PL210791B1 - Fermentacyjny sposób wytwarzania L-treoniny, drobnoustroje z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzające L-treoninę, plazmidy, wyizolowany polinukleotyd oraz szczepy bakteryjne z rodziny Enterobacteriaceae - Google Patents

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 210791 (21) Numer zgłoszenia: 387772 (13) B1 (22) Data zgłoszenia: 05.09.2001 (62) Numer zgłoszenia, z którego nastąpiło wydzielenie:

362315 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

05.09.2001, PCT/EP01/010209 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

11.04.2002, WO02/29080 (51) Int.Cl.

C12P 13/08 (2006.01) C12N 15/31 (2006.01) C12N 1/21 (2006.01)

Fermentacyjny sposób wytwarzania L-treoniny, drobnoustroje z rodziny (54) Enterobacteriaceae wytwarzające L-treoninę, plazmidy, wyizolowany polinukleotyd oraz szczepy bakteryjne z rodziny Enterobacteriaceae

(30) Pierwszeństwo: 30.09.2000, DE, 10048605.3	(73) Uprawniony z patentu:
DEGUSSA AG, Dϋsseldorf, DE
09.11.2000, DE, 10055516.0 22.06.2001, DE, 10130192.8	(72) Twórca(y) wynalazku:
	MECHTHILD RIEPING, Bielefeld, DE
(43) Zgłoszenie ogłoszono: 18.10.2004 BUP 21/04	CHRISTINE BASTUCK, Bielefeld, DE THOMAS HERMANN, Bielefeld, DE GEORG THIERBACH, Bielefeld, DE
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:	(74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Janina Kossowska
30.03.2012 WUP 03/12

PL 210 791 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są fermentacyjny sposób wytwarzania L-treoniny, drobnoustroje z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzające L-treoninę, plazmidy, wyizolowany polinukleotyd oraz szczepy bakteryjne z rodziny Enterobacteriaceae.

L-aminokwasy stosowane są do żywienia zwierząt, jako leki dla ludzi i w przemyśle farmaceutycznym. Znane jest wytwarzanie L-aminokwasów w procesie fermentacyjnym z udziałem szczepów z rodziny Enterobacteriaceae, zwłaszcza Escherichia coli i Serratia marcescens. Z powodu wielkiego znaczenia tych procesów, stale podejmuje się wysiłki zmierzające do polepszenia sposobów wytwarzania. Udoskonalenia wspomnianych procesów mogą dotyczyć: sposobów związanych z technologią fermentacji, na przykład, mieszania i dostarczania tlenu, albo składu pożywki odżywczej, na przykład stężenia cukrów podczas fermentacji, albo dalszej obróbki z otrzymaniem odpowiedniej postaci produktu, na przykład, za pomocą chromatografii jonowymiennej, albo wewnętrznej charakterystyki produktywności danego drobnoustroju.

Charakterystyki produktywności tych drobnoustrojów poprawia się przez zastosowanie metod mutaganezy, selekcji i wyboru mutanta, w wyniku czego otrzymuje się szczepy oporne na antymetabolity, na przykład, treoninowe analogi kwasu α-amino-e-hydroksywalerianowego (AHV) lub szczepy auksotroficzne dla metabolitów o znaczeniu regulującym, i produkujące L-aminokwasy, na przykład, L-treoninę.

Od pewnego czasu stosowane są także metody rekombinacji DNA w celu polepszenia właściwości szczepów z rodziny Enterobacteriaceae produkujących L-aminokwasy przez amplifikowanie poszczególnych genów biosyntezy aminokwasów i badanie wpływu na produkcję.

Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie nowych sposobów postępowania zapewniających polepszenie wytwarzania L-treoniny w procesie fermentacyjnym.

Niniejszy wynalazek dotyczy fermentacyjnego sposobu wytwarzania L-treoniny, w którym przeprowadza się następujące etapy:

a) fermentację z udziałem drobnoustrojów z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzających L-treoninę, w których otwarte ramki odczytu yjfA i ytfP, lub kodujące je sekwencje nukleotydowe, są wyłączone przez mutację wybraną z grupy składającej się z tranzycji, transwersji, insercji i delecji,

b) wzbogacenie podłoża lub komórki bakterii pod względem zawartości L-treoniny, oraz

c) izolację L-treoniny.

Zakres wynalazku dotyczy również drobnoustrojów z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzających L-treoninę, w których otwarte ramki odczytu yjfA i ytfP lub kodujące je sekwencje nukleotydowe są wyłączone przez mutację wybraną z grupy składającej się z tranzycji, transwersji, insercji i delecji.

Niniejszy wynalazek dotyczy również plazmidu pMAK705ΔyjfA, zawierającego sekwencje flankujące 5' i 3' regionu ytfP-yjfA, obejmujące krótkie reszty otwartych ramek odczytu yjfA i ytfP, co odpowiada SEK. ID Nr. 6.

W zakres wynalazku wchodzi również plazmid pMAK705Δ90bp, zawierający sekwencje flankujące 5' i 3' regionu ytfP-yjfA, obejmujące krótkie reszty otwartych ramek odczytu yjfA i ytfP, co odpowiada SEK. ID Nr 7.

Niniejszy wynalazek dotyczy również wyizolowanego polinukleotydu z drobnoustrojów z rodziny Enterobacteriaceae, obejmującego sekwencje flankujące 5' i 3' regionu ytfP-yjfA, przedstawionego w SEK. ID Nr 6, korzystnie przeznaczonego do wykorzystania jako składnik plazmidu dla specyficznej względem miejsca mutagenezy otwartych ramek odczytu ytfP i yjf/A.

W zakres wynalazku wchodzą również szczepy bakteryjne z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzające L-treoninę, zawierające mutację delecyjną w otwartej ramce odczytu ytfP i yjfA, odpowiednio do SEK ID Nr 6 lub 7.

Niniejszy wynalazek dotyczy również szczepu Escherichia coli K-12 MG442Δ90yjfA zdeponowanego pod numerem DSM 14289 w Deutsche Sammlung far Mikroorganismen und Zellkulturen.

Stosowany w dalszej części niniejszego opisu termin „L-treonina” oznacza treoninę z jej solami włącznie.

W tym kontekście, termin „atenuacja” oznacza zmniejszenie lub wyłączenie, w drobnoustroju, wewnątrzkomórkowej aktywności jednego, lub więcej niż jednego enzymu (białka) kodowanego przez odpowiedni DNA, na przykład, przez użycie słabego promotora albo genu lub allelu, kodującego odpowiedni enzym o niskiej aktywności lub inaktywującego odpowiedni enzym (białko), oraz, ewentualnie, połączenie ze sobą tych sposobów.

PL 210 791 B1

Dzięki zastosowaniu atenuacji aktywność lub stężenie odpowiedniego białka ulega na ogół zmniejszeniu do poziomu w zakresie od 0 do 75%, od 0 do 50%, od 0 do 25%, od 0 do 10% lub od 0 do 5% aktywności lub stężenia białka typu dzikiego, albo aktywności lub stężenia białka obecnego w wyjściowym drobnoustroju.

Drobnoustroje mogą wytwarzać L-aminokwasy z glukozy, sacharozy, laktozy, fruktozy, maltozy, melasy, ewentualnie ze skrobi lub, ewentualnie, z celulozy, albo z glicerolu i etanolu. Drobnoustroje te są reprezentatami rodziny Enterobacteriaceae wybranymi z rodzajów Escherichia, Erwinia, Providencia i Serratia. Korzystne są rodzaje Escherichia i Serratia. Spośród rodzajów Escherichia i Serratia wyróżnić można zwłaszcza gatunki, odpowiednio, Escherichia coli i Serratia marcescens.

