DE10130192A1

DE10130192A1 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae

Info

Publication number: DE10130192A1
Application number: DE10130192A
Authority: DE
Inventors: Mechthild Rieping; Christine Bastuck; Thomas Hermann; Georg Thierbach
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2000-09-30
Filing date: 2001-06-22
Publication date: 2002-04-11
Also published as: DE60140373D1; PL210791B1; ATE447618T1; DK1320626T3; ES2336192T3; PT1320626E

Abstract

Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, DOLLAR A dadurch gekennzeichnet, DOLLAR A daß man folgende Schritte durchführt: DOLLAR A a) Fermentation der die gewünschte L-Aminosäure produzierenden Mikroorganismen der Familie Enterobactericeae, in denen man zumindest das pckA-Gen und/oder die offenen Leserahmen yifA und ytfP einzeln oder gemeinsam abschwächt, insbesondere ausschaltet, DOLLAR A b) Anreicherung der L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Bakterien und DOLLAR A c) Isolieren der L-Aminosäure.

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae, in denen zumindest das pckA-Gen abgeschwächt wird.

Stand der Technik

L-Aminosäuren finden in der Tierernährung, in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie Anwendung.

Es ist bekannt L-Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen der Enterobacteriaceae, insbesondere Escherichia coli und Serratia marcescens, herzustellen. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen, wie z. B. Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien wie z. B. die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform, durch z. B. Ionenaustauschchromatographie, oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.

Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite wie z. B. das Threonin-Analogon α-Amino-β-Hydroxyvaleriansäure (AHV) oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und L-Aminosäuren wie z. B. L-Threonin produzieren.

Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung L- Aminosäuren produzierender Stämme der Familie Enterobacteriaceae eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die Produktion untersucht.

Aufgabe der Erfindung

Die Erfinder haben sich die Aufgabe gestellt, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von L- Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, bereitzustellen.

Beschreibung der Erfindung

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, unter Verwendung von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, die insbesondere bereits L- Threonin produzieren, und in denen die für das Enzym Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (PEP-Carboxykinase) (EC 4.1.1.49) kodierende Nukleotidsequenz (pckA-Gen) abgeschwächt wird.

Werden im folgenden L-Aminosäuren oder Aminosäuren erwähnt, sind damit eine oder mehrere Aminosäuren einschließlich ihrer Salze, ausgewählt aus der Gruppe L-Asparagin, L- Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L- Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L- Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan, L-Homoserin und L-Arginin gemeint. Besonders bevorzugt ist L-Threonin.

Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Enzym (Protein) inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte durchführt:

a) Fermentation von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen zumindest das pckA-Gen abgeschwächt wird,
b) Anreicherung der entsprechenden L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, und
c) Isolieren der gewünschten L-Aminosäure.

Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können L-Aminosäuren aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, gegebenenfalls Stärke, gegebenfalls Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es handelt sich um Vertreter der Familie Enterobacteriaceae, ausgewählt aus den Gattungen Escherichia, Erwinia, Providencia und Serratia. Die Gattungen Escherichia und Serratia werden bevorzugt. Bei der Gattung Escherichia ist insbesondere die Art Escherichia coli und bei der Gattung Serratia insbesondere die Art Serratia marcescens zu nennen.

Geeignete, insbesondere L-Threonin produzierende Stämme der Gattung Escherichia, insbesondere der Art Escherichia coli sind beispielsweise
Escherichia coli TF427
Escherichia coli H4578
Escherichia coli KY10935
Escherichia coli VNIIgenetika MG442
Escherichia coli VNIIgenetika M1
Escherichia coli VNIIgenetika 472T23
Escherichia coli BKIIM B-3996
Escherichia coli kat 13
Escherichia coli KCCM-10132

Geeignete L-Threonin produzierende Stämme der Gattung Serratia, insbesondere der Art Serratia marcescens sind beispielsweise
Serratia marcescens HNr21
Serratia marcescens TLr156
Serratia marcescens T2000

L-Threonin produzierende Stämme aus der Familie der Enterobacteriaceae besitzen bevorzugt unter anderen ein oder mehrere der genetischen bzw. phänotypischen Merkmale ausgewählt aus der Gruppe: Resistenz gegen α-Amino-β- Hydroxyvaleriansäure, Resistenz gegen Thialysin, Resistenz gegen Ethionin, Resistenz gegen α-Methylserin, Resistenz gegen Diaminobernsteinsäure, Resistenz gegen α- Aminobuttersäure, Resistenz gegen Borrelidin, Resistenz gegen Rifampicin, Resistenz gegen Valin-Analoga wie beispielsweise Valinhydroxamat, Resistenz gegen Purinanaloga wie beispielsweise 6-Dimethylaminopurin, Bedürftigkeit für L-Methionin, gegebenfalls partielle und kompensierbare Bedürftigkeit für L-Isoleucin, Bedürftigkeit für meso-Diaminopimelinsäure, Auxotrophie bezüglich Threonin-haltiger Dipeptide, Resistenz gegen L-Threonin, Resistenz gegen L-Homoserin, Resistenz gegen L-Lysin, Resistenz gegen L-Methionin, Resistenz gegen L- Glutaminsäure, Resistenz gegen L-Aspartat, Resistenz gegen L-Leucin, Resistenz gegen L-Phenylalanin, Resistenz gegen L-Serin, Resistenz gegen L-Cystein, Resistenz gegen L- Valin, Empfindlichkeit gegenüber Fluoropyruvat, defekte Threonin-Dehydrogenase, gegebenenfalls Fähigkeit zur Saccharose-Verwertung, Verstärkung des Threonin-Operons, Verstärkung der Homoserin-Dehydrogenase I-Aspartatkinase I bevorzugt der feed back resistenten Form, Verstärkung der Homoserinkinase, Verstärkung der Threoninsynthase, Verstärkung der Aspartatkinase, gegebenenfalls der feed back resistenten Form, Verstärkung der Aspartatsemialdehyd- Dehydrogenase, Verstärkung der Phosphoenolpyruvat- Carboxylase, gegebenenfalls der feed back resistenten Form, Verstärkung der Phosphoenolpyruvat-Synthase, Verstärkung der Transhydrogenase, Verstärkung des RhtB-Genproduktes, Verstärkung des RhtC-Genproduktes, Verstärkung des YfiK- Genproduktes, Verstärkung der Malat : Chinon Oxidoreduktase und Verstärkung einer Pyruvat-Carboxylase und Abschwächung der Essigsäurebildung.

Es wurde gefunden, daß Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae nach Abschwächung, insbesondere Ausschaltung des für die PEP-Carboxykinase (EC 4.1.1.49) kodierenden pckA-Gens in verbesserter Weise L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin produzieren.

Die Nukleotidsequenz des pckA-Gens von Escherichia coli wurde von Medina et al. (Journal of Bacteriology 172, 7151- 7156 (1990)) publiziert und kann ebenfalls der von Blattner et al. (Science 277, 1453-1462 (1997) publizierten Genomsequenz von Escherichia coli entnommen werden. Die Nukleotidsequenz des pckA-Gens von Escherichia coli ist in SEQ ID No. 1 und die Aminosäuresequenz des dazugehörigen Genproduktes in SEQ ID No. 2 dargestellt.

Die in den angegebenen Textstellen beschriebenen pckA-Gene können erfindungsgemäß verwendet werden. Weiterhin können Allele des pckA-Gens verwendet werden, die sich aus der Degeneriertheit des genetischen Codes oder durch funktionsneutrale Sinnmutationen (sense mutations) ergeben.

Zur Erzielung einer Abschwächung können beispielsweise die Expression des pckA-Gens oder die katalytischen Eigenschaften des Enzymproteins herabgesetzt bzw. ausgeschaltet werden. Gegebenenfalls können beide Maßnahmen kombiniert werden.

Die Verringerung der Genexpression kann durch geeignete Kulturführung, durch genetische Veränderung (Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression oder auch durch Antisense-RNA Technik erfolgen. Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann unter anderem beispielsweise bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191-195 (1998)), bei Carrier und Keasling (Biotechnology Progress 15, 58-64 (1999)), Franch und Gerdes (Current Opinion in Microbiology 3, 159-164 (2000)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie beispielsweise dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990).

