enzymen EcoRI, XbaI und HindIII detektiert. Eines des Plasmide wird als pCR2.1-TOPOΔaspA (=pCR2.1-TOPOdeltaaspA) bezeichnet.
Beispiel 2
Erstellung des replacement-Vektors pMA.K705ΔaspA
Nach Restriktion mit den Enzymen HindIII und XbaI und Abtrennung in 0,8%igem Agarosegel wird das in Beispiel 1 beschriebene ΔaspA-Allel vom Vektor pCR2.1-TOPOΔaspA isoliert und mit dem Plasmid pMAK705 (Hamilton et al., Journal of Bacteriology 171: 4617–4622 (1989)) ligiert, welches mit den Enzymen HindIII und XbaI verdaut wurde. Die Ligationscharge wird in DH5α transformiert, und plasmidtragende Zellen werden auf LB-Agar selektiert, welchem 20 μg/ml Chloramphenicol zugesetzt wurden. Ein erfolgreiches Klonen zeigt sich nach Isolierung der Plasmid-DNA und Spaltung mit den Enzymen HindIII und XbaI. Der gebildete replacement-Vektor, pMAK705ΔaspA (= pMAK705deltaaspA) ist in 1 dargestellt.
Beispiel 3
Positionsspezifische Mutagenese des aspA-Gens im E. Coli-Stamm MG442.
Der L-Threonin produzierende E. Coli-Stamm MG442 ist in der Patentschrift US-A-4,278,765 beschrieben und wurde unter dem Zeichen CMIM B-1628 bei der Russian National Collection for Industrial Microorganisms (VKPM, Moskau, Russland) hinterlegt.
Um das chromosomale aspA-Gen durch das plasmidcodierte Deletionskonstrukt zu ersetzen, wird MG442 mit dem Plasmid pMAK705ΔaspA transformiert. Das Ersetzen des Gens wird unter Anwendung des von Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 171: 4617–4622 (1989)) beschriebenen Selektionsverfahrens durchgeführt und durch PCR-Standardverfahren (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to methods and Applications, Academic Press) mit folgenden Oligonukleotidprimern überprüft: aspA5'-1: 5' – GCTGCATCAGCACGAAATTC – 3' (SEQ ID Nr. 3) aspA3'-2: 5' – TAGTCCAGACCGCCAGCAAC – 3' (SEQ ID Nr. 6) Nach dem Ersetzen enthält MG442 die Form des ΔaspA-Allels, die in SEQ ID Nr. 8 dargestellt ist. Der erhaltene Stamm wird als MG442ΔaspA bezeichnet.
Beispiel 4
Herstellung von L-Threonin mit dem MG442ΔaspA-Stamm
MG442ΔaspA wird auf einem Minimalmedium folgender Zusammensetzung vervielfältigt: 3,5 g/l Na₂HPO₄·2H₂O, 1,5 g/l KH₂PO₄, 1 g/l NH₄Cl, 0,1 g/l MgSO₄·7H₂O, 2 g/l Glucose, 20 g/l Agar-Agar. Die Bildung von L-Threonin wird in Chargenkulturen von 10 ml geprüft, die in 100-ml-Erlenmeyerkolben enthalten sind. Dazu werden 10 ml Vorkulturmedium folgender Zusammensetzung: 2 g/l Hefeextrakt, 10 g/l (NH₄)₂SO₄, 1 g/l KH₂PO₄, 0,5 g/l MgSO₄·7H₂O, 15 g/l CaCO₃, 20 g/l Glucose beimpft und die Charge 16 Stunden lang bei 37 °C und 180 UpM in einem ESR Inkubator von Kühner AG (Birsfelden, Schweiz) bebrütet. 250 μl dieser Vorkultur werden in 10 ml des Produktionsmediums (25 g/l (NH₄)₂SO₄ , 2 g/l KH₂PO₄, 1 g/l MgSO₄·7H₂O, 0,03 g/l FeSO₄·7H₂O, 0, 018 g/l MnSO₄*1H₂O, 30 g/l CaCO₃, 20 g/l Glucose) überimpft, und die Charge wird 48 Stunden lang bei 37 °C bebrütet. Nach der Bebrütung wird die Optimale Dichte (OD) der Kultursuspension mit einem LP2W-Photometer von Dr. Lange (Düsseldorf, Deutschland) bei einer Messwellenlänge von 660 nm bestimmt.
Die Konzentration des gebildeten L-Threonins wird dann im sterilgefilterten Überstand mit einem Aminosäure-Analysator von Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenreaktion mit Ninhydrindetektion bestimmt:
Das Ergebnis des Versuchs ist in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1
Kurzbeschreibung der Figur:

• 1: pMAK705ΔaspA (= pMAK705deltaaspA)

Die Längenangaben sind als näherungsweise Angaben zu verstehen. Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben folgende Bedeutung:

• cat: Chloramphenicolresistenz-Gen
• rep-ts: Temperaturempfindliche Replikationsregion des Plasmids pSC101
• aspA5': Teil der 5'-Region des aspA-Gens and der strangaufwärts liegenden Region
• aspA3': Teil der 3'-Region des aspA-Gens and der strangabwärts liegenden Region

Die Abkürzungen für die Restriktionsenzyme haben folgende Bedeutung

• EcoRI: Restriktionsendonuklease von Escherichia coli
• HindIII: Restriktionsendonuklease von Haomophilus influenza
• XbaI: Restriktionsendonuklease von Xanthomonas badrii

Claims

Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe L-Threonin, L-Valin, L-Methionin, L-Homoserin und L-Lysin, bei dem man in den folgenden Schritten a) eine Fermentation von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, die die genannte(n) L-Aminosäure(n) produzieren und in denen das endogene aspA-Gen ausgeschaltet ist, wobei aerobe Bedingungen aufrechterhalten werden, b) eine Anreicherung der L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen und c) eine Isolierung der L-Aminosäure durchführt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wodurch Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder die Biomasse insgesamt oder teilweise (> 0 bis 100%) im Produkt verbleiben.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei man Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae fermentiert, in denen zudem gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe: a) das für Aspartatkinase, Homoserin-Dehydrogenase, Homoserinkinase und Threonin-Synthase codierende thrABC-Operon, b) das für die Pyruvat-Carboxylase codierende pyc-Gen, c) das für die Phosphoenolpyruvat-Synthase codierende pps-Gen, d) das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxylase codierende ppc-Gen, e) die für Transhydrogenase codierenden Gene pntA und pntB, f) das Homoserin-Resistenz verleihende rhtB-Gen, g) das für die Malat:Chinon-Oxidoreduktase codierende mqo-Gen, h) das Threonin-Resistenz verleihende rhtB-Gen, i) das für das Threonin-Export-Protein codierende thrE-Gen, j) das für die Glutamat-Dehydrogenase codierende gdhA-Gen, k) das für das DNA-Bindungsprotein HLP-II codierende hns-Gen, l) das für die Phosphoglucomutase codierende pgm-Gen, m) das für die Fructosebisphosphat-Aldolase codierende fba-Gen, n) das für die Phosphohistidinprotein-Hexose-Phosphotransferase codierende ptsH-Gen, o) das für Enzym I des Phosphotransferasesystems codierende ptsI-Gen, p) das für die glucosespezifische Komponente IIA codierende crr-Gen, q) das für die glucosespezifische Komponente IIBC codierende ptsG-Gen, r) das für den Regulator des Leucin-Regulons codierende lrp-Gen, s) das für das 10-Kd-Chaperon codierende mopB-Gen, t) das für die kleine Untereinheit der Alkylhydroperoxid-Reduktase codierende ahpC-Gen, u) das für die große Untereinheit der Alkylhydroperoxid-Reduktase codierende ahpF-Gen, v) das für die Cystein-Synthase A codierende cysK-Gen, w) das für den Regulator des cys-Regulons codierende cysB-Gen, x) das für das Flavoprotein der NADPH-Sulfit-Reduktase codierende cysJ-Gen, y) das für das Hämoprotein der NADPH-Sulfit-Reduktase codierende cysI-Gen und z) das für die Adenylylsulfat-Reduktase codierende cysH-Gen, verstärkt ist bzw. sind.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei man Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae fermentiert, in denen zudem gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe: a) das für die Threonin-Dehydrogenase codierende tdh-Gen, b) das für die Malat-Dehydorgenase codierende mdh-Gen, c) das Genprodukt des offenen Leserasters (orf) yjfA, d) das Genprodukt des offenen Leserasters (orf) ytfP, e) das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase codierende pckA-Gen, f) das für die Pyruvat-Oxidase codierende poxB-Gen, g) das für die Isocitrat-Lyase codierende aceA-Gen, h) das für den Regulator DgsA des Phosphotransferasesystems codierende dgsA-Gen, i) das für den Fructose-Repressor codierende fruR-Gen, j) das für den sigma³⁸-Faktor codierende rpoS-Gen, k) das für die Malat-Synthase A codierende aceB-Gen, l) das für die Isocitrat-Dehydrogenase-Kinase/Phosphatase codierende aceK-Gen und m) das für das periplasmatische Bindungsprotein des sn-Glycerin-3-phosphat-Transportsystems codierende ugpB-Gen, ausgeschaltet ist bzw. sind.
Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, die L-Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe L-Threonin, L-Valin, L-Methionin, L-Homoserin und L-Lysin, produzieren, wobei das endogene aspA-Gen ausgeschaltet ist.
Mikroorganismen gemäß Anspruch 5, wobei die Mikroorganismen aus der Gattung Escherichia stammen.
Mikroorganismen gemäß Anspruch 5, wobei die Mikroorganismen aus der Spezies E. coli stammen.