Przykładami odpowiednich szczepów z rodzaju Escherichia, zwłaszcza z gatunku Escherichia coli produkujących L-treoninę są następujące szczepy:

Escherichia coli TF427;

Escherichia coli H4578;

Escherichia coli KY10935;

Escherichia coli VNIIgenetika MG442;

Escherichia coli VNIIgenetika M1;

Escherichia coli VNIIgenetika 472T23;

Escherichia coli BKIIM B-3996;

Escherichia coli kat 13;

Escherichia coli KCCM-10132.

Przykładami odpowiednich szczepów z rodzaju Serratia, zwłaszcza z gatunku Serratia marcescens produkujących L-treoninę, są następujące szczepy:

Serratia marcescens HNr 21;

Serratia marcescens TLr156;

Serratia marcescens T2000.

Szczepy z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzające L-treoninę korzystnie mają, między innymi, jedną lub więcej właściwości genotypowych lub fenotypowych wybranych z grupy obejmującej oporność na kwas α-amino-e-hydroksywalerianowy, oporność na tializynę, oporność na etioninę, oporność na α-metyloserynę, oporność na kwas diaminobursztynowy, oporność na kwas α-aminomasłowy, oporność na borelidynę, oporność na ryfampicynę, oporność na analogi waliny, takie jak hydroksamian waliny, oporność na analogi puryny, takie jak 6-dimetyloaminopuryna, zapotrzebowanie na L-metioninę, ewentualnie częściowe i dające się skompensować zapotrzebowanie na L-izoleucynę, zapotrzebowanie na kwas mezo-diaminopimelinowy, auksotrofię w odniesieniu do dipeptydów zawierających treoninę, oporność na L-treoninę, oporność na L-homoserynę, oporność na L-lizynę, oporność na L-metioninę, oporność na kwas L-glutaminowy, oporność na L-asparaginian, oporność na L-leucynę, oporność na L-fenyloalaninę, oporność na L-serynę, oporność na L-cysteinę, oporność na L-walinę, wrażliwość na fluoropirogronian, wadliwą dehydrogenazę treoninową, ewentualnie zdolność do wykorzystywania sacharozy, amplifikację operonu treoninowego, amplifikację dehydrogenazy homoserynowej I-kinazy asparaginianowej I, korzystnie w postaci opornej na mechanizm zwrotny, amplifikację kinazy homoserynowej, amplifikację syntazy treoninowej, amplifikację kinazy asparginianowej, ewentualnie w postaci opornej na mechanizm zwrotny, amplifikację dehydrogenazy semialdehydu asparaginianowego, amplifikację karboksylazy fosfoenolopirogronianowej, ewentualnie w postaci opornej na mechanizm zwrotny, amplifikację syntazy fosfoenolopirogronianowej, amplifikację transhydrogenazy, amplifikację produktu genu RhtB, amplifikację produktu genu RhtC, amplifikację produktu genu YfiK, amplifikację oksydoreduktazy jabłczanowo-chinonowej i amplifikację karboksylazy pirogronianowej oraz atenuację tworzenia się kwasu octowego.

Z dotychczasowego stanu techniki znane są mutacje powodujące zmianę lub redukcję katalitycznych właściwości białek enzymatycznych. Przykładowo, wymienić tu można badania, które przeprowadzili Qiu i Goodman [Journal of Biological Chemistry, 272, 8611-8617 (1997)], Yano i in. [Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 95, 5511-5515 (1998)] oraz Wente i Schachmann [Journal of Biological Chemistry, 266, 20833-20939 (1991)]. Przeglądy można znaleźć w dobrze znanych podręcznikach z dziedziny genetyki i biologii molekularnej, na przykład w podręczniku Hagemanna [„Allgemeine Genetik” („General Genetics”), Gustav Fischer Verlag, Stuttgart (1986)].

Mutacjami branymi tu pod uwagę są: tranzycje, transwersje, insercje i delecje. W zależności od wpływu wymiany aminokwasu na aktywność enzymatyczną, stosowane są określenia: mutacje zmiany sensu (mutacje missens) lub mutacje nonsensowne. Insercje lub delecje co najmniej jednej pary

PL 210 791 B1 zasad w genie powodują mutacje przesunięcia ramki odczytu (ang. frameshift mutations), w wyniku których wbudowane są fałszywe aminokwasy lub dochodzi do przedwczesnej terminacji translacji. Delecje kilku kodonów typowo prowadzą do całkowitej utraty aktywności enzymatycznej. Instrukcje dotyczące wytwarzania takich mutacji stanowią część stanu techniki i można je znaleźć w dobrze znanych podręcznikach z dziedziny genetyki i biologii molekularnej, na przykład, w podręczniku Knippersa [„Molekulare Genetik” („Molecular Genetics”), wyd. VI, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Niemcy (1995)], w podręczniku Winnackera [„Gene und Klone („From Genes to Clones), VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Niemcy (1990)] lub w podręczniku Hagemanna [„Allgemeine Genetik” („General Genetics”), Gustav Fischer Verlag, Stuttgart (1986)].

Do wytwarzania L-treoniny okazała się korzystna atenuacja, a zwłaszcza wyłączenie • genu produktu otwartej ramki odczytu (orf) yjfA [numer rejestracyjny AAC77180 w National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA) i SEK ID Nr. 5], oraz • genu produktu otwartej ramki odczytu (orf) ytfP [numer rejestracyjny AAC77179 w National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA) i SEK ID Nr. 5].

W celu uzyskania polepszenia produkcji aminokwasów, szczególnie L-treoniny, moż na przeprowadzić tylko wyłączenie otwartych ramek odczytu yjfA i ytfP, jak w sposobie według wynalazku bądź takie wyłączenie razem z atentacją ekspresji genu pckA.

Przykładem plazmidu, przy pomocy którego można przeprowadzić wyłączenie otwartych ramek odczytu yjfA i ytfP Escherichia coli na drodze mutagenezy specyficznej względem miejsca, jest plazmid pMAK705ΔyjfA (fig. 1).

Zawiera on tylko sekwencje flankujące 5' i 3' regionu ytfP-yjfA, obejmując bardzo krótkie reszty otwartych ramek odczytu yjfA i ytfP. Brak jest (delecja) odcinka o długości 337 pz regionu ytfP-yjfA. Sekwencję tego DNA, który można użyć do mutagenezy regionu ytfP-yjfA przedstawiono w SEK ID Nr. 6.

Dalszym przykładem plazmidu, przy pomocy którego można wyłączyć, otwarte ramki odczytu yjfA i ytfP na drodze mutagenezy specyficznej względem miejsca, jest plazmid pMAK705Δ90bp (fig. 2).

Zawiera on również tylko sekwencje flankujące 5' i 3' regionu ytfP-yjfA, obejmując bardzo krótkie reszty otwartych ramek odczytu yjfA i ytfP. Brak jest (delecja) regionu ytfP-yjfA o długości 90 pz. Sekwencję tego DNA, który można użyć do mutagenezy regionu ytfP-yjfA przedstawiono w SEK ID Nr. 7.

Tę delecyjną mutację można włączyć do odpowiednich szczepów za pomocą wymiany genu lub allelu. Możliwe jest także przeniesienie mutacji w otwartych ramkach odczytu yjfA i ytfP, lub mutacji wywołujących ekspresję tych otwartych ramek odczytu, do rozmaitych szczepów na drodze koniugacji lub transdukcji.

W przypadku przeprowadzenia zastąpienia, w omawianym szczepie występuje postać alleli Δyt1P i ΔyjfA przedstawionych w SEK ID Nr. 6 lub SEK ID Nr. 7.

Dla wytwarzania L-treoniny, może okazać się korzystne (oprócz indywidualnej lub łącznej atenuacji genu pckA lub otwartych ramek odczytu yjfA i ytfP) wyłączenie niepożądanych reakcji wtórnych [Nakayama: „Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms” w Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (red.), Academic Press, Londyn, UK (1982)].