Mutationen, die zu einer Veränderung bzw. Herabsetzung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind aus dem Stand der Technik bekannt. Als Beispiele seien die Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Yano et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 95, 5511-5515 (1998), Wente und Schachmann (Journal of Biological Chemistry 266, 20833-20839 (1991)) genannt. Zusammenfassende Darstellungen können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.

Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen in Betracht. In Abhängigkeit von der Wirkung des Aminosäureaustausches auf die Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen (missense mutations) oder Nichtsinnmutationen (nonsense mutations) gesprochen. Insertionen oder Deletiorien von mindestens einem Basenpaar in einem Gen führen zu Rasterverschiebungsmutationen (frame shift mutations), die dazu führen, daß falsche Aminosäuren eingebaut werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Deletionen von mehreren Kodonen führen typischerweise zu einem vollständigen Ausfall der Enzymaktivität. Anleitungen zur Erzeugung derartiger Mutationen gehören zum Stand der Technik und können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.

Ein Beispiel für ein Plasmid, mit Hilfe dessen das pckA-Gen von Escherichia coli durch ortsspezifische Mutagenese abgeschwächt, insbesondere ausgeschaltet werden kann, ist das Plasmid pMAK705ΔpckA (Fig. 1). Es enthält lediglich einen Teil der 5'- und einen Teil der 3'-Region des pckA- Gens. Ein 349 bp langer Abschnitt der Kodierregion fehlt (Deletion). Die Sequenz dieser für die Mutagenese des pckA- Gens einsetzbaren DNA ist in SEQ ID No. 3 dargestellt.

Die Deletionsmutation des pckA-Gens kann durch Gen- bzw. Allelaustausch in geeignete Stämme eingebaut werden.

Eine gebräuchliche Methode ist die von Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 174, 4617-4622 (1989)) beschriebene Methode des Genaustauschs mit Hilfe eines konditional replizierenden pSC101-Derivates pMAK705. Andere im Stand der Technik beschriebene Methoden wie beispielsweise die von Martinez-Morales et al. (Journal of Bacteriology 1999, 7143-7148 (1999)) oder die von Boyd et al. (Journal of Bacteriology 182, 842-847 (2000)) können gleichfalls benutzt werden.

Nach erfolgtem Austausch liegt in dem betreffenden Stamm die in SEQ ID No. 4 dargestellte Form des ΔpckA-Allels vor, die ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist.

Es ist ebenfalls möglich, Mutationen im pckA-Gen oder Mutationen, die die Expression des pckA-Gens betreffen, durch Konjugation oder Transduktion in verschiedene Stämme zu überführen.

Weiterhin kann es für die Produktion von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin mit Stämmen der Familie Enterobacteriaceae vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung des pckA-Gens ein oder mehrere Enzyme des bekannten Threonin-Biosyntheseweges oder Enzyme des anaplerotischen Stoffwechsels oder Enzyme für die Produktion von reduziertem Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid- Phosphat zu verstärken.

Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor oder ein Gen verwendet, das für ein entsprechendes Enzym bzw. Protein mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.

So können beispielsweise gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe

- das für die Aspartatkinase, die Homoserin-Dehydrogenase, die Homoserinkinase und die Threoninsynthase kodierende thrABC-Operon (US-A-4,278,765),
- das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende pyc-Gen (DE- A-198 31 609),
- das für die Phosphoenolpyruvat-Synthase kodierende pps- Gen (Molecular and General Genetics 231: 332 (1992)),
- das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxylase kodierende ppc-Gen (Gene 31: 279-283 (1984)),
- die für die Transhydrogenase kodierenden Gene pntA und pntB (European Journal of Biochemistry 158: 647-653 (1986)),
- das Homoserinresistenz vermittelnde Gen rhtB (EP-A-0994190),
- das Threoninresistenz vermittelnde Gen rhtC (EP-A-1013765),
- das für die Glutamat-Dehydrogenase kodierende gdhA-Gen (Gene 27: 193-199 (1984))

verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.

Weiterhin kann es für die Produktion von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung des pckA-Gens eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe

- das für die Threonin-Dehydrogenase kodierende tdh-Gen (Ravnikar und Somerville, Journal of Bacteriology 169, 4716-4721 (1987)),
- das für die Malat-Dehydrogenase (E.C. 1.1.1.37) kodierende mdh-Gen (Vogel et al., Archives in Microbiology 149, 36-42 (1987)),
- das Genprodukt des offenen Leserahmens (orf) yjfA (Accession Number AAC77180 des National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA) und SEQ ID No. 5)
- das Genprodukt des offenen Leserahmens (orf) ytfP (Accession Number AAC77179 des National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA) und SEQ ID No. 5)

abzuschwächen, insbesondere auszuschalten oder die Expression zu verringern.

Die Abschwächung des offenen Leserahmens yjfA und/oder des offenen Leserahmens ytfP wird bevorzugt.

Es ist erfindungsgemäß ebenfalls möglich, die offenen Leserahmen yjfA und/oder ytfP unabhängig vom pckA-Gen abzuschwächen, um zu einer Verbesserung der Aminosäuren, insbesondere der L-Threonin-Produktion zu gelangen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte durchführt:

a) Fermentation von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen zumindest der offene Leserahmen yjfA und/oder ytfP abgeschwächt wird,
b) Anreicherung der L-hminosäure im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, und
c) Isolieren des L-Threonins, wobei man gegebenenfalls Bestandteile der Fermentationsbrühe und die Biomasse in ihrer Gesamtheit oder zum Teil zusammen mit der L-Aminosäure als festes Produkt isoliert.

Ein Beispiel für ein Plasmid, mit Hilfe dessen die offenen Leserahmen yjfA und ytfP von Escherichia coli durch ortsspezifische Mutagenese abgeschwächt, insbesondere ausgeschaltet werden können, ist das Plasmid pMAK705ΔyjfA (Fig. 2). Es enthält lediglich die 5'- und die 3'-Flanke der ytfP-yjfA Region einschließlich sehr kurzer Reste der offenen Leserahmen yjfA und ytfP. Ein 337 bp langer Teil der ytfP-yjfA Region fehlt (Deletion). Die Sequenz dieser für die Mutagenese der ytfP-yjfA Region einsetzbaren DNA ist in SEQ ID No. 6 dargestellt.

Ein weiteres Beispiel für ein Plasmid, mit Hilfe dessen die offenen Leserahmen yjfA und ytfP von Escherichia coli durch ortsspezifische Mutagenese abgeschwächt, insbesondere ausgeschaltet werden können, ist das Plasmid pMAK705Δ90bp (Fig. 5). Es enthält ebenfalls lediglich die 5'- und die 3'-Flanke der ytfP-yjfA Region einschließlich sehr kurzer Reste der offenen Leserahmen yjfA und ytfP. Ein 90 bp langer Teil der ytfP-yjfA Region fehlt (Deletion). Die Sequenz dieser für die Mutagenese der ytfP-yjfA Region einsetzbaren DNA ist in SEQ ID No. 7 dargestellt.

Diese Deletionsmutation kann durch Gen- bzw. Allelaustausch in geeignete Stämme eingebaut werden. Es ist ebenfalls möglich, Mutationen in den offenen Leserahmen yjfA und/oder ytfP oder Mutationen, die die Expression dieser offenen Leserahmen betreffen, durch Konjugation oder Transduktion in verschiedene Stämme zu überführen.

Nach erfolgtem Austausch liegt in dem betreffenden Stamm die in SEQ ID No. 6 oder SEQ ID No. 7 dargestellte Form des ΔytfP- und des ΔyjfA-Allels vor, die ebenfalls Gegenstand der Erfindung sind.

Weiterhin kann es für die Produktion von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin vorteilhaft sein, zusätzlich zur einzelnen oder gemeinsamen Abschwächung des pckA-Gens oder der offenen Leserahmen yjfA und/oder ytfP unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).

Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können im batch - Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.

Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) enthalten. Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und gegebenenfalls Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten, wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.

Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff haltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 25°C bis 45°C und vorzugsweise bei 30°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum an L- Aminosäuren bzw. L-Threonin gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.

Die Analyse von L-Aminosäuren kann durch Anionenaustauschchromatographie mit anschließender Ninhydrin Derivatisierung erfolgen, so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) beschrieben.

Eine Reinkultur des Escherichia coli K-12 Stammes DH5α/pMAK705 wurde am 12. September 2000 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß Budapester Vertrag als DSM 13720 hinterlegt.

Eine Reinkultur des Escherichia coli K-12 Stammes MG442ΔpckA wurde am 02. Oktober 2000 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß Budapester Vertrag als DSM 13761 hinterlegt.

Eine Reinkultur des Escherichia coli K-12 Stammes B-3996kurΔtdhΔpckA/pVIC40 wurde am 09. März 2001 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß Budapester Vertrag als DSM 14150 hinterlegt.

Eine Reinkultur des Escherichia coli K-12 Stammes MG442Δ90yjfA wurde am 09. Mai 2001 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß Budapester Vertrag als DSM 14289 hinterlegt.

Es ist erfindungsgemäß ebenfalls möglich, die Abschwächung der offenen Leserahmen ytfP und yjfA einzeln vorzunehmen, um zu einer verbesserten Herstellung von L-Aminosäuren zu gelangen.

Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, wie z. B. L-Threonin, L- Isoleucin, L-Methionin, L-Homoserin und L-Lysin, insbesondere L-Threonin.

Beispiele

Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli sowie alle Techniken zur Restriktion, Klenow- und alkalische Phosphatasebehandlung wurden nach Sambrook et al. (Molecular cloning - A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press) durchgeführt. Die Transformation von Escherichia coli wurde, wenn nicht anders beschrieben, nach Chung et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1989) 86: 2172-2175) durchgeführt.

Die Bebrütungstemperatur bei der Herstellung von Stämmen und Transformanten war 37°C. Bei dem Genaustauschververfahren nach Hamilton et.al. wurden Temperaturen von 30°C und 44°C verwendet.

Beispiel 1 Konstruktion der Deletionsmutation des pckA-Gens

Teile der 5'- und 3'-Region des pckA-Gens wurden aus Escherichia coli K12 unter Anwendung der Polymerase- Kettenreaktion (PCR) sowie synthetischen Oligonukleotiden amplifiziert. Ausgehend von der Nukletidsequenz des pckA- Gens in E. coli K12 MG1655 (SEQ ID No. 1) wurden folgende PCR-Primer synthetisiert (MWG Biotech, Ebersberg, Deutschland)
pckA'5'-l: 5'-GATCCGAGCCTGACAGGTTA-3'
pckA'5'-2: 5'-GCATGCGCTCGGTCAGGTTA-3'
pckA'3'-1: 5'-AGGCCTGAAGATGGCACTATCG-3'
pckA'3'-2: 5'-CCGGAGAAGCGTAGGTGTTA-3'

Die für die PCR eingesetzte chromosomale E. coli K12 MG1655 DNA wurde nach Herstellerangaben mit"Qiagen Genomic-tips 100/G" (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Ein ca. 500 bp grosses DNA-Fragment aus der 5'-Region des pckA-Gens (mit pck1 bezeichnet) und ein ca. 600 bp grosses DNA- Fragment aus der 3'-Region des pckA-Gens (mit pck2 bezeichnet) konnte mit den spezifischen Primern unter Standard-PCR-Bedingungen (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A guide to methods and applications, Academic Press) mit der Taq-DNA-Polymerase (Gibco-BRL, Eggenstein, Deutschland) amplifiziert werden. Die PCR-Produkte wurden den Herstellerangaben entsprechend jeweils mit dem Vektor pCR2.1TOPO (TOPO TA Cloning Kit, Invitrogen, Groningen, Niederlande) ligiert und in den E. coli Stamm TOP10F' transformiert. Die Selektion Plasmid tragender Zellen erfolgte auf LB Agar, der mit 50 µg/ml Ampicillin versetzt war. Nach der Plasmid DNA Isolierung wurde der Vektor pCR2.1TOPOpck2 mit den Restriktionsenzymen Stul und XbaI gespalten und das pck2-Fragment nach der Auftrennung im 0,8%igen Agarosegel mit Hilfe des QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden, Deutschschland) isoliert. Der Vektor pCR2.1TOPOpck1 wurde nach der Plasmid DNA Isolierung mit den Enzymen EcoRV und XbaI gespalten und mit dem isolierten pck2-Fragment ligiert. Der E. coli Stamm DH5α wurde mit dem Ligationsansatz transformiert und Plasmid tragende Zellen auf LB Agar, der mit 50 µg/ml Ampicillin versetzt war, selektioniert. Nach der Plasmid DNA Isolierung wurden durch die Kontrollspaltung mit den Enzymen SpeI und XbaI solche Plasmide nachgewiesen, in denen die in SEQ ID No. 3 dargestellte mutagene DNA Sequenz kloniert vorliegt. Eines der Plasmide wurde als pCR2.1TOPOΔpckA bezeichnet.

Beispiel 2 Konstruktion des Austauschvektors pMAK705ΔpckA

Das in Beispiel 1 beschriebene pckA-Allel wurde aus dem Vektor pCR2.1TOPOΔpckA nach der Restriktion mit den Enzymen SpeI und XbaI und Auftrennung im 0,8%igen Agarosegel isoliert und mit dem Plasmid pMAK705 (Hamilton et al. (1989) Journal of Bacteriology 174, 4617-4622), das mit dem Enzym XbaI verdaut worden war, ligiert. Der Ligationsansatz wurde in DH5α transformiert und Plasmid tragende Zellen auf LB Agar, der mit 20 µg/ml Chloramphenicol versetzt war, selektioniert. Die erfolgreiche Klonierung wurde nach Plasmid DNA Isolierung und Spaltung mit den Enzymen HpaI, KpnI, HindIII, SalI und PstI nachgewiesen. Der entstandene Austauschvektor pMAK705ΔpckA (= pMAK70SdeltapckA) ist in Fig. 1 dargestellt.

Beispiel 3 Ortsspezifische Mutagenese des pckA-Gens in dem E. coli Stamm MG442

Der L-Threonin produzierende E. coli Stamm MG442 ist in der Patentschrift US-A-4,278,765 beschrieben und bei der Russischen Nationalsammlung für industrielle Mikroorganismen (VKPM, Moskau, Russland) als CMIM B-1628 hinterlegt.

Der Stamm MG442 weist eine Resistenz gegen α-Amino-β- Hydroxyvaleriansäure auf und besitzt eine gegebenfalls partielle und kompensierbare Bedürftigkeit für L-Isoleucin.

Für den Austausch des chromosomalen pckA-Gens gegen das Plasmid-kodierte Deletionskonstrukt wurde MG442 mit dem Plasmid pMAK705ΔpckA transformiert. Der Genaustausch erfolgte mit dem von Hamilton et al. (1989) Journal of Bacteriology 174, 4617-4622) beschriebenen Selektionsverfahren und wurde durch Standard-PCR-Methoden (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A guide to methods and applications, Academic Press) mit folgenden Oligonukleotid Primern verifiziert:
pckA'5'-1: 5'-GATCCGAGCCTGACAGGTTA-3'
pckA'3'-2: 5'-CCGGAGAAGCGTAGGTGTTA-3'

Der erhaltene Stamm wurde als MG442ΔpckA bezeichnet.

Beispiel 4 Herstellung von L-Threonin mit dem Stamm MG442ΔpckA

MG442ΔpckA wurde auf Minimalmedium mit der folgenden Zusammensetzung vermehrt: 3,5 g/l Na₂HPO₄.2H₂O, 1,5 g/l KH₂PO₄, 1 g/l NH₄Cl, 0,1 g/l MgSO₄.7H₂O, 2 g/l Glucose, 20 g/l Agar. Die Bildung von L-Threonin wurde in batch Kulturen von 10 ml, die in 100 ml Erlenmeierkolben enthalten waren, überprüft. Dazu wurde 10 ml Vorkulturmedium der folgenden Zusammensetzung: 2 g/l Hefeextrakt, 10 g/l (NH₄)₂SO₄, 1 g/l KH₂PO₄, 0,5 g/l MgSO₄.7H₂O, 15 g/l CaCO₃, 20 g/l Glucose beimpft und für 16 Stunden bei 37°C und 180 rpm auf einem ESR Inkubator der Firma Kühner AG (Birsfelden, Schweiz) inkubiert. 250 µl dieser Vorkultur wurden in 10 ml Produktionsmedium (25 g/l (NH₄)₂SO₄, 2 g/l KH₂PO₄, 1 g/l MgSO₄.7H₂O, 0,03 g/l FeSO₄.7H₂O, 0,018 g/l MnSO₄.1H₂O, 30 g/l CaCO₃, 20 g/l Glucose) überimpft und für 48 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde die optische Dichte (OD) der Kultursuspension mit einem LP2 W-Photometer der Firma Dr. Lange (Berlin, Deutschland) bei einer Messwellenlänge von 660 nm bestimmt.

Anschließend wurde die Konzentration an gebildetem L- Threonin im steril filtrierten Kulturüberstand mit einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenreaktion mit Ninhydrindetektion bestimmt.

In Tabelle 1 ist das Ergebnis des Versuches dargestellt.

Tabelle 1

Ab hier 2. Innere Priorität

Beispiel 5 Herstellung von L-Threonin mit dem Stamm MG442ΔpckA/pMW218gdhA 5.1 Amplifizierung und Klonierung des gdhA-Gens

Das Glutamat-Dehydrogenase-Gen aus Escherichia coli K12 wird unter Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) sowie synthetischen Oligonukleotiden amplifiziert. Ausgehend von der Nukleotidsequenz für das gdhA-Gen in E. coli K12 MG1655 (GenBank: Accession Nr. AE000270 und Nr. AE000271) werden PCR-Primer synthetisiert (MWG Biotech, Ebersberg, Deutschland):
Gdh1: 5'-TGAACACTTCTGGCGGTACG-3'
Gdh2: 5'-CCTCGGCGAAGCTAATATGG-3'

Die für die PCR eingesetzte chromosomale E. coli K12 MG1655 DNA wird nach Herstellerangaben mit "QIAGEN Genomic-tips 100/G" (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Ein ca. 2150 bp großes DNA-Fragment, das den gdhA-Kodierbereich und ca. 350 bp 5'-flankierende und ca. 450 bp 3'-flankierende Sequenzen umfaßt, kann mit den spezifischen Primern unter Standard-PCR-Bedingungen (Innis et al.: PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press) mit der Pfu-DNA Polymerase (Promega Corporation, Madison, USA) amplifiziert werden. Das PCR-Produkt wird in das Plasmid pCR2.1TOPO kloniert und in den E. coli Stamm TOP10 transformiert (Invitrogen, Leek, Niederlande, Produktbeschreibung TOPO TA Cloning Kit, Cat. No. K4500- 01). Die erfolgreiche Klonierung wird durch Spaltung des Plasmids pCR2.1TOPOgdhA mit den Restriktionsenzymen EcoRI und EcoRV nachgewiesen. Dazu wird die Plasmid DNA mittels des "QIAprep Spin Plasmid Kits" (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert und nach der Spaltung in einem 0,8%igen Agarosegel aufgetrennt.

5.2 Klonierung des gdhA-Gens in den Plasmidvektor pMW218

Das Plasmid pCR2.1TOPOgdhA wird mit dem Enzym EcoRI gespalten, der Spaltungsansatz im 0,8%igen Agarosegel aufgetrennt und das 2,1 kbp große gdhA-Fragment mit Hilfe des "OIAquick Gel Extraction Kit" (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Das Plasmid pMW218 (Nippon Gene, Toyama, Japan) wird mit dem Enzym EcoRI gespalten und mit dem gdhA-Fragment ligiert. Der E. coli Stamm DH5α wird mit dem Ligationsansatz transformiert und pMW218 tragende Zellen durch Ausplattieren auf LB Agar (Lennox, Virology 1955, 1: 190), der mit 20 µg/ml Kanamycin versetzt ist, selektioniert.

Die erfolgreiche Klonierung des gdhA-Gens kann nach der Plasmid DNA-Isolierung und Kontrollspaltung mit EcoRI und EcoRV nachgewiesen werden. Das Plasmid wird als pMW218gdhA (Fig. 3) bezeichnet.

5.3 Herstellung des Stammes MG442ΔpckA/pMW21BgdhA

Der in Beispiel 3 erhaltene Stamm MG442ΔpckA und der Stamm MG442 werden mit dem Plasmid pMW218gdhA transformiert und Transformanten auf LB-Agar selektioniert, der mit 20 µg/ml Kanamycin supplementiert ist. Auf diese Weise entstehen die Stämme MG442ΔpckA/pMW218gdhA und MG442/pMW218gdhA.

5.4 Herstellung von L-Threonin

Die Herstellung von L-Threonin durch die Stämme MG442ΔpckA/pMW218gdhA und MG442/pMW218gdhA wird wie in Beispiel 4 beschrieben geprüft. Das Minimalmedium und das Vorkulturmedium werden zusätzlich mit 20 µg/ml Kanamycin supplementiert.

In Tabelle 2 ist das Ergebnis des Versuches zusammengefasst.

Tabelle 2

Beispiel 6 Herstellung von L-Threonin mit dem Stamm MG442ΔpckA/pMW219rhtC 6.1 Amplifizierung des rhtC-Gens

Das rhtC-Gen aus Escherichia coli K12 wird unter Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) sowie synthetischen Oligonukleotiden amplifiziert. Ausgehend von der Nukleotidsequenz für das rhtC-Gen in E. coli K12 MG1655 (GenBank: Accession Nr. AE000458, Zakataeva et al. (FEBS Letters 452, 228-232 (1999)) werden PCR-Primer synthetisiert (MWG Biotech, Ebersberg, Deutschland):
RhtC1: 5'-CTGTTAGCATCGGCGAGGCA-3'
RhtC2: 5'-GCATGTTGATGGCGATGACG-3'

Die für die PCR eingesetzte chromosomale E. coli K12 MG1655 DNA wird nach Herstellerangaben mit "QIAGEN Genomic-tips 100/G" (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Ein ca. 800 bp großes DNA-Fragment kann mit den spezifischen Primern unter Standard-PCR-Bedingungen (Innis et al.: PCR protocols, A guide to methods and applications, 1990, Academic Press) mit der Pfu-DNA Polymerase (Promega Corporation, Madison, USA) amplifiziert werden.

6.2 Klonierung des rhtC-Gens in den Plasmidvektor pMW219

Das Plasmid pMW219 (Nippon Gene, Toyama, Japan) wird mit dem Enzym SmaI gespalten und mit dem rhtC-PCR-Fragment ligiert. Der E. coli Stamm DH5α wird mit dem Ligationsansatz transformiert und pMW219 tragende Zellen auf LB Agar, der mit 20 µg/ml Kanamycin supplementiert ist, selektioniert. Die erfolgreiche Klonierung kann nach der Plasmid DNA-Isolierung und Kontrollspaltung mit KpnI, HindIII und NcoI nachgewiesen werden. Das Plasmid pMW219rhtC ist in Fig. 4 dargestellt.

6.3 Herstellung des Stammes MG442ΔpckA/pMW219rhtC

Der in Beispiel 3 erhaltene Stamm MG442ΔpckA und der Stamm MG442 werden mit dem Plasmid pMW219rhtC transformiert und Transformanten auf LB-Agar selektioniert, der mit 20 µg/ml Kanamycin supplementiert ist. Auf diese Weise entstehen die Stämme MG442ΔpckA/pMW219rhtC und MG442/pMW219rhtC.