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem drobnoustroje można hodować w procesie okresowym lub w procesie okresowym z zasilaniem. Podsumowanie znanych metod hodowli drobnoustrojów podane jest w podręczniku Chmiela [Bioprozesstechnik 1. Einfijhrung in die Bioverfahrentechnik (Bioprocess Technology 1, Introduction to Bioengineering), Gustav Fischer Verlag, Stuttgart (1991)], lub w podręczniku Storhasa [Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Bioreactors and Peripheral Equipment), Vieweg Verlag, Brunszwik/Wiesbaden (1994)]. Zastosowana pożywka hodowlana musi odpowiednio spełniać wymagania konkretnych szczepów. Opis pożywek hodowlanych dla rozmaitych drobnoustrojów można znaleźć w podręczniku: „Manual of Methods for General Bacteriology” of the American Society for Bacteriology [(Washington DC, USA (1981)].

Źródłami węgla, które można zastosować, są cukry i węglowodany, na przykład, glukoza, sacharoza, laktoza, fruktoza, maltoza, melasa, skrobia i, ewentualnie, celuloza, oleje i tłuszcze, na przykład, olej sojowy, olej słonecznikowy, olej arachidowy i olej kokosowy, kwasy tłuszczowe, na przykład, kwas palmitynowy, kwas stearynowy i kwas linolowy, alkohole, na przykład, glicerol i etanol, lub kwasy organiczne, na przykład, kwas octowy. Substancje te można stosować pojedynczo lub jako mieszaninę.

PL 210 791 B1

Źródłami azotu, które można zastosować, są związki organiczne zawierające azot, takie jak peptony, ekstrakt drożdżowy, ekstrakt mięsny, ekstrakt słodowy, namok kukurydziany, mąka sojowa i mocznik lub zwią zki nieorganiczne, takie jak siarczan amonu, chlorek amonu, fosforan amonu, wę glan amonu i azotan amonu. Związki azotowe można stosować osobno lub jako mieszaninę.

Źródłami fosforu, które można zastosować, są kwas fosforowy, diwodorofosforan potasu lub wodorofosforan dipotasu, lub odpowiednie sole sodu. Pożywka hodowlana musi zawierać także sole metali, na przykład, siarczan magnezu lub siarczan żelaza, które są niezbędne dla wzrostu drobnoustroju. W końcu, oprócz substancji powyżej wymienionych, użyć można podstawowych substancji stymulujących wzrost, takich jak aminokwasy i witaminy. Do pożywki hodowlanej dodać można także odpowiednie prekursory. Wspomniane substancje odżywcze można dodać do hodowli od razu wszystkie, albo można zasilać odpowiednio podczas hodowli.

Poziom pH hodowli reguluje się za pomocą odpowiedniego stosowania związków zasadowych, takich jak wodorotlenek sodu, wodorotlenek potasu, amoniak lub uwodniony amoniak, albo związków kwasowych, takich jak kwas fosforowy lub kwas siarkowy. Pienienie można kontrolować przy użyciu środków przeciwpieniących, takich jak estry poliglikoli z kwasami tłuszczowymi. Stabilność plazmidów można utrzymać przez dodanie do pożywki odpowiednich substancji o działaniu wybiórczym, takich jak, na przykład, antybiotyki. Warunki aerobowe utrzymuje się przez wprowadzanie do hodowli tlenu lub zawierających tlen mieszanin gazowych, na przykład, powietrza. Temperatura hodowli normalnie wynosi od 25°C do 45°C, korzystnie od 30°C do 40°C. Hodowlę kontynuuje się do momentu, w którym tworzenie się L-treoniny osiągnęło poziom maksymalny. Zwykle cel ten osiąga się w ciągu 10 do 160 godzin.

L-aminokwasy można analizować z wykorzystaniem metody chromatografii anionowymiennej, z póź niejszą derywatyzacją z zastosowaniem ninhydryny, jak to opisali Spackman i in. [Analytical Chemistry, 30, 1190 (1958)] lub metody HPLC z odwróconymi fazami, jak to opisali Lintroth i in. [Analytical Chemistry, 51, 1167-1174 (1979)].

Czystą kulturę Escherichia coli szczep K-12 MG442Δ90yjfA zdeponowano 9 maja 2001 w Deutsche Sammlung far Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = German Collection of Microorganisms and Cell Cultures), Brunszwik, Niemcy), zgodnie z Układem Budapeszteńskim, jako DSM 14289.

Wynalazek niniejszy objaśniają bardziej szczegółowo poniższe przykłady.

Wyodrębnianie plazmidowego DNA z Escherichia coli i całość metod związanych z restrykcją i obróbką z udziałem enzymu (fragmentu) Klenowa oraz fosfatazy alkalicznej przeprowadzano tak, jak to opisali Sambrook i in. [„Molecular cloning - a laboratory manual”. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]. Jeżeli tego inaczej nie zaznaczono, transformację Escherichia coli przeprowadzano sposobem opisanym przez Chunga i in. [Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 86, 2172-2175 (1989)].

Temperatura inkubacji przy otrzymywaniu szczepów i transformantów wynosiła 37°C. Temperatury wynoszące 30°C i 44°C stosowano w procesie wymiany genów według Hamiltona i in.

P r z y k ł a d 1

Konstruowanie mutacji delecyjnej regionu ytfP-yjfA genu

Region ytfP-yjfA genu z Escherichia coli K12 amplifikuje się z zastosowaniem reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i z udziałem oligonukleotydów syntetycznych. Wychodząc z sekwencji nukleotydowej regionu ytfP-yjfA genu w E. coli K12 MG1655 (SEK ID No. 5) syntetyzuje się następujące startery PCR (MWG Biotech, Ebersberg, Niemcy):

ytfP-1: 5'-GGCGATGTCGCAACAAGCTG-3' ytfP-2: 5'-CTGTTCATGGCCGCTTGCTG-3'.

Chromosomowy DNA E. coli K12 MG1655 użyty do PCR izoluje się z zastosowaniem „Qiagen Genomic-tips 100/g (QIAGEN, Hilden, Niemcy) zgodnie z instrukcjami wytwórcy. Fragment DNA o wielkości około 1300 pz z regionu 5' można zamplifikować przy użyciu specyficznych starterów w typowych warunkach przeprowadzania PCR [Innis i in.: „PCR Protocols. A guide to Methods and Applications”, Academic Press (1990)] z udziałem polimerazy DNA Tag (Gibco-BRL, Eggenstein, Niemcy). Produkt PCR liguje się z wektorem pCR2.1TOPO (TOPO TA Cloning Kit, Invitrogen, Groningen, Holandia), zgodnie z instrukcjami wytwórcy, i transformuje do E. coli szczep TOP10F'. Komórki z plazmidem selekcjonuje się na agarze LB, do którego dodano 50 μg/ml ampicyliny. Po wyizolowaniu plazmidowego DNA, dokonuje się oceny udanego sklonowania produktu PCR przy użyciu enzymów restrykcyjnych EcoRI i Nsil.

PL 210 791 B1

W celu utworzenia delecji o 337 pz w regionie yftP-yjfA, wektor pcr2.1TOPOytfP-yjfA rozszczepia się przy użyciu enzymów restrykcyjnych Ndel i Sspl i liguje się fragment DNA o wielkości 4,8 kpz, po obróbce z udziałem enzymu Klenowa.

W celu utworzenia delecji o 90 pz, wektor pcr2.1TOPOytfP-yjfA rozszczepia się przy uż yciu enzymów Ndel i SplI i liguje się fragment DNA o wielkości 5 kpz, po obróbce z udziałem enzymu Klenowa.