6.4 Herstellung von L-Threonin

Die Herstellung von L-Threonin durch die Stämme MG442ΔpckA/pMW219rhtC und MG442/pMW219rhtC wird wie in Beispiel 4 beschrieben geprüft. Das Minimalmedium und das Vorkulturmedium werden zusätzlich mit 20 µg/ml Kanamycin supplementiert.

In Tabelle 3 ist das Ergebnis des Versuches zusammengefasst.

Tabelle 3

Beispiel 7 Herstellung von L-Threonin mit dem Stamm B- 3996kurΔtdhΔpckA/pVIC40

Der L-Threonin produzierende E. coli Stamm B-3996 ist in US-A- 5,175,107 beschrieben und bei der Russischen Nationalsammlung für industrielle Mikroorganismen (VKPM, Moskau, Russland) hinterlegt.

Der Stamm B-3996 weist unter anderem eine Resistenz gegen α-Amino-β-Hydroxyvaleriansäure auf, besitzt eine abgeschwächte, insbesondere ausgeschaltete, beziehungsweise defekte Threonindehydrogenase, besitzt eine verstärkte Homoserin-Dehydrogenase I-Aspartatkinase I in der feed back resistenten Form, besitzt eine gegebenfalls partielle und kompensierbare Bedürftigkeit für L-Isoleucin und besitzt die Fähigkeit zur Saccharose-Verwertung.

7.1 Herstellung des Stammes B-3996kurΔtdhΔpckA/pVIC40

Von Stamm B-3996 wird nach Kultur im Antibiotika-freien Vollmedium für ungefähr zehn Generationen ein Derivat isoliert, das das Plasmid pVIC40 nicht mehr enthält. Der entstandene Stamm ist Streptomycin-sensitiv und wird als B-3996kur bezeichnet.

Zum Einbau einer Deletion in das tdh-Gen wird die von Hamilton et al. (Journal of Bacteriology (1989) 171: 4617-4622) beschriebene Methode eingesetzt, die auf der Verwendung des Plasmids pMAK705 mit einem temperatursensitiven Replikon beruht. Das Plasmid pDR121 (Ravnikar und Somerville, Journal of Bacteriology (1987) 169: 4716-4721) enthält ein 3,7 Kilo-Basenpaare (kbp) großes DNA-Fragment aus EX coli, auf dem das tdh-Gen kodiert ist. Zur Erzeugung einer Deletion des tdh-Genbereiches wird pDR121 mit den Restriktionsenzymen ClaI und EcoRV gespalten und das isolierte 5 kbp große DNA-Fragment nach Behandlung mit dem Klenow-Enzym ligiert. Der Ligationsansatz wird in den E. coli Stamm DH5α transformiert und Plasmid tragende Zellen auf LB Agar, der mit 50 µg/ml Ampicillin versetzt ist, selektioniert.

Die erfolgreiche Deletion des tdh-Gens kann nach der Plasmid-DNA Isolierung und Kontrollspaltung mit EcoRI nachgewiesen werden. Das 1,7 kbp große EcoRI-Fragment wird isoliert und mit dem Plasmid pMAK705, das partiell mit EcoRI verdaut wird, ligiert. Der Ligationsansatz wird in DH5α transformiert und Plasmid tragende Zellen auf LB Agar, der mit 20 µg/ml Chloramphenicol versetzt ist, selektioniert. Die erfolgreiche Klonierung wird nach Plasmid-DNA Isolierung und Spaltung mit EcoRI nachgewiesen. Das entstandene pMAK705 Derivat wird als pDM32 bezeichnet.

Für den Genaustausch wird B-3996kur mit dem Plasmid pDM32 transformiert. Der Austausch des chromosomalen tdh-Gens gegen das Plasmid-kodierte Deletionskonstrukt erfolgt mit dem von Hamilton et al. beschriebenen Selektionsverfahren und wird durch Standard-PCR-Methoden (Innis et al. (1990), PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) mit folgenden Oligonukleotid Primern verifiziert:
Tdh1: 5'-TCGCGACCTATAAGTTTGGG-3'
Tdh2: 5'-AATACCAGCCCTTGTTCGTG-3'.

Der entstandene Stamm wird auf Kanamycin-Sensitivität getestet und als B-3996kurΔtdh bezeichnet.

Für die ortsspezifische Mutagenese des pckA-Gens wird B- 3996kurΔtdh mit dem in Beispiel 2 beschriebenen Austauschvektor pMAK705ΔpckA transformiert. Der Austausch des chromosomalen pckA-Gens gegen das Plasmid-kodierte Deletionskonstrukt erfolgt wie in Beispiel 3 beschrieben. Der erhaltene Stamm wird als B-3996kurΔtdhΔpckA bezeichnet.

B-3996kurΔtdh und B-3996kurΔtdhΔpckA werden mit dem aus B- 3996 isolierten Plasmid pVIC40 transformiert und auf LB- Agar mit 20 µg/ml Streptomycin Plasmid tragende Zellen selektioniert. Jeweils eine ausgewählte Einzelkolonie wird mit B-3996kurΔtdh/pVIC40 und mit B-3996kurΔtdhΔpckA/pVIC40 bezeichnet.

7.2 Herstellung von L-Threonin

Die Herstellung von L-Threonin durch die Stämme B-3996kurΔtdh/pVIC40 und B-3996kurΔtdhΔpckA/pVIC40 wird wie im Beispiel 4 beschrieben geprüft. Das Minimalmedium, das Vorkulturmedium und das Produktionsmedium werden zusätzlich mit 20 µg/ml Streptomycin supplementiert.

In Tabelle 4 ist das Ergebnis des Versuches zusammengefasst.

Tabelle 4

Beispiel 8 Herstellung von L-Lysin mit dem Stamm TOC2IRΔpckA

Der L-Lysin produzierende E. coli Stamm pDA1/TOC21R ist in der Patentanmeldung F-A-2511032 beschrieben und bei der Collection Nationale de Culture de Microorganisme (CNCM, Institut Pasteur, Paris, Frankreich) unter der Nummer I-167 hinterlegt. Der Stamm und der plasmidfreie Wirt sind ebenfalls bei Dauce-Le Reverend et al. (European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology 15: 227-231 (1982)) unter der Bezeichnung TOCR21/pDA1 beschrieben.

8.1 Ortsspezifische Mutagenese des pckA-Gens in dem E. coli Stamm TOC21R

Von Stamm pDA1/TOC21R wird nach Kultur im Antibiotika freien LB-Medium für ungefähr sechs Generationen ein Derivat isoliert, das das Plasmid pDA1 nicht mehr enthält. Der entstandene Stamm ist Tetracyclin-sensitiv und wird als TOC21R bezeichnet.

Für den Austausch des chromosomalen pckA-Gens gegen das Plasmid-kodierte Deletionskonstrukt wird TOC21R mit dem Plasmid pMAK705ΔpckA (Beispiel 2) transformiert. Der Genaustausch erfolgt mit dem von Hamilton et al. (1989) Journal of Bacteriology 174, 4617-4622) beschriebenen Selektionsverfahren und wird durch Standard-PCR-Methoden (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) mit folgenden Oligonukleotid Primern verifiziert:
pckA'5'-1: 5'-GATCCGAGCCTGACAGGTTA-3'
pckA'3'-2: 5'-CCGGAGAAGCGTAGGTGTTA-3'

Der erhaltene Stamm wird als TOC21RΔpckA bezeichnet.