E. coli szczep DH5a transformuje się przy użyciu materiałów po ligowaniu i komórki z plazmidem selekcjonuje się na agarze LB, do którego dodano 50 μg/ml ampicyliny. Po wyizolowaniu plazmidowego DNA, te plazmidy, w których znajduje się sklonowana sekwencja mutagennego DNA, pokazana w SEK ID Nr. 6 i SEK ID Nr. 7, wykrywa się za pomocą kontrolnego rozszczepiania przy użyciu enzymu EcoRI. Plazmidy zostały nazwane pCR2.1TOPOΔyjfA i pCR2.1TOPOΔ90bp.

P r z y k ł a d 2

Konstruowanie wektorów zastąpienia pMAK7 05ΔyifA i pMAK705Δ90bp

Allele ytfP-yjfA opisane w powyższym przykładzie 1 wyodrębnia się z wektorów pCR2.1TOPOΔyjfA i pCR2.1TOPOΔ90bp, po restrykcji z udziałem enzymów SacI i Xbal i rozdzieleniu w 0,8% żelu agarozowym, i liguje z plazmidem pMAK705 [Hamilton i in., Journal of Bacteriology, 174, 4617-4622 (1989)], strawionym enzymami SacI i Xbal. Materiały po ligowaniu transformuje się w DH5a i komórki z plazmidem selekcjonuje się na agarze LB, do którego dodano 20 μg/ml chloramfenikolu. Udane sklonowanie demonstruje się po wyizolowaniu DNA plazmidowego i rozszczepieniu przy użyciu enzymów SacI i Xbal. Zastąpienie utworzonych tak wektorów, pMAK705ΔyjfA (= pMAK705ΔyjfA) i pMAK705Δ90bp (= pMAK705Δ90bp) przedstawiono na fig. fig. 1 i 2.

P r z y k ł a d 3

Specyficzna względem miejsca mutageneza regionu ytfP-yjfA genu w szczepie MG422 E. coli

W celu zastąpienia chromosomowego regionu ytfP-yjfA genu kodowaną plazmidem konstrukcją z delecją 90 pz, MG442 transformuje się plazmidem pMAK705Δ90pz. Zastąpienie genu przeprowadza się metodą selekcyjną opisaną przez Hamiltona i in. [Journal of Bacetriology, 174, 4617-4622) (1989)] i weryfikuje typowymi metodami PGR [Innis i in.: „PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications”, Academic Press (1990)], z następującymi starterami oligonukleotydowymi:

ytfP-1: 5'-GGCGATGTCGCAACAAGCTG-3' ytfP-2: 5'-CTGTTCATGGCCGCTTGCTG-3'.

Otrzymany szczep został nazwany MG442Δ90yjfA.

P r z y k ł a d 4

Wytwarzanie L-treoniny przy użyciu szczepu MG442Δ90yjfA

Wytwarzanie L-treoniny przez szczep MG442Δ90yjfA przetestowano sposobem opisanym poniżej.

Tworzenie L-treoniny sprawdzano w 10 ml hodowlach okresowych znajdujących się w 100 ml kolbach Erlenmeyera. Były one inokulowane 10 ml pożywki do hodowli wstępnej o następującym składzie: 2 g/litr ekstraktu drożdżowego, 10 g/litr (NH₄)₂SO₄, 1 g/litr KH₂PO₄, 0,5 g/litr MgSO₄-7H₂O, 15 g/litr CaCO3 i 20 g/litr glukozy i inkubowane w ciągu 16 godzin, w temperaturze 37°C i przy 180 obr/min, w inkubatorze ESR z firmy Kiihner AG (Birsfelden, Szwajcaria). 250 μl tej hodowli wstępnej przeniesiono do 10 ml pożywki produkcyjnej (25 g/litr (NH₄)₂SO₄, 2 g/litr KH₂PO₄, 1 g/litr MgSO₄-7H₂O, 0,03 g/litr FeSO₄-7H₂O, 0,018 g/litr MnSO₄ 1H₂O, 30 g/litr CaCO₃, 20 g/litr glukozy) i inkubowano przez 48 godzin w temperaturze 37°C. Po inkubacji oznaczono gęstość optyczną (OD) zawiesiny hodowlanej przy użyciu fotometru LP2W z firmy Dr. Lange (Berlin, Niemcy), przy długości fali 660 nm.

Następnie, oznaczono stężenie L-treoniny w supernatancie przesączonej w warunkach jałowych hodowli, przy użyciu analizatora aminokwasów z firmy Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Niemcy) z zastosowaniem chromatografii jonowymiennej oraz pokolumnowej reakcji z detekcją ninhydrynową.

Otrzymane wyniki eksperymentu podsumowano w poniższej tabeli 1.

PL 210 791 B1

T a b e l a 1

Szczep	Od (660 nm)	L-Treonina (g/litr)
MG442	6,0	1,5
MG442Δ90yjfA	5,7	2,1

Krótki opis figur • Figura 1: pMAK705ΔyjfA (= pMAK705deltayjfA).

• Figura 2: pMAK705Δ90bp (= pMAK705delta90bp)

Dane dotyczące długości należy rozumieć jako dane przybliżone.

Użyte skróty i oznaczenia mają następujące znaczenie:

• cat: gen oporności na chloramfenikol, • rep-ts: termowrażliwy region replikacji plazmidu pSC101, • pckl: część regionu 5' genu pckA, • pck2: część regionu 3' genu pckA, • ytfP'-yjfA': sekwencja DNA zawierające skrócone regiony kodujące ytfP i yjfA, • kan: gen oporności na kanamycynę, • gdhA: gen dehydrogenzy glutaminianowej, • rhtC: gen nadający odporność na treoninę.

Skróty odnoszące się do enzymów restrykcyjnych mają następujące znaczenie:

• BamHI: endonukleaza restrykcyjna z Bacillus amyloliquefaciens;

• Bg1ll: endonukleaza restrykcyjna z Bacillus globigii;

• Clal: endonukleaza restrykcyjna z Caryphanon latum;

• EcoRI: endonukleaza restrykcyjna z Escherichia coli;

• EcoRV: endonukleaza restrykcyjna z Escherichia coli;

• Hindlll: endonukleaza restrykcyjna z Haemophilus influenzae;

• KpnI: endonukleaza restrykcyjna z Klebsiella pneumoniae;

• Pstl: endonukleaza restrykcyjna z Providencia stuartii;

• Pvul: endonukleaza restrykcyjna z Proteus vulgaris;

• SacI: endonukleaza restrykcyjna z Streptomyces achromogenes;

• SalI: endonukleaza restrykcyjna z Streptomyces albus;

• Smal: endonukleaza restrykcyjna z Serratia marcescens;

• Xbal: endonukleaza restrykcyjna z Xanthomonas badrii;

• Hhol: endonukleaza restrykcyjna z Xanthomonas holcicola.

PL 210 791 B1

Wykaz sekwencji <110> Degussa AG <120) Proces fermentacyjny przeznaczony do wytwarzania L-amino-kwasów, drobnoustroje z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzające L-aminokwas, plazmidy, wyizolowany polinukleotyd oraz

szczepy bakteryjne
<130>	000425 BT
<140>
<141 >
<160>	19
<170>	Patent In Ver 2.1
<210>	1
<211 >	1622
<212>	DNA
<213>	Escherichia coli
<220>
<221 >	CDS
<222>	(1) . . (1620)
<223>	pckA
<400>	1

atg ogc gtt aac aat ggt ttg acc ccg caa gaa ctc gag gct tat ggt <8

Met Arg val Aan Aan Gly Leu Thr Pro Gin Glu Leu Glu Ala Tyr Gly

10 15 *tc agt gac gta cat gat atc gtt tao aac coa ago tac gac ctg ctg 96

Ile Sar Aap Val Bis Aap 11« Val Tyr Aan Pro Sar Tyr Aap Leu Leu

25 30 tat cag gaa gag ctc gat ccg agc ctg aca ggt tat gag cgc ggg gtg 144

Tyr Gin Gin Glu Lau Asp Pro Sar Lau Thr Gly Tyr Glu Arg Gly Vnl

40 45 tta act aat ctg ggt gcc gtt gea gte gat acc ggg ato ttc acc ggt 192

Lau Thr Aan Lau Gly Ala Val Ala Val Aap Thr Gly Ile Pha Thr Gly

55 60 cgt tca coa aaa gat aag tat atc gta agt gaa gat acc act cgc gat 240

Arg Sar Pro Lya Aap Lye Tyr Ile Val Arg Aap Aap Thr Thr Arg Asp

70 75 BO act ttc tgg tgg gca gac aaa ggc aaa ggt aag aac gac aaa aaa oet 288

Thr Pha Trp Trp Ala Aap Lya Gly Lya Gly Lya Aaa. Aap Asa. Lya Pro

90 95 ctc tct oog gaa acc tgg oag cat ctg aaa ggc ctg gtg acc agg cag 336

Leu Sar Pro Gla Thr Trp Gin Bis Laa Lya Gly Len Pal Thr Arg Gin

100 103 110 ctt toc ggc aaa cgt ctg ttc gtt gte gac get ttc tgt ggt gog aae 386

Len Sar Gly Lya Arg Leo Pha Val Val Asp Ala Pha Cya Gly Ala Ma

115 120 125

PL 210 791 B1 ccg gat act'cgt ctt tcc gte cgt ttc atc acc gaa gtg gcc tgg cag 432

Pro Aap Thr Arg Leu Ser Val Arg Phe Ile Thr Glu Val Ala Trp Gin

130 135 140 gcg cat ttt gte aaa aac atg ttt att cgc ccg agc gat gaa gaa ctg 480

Ala Bis Cha Val Lya Asn Met Phe He Arg Pro Ser Aap Glu Glu Leu

145 150 155 160

gca Ala

ggt ttc aaa cca

gac ttt

atc gtt atg aac ggc gcg aag tgc act

528

Gly Pha

Lya

Pro 165

Aap

Pha

Zla Val

Mat 170

Asn

Gly Ala

Lya

Cya Thr 175

aac

ccg cag

tgg

aaa.

gaa

cag

ggt ctc

aac

tcc

gaa aae

ttc

gtg gcg

576

Asn

Pro Glu

Trp

Lya

Glu

Gin

Gly Leu

Aan

Ser

Glu Aan

Phe

Val Ala

180

185

190

ttt

aac ctg

acc

gag

cgc

atg

cag ctg

att

ggc

ggc acc

tgg

tac ggc

624

Pha

Aan Leu

Thr

Glu Arg

Mat

Gin Lau

tle

Gly Gly Thr

Trp Tyr Gly

195

200

205

ggc

gaa atg

aag

aaa

ggg

atg ttc tog atg

atg

aac tac

ctg ctg ccg

672

Gly

Glu Met

Lya

Lya

Gly

Mat

Phe Ser

Mat

Mat

Aan Tyr

Leu

Lau Pro

210

215

220

ctg

aaa ggt

atc

gct

tct

•tg

cac tgc

tcc

gcc

aac gtt

ggt

gag aaa

720

Lau

Lya Gly

Ile

Ala

Ser

Met

Sie Cya

Sar

Ala

Aan Val Gly

Glu Lya

225

230

235

240

ggc

gat gtt

gcg

gtg

ttc

ttc

ggo ctt

tcc

ggc

aac ggt aaa

acc acc

768

Gly

Aap val

Ala

Val

Pha

Pha

Gly Leu

Ser

Gly

Thr Gly Lya

Thr Thr

245

250

255

ctt

tcc acc

gac

ccg

aaa

cgt

cgc ctg

att

ggc

gat gac

ff*a

cac ggc

816

Lau

Ser Thr

Aap

Pro

Lya Arg Arg Lau

Zla

Gly Aap Aap

Glu

Bla Gly

260

265

270

tgg

gac gat

gac

ggo

gtg

ttt

aac ttc

gaa

ggc

ggc tgc

tac

gca aaa

864

T=P

Aap Aap Aap Gly

Val

Pha Aan Phe

Glu

Gly Gly Cya

Tyr Ala Lya

275 280 285 act atc aag ctg teg aaa gaa gcg gaa cet gaa atc tac aac gct atc 912

Thr Zla Lya Leu Ser Lya Glu Ala Gin Pro Glu 11· Tyr Aan Ala U·

290 295 300 cgt cgt gat gcg ttg ctg gaa aac gte acc gtg cgt gaa gat ggc act 960

Arg Arg Aap Ala Leu Leu Glu Aan V*1 Thr Val Arg Gin Aap Gly Thr

305 310 315 320 atc gaa ttt gat gat ggt tca aaa acc gag aac acc cgc gtt tct tat 1008

Ile Aap Phe Asp Aap Gly Ser Lya thr Glu Aan Thr Arg Val Sar Tyr

325 330 335 oog atc tat cac atc gat aac att gtt aag ccg gtt tac aaa gog ggc 1056

Pro Zla Tyr Bla Ile Aap Aan 11« Tal Lya Pro Tal Ser Lya Ala Gly

340 345 350 caa.gcg act aag gtt atc ttc ctg act gct gat get ttc ggc gtg ttg 1104

Bis Ala Thr Lya Tal Zla Pha Lau Thr Ala Aap Ala Pha Gly Val Laa

355 360 36S

PL 210 791 B1 ccg ccg Pro Pro

370 tct ggc Ser Gly 365 ccg acg Pro Thr cac ccg Bie Pro ggc gcg Gly Ala egt ate Arg Ile

450 ggt tcg Gly Ser 465 gcg etc Ala Ile egt aac Arg Aso ctg gog Leu Ala gog ggt Ala Gly

530

gtt tct cgc	ctg act	gcc gat caa acc cag tat cac ttc etc	1152
vai	Ser	Arg	Leu	Thr 375	Ala Aep Glu	Thr Gin Tyr His 380	Phe Leu
ttc	acc	gcc	aaa	ctg	gcc ggt act	gag cgt ggc atc	acc gaa	1200
Phe	Thr	Ala	Lya	Leu Ala Gly Thr	Glu Arg Gly Ile	Thr Glu
			390			395	400
cca	acc	ttc	tcc	gct	tgc ttc ggc	gcg gca ttc ctg tcg ctg	1248
Pro	Thr	Phe	Ser	Ala	Cya Phe Gly Ala Ala Phe Leu	Ser Leu
		405			410		415
act	cag	tac	gca	gaa	gtg ctg gtg	aaa cgt atg cag gcg gcg	1296
Thr	Gin	Tyr	Ala	Glu	Val Leu Val	Lye Arg Met Giń	Ala Ala
	420				425	430
cag	gct	tat	ctg	gtt	aec act ggc	tgg aac ggc act	ggc aaa	1344
Gla Ala	Tyr	Len	Val	Asn Thr Gly Trp Aan Gly Thr	Gly Lye
«35					440	445
tcg	att	aaa	gat	acc	cgc gcc att	atc gac gcc atc	eto aac	1392
Ser	Ile	Lya	Aap	Thr	Arg Ala Ile	Ile Aep Ala He	Leu Aen
				455		460
ctg	gat	aat	gca		acc ttc act	ctg cog atg ttt	aac ctg	1440
Leu	Aap	Aaa	Ala	Glu	Thr Phe Thr	Leu Pro Met Phe	Aen Leu
			470			475	480
cca	aec	gaa	ctg	cog	ggc gta gac	acg aag att etc	gat cog	1488
Pro	Thr Glu	Len	Pro	Gly Val Aep	Thr Lye Ile Leu Am Pro
		485			490		495
ace	tac gct	tct	ccg	gaa cag tgg	cag gaa aaa goc	gaa aoo	1536
Thr	Tyr Ala	Ser	Pro	Glu Gin Txp	Gis Glu Lye Ale	Glu Thr
	500				505	510
aaa	ctg	ttfe	etc	gac	aac ttc gat	aaa tac acc gac	acc cct	1584
Lya	Leu	Phe	Ile	Aap	Aaa Pbe Aep	Lye Tyr Thr Aap	Thr Pro
515					520	525
gcc	gcg	ctg gta	flOfl	gct ggt ccg	aaa ctg taa		1623
Ala	Ala	Len	Val Ala	Ala Gly Pro	Lya Leu
				535		540