8.2 Herstellung von L-Lysin mit dem Stamm TOC21RΔpckA

Die Bildung von L-Lysin durch die Stämme TOC21RΔpckA und TOC21R wird in batch Kulturen von 10 ml, die in 100 ml Erlenmeierkolben enthalten sind, überprüft. Dazu wird 10 ml Vorkulturmedium der folgenden Zusammensetzung: 2 g/l Hefeextrakt, 10 g/l (NH₄)₂SO₄, 1 g/l KH₂PO₄, 0,5 g/l MgSO₄.7H₂O, 15 g/l CaCO₃, 20 g/l Glucose beimpft und für 16 Stunden bei 37°C und 180 rpm auf einem ESR Inkubator der Firma Kühner AG (Birsfelden, Schweiz) inkubiert. 250 µl dieser Vorkultur werden in 10 ml Produktionsmedium (25 g/l (NH₄)₂SO₄, 2 g/l KH₂PO₄, 1 g/l MgSO₄.7H₂O, 0,03 g/l FeSO₄.7H₂O, 0,018 g/l MnSO₄.1H₂O, 30 g/l CaCO₃, 20 g/l Glucose, 25 mg/l L-Isoleucin und 5 mg/l Thiamin) überimpft und für 72 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wird die optische Dichte (OD) der Kultursuspension mit einem LP2W-Photometer der Firma Dr. Lange (Berlin, Deutschland) bei einer Messwellenlänge von 660 nm bestimmt.

Anschließend wird die Konzentration an gebildetem L-Lysin im steril filtrierten Kulturüberstand mit einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenreaktion mit Ninhydrindetektion bestimmt. In Tabelle 5 ist das Ergebnis des Versuches dargestellt.

Tabelle 5

Beispiel 9 Herstellung von L-Isoleucin mit dem Stamm Stamm B-3996kurΔtdhilvA⁺ΔpckA/pVIC40 9.1 Herstellung des Stammes B-3996kurΔtdhilvA⁺ΔpckA/pVIC40

Der in Beispiel 7.1 erhaltene L-Isoleucin bedürftige Stamm B-3996kurΔtdh wird unter Zuhilfenahme des Phagen P1kc (Lennox, Virology 1, 190-206 (1955); Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbour Laboratory 1972) transduziert und L-Isoleucin prototrophe Transduktanten isoliert.

Hierzu wird der Phage P1kc auf dem Stamm MG1655 (Guyer et ab, Cold Spring Harbor Symposium of Quantitative Biology 45, 135-140 (1981) und Blattner et al., Science 277, 1453- 1462 (1997))vermehrt und das Phagenlysat zur Transduktion des Stammes B-3996kurΔtdh eingesetzt. Die Multiplizität der Infektion beträgt ungefähr 0,2. Die Selektion auf L- Isoleucin protrophe Transduktanten erfolgt auf Minimal- Agar, der 2 g/l Glucose und 10 mg/l L-Threonin enthält. Eine L-Isoleucin prototrophe Transduktante wird isoliert, zur Reinigung beziehungsweise Vereinzelung auf LB-Agar ausgestrichen und als B-3996kurΔtdhilvA+ bezeichnet.

Das pckA-Gen des Stammes B-3996kurΔtdhilvV wird anschliessend gegen das in Beispiel 1 und 2 hergestellte ΔpckA-Allel so wie in Beispiel 3 beschrieben ausgetauscht. Der erhaltene Stamm wird als B-3996kurΔtdhilvA⁺ΔpckA bezeichnet.

Die Stämme B-3996kurΔtdhilvA⁺ und B-3996kurΔtdhilvA⁺ΔpckA werden mit dem aus Stamm B-3996 isolierten Plasmid pVIC40 transformiert und Plasmid tragende Zellen auf LB-Agar, der mit 20 µg/ml Streptomycin supplementiert ist, selektioniert. Jeweils eine ausgewählte Einzelkolonie wird als B-3996kurΔtdhilvA⁺ΔpckA/pVIC40 und B- 3996kurΔtdhilvA⁺/pVIC40 bezeichnet.

9.2 Herstellung von L-Isoleucin

Die Herstellung von L-Isoleucin durch die Stämme 8- 3996kurΔtdhilvA⁺/pVIC40 und B-3996kurΔtdhilvA⁺ΔpckAlpVIC40 wird unter den Versuchsbedingungen, wie in Beispiel 4 beschrieben, geprüft. Das Minimalmedium, das Vorkulturmedium und das Produktionsmedium werden zusätzlich mit 20 µg/ml Streptomycin supplementiert.

In Tabelle 6 ist das Ergebnis des Versuches dargestellt.

Tabelle 6

Beispiel 10 Herstellung von L-Valin mit dem Stamm B-12288ΔpckA

Der L-Valin produzierende E. coli Stamm AJ 11502 ist in der Patentschrift US-A-4391907 beschrieben und bei dem National Center for Agricultural Utilization Research (Peoria, Illinois, USA) als NRRL B-12288 hinterlegt.

10.1 Ortsspezifische Mutagenese des pckA-Gens in dem E. coli Stamm B-1288

Von Stamm AJ 11502 wird nach Kultur im Antibiotika-freien LB-Medium für ungefähr sechs Generationen ein plasmidfreies Derivat isoliert. Der entstandene Stamm ist Ampicillin sensitiv und wird als AJ11502kur bezeichnet.

Für den Austausch des chromosomalen pckA-Gens gegen das Plasmid-kodierte Deletionskonstrukt wird AJ11502kur mit dem Plasmid pMAK705ΔpckA (Siehe Beispiel 2) transformiert. Der Genaustausch erfolgt mit dem von Hamilton et al. (1989) Journal of Bacteriology 174, 4617-4622) beschriebenen Selektionsverfahren und wird durch Standard-PCR-Methoden (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) mit folgenden Oligonukleotid Primern verifiziert:
pckA'5'-1: 5'-GATCCGAGCCTGACAGGTTA-3'
pckA'3'-2: 5'-CCGGAGAAGCGTAGGTGTTA-3'

Der erhaltene Stamm wird als AJ11502kurΔpckA bezeichnet. Aus Stamm NRRL B-12288 wird das in der Patentschrift US-A- 4391907 beschriebene Plasmid isoliert, welches die genetische Information bezüglich der Valin-Produktion trägt. Der Stamm AJ11502kurΔpckA wird mit diesem Plasmid transformiert. Eine der erhaltenen Transformanten wird als B-12288ΔpckA bezeichnet.

10.2 Herstellung von L-Valin mit dem Stamm B-12288ΔpckA

Die Bildung von L-Valin durch die Stämme B-12288ΔpckA und NRRL B-12288 wird in batch Kulturen von 10 ml, die in 100 ml Erlenmeierkolben enthalten sind, überprüft. Dazu wird 10 ml Vorkulturmedium der folgenden Zusammensetzung: 2 g/l Hefeextrakt, 10 g/l (NH₄)₂SO₄, 1 g/l KH₂PO₄, 0,5 g/l MgSO₄.7H₂O, 15 g/l CaCO₃, 20 g/l Glucose und 50 mg/l Ampicillin beimpft und für 16 Stunden bei 37°C und 180 rpm auf einem ESR Inkubator der Firma Kühner AG (Birsfelden, Schweiz) inkubiert. 250 µl dieser Vorkultur werden in 10 ml Produktionsmedium (25 g/l (NH₄)₂SO₄, 2 g/l KH₂FO₄, 1 g/l MgSO₄.7H₂O, 0,03 g/l FeSO₄.7H₂O, 0,018 g/l MnSO₄.1H₂O, 30 g/l CaCO₃, 20 g/l Glucose, 5 mg/l Thiamin und 50 mg/l Ampicillin) überimpft und für 72 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wird die optische Dichte (OD) der Kultursuspension mit einem LP2W-Photometer der Firma Dr. Lange (Berlin, Deutschland) bei einer Messwellenlänge von 660 nm bestimmt.

Anschließend wird die Konzentration an gebildetem L-Valin im steril filtrierten Kulturüberstand mit einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenreaktion mit Ninhydrindetektion bestimmt.

In Tabelle 7 ist das Ergebnis des Versuches dargestellt.