<210>	2
<211>	540
<212>	PRT
<213>	Escherichia
<400>	2

coli

PL 210 791 B1

Mat Axw Tal Aaa A*a filY Łaa Iks Kro βΐ» ®^-^u ^·* Τϊ*

U 15

II· Sar Aap Tal ala Aap 11« Tal Tyt Aan Kro S« Tyr Aap Leo Im 20 25 3°

Tyr βΐη βία βία im Aap Pro flar Im 2tar βΐγ Τχν βία Ara βΐγ Tal 35 4fl «

Len

Tłu· 50

Aen

ΪΛ1Χ

Gly

Ale

val 55

Ala

Val

Aap

Thr

Gly 60

Ile

Pbe

Thr

Gly

Arg 65

Bez*

Pro

Lye

Aep

Lye 70

Tyr

Ile

Val

Arg

Aap 75

Aep

Thr

Thr

Arg

Aep 80

Thr

Phe

Trp

Trp

Ala B5

Aap

Lye

Gly

Lye

Gly 90

Lye

Aen

Aep

Ara

Lye 95

Pro

Len

Ser

Pro

Glu 100

Thr

Trp

Gin.

Kia

Len 105

Łye

Gly

Len

Val

Thr 110

Arg

Gin

LeU

Ser

Gly 115

Lye

Arg

Leu

Pbe

Yal 120

Val

Aep

Ale

Pbe

cye 125

Gly

Ale

Ara

Pro

Aep 130

Thr

Arg

Leu

Ser

vel 135

Arg

Pbe

Ile

Thr

Glu 140

Vel

Ale

Trp

Gin

Ala. 145

Hie

Phe

Vel

Lye

Aen 150

Met

Phe

Ile

Arg

Pro 155

Ser

Aep

Gin

Glu

Leu 160

Ala

Gly

Phe

Lye

Pro 165

Aep

Phe

Ile

Val

Met 170

Ara

Gly

Ale

Lye

cye 17S

Thr

*“

Pro

Gin

Trp 180

Lye

Gin

Gin

Gly

Leu 185

Ara

Ser

Gin

Ara

Pbe IM

Val

Ale

Phe

Ara

Leu 195

Thr

Olu

Arg

Met

Gin 200

Len

Ile

Gly

Gly

Thr 205

Trp

Tyr

Gly

Gly Gla Mat Łya Łye »rt Phe
	210	215
Len 225	Lye	Gly	Ile	Ale	Ser 230	Het	Hie
Gly	Aep	Val	Ale	Val 245	Phe	Pbe	Gly
Len	Ser	Thr	Aep 260	Pro	Lye	Arg	Arg
Trp	Aep	Aep 275		Gly	Vel	Pbe	280
Thr	Ile 290	Lye	Lata	Ser	Lye	Gin 295	Ale
Arg Arg Aep 305	Ala	Len	Len 310	Glu	Aen
Ile		Ko.	Mp	325	Gly		Lye
Pro	Ile	Tyr	Ala 340	Ile	Aep		Ile

Pba Łan

Hla Ala Thr Χήρο Tal II· 355

Ser Het Net Ara Tyr	Len Len Pro
	220
Cye Ser	Ale Aen Vel 235	Gly Gin Lye 240
Len Ser 250	Gly Thr Gly	Lye Thr Thr 255
Len Ile 265	Gly Aep Aep	Gin file Gly 270
Pbe Gin	Gly Gly Cye 255	Tyr Ale Lye
Gin Pro	Gin Ile Tyr 300	Ara Ale Ile
Vtl Thr	Tel Arg Gin 313	Aep Gly Thr 320
Thr Glu 330	Aen Thr Arg	v*l Ser Tyr 335
▼el Lye 345	Pro Val Ser	Lye Ale Gly 350
The Ala Aap Ala Pha	Gly V*1 Leo

355

350

PL 210 791 B1

Pro

Pro Val 310

Sar Arg

Łeu

Thr 375

Ala

Aap

Gin

Thr

Gin 380

Tyr

His

Phe

Łau

Ser

Gly Pha

Thr Ala

Łya

hau

Ala

Gly

Thr

Glu

Arg

Gly

Ile

Thr

Glu

385

350

395

400

Psa

Thx Pro

Thr Phe

Ser

Ala

Cya

Pha

Gly

Ala

Ala

Pha

Łeu

Sar

Łeu

405

410

415

Hia

Pro Thr

Gin Tyr

Ala

Glu

Val

Łeu

Val

Łya

Arg

Met

Gin

Ala

Ala

420

425

430

Gly

Ala Gin

Ala Tyr

Łeu

Val

Aan

Thr

Gly

Trp

Aan

Gly

Thr

Gly

Łya

435

«0

445

Arg

11« Sar

Ile Łya

Aap

Thr

Arg

Ala

Ile

Ile

Aap

Ala

Ile

Łau

Aan

450

455

450

Gly

Sar Łeu

Aap Aan

Ala

Glu

Thr

Pha

Thr

Łau

Pro

Mat

Pha

Aan

Łau

465

470

475

490

Ala

Ela Pro

Thr Glu

Łeu

Pro

Gly

Val

Aap

Thr

Łya

Ile

Łau

Aap

PSU

485

490

495

Arg

Aan Tłuc

Tyr Ala

Sar

Pro

Olu

Glu

Trp

Gin

du

Łya

Ala

Glu

Thr

500

505

510

Leu

Ala Łya

Łan Pha

Ile

Aap

Aan .Pha

Aap

Łya

Tyr

Thr

Aap

Thr

Pro

515

520

525

Ala

Gly Ala

Ala Lete

Tal

Ala

Ala Gly

Pro

Łya

Łau

530

535

540

<210> 3 <211> 1156 <212> DNA <213> Escherichia coli <220>

(221> cecha dowolna <220> (1) . . (1156) <223> DNA mutagenny <220>

(221> cecha dowolna <220> (1)..(35) <223> DNA techniczny/reszty sekwencji polilinkera <220>

(221> cecha dowolna <220> (36)..(522) <223> część regionu 5' (pckl) genu pckA <220>

(221> cecha dowolna <220> (523)..(542) <223> techniczny DNA/reszty sekwencji polilinkera

PL 210 791 B1 <220>

(221> cecha dowolna <222> (543) . . (1105) <223> część regionu 3' (pck2) genu pckA <220>

<221> misc_ feature <222> (1106)..(1156) <223> DNA techniczny/reszty sekwencji polilinkera <400> 3 ctagtaacgg ccgccagtgt gctggaattc ggcttgatce gagcctgaea ggttatgagc 60 gcggggtgtt aacta&tctg ggtgccgttg ccgtcgatac cgggatcttc accggtcgtt 120 caccaaaaga ta&gtatatc gtccgtgacg ataccactcg cgatactttc tggtgggcag 180 acaaaggcaa aggtaaga&c gacaacaaac etctctctcc ggaaacetgg cagcatctga 240 aaggcctggt gaccaggcag ctttccggca aacgtctgtt cgttgtcgac gctttctgtg 300 gtgcgaaccc ggatactcgt ctttccgtcc gtttcatcac ogaagtggcc tggcaggcgc 360 attttgtcaa aaacatgttt attcgcccga gcgatgaaga actggcaggt ttcaaaccag 420 acttt&tcgt tatgaaoggc gcgaagtgca ctaaoccgca gtgg&aagaa cagggtcrtca 480 actccgaaaa cttcgt.ggcg tttaacctga ccgagcgcat gcaagcega* ttctgcagat 540 cctgaagatg gcactatcga ctttgatgat ggttcaaaaa ccgagaacac ccgcgtttct 600 tatccgatct atcacatcga taacattgtt aagecggttt coaaagcggg ccacgcgact 660 aaggttatct tcctgactgc tgatgctttc ggcgtgttgc cgccggtttc tcgcćtgact 720 gccgatcaaa cceagtatca cttcctctct ggcttcaccg ccaaactggc cggtactgag 780 egrtggcatca ccgaaccgac gccaaecttc tccgottgct tcggcgcggc attectgtcg 840 ctgeacccga ctcagtacgc agaagtgctg gtgaaacgta tgcaggcggc gggogcgcag 900 gcttatctgg ttaac&ctgg ctgga&cgge aetggcaaac gtatctcgat taaagataec 960 egcgceatta tcgacgcoat cetcaaoggt tcgctggata atgcagaaac cttcaotctg 1020 ccgatgttta acctggcgat cccaaccgaa ctgocgggcg tagacacgaa gattctcgat 1080 ccgcgtaaca cctacgcttc tccggaagcc gaattctgcagatatccatc acactggcgg 1140 ccgctcgagc atgcat 1156 <210> 4 (211> 1294 <212> DNA <213> Escherichia coli <220>

<2 21> cecha dowolna <222> (1) . . (3) <223> kodon inicjacyjny allelu delta pckA <220>

<221> cecha dowolna <222> (1) . . (598) <223> region 5' allelu delta pckA <220>

<221> cecha dowolna <222> (599)..(618) <223> DNA techniczny/reszty sekwencji polilinkera

PL 210 791 B1 <220>

<221> cecha dowolna <222> (619) . . (1291) <223> region 3' allelu delta pckA <220>

<221> cecha dowolna <222> (1292) . . (1294) <223> kodon stop allelu delta pckA <400) 4 atgcgcgtta acaatggttt gaccccgcaa gaactcgagg cttatggtat cagtgacgta €0 catgatatcg tttacaaccc aaęjctacgac ctgctgtatc aggaagagct cgatccgagc 120 ctgacaggtt atgagcgcgg ggtgttaact aatctgggtg ccgttgocgt egataccggg 180 atcttcaccg gtcgttcacc aaaagataag tatatcgtcc gtgacgatac cactcgcgat 240 actttctggt gggcagacaa aggcaaaggt aaga&cgaca acaaaectct ctctccggaa 300 acctggcagc atctgaaagg cctggtgacc aggcagattt ccggcaaacg tctgttcgtt 360 gtcgacgctt tctgtggtgc gaaccoggat actcgtcttt ccgtccgttt eatcaccgaa 420 gtggcctggc aggcgcattt tgtcaaaaac atgtttattc gcccgagcga tgaagaactg 480 gcaggtttca aaccagactt tatcgttatg a&cggcgcga agtgcactaa cocgcagtgg 540 aaagaacagg gtctcaactc egaaaacttc gtggcgttta acetgaccga gegcatgcaa 500 gecgaattct gcagatcotg aagatggcac tatcgaettt gatgatggtt eaaaaaccga 660 gaacacccgc gtttcttatc cgatctatca catogataac attgttaage oggtttocaa 720 agcgggccac gcgactaagg ttatettcct gactgetgat gctttoggcg tgttgccgcc 780 ggtttctcgc ctgactgccg atcaaaecca gtateactte ctctctggct teaoegccaa 840 aetggccggt actgagcgtg gcatcaecga accgacgcca accttctccg cttgcttcgg 900 cgcggcattc ctgtcgctgc acccgactca gtacgcagaa gtgetggtga aacgtatgca 960 ggcggcgggc gcgcaggctt atctggttaa caotggctgg aacggcactg gcaaaegtat 1020 ctcgattaaa gatacccgcg ccattatcga cgccatcctc aacggttogc tggataatgc 1080 agaaaccttc actctgcoga tgtttaacct ggcgatccca aecgaaetge cgggcgtaga 1140 cacgaagatt ctcgatccgc gtaacaecta cgcttctccg gaacagtggc aggaaaaage 1200 cgaaaccctg gogaaactgt ttatcgacaa Ottcgataaa tacaccgaca cccetgcggg 1260 tgccgcgctg gtagcggctg gtccgaaact gtaa 1294

<210>	5
(211>	1248
<212>	DNA
<213>	Escherichia
<220>
(221>	gen
<220>	(376) . . (714)
<223>	ORF ytfP
<220>
(221>	gen
<220>	komplement (
<223>	ORF yj fA

PL 210 791 B1 <400> 5 ggegatgtcg caacaagotg ccttgtctta tttgctacgt ggacaagggn tggagagoga 60 tcagagcgac agtgcggcaa tgacetcgat gctgattggt ttgggggttg cgeaaagtgg 120 ccagattgtg ggtaaaatcg gcgagaogtt tggcgtaagc aatttagogc «ogaeaoeea ISO gggagtaggc gactcctcoc aggtagtggt cagcggctat gtattgecag gtctgcaagt 240 gaaataegge gtgggtatat ttgactetat agcaacactc aegttaegtt atogcctgat 300 gectaagcta tatctggaag ccgtgtctgg tgtagaccag geaetggatt tgctctatca 360 gttcgagttt tagcaatgcg aatatttgte tacggcagtt tacgccacaa acaaggcuo 420 agteactgga tgaccaatgc ccagttactg ggogatttea gtategataa ctaccagttg 410 tatagcctgg gccactatcc aggogcagtt ccggggaaog gaacggtaca eggtgaagtt 540 tatcgtattg acaaegcoae gctggccgaa cttgatgoct tgcgeaecag gggeggtgaa 600 tacgcgcgcc agttgattca gacgccgtac gggagtgoat ggatgtacgt ttateaacga 660 cocgtcgatg gattaaaget aattgaaage ggogactggt tagaeaggga taagtaaooa 720 tatgcataeg ccaccttogg gtggćgttgt tttttgcgag acgactcgoa ttctgttttg 760 taattooctc accttttgct tttctctccg agoogetttę catatctatt aacgcataaa 640 aaactctget ggcattcaea aatgogcagg ggtaaaaogt ttcctgtagc accgtgagtt 900 •tactttgta taacttaagg aggtgcagat gcgtattaoc ataaaaagat gggggaaoag 960 tgcaggtatg gteattooca atatcgtaat gaaagaactt aacttacagc egggyeagag 1020 egtggaggog caagtgagca acaatcaaot gattctgaoa occatctcca ggogctaete 1060 gcttgatgaa ctgctggcae agtgtgacat gaaogoogeg gaacttagog agcaggatgt 1140 ctggggtaa* tccaccoctg cgggtgaoga aatatggtaa agaaaagtga atttgaaogg 1200 ggagacattg tgetggttgg ctttgatoca geaagoggoe atgaaoag 1246 <210> 6 <211> 911 <212> DNA <213> Escherichia coli <220>

<221> cecha dowolna <222> (1)..(911) <223> region ytfP-yjfA z delecją <220>

<221> cecha dowolna <222> (11)..(383) <223> sekwencja flankująca 5' regionu ytfP-yjfA <220>