Tabelle 7

Beispiel 11 Konstruktion von Deletionsmutationen der ytfP-yjfA Genregion

Die ytfP-yjfA Genregion wird aus Escherichia coli K12 unter. Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) sowie synthetischen Oligonukleotiden amplifiziert. Ausgehend von der Nukleotidsequenz der ytfP-yjfA Genregion in E. coli K12 MG1655 (SEQ ID No. 5) werden folgende PCR-Primer synthetisiert (MWG Biotech, Ebersberg, Deutschland):
ytfP-1: 5'-GGCGATGTCGCAACAAGCTG-3'
ytfP-2: 5'-CTGTTCATGGCCGCTTGCTG-3'

Die für die PCR eingesetzte chromosomale E. coli K12 MG1655 DNA wird nach Herstellerangaben mit "Qiagen Genomic-tips 100/G" (QIAGEN, Hilden; Deutschland) isoliert. Ein ca. 1300 bp grosses DNA-Fragment kann mit den spezifischen Primern unter Standard-PCR-Bedingungen (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A guide to methods and applications, Academic Press) mit der Taq-DNA-Polymerase (Gibco-BRL, Eggenstein, Deutschland) amplifiziert werden. Das PCR-Produkt wird den Herstellerangaben entsprechend mit dem Vektor pCR2.1TOPO (TOPO TA Cloning Kit, Invitrogen, Groningen, Niederlande) ligiert und in den E, coli Stamm TOP10F' transformiert. Die Selektion Plasmid tragender Zellen erfolgt auf LB Agar, der mit 50 µg/ml Ampicillin versetzt ist. Nach der Plasmid DNA Isolierung wird die erfolgreiche Klonierung des PCR- Produktes mit den Restriktionsenzymen EcoRI und NsiI überprüft.

Zur Erzeugung einer 337 bp Deletion in der ytfP-yjfA Region wird der Vektor pCR2.1TOPOytfP-yjfA mit den Restriktionsenzymen NdeI und SspI gespalten und das 4,8 kbp große DNA-Fragment nach Behandlung mit dem Klenow-Enzym ligiert.

Zur Erzeugung einer 90 bp Deletion wird der Vektor pCR2.1TOPOytfP-yjfA mit den Enzymen NdeI und SplI gespalten und das 5 kbp große DNA-Fragment nach Behandlung mit dem Klenow-Enzym ligiert.

Der E. coli Stamm DH5α wird mit den Ligationsansätzen transformiert und Plasmid tragende Zellen auf LB Agar, der mit 50 µg/ml Ampicillin versetzt ist, selektioniert. Nach der Plasmid DNA Isolierung werden durch die Kontrollspaltung mit den Enzym EcoRI solche Plasmide nachgewiesen, in denen die in SEQ ID No. 6 und die in SEQ ID No. 7 dargestellte mutagene DNA Sequenz kloniert vorliegt. Die Plasmide werden als pCR2.1TOPOΔyjfA und pCR2.1TOPOΔ90bp bezeichnet.

Beispiel 12 Konstruktion der Austauschvektoren pNAK705ΔyjfA und pMAK705Δ90bp

Die in Beispiel 11 beschriebenen ytfP-yjfA Allele werden aus den Vektoren pCR2.1TOPOΔyjfA und pCR2.1TOPOΔ90bp nach der Restriktion mit den Enzymen SacI und XbaI und Auftrennung im 0,8%igen Agarosegel isoliert und mit dem Plasmid pMAK705 (Hamilton et al. (1989) Journal of Bacteriology 174, 4617-4622), das mit den Enzymen SacI und XbaI verdaut wird, ligiert. Die Ligationsansätze werden in DH5α transformiert und Plasmid tragende Zellen auf LB Agar, der mit 20 µg/ml Chloramphenicol versetzt ist, selektioniert. Die erfolgreiche Klonierung wird nach Plasmid DNA Isolierung und Spaltung mit den Enzymen SacI und XbaI nachgewiesen. Die entstandenen Austauschvektoren pNAK705ΔyjfA (= pMAK705deltayjfA) und pMAK705Δ90bp (=pMAK705delta90bp) sind in Fig. 2 und in Fig. 5 dargestellt.

Beispiel 13 Ortsspezifische Mutagenese der ytfP-yjfA Genregion in dem E. coli Stamm MG442

Für den Austausch der chromosomalen ytf9-yjfA Genregion gegen das Plasmid-kodierte 90 bp Deletionskonstrukt wird MG442 mit dem Plasmid pMAK705Δ90bp transformiert. Der Genaustausch erfolgt mit dem von Hamilton et al. (1989) Journal of Bacteriology 174, 4617-4622) beschriebenen Selektionsverfahren und wird durch Standard-PCR-Methoden (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A guide to methods and applications, Academic Press) mit folgenden Oligonukleotid Primern verifiziert:
ytfP-1: 5'-GGCGATGTCGCAACAAGCTG-3'
ytfP-2: 5'-CTGTTCATGGCCGCTTGCTG-3'

Der erhaltene Stamm wird als MG442Δ90yjfA bezeichnet.

Beispiel 14 Herstellung von L-Threonin mit dem Stamm MG442Δ90yjfA

Die Herstellung von L-Threonin durch den Stamm MG442Δ90yjfA wird wie in Beispiel 4 beschrieben geprüft. In Tabelle 8 ist das Ergebnis des Versuches zusammengefasst.

Tabelle 8

Beispiel 14 Herstellung von L-Threonin mit dem Stamm MG442Δ90yjfAΔpckA

14.1 Herstellung des Stammes MG442Δ90yjfAΔpckA Das pckA-Gen des Stammes MG442Δ90yjfA wird wie in Beispiel 3 beschrieben gegen das ΔpckA-Allel (Siehe Beispiel 1 und 2) ausgetauscht. Der erhaltene Stamm wird als MG442Δ90yjfAΔpckA bezeichnet.

14.2 Herstellung von L-Threonin

Die Herstellung von L-Threonin mit dem Stamm MG442Δ90yjfAΔpckA erfolgt wie in Beispiel 4 beschrieben.

Das Ergebnis ist in Tabelle 9 dargestellt.

Tabelle 9

Folgende Figuren sind beigefügt:

Fig. 1: pMAK705ΔpckA (= pMAK705deltapckA)

Fig. 2: pMAK705ΔyjfA (= pMAK705deltayjfA)

Fig. 3: pMW218gdhA

Fig. 4: pMW219rhtC

Fig. 5: pMAK705Δ90bp (= pMAK705delta90bp)

Längenangaben sind als ca.-Angaben aufzufassen. Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben folgende Bedeutung:
cat: Chloramphenicolresistenzgen
rep-ts: temperatursensitive Replikationsregion des Plasmides pSC101
pck1: Teil der 5'-Region des pckA-Gens
pck2: Teil der 3'-Region des pckA-Gens
ytfP'-yjfA': DNA-Sequenz enthaltend trunkierte Kodierregionen von ytfP und yjfA
kan: Kanamycinresistenzgen
gdhA: Glutamat-Dehydrogenase-Gen
rhtC: Threoninresistenz vermittelndes Gen

Die Abkürzungen für die Restriktionsenzyme haben folgende Bedeutung
BamHI: Restriktionsendonuklease aus Bacillus amyloliquefaciens
BglII: Restriktionsendonuklease aus Bacillus globigii
ClaI: Restriktionsendonuklease aus Caryphanon latum
EcoRI: Restriktionsendonuklease aus Escherichia coli
EcoRV: Restriktionsendonuklease aus Escherichia coli
HindIII: Restriktionsendonuklease aus Haemophilus influenzae
KpnI: Restriktionsendonuklease aus Klebstella pneumoniae
PstI: Restriktionsendonuklease aus Providencia stuartii
PvuI: Restriktionsendonuklease aus Proteus vulgaris
SacI: Restriktionsendonuklease aus Streptomyces achromogenes
SalI: Restriktionsendonuklease aus Streptomyces albus
SmaI: Restriktionsendonuklease aus Serratia marcescens
XbaI: Restriktionsendonuklease aus Xanthomonas badrii
XhoI: Restriktionsendonuklease aus Xanthomonas holcicola