<221> cecha dowolna <222> (384)..(911) <223> sekwencja flankująca 3' regionu ytfP-yjfA <220>

<221> cecha dowolna <222> (376)..(378) <223> kodon ATG skróconej ORF ytfP

PL 210 791 B1 <220>

<221> cecha dowolna <222 > komplement ( (388) . . (390)) <223> kodon ATG skróconej ORF y j f A <400> 6 ggcgatgtcg caacaagctg ccttgtctta tcagagcgac agtgcggca* tgacctcgat ccagattgtg ggtaaaatcg gcgagacgtt gggagtaggc gactcctoec aggtagtggt gaaataoggc gtgggtatat ttgactetat gcctaagct* tatctggang ccgtgtctgg gttcgagttt tagcaatgcg aattatgcat gagacgactc gcattctgtt ttgtaattce ttccatatct attaacgcat aaaaaactct cgtttcctgt agcaccgtga gttatacttt accataaaaa gatgggggaa cagtgcaggt cttaacttac agccggggca gagcgtggag acacccatct ccaggcgcta otcgcttgat goggaactta gcgagcagga tgtctggggt taaaguaag tgaatttgaa cggggagaoa gccatga&ca g tttgctaogt ggacaagggc tggagagcga 60 gctgattggt ttgggggttg cgcaaagtgg 120 tggcgtaagc aatttagcgc tcgacaocca 180 cagcggctat gtattgocag gtctgcaagt 240 agcaacactc acgttacgtt atcgcctgat 300 tgtagacscag gcactggatt tgctctatca 360 aogccacett cgggtggogt tgttttttgc 420 ctcacctttt gcttttctct ccgagccgct 480 gctggcatte acaaatgcgc aggggtaaaa 540 gtat&actta aggaggtgca gatgcgtatt 600 atggtcattc cc&atatcgt aatgaaagaa 660 gcgcaagtga gcaacaatca actgattctg 720 gaactgctgg cacagtgtga catgaacgoc 780 aaatccacoo ctgcgggtga cgaaatatgg 840 ttgtgctggt tggctttgat ccagcaagcg 900 »11 <210> 7 <211> 1158 <212> DNA <213> Escherichia coli <220>

<221> cecha dowolna <222> (1) . . (1158) <223> region ytfP-yjfA z delecją <220>

<221> cecha dowolna <222> (1)..(530) <223> sekwencja flankująca 5' regionu ytfP-yjfA <220>

<221> cecha dowolna <222> (631) . . (1158) <223> sekwencja flankująca 3' regiony ytfP-yjfA <220>

<221> cecha dowolna <222> (376)..(378) <223> kodon ATG skróconej ORF ytfP

PL 210 791 B1 <220>

<221> cecha dowolna <222> komplement ( (635) . . (637)) <223> kodon ATG skróconej ORF y j f A <400> 7 ggcgatgtcg caacaagctg ccttgtctta tttgctacgt ggacaagggc tggagagog* 60 tcagagcgac agtgcggcaa tgacctcgat gctgattggt ttgggggttg cgcaaagtgg 120 ccagattgtg ggtaaaatog gcgagacgtt tggcgt&agc aatttagcgc tcgacaocca. 180 gggagtagge gaotcctccc aggtagtggt cagcggctat gtattgccag gtctgcaagk 240 gaaatacggc gtgggtatat ttgactctat agcaacacto acgttacgtt atcgcctgat 300 gcctaagcta tatctggaag ccgtgtctgg tgtagaccag gcaetggatt tgctctatca 380 gttcgagttt tagcsatgcg aatatttgte tacggcagtt tacgecacaa acaaggeaae <20 agtcactgga tgaccaatge ccagttactg ggogatttca gtatcgataa ctaccagttg 480 tatagcctgg gccactatcc aggcgoagtt coggggaacg gaacggtaca cggtgaagtt 540 tatcgtattg acaacgccac gctggccgaa cttgatgcct tgcgoaccag gggcggtgaa 600 taogogogoe agttgattca gacgccgtac t&tgęat&cg ceaecttcgg gtggcgttgt 660 tttttgcgag acgactcgca ttctgttttg taattccctc accttttgct tttctctccg 720 agccgctttc catatctatt aacgcataaa aaactctgct ggcattcaca aatgcgcagg 780 ggtaaaaegt ttoctgtagc accgtgagtt atactttgta taacttaagg aggtgcagat B40 gcgtattacc ataaaaagat gggggaacag tgcaggtatg gtcattccca atatcgtaat 900 gaaagaaett aacttacagc cggggcagag cgtggaggcg caagtgagca acaatcaact 960 gattctgaca cccatctcca ggcgctacte gcttgatgaa ctgctggcae agtgtgacat 1020 gaacgccgeg gaacttagcg agcaggatgt ctggggtaaa tocacccetg cgggtgacga 1080 aatatggtaa agaaaagtga atttgaacgg ggagacattg tgctggttgg ctttgatoea 1140 gcaagcggcc atgaacag 1158 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>

<223> opis sekwencji sztucznej: starter pckA’5'-l <400> 8 20 gatccgagcc tgacaggtta <21O> 9 <211> 20 <212? DNA <213> sekwencja sztuczna <220?

<223? opis sekwencji sztucznej: starter pckA'5'-2 <400> 9 20 gcatgcgctc ggtcaggtta <210> 10 <211> 22

PL 210 791 B1

PL 210 791 B1

PL 210 791 B1

Claims (7)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Fermentacyjny sposób przeznaczony do wytwarzania L-treoniny, znamienny tym, że przeprowadza się następujące etapy:

   a) fermentację z udziałem drobnoustrojów z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzających L-treoninę, w których otwarte ramki odczytu yjfA i ytfP, lub kodujące je sekwencje nukleotydowe, są wyłączone przez mutację wybraną z grupy składającej się z tranzycji, transwersji, insercji i delecji;

   b) wzbogacenie podłoża lub komórki bakterii pod względem zawartości L-treoniny, oraz

   c) izolację L-treoniny.
2. 2. Drobnoustroje z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzające L-treoninę, w których otwarte ramki odczytu yjfA i ytfP lub kodujące je sekwencje nukleotydowe są wyłączone przez mutację wybraną z grupy składającej się z tranzycji, transwersji, insercji i delecji.
3. 3. Plazmid pMAK705ΔyjfA, zawierający sekwencje flankujące 5' i 3' regionu ytfP-yjfA, obejmujące krótkie reszty otwartych ramek odczytu yjfA i ytfP, co odpowiada SEK. ID Nr. 6.
4. 4. Plazmid pMAK705Δ90bp, zawierający sekwencje flankujące 5' i 3' regionu ytfP-yjfA, obejmujące krótkie reszty otwartych ramek odczytu yjfA i ytfP, co odpowiada SEK. ID Nr 7.
5. 5. Wyizolowany polinukleotyd z drobnoustrojów z rodziny Enterobacteriaceae, obejmujący sekwencje flankujące 5' i 3' regionu ytfP-yjfA, przedstawiony w SEK. ID Nr 6, korzystnie przeznaczony do wykorzystania, jako składnik plazmidu dla specyficznej względem miejsca mutagenezy otwartych ramek odczytu ytfP i yjfA.
6. 6. Szczepy bakteryjne z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzające L-treoninę, znamienne tym, że zawierają mutację delecyjną w otwartej ramce odczytu ytfP i yjfA, odpowiednio do SEK ID Nr 6 lub 7.
7. 7. Szczep Escherichia coli K-12 MG442Δ90yjfA zdeponowany pod numerem DSM 14289 w Deutsche Sammlung far Mikroorganismen und Zellkulturen.