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Verfahren zur fermentativen Herstellung von L- Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte durchführt:

a) Fermentation der die gewünschte L-Aminosäure produzierenden Mikroorganismen der Familie Enterobactericeae, in denen man zumindest das pckA-Gen oder dafür kodierende Nukleotidsequenzen abschwächt, insbesondere ausschaltet,
b) Anreicherung der L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Bakterien und
c) Isolieren der L-Aminosäure, wobei man gegebenenfalls Bestandteile Fermentationsbrühe und die Biomasse in ihrer Gesamtheit oder zum Teil zusammen mit der L-Aminosäure als festes Produkt isoliert:

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen einsetzt, in denen man zusätzlich weitere Gene des Biosyntheseweges der gewünschten L-Aminosäure verstärkt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung der gewünschten L-Aminosäure verringern.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Expression des (der) Polynukleotides (e), das (die) für das pckA-Gen kodiert (kodieren) abschwächt, insbesondere ausschaltet.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die regulatorischen und/oder katalytischen Eigenschaften des Polypeptids (Enzymprotein) verringert, für das das Polynukleotid pckA kodiert.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von L-Aminosäuren Mikroorganismen der Familie Enterobactericeae fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe:

1. 6.1 das für die Aspartatkinase, die Homoserin- Dehydrogenase, die Homoserinkinase und die Threoninsynthase kodierende thrABC-Operon,
2. 6.2 das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende pyc- Gen,
3. 6.3 das für die Phosphoenolpyruvat-Synthase kodierende pps-Gen,
4. 6.4 das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxylase kodierende ppc-Gen,
5. 6.5 die für die Transhydrogenase kodierende Gene pntA und pntB,
6. 6.6 das Homoserinresistenz vermittelnde Gen rhtB,
7. 6.7 das Threoninresistenz vermittelnde Gen rhtC, und
8. 6.8 das für die Glutamat-Dehydrogenase kodierende gdhA-Gen

verstärkt, insbesondere überexprimiert.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von L-Aminosäuren Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe:

1. 7.1 das für die Threonin-Dehydrogenase kodierende tdh- Gen,
2. 7.2 das für die Malat-Dehydrogenase kodierende mdh- Gen,
3. 7.3 das Genprodukt des offenen Leserahmens (orf) yjfA,
4. 7.4 das Genprodukt des offenen Leserahmens (orf) ytfP,

abschwächt, insbesondere ausschaltet oder die Expression verringert.

8. Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte durchführt:

a) Fermentation der die gewünschte L-Aminosäure produzierende Mikroorganismen der Familie Entero bactericeae, in denen man zumindest den offenen Leserahmen yjfA und/oder ytfp oder dafür kodierende Nukleotidsequenzen abschwächt, insbesondere aus schaltet,
b) Anreicherung der L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Bakterien und
c) Isolieren der L-Aminosäure, wobei man gegebenenfalls Bestandteile der Fermentationsbrühe und die Biomasse in ihre Gesamtheit oder zum Teil zusammen mit der L- Aminosäure als festes Produkt isoliert.

9. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß man L-Isoleucin, L-Valin, L-Lysin oder L-Threonin herstellt.

10. L-Aminosäuren produzierende Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen mindestens das pckA-Gen oder dafür kodierende Nukleotidsequenzen abgeschwächt, insbesondere ausgeschaltet sind.

11. L-Aminosäuren produzierende Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae gemäß Anspruch 10, die zusätzlich ein oder mehrere der Merkmale ausgewählt aus der Gruppe: eine Resistenz gegen α-Amino-β- Hydroxyvaleriansäure, eine verstärkte Homoserin- Dehydrogenase I-Aspartatkinase I in der feed back resistenten Form, eine gegebenenfalls kompensierbare partielle Bedürftigkeit für L-Isoleucin, eine abgeschwächte Threonindehydrogenase und die Fähigkeit zur Saccharose-Verwertung besitzen.

12. L-Aminosäuren produzierende Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae in denen mindestens der offene Leserahmen yjfA und/oder ytfP oder dafür kodierende Nukleotidsequenzen abgeschwächt, insbesondere ausgeschaltet sind.

13. L-Aminosäuren produzierende Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae gemäß Anspruch 12, die zusätzlich ein oder mehrere der Merkmale ausgewählt aus der Gruppe: eine Resistenz gegen α-Amino-β- Hydroxyvaleriansäure, eine verstärkte Homoserin- Dehydrogenase I-Aspartatkinase I in der feed back resistenten Form, eine gegebenenfalls kompensierbare partielle Bedürftigkeit für L-Isoleucin, eine abgeschwächte Threonindehydrogenase und die Fahigkeit zur Saccharose-Verwertung besitzen.

14. Plasmid pMAK705ΔpckA, das Teile der 5'-und der 3'-Region des pckA-Gens, entsprechend SEQ ID No. 3, enthält, dargestellt in Fig. 1.

15. Plasmid pMAK705ΔyjfA, das die 5'- und die 3'-Flanke der ytfP-yjfA Region einschließlich sehr kurzer Reste der offenen Leserahmen yjfA- und des ytfP, entsprechend SEQ ID No. 6 enthält, dargestellt in Fig. 2.

16. Plasmid pMAK705Δ90bp, das die 5'- und die 3'-Flanke der ytfp-yjfA Region einschließlich sehr kurzer Reste der offenen Leserahmen yjfA- und des ytfP, entsprechend SEQ ID No. 7 enthält, dargestellt in Fig. 5.

17. Isoliertes Polynukleotid aus Mikroorganismen der Familie Enterobactericeae, enthaltend eine für die 5'- und 3'-Region des pckA-Gens kodierende Polynukleotidsequenz dargestellt in SEQ ID No. 4 insbesondere geeignet als Bestandteil von Plasmiden für die ortsspezifische Mutagenase des pckA-Gens.

18. Isoliertes Polynukleotid aus Mikroorganismen der Familie Enterobactericeae, enthaltend die 5'- und 3'- Flanke der ytfP-yjfA Region, dargestellt in SEQ ID No. 6, insbesondere geeignet als Bestandteil von Plasmiden für die ortsspezifische Mutagenese des offenen Leserahmens ytfP und/oder yjfA.

19. L-Threonin produzierende Stämme der Familie Enterobacteriaceae, enthaltend eine Deletionsmutation im pckA-Gen entsprechend SEQ ID No. 4.

20. L-Threonin produzierende Stämme der Familie Enterobacteriaceae, enthaltend eine Deletionsmutation im offenen Leserahmen ytfP, entsprechend SEQ ID No. 6 oder 7.

21. L-Threonin produzierende Stämme der Familie Enterobacteriaceae, enthaltend eine Deletionsmutation im offenen Leserahmen yjfA, entsprechend SEQ ID No. 6 oder 7.

22. L-Threonin produzierende Stämme der Familie Enterobacteriaceae gemäß Anspruch 19, zusätzlich enthaltend eine Deletionsmutation im offenen Leserahmen ytfP, entsprechend SEQ ID No. 6 oder 7.

23. L-Threonin produzierende Stämme der Familie Enterobacteriaceae gemäß Anspruch 19, zusätzlich enthaltend eine Deletionsmutation im offenen Leserahmen yjfA, entsprechend SEQ ID No. 6 oder 7.

24. L-Threonin produzierende Stämme der Familie Enterobacteriaceae gemäß den Ansprüchen 19, 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein oder mehrere der Merkmale ausgewählt aus der Gruppe: eine Resistenz gegen α-Amino-β- Hydroxyvaleriansäure, eine verstärkte Homoserin- Dehydrogenase I-Aspartatkinase I in der feed back resistenten Form, eine gegebenenfalls kompensierbare partielle Bedürftigkeit für L-Isoleucin, eine abgeschwächte Threonindehydrogenase und die Fähigkeit zur Saccharose-Verwertung besitzen.

25. Eschericia coli K-12 Stamm MG442ΔpckA, hinterlegt unter der Nummer DSM 13761 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen.

26. Escherichia coli K-12 Stamm MG442Δ90yjfA, hinterlegt unter der Nummer DSM 14289 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen.

27. Escherichia coli K-12 Stamm B3996kurΔtdhpckA/pVIC40, hinterlegt unter der Nummer DSM 14150 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen.