PT1320626E - Processo de fermentação para a preparação de l-aminoácidos usando estirpes da família das enterobacteriaceas - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "PROCESSO DE FERMENTAÇÃO PARA A PREPARAÇÃO DE L-AMINOÁCIDOS USANDO ESTIRPES DA FAMÍLIA DAS ENTEROBACTERIACEAS"

Campo da Invenção A presente invenção refere-se a um processo de fermentação para a preparação de L-aminoácidos, especialmente L-treonina, usando estirpes da família das Enterobacteriaceas, nas quais pelo menos o gene pckA é atenuado.

Estado da Técnica

Os L-aminoácidos são usados na nutrição animal, em medicina humana e na indústria farmacêutica.

Sabe-se como preparar L-aminoácidos por fermentação de estirpes de Enterobacteriaceas, especialmente Escherichia coli e Serratia marcescens. Devido à sua enorme importância, há tentativas constantes de melhorar o processo de preparação. Melhorias no processo podem estar relacionadas com medidas envolvendo a tecnologia de fermentação, por exemplo, agitação e fornecimento de oxigénio, ou a composição do meio de nutrientes, por exemplo, a concentração de açúcar durante a fermentação, ou o melhoramento da forma do produto, por exemplo por cromatografia de permuta iónica, ou as características de produtividade intrínsecas características do microorganismo em si.

As características de produtividade destes microorganismos são melhoradas pela utilização de métodos de mutagénese, selecção e escolha de mutante que resultam em estirpes que são resistentes a antimetabolitos, por exemplo o análogo da treonina ácido a-amino-β-hidroxivalérico (AHV), ou auxotróficas para metabolitos de 2 importância reguladora, e produzem L-aminoácidos, por exemplo L-treonina. Métodos de tecnologia de ADN recombinante também têm sido usados durante alguns anos para melhorar as estirpes da família das Enterobacteriaceas produtoras de L-aminoácidos, através da amplificação de genes de biosíntese de aminoácidos individuais, e estudando o efeito na produção. A EP-A-1 094 111 fornece um processo para a preparação por fermentação de L-aminoácidos, em particular L-lisina e L-treonina, usando bactérias corineformes as quais, em particular, já produzem os L-aminoácidos e nas quais a(s) sequência(s) de nucleótidos para o produto do gene pck são atenuadas.

Prost Jean-François et al: "Detection of an extended -10 element in the promoter region of the pckA gene encoding phosphoenolpyruvate carboxykinase in Escherichia coli." Biochemie 81: 197-200 (1999), descreve que a regulação da transcrição do gene pckA que codifica para a fosfoenolpiruvato carboxiquinase em Escherichia coli foi analisada por mutagénese dirigida da região do promotor e medição da iniciação da transcrição in vitro.

Kramer R: "Genetic and physiological approaches for the production of amino acids" Journal of Biotechnology, Elsevier Science Publishers, Amesterdão, Holanda, vol. 45, no. 1, 12 Fevereiro (1996-02-12), páginas 1-21, XP004036833 ISSN: 0168-1656, descreve as vias relevantes em microorganismos produtores de aminoácidos de relevância biotecnológica.

Base de dados Biosis [online] Biosciences Information Service, Filadélfia, PA, EUA; 1990, Medina V. et al. fornece "Sequence of the pck - a gene of Escherichia Coli K-12 Relevance to genetic and allosteric regulation and 3

Homology of Escherichia coli Phosphoenolpyruvate Carboxykinase with the enzymes from Trypanosoma-Brucei and Saccharomyces-Cerevisiae" XP002193203 n°. de acesso da base de dados PREV199191038347.

Na base de dados Biosis [online] Biosciences Information Service, Filadélfia, PA, EUA; 1990, pode-se encontrar Goldie H. et al: "Physical and genetic locus from Escherichia-Coli K12" XP002193202 n°. de acesso da base de dados PREVI99089092769.

Objectivo da Invenção O objectivo que a invenção pretendia atingir era o de fornecer novos procedimentos para melhorar a preparação de L-aminoácidos, especialmente L-treonina, por fermentação.

Sumário da Invenção

A invenção fornece um processo de fermentação para a preparação de L-aminoácidos, especialmente L-treonina, usando microorganismos da família da Enterobacteriaceas, os quais, em particular, já produzem L-treonina e nos quais a sequência de nucleótidos (gene pckA) que codifica para a enzima fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PEP carboxiquinase) (EC 4.1.1.49) é atenuada.

Descrição detalhada da Invenção

Quando L-aminoácidos ou aminoácidos são referidos na seguinte descrição, isto significa um ou mais aminoácidos, incluindo os seus sais, escolhidos a partir do grupo consistindo em L-asparagina, L-treonina, L-serina, L-glutamato, L-glicina, L-alanina, L-cisteína, L-valina, L-metionina, L-isoleucina, L-leucina, L-tirosina, L-fenilalanina, L-histidina, L-lisina, L-triptofano, L- 4 homoserina e L-arginina. L-treonina é particularmente privilegiado.

Neste contexto, o termo "atenuação" descreve a redução ou o desligar da actividade intracelular de uma ou mais enzimas (proteínas), num microorganismo, as quais são codificadas pelo ADN apropriado, por exemplo através da utilização de um promotor fraco ou um gene ou alelo que codifica para uma enzima apropriada com baixa actividade, ou inactivando a enzima apropriada (proteína), e opcionalmente, combinando estas duas medidas. A actividade ou concentração da proteína correspondente é em geral reduzida por medidas de atenuação para 0 até 75%, 0 até 50%, 0 até 25%, 0 até 10% ou 0 até 5% da actividade ou concentração da proteína tipo-selvagem ou da actividade ou concentração da proteína no microorganismo de partida. O processo é caracterizado de forma a que os seguintes passos são executados: a) fermentação pelos microorganismos da família das

Enterobacteriaceas, produzindo o L-aminoácido desejado, em cujos microorganismos pelo menos o gene pckA , ou sequências de nucleótidos codificando para o produto do gene pckA são atenuados. b) enriquecimento do L-aminoácido no meio ou nas células bacterianas, e c) isolamento do L-aminoácido ou d) constituintes do meio de fermentação e a biomassa na sua totalidade ou partes desta isoladas como um produto sólido juntamente com o L-aminoácido.

Os microorganismos fornecidos pela presente invenção podem produzir L-aminoácidos a partir de glucose, sucrose, lactose, frutose, maltose, melaço, opcionalmente amido ou opcionalmente celulose, ou a partir de glicerol e etanol. 5

Os referidos microorganismos são representativos da familia das Enterobacteriaceas, seleccionados dos géneros Escherichia, Erwinia, Providencia e Serratia. Os géneros Escherichia e Serratia são preferidos. As espécies

Escherichia coli e Serratia marcescens podem ser referidas em particular, dentro dos géneros Escherichia e Serratia respectivamente.

Exemplos de estirpes adequadas, em partícula estirpes produtoras de L-treonina, do género Escherichia, especialmente da espécie Escherichia coli são:

Escherichia coli TF427 Escherichia coli H4578 Escherichia coli KY10935 Escherichia coli VNIIgenetika MG442 Escherichia coli VNIIgenetika Ml Escherichia coli VNIIgenetika 472T23 Escherichia coli BKIIM B-3996 Escherichia coli kat 13 Escherichia coli KCCM-10132

Exemplos de estirpes do género Serratia produtoras de L-treonina adequadas, especialmente da espécie Serratia marcescens, são:

Serratia marcescens HNr21 Serratia marcescens TLrl56 Serratia marcescens T2000

Estirpes da familia das Enterobacteriaceas, produtoras de L-treonina, possuem preferencialmente, designadamente uma ou mais caracteristicas genéticas ou fenotipicas seleccionadas do grupo compreendendo resistência ao ácido a-amino-p-hidroxivalérico, resistência a tialisina, resistência a etionina, resistência a a-metilserina, resistência a ácido diaminosuccinico, resistência a ácido α-aminobutírico, resistência a borrelidina, resistência a 6 rifampicina, resistência a análogos de valina tais como hidroxamato de valina, resistência a análogos de purina tais como β-dimetilaminopurina, necessidade de L-metionina, necessidade opcionalmente parcial e compensável de L-isoleucina, necessidade de ácido meso-diaminopimélico, auxotrofia relativamente a dipéptidos contendo treonina, resistência a L-treonina, resistência a L-homoserina, resistência a L-lisina, resistência a L-metionina, resistência a ácido L-glutâmico, resistência a L-aspartato, resistência a L-leucina, resistência a L-fenilalanina, resistência a L-serina, resistência a L-cisteina, resistência a L-valina, sensibilidade a fluoropiruvato, deficiente para treonina desidrogenase, opcionalmente capaz de utilizar sucrose, amplificação do operão da treonina, amplificação de homoserina desidrogenase I - aspartato quinase I, preferencialmente da forma resistente a feedback, amplificação de homoserina quinase, amplificação de treonina sintase, amplificação de aspartato quinase, opcionalmente da forma resistente a feedback, amplificação de aspartato semialdeido desidrogenase, amplificação de fosfoenolpiruvato carboxilase, opcionalmente da forma resistente a feedback, amplificação de fosfoenolpiruvato sintase, amplificação de transhidrogenase, amplificação do produto do gene RhtB, amplificação do produto do gene RhtC, amplificação do produto do gene YfiK, amplificação de malato quinona oxiredutase e amplificação de uma piruvato carboxilase e atenuação da formação de ácido acético.

Foi observado que a produção de L-aminoácidos, especialmente L-treonina, por microorganismos da família das Enterobacteriaceas é melhorada após a atenuação e, em particular, o desligar do gene pckA que codifica para a PEP carboxiquinase (EC 4.1.1.49). 7 A sequência de nucleótidos do gene pckA da Escherichia coli foi publicada por Medina et al. (Journal of Bacteriology 172, 7151-7156 (1990)) e pode também ser retirada da sequência do genoma da Escherichia coli publicada por Blattner et al. (Science, 277, 1453-1462 (1997)) . A sequência de nucleótidos do gene pckA de Escherichia coli é representada em SEQ ID N° 1 e a sequência de aminoácidos do correspondente produto do gene é representado em SEQ ID N° 2.

Os genes pckA descritos nas referências de literatura acima mencionadas podem ser usados de acordo com a invenção. Também é possível usar alelos do gene pckA, os quais resultam da degeneração do código genético ou de mutações sense neutrais. A atenuação pode ser atingida por exemplo, reduzindo ou desligando a expressão do gene pckA ou das propriedades catalíticas da proteína enzima. Opcionalmente, podem-se combinar ambas as estratégias. A expressão do gene pode ser reduzida por uma técnica de cultura apropriada, por modificação genética (mutação) das estruturas de sinal de expressão genética, ou por intermédio de tecnologia de ARN antisense. Exemplos de estruturas de sinalização de expressão genética são genes repressores, genes activadores, operadores, promotores, atenuadores, locais de ligação a ribossomas, o codão de iniciação e terminadores. Peritos na especialidade encontrarão informação relevante designadamente por exemplo em Jensen e Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), Carrier e Keasling (Biotechnology Progress 15, 58-64 (1999)), Franch e Gerdes (Current Opinion in Microbiology 3, 159-164 (2000)) e livros de texto de

Genética e Biologia Molecular bem conhecidos, por exemplo o livro de texto por Knippers ("Molekulare Genetik" 8 ("Genética Molecular"), 6a. Edição, Georg Thieme Verlag, Estugarda, Alemanha, 1995) ou o livro por Winnacker ("Gene und Klone" ("Genes e Clones"), VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemanha, 1990) .

Mutações que levam a uma alteração ou redução nas propriedades catalíticas de proteínas do tipo enzima são conhecidas do estado da técnica. Exemplos que podem ser referidos são os estudos de Qiu e Goodman (Journal of Biological Chemistry 272, 8611-8617 (1997)), Yano et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 95, 5511-5515 (1998)) e Wente e Schachmann (Journal of

Biological Chemistry 266, 20833-20839 (1991)). Pesquisas podem ser encontradas em livros de texto de Genética e Biologia Molecular bem conhecidos, por exemplo o livro de texto por Hagemann ("Allgemeine Genetik" ("Genética Geral"), Gustav Fischer Verlag, Estugarda, 1986).

Mutações que podem ser levadas em consideração são transições, transversões, inserções e deleções. Dependendo do efeito da troca do aminoácido na actividade da enzima, o termo mutações missense ou mutações nonsense é usado. Inserções ou deleções de pelo menos um par de bases num gene, causam mutações que originam alterações na grelha de leitura, tendo como consequência a incorporação de aminoácidos errados ou o fim prematuro da translação. Deleções de vários codões levam tipicamente a uma perda completa da actividade enzimática. Instruções para a produção de tais mutações são bem conhecidas do estado da técnica e podem ser encontradas em livros de texto de Genética e Biologia Molecular bem conhecidos, por exemplo o livro de texto de Knippers ("Molekulare Genetik" ("Genética Molecular"), 6a. Edição, Georg Thieme Verlag, Estugarda, Alemanha, 1995), o livro de texto de Winnacker ("Gene und Klone" ("Genes e Clones") VCH Verlagsgesellschaft, 9

Weinheim, Alemanha, 1990) ou o livro de texto de Hagemann ("Allgemeine Genetik") ("Genética Geral"), Gustav Fischer Verlag, Estugarda, 1986). O plasmídeo pMAK705ApckA (Figura 1) é um exemplo de um plasmídeo, por intermédio do qual o gene pckA da Escherichia coli pode ser atenuado e, em particular, desligado por mutagénese sitio-especifica. Este plasmídeo contém apenas parte da região 5' e parte da região 3' do gene pckA. Falta um segmento de 349 pares de bases da região codificante (deleção) . A sequência deste ADN, que pode ser usado para a mutagénese do gene pckA, está representada na SEQ ID N°.3 A mutação do gene pckA por deleção pode ser incorporada em estirpes apropriadas por substituição genética ou alelica.

Um método comum é o da substituição genética usando um derivado de pSClOl de replicação condicionada, pMAK705, tal como descrito por Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 174, 4617-4622 (1989)). Também podem ser usados outros métodos descritos no estado da técnica, por exemplo os descritos por Matinez-Morales et al. (Journal of Bacteriology, 7143-7148 (1999)) ou por Boyd et al. (Journal of Bacteriology 182, 842-847 (2000)) .

Quando a substituição foi executada, a forma do alelo ApckA representada na SEQ ID N°. 4, a qual é também objecto desta invenção, está presente na estirpe em questão.

Mutações no gene pckA ou mutações envolvendo a expressão do gene pckA podem também ser transferidas para diferentes estirpes por conjugação ou transdução.

Adicionalmente, para a produção de L-aminoácidos, especialmente L-treonina, com estirpes da família das Enterobacteriaceas, pode ser vantajoso não só atenuar o gene pckA mas também amplificar uma ou mais enzimas da 10 conhecida via de biosintese de treonina, ou enzimas do metabolismo anaplerótico, ou enzimas para a produção de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reduzida.

Neste contexto, o termo "amplificação" descreve o aumento na actividade intracelular num microorganismo, de uma ou mais enzimas ou proteínas que são codificadas por um ADN apropriado, por exemplo aumentando o número de cópias do(s) gene(s), usando um promotor forte ou usando um gene que codifica para uma enzima ou proteína apropriada com actividade elevada, e opcionalmente combinando estas duas medidas.

Através de medidas de amplificação, em particular de sobre-expressão, a actividade ou concentração da proteína correspondente é aumentada em geral, pelo menos 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% ou 500%, até um máximo de 1000% ou 2000%, com base na actividade ou concentração da proteína tipo selvagem ou na actividade ou concentração da proteína no microorganismo de partida.

Deste modo, por exemplo, podem ser simultaneamente amplificados e, em particular, sobre-expressos, genes seleccionados do grupo compreendendo: • o operão thrABC, que codifica para a aspartato quinase, homoserina desidrogenase, homoserina quinase e treonina sintase (US-A-4,278,765), • o gene pyc que codifica para a piruvato carboxilase (DE-A-19 831 609) , • o gene pps que codifica para a fosfoenolpiruvato sintase (Molecular and General Genetics 231, 332 (1992)), • o gene ppc que codifica para a fosfoenolpiruvato carboxilase (Gene 31, 279-283 (1984)), 11 • os genes pntA e pntB que codificam para a transhidrogenase (European Journal of Biochemistry 158, 647-653 (1986)), • o gene rhtB para a resistência à homoserina (EP-A-0994190)), e • o gene rhtC para a resistência à treonina (EP-A-1013765), • o gene gdhA que codifica para a glutamato desidrogenase (Gene 27:193-199 (1984)).

Adicionalmente, para a produção de L-aminoácidos, especialmente L-treonina, pode ser vantajoso não só atenuar o gene pckA mas também atenuar e, em particular, desligar um ou mais genes seleccionados do grupo compreendendo: • o gene tdh, que codifica para a treonina desidrogenase (Ravnikar e Somerville, Journal of Bacteriology 169, 4716-4721 (1987)), • o gene mdh que codifica para a malato desidrogenase (EC 1.1.1.37) (Vogel et al.,

Archives in Microbiology 149, 36-42 (1987)), • o produto do gene da grelha de leitura aberta (orf) y j f A (Número de Acesso AAC77180 do Centro

Nacional para Informação Biotecnológica (NCBI,

Bethesda, MD, EUA) e SEQ ID N°. 5), e • o produto do gene da grelha de leitura aberta (orf) ytfP (Número de Acesso AAC77179 do Centro

Nacional para Informação Biotecnológica (NCBI,

Bethesda, MD, EUA) e SEQ ID N°. 5), ou reduzir a expressão. É preferido atenuar a grelha de leitura aberta yjfA e/ou a grelha de leitura aberta ytfP.

Também é possível, de acordo com a descrição, atenuar as grelhas de leitura aberta yjfA e/ou ytfP 12 independentemente do gene pckA, de modo a atingir um aumento na produção de aminoácidos , em particular na produção de L-treonina Consequentemente, a descrição também fornece um processo, caracterizado pela execução dos seguintes passos: d) fermentação por microorganismos da família das Enterobacteriaceas, nos quais pelo menos a grelha de leitura aberta yjfA e/ou ytfP é atenuada, e) enriquecimento de L-aminoácido no meio ou nas células dos microorganismos da família das Enterobacteriaceas, e f) isolamento da L-treonina, constituintes do meio de fermentação e a biomassa na sua totalidade ou partes desta isoladas opcionalmente como um produto sólido juntamente com o L-aminoácido.

Um exemplo de um plasmídeo, por intermédio do qual as grelhas de leitura aberta yjfA e ytfP de Escherichia coli podem ser atenuadas e, em particular, desligadas por mutagénese sitio-específica, é o plasmídeo pMAK7 0 5Ay j fA (Figura 2). Este plasmídeo contém apenas as extremidades 5' e 3' da região ytfP-yjfA, incluindo resíduos muito pequenos das grelhas de leitura aberta yjfA e ytfP. Um fragmento da região ytfP-yjfA de 337 pares de bases está a ausente (deleção) . A sequência deste ADN, o qual pode ser usado para a mutagénese da região ytfP-yjfA, está representada na SEQ ID N°. 6.

Um exemplo adicional de um plasmídeo, por intermédio do qual as grelhas de leitura aberta yjfA e ytfP de Escherichia coli podem ser atenuadas e, em particular, desligadas por mutagénese sitio-específica, é o plasmídeo pMAK705A90bp (Figura 5). Este plasmídeo também contém apenas as extremidades 5' e 3' da região ytfP-yjfA, incluindo resíduos muito pequenos das grelhas de leitura 13 aberta yjfA e ytfP. Um fragmento da região ytfP-yjfA de 90 pares de bases está ausente (deleção) . A sequência deste ADN, o qual pode ser usado na mutagénese da região ytfP-yjfA, está representada na SEQ ID N°. 7.

Esta mutação do tipo deleção pode ser incorporada em estirpes adequadas por substituição de genes ou alelos. Também é possivel transferir mutações nas grelhas de leitura aberta yjfA e/ou ytfP ou mutações que afectam a expressão destas grelhas de leitura aberta, para várias estirpes, por conjugação ou transdução.

Quando a substituição foi levada a cabo, a forma dos alelos AytfP e AyjfA representada na SEQ ID N°. 6 ou SEQ ID N° . 7, que são objecto adicional da descrição, está presente na estirpe em questão.

Adicionalmente, para a produção de L-aminoácidos, especialmente L-treonina, pode ser vantajoso, como complemento da atenuação individual ou conjunta do gene pckA ou das grelhas de leitura aberta yjfA e/ou ytfP, desligar reacções secundárias indesejadas (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", em: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, Londres, Reino Unido, 1982).

Os microorganismos preparados de acordo com a invenção podem ser cultivados em sistema descontinuo ou em sistema semi-descontinuo. Um sumário de métodos de cultura conhecidos é fornecido no livro de texto por Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Tecnologia de Bioprocessamento 1. Introdução à Bioengenharia) (Gustav Fischer Verlag, Estugarda, 1991)) ou no livro de texto por Storhas (Bioreaktoren und Periphere Einrichtungen (Bioreactores e Equipamento Periférico) (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994)). 14 0 meio de cultura a ser usado deve ir ao encontro das exigências de cada estirpe em particular. Descrições de meios de cultura para vários microorganismos podem ser encontradas no livro "Manual of Methods for General Bacteriology" da Sociedade Americana de Bacteriologia (Washington DC, EUA, 1981) .

As fontes de carbono que podem ser utilizadas são açúcares e carbohidratos, por exemplo glucose, sucrose, lactose, frutose, maltose, melaço, amido e opcionalmente celulose, óleos e gorduras, por exemplo óleo de soja, óleo de girassol, óleo de amendoim e gordura de coco, ácidos gordos, por exemplo ácido palmitico, ácido esteárico e ácido linoleico, álcoois, por exemplo glicerol e etanol e ácidos orgânicos, por exemplo ácido acético. Estas substâncias podem ser usadas individualmente ou como misturas.

As fontes de azoto que podem ser usadas são compostos contendo azoto orgânico tais como peptonas, extracto de levedura, extracto de carne, extracto de malte, água da maceração do milho, farinha de soja e ureia, ou compostos inorgânicos tais como o sulfato de amónio, cloreto de amónio, fosfato de amónio, carbonato de amónio e nitrato de amónio. As fontes de azoto podem ser usadas individualmente ou em misturas.

As fontes de fósforo que podem ser usadas são ácido fosfórico, dihidrogenofosfato de potássio ou hidrogenofosfato de dipotássio ou os sais de sódio correspondentes. 0 meio de cultura também deve conter sais de metais, por exemplo sulfato de magnésio ou sulfato de ferro, os quais são necessários para o crescimento. Finalmente, substâncias promotoras de crescimento essenciais tais como aminoácidos e vitaminas podem ser usadas em acréscimo às substâncias anteriormente 15 mencionadas. Também podem ser adicionados ao meio de cultura precursores adequados. Os nutrientes referidos podem ser adicionados à cultura todos de uma vez ou adicionados apropriadamente durante a cultura. 0 pH da cultura é controlado pelo uso apropriado de compostos básicos tais como o hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, amoniaco ou solução aquosa de amoníaco, ou compostos ácidos tais como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico. A formação de espuma pode ser controlada usando agentes anti-espuma tais como poliglicol ésteres de ácidos gordos. A estabilidade dos plasmídeos pode ser mantida através da adição ao meio de substâncias de selecção , por exemplo antibióticos. Condições aeróbias são mantidas através da introdução na cultura de oxigénio ou misturas gasosas contendo oxigénio, por exemplo ar. A temperatura da cultura é normalmente de 25°C a 45°C, e preferencialmente de 30°C a 40°C. A cultura é continuada até que a formação de L-aminoácidos ou L-treonina atinja o máximo. Este objectivo é normalmente atingido ao fim de 10 a 160 horas.

Os L-aminoácidos podem ser analisados por intermédio de cromatografia de permuta aniónica seguida de reacção da ninidrina, tal como descrito por Spackman et al. (Analytical Chemistry 30, 1190 (1958)), ou por HPLC de fase reversa, como descrito por Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51, 1167-1174 (1979)).

Foi depositada, a 8 de Setembro de 2000 no Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = Colecção Alemã de Microorganismos e Culturas Celulares Braunschweig, Alemanha), uma cultura pura da estirpe DH5a/pMAK705 de Escherichia coli K-12, de acordo com o Tratado de Budapeste, como DSM 13720.

Foi depositada, a 2 de Outubro de 2000 no Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = 16

Colecção Alemã de Microorganismos e Culturas Celulares Braunschweig, Alemanha), uma cultura pura da estirpe MG442ApckA de Escherichia coli K-12, de acordo com o Tratado de Budapeste, como DSM 13761.

Foi depositada, a 9 de Março de 2001 no Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = Colecção Alemã de Microorganismos e Culturas Celulares Braunschweig, Alemanha), uma cultura pura da estirpe B-3996kurAtdhApckA/pVIC40 de Escherichia coli K-12, de acordo com o Tratado de Budapeste, como DSM 14150.

Foi depositada, a 9 de Março de 2001 no Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = Colecção Alemã de Microorganismos e Culturas Celulares Braunschweig, Alemanha), uma cultura pura da estirpe MG442A90yjfA de Escherichia coli K-12, de acordo com o Tratado de Budapeste, como DSM 14289.

Também é possível, de acordo com a descrição, atenuar apenas as grelhas de leitura aberta ytfP e yjfA, de forma a melhorar a produção de L-aminoácidos. O processo de acordo com a invenção é usado para a preparação de L-aminoácidos, por exemplo L-treonina, L-isoleucina, L-metionina, L-homoserina e L-lisina, em particular L-treonina, por fermentação. A presente invenção é seguidamente ilustrada em maior detalhe com a ajuda de Exemplos. O isolamento de ADN plasmídico da Escherichia coli e todas as técnicas para restrição, tratamento de Klenow e tratamento por fosfatase alcalina foram realizados tal como descrito por Sambrook et al. (Molecular Cloning - A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratoty Press). A menos que indicado em contrário, a transformação de Escherichia coli foi levada a cabo tal como descrito por 17

Chung et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 86, 2172-2175 (1989)). A temperatura de incubação para a preparação de estirpes e microorganismos transformados foi 37°C. No processo de substituição de genes de Hamilton et al., foram usadas temperaturas de 30°C a 44°C.

Exemplo 1

Construção da mutação de tipo deleção no gene pckA.

Partes das regiões 5' e 3' do gene pckA de Escherichia coli K12 foram amplificadas usando a reacção em cadeia da polimerase (PCR) e oligonucleótidos sintéticos. A sequência de nucleótidos do gene pckA de E. coli K12 MG1655 (SEQ ID N°. 1) foi usada para sintetizar as seguintes sequências iniciadoras de PCR (MWG Biotech, Ebersberg, Alemanha): pckA'5'-1: 5' - GATCCGAGCCTGACAGGTTA - 3' pckA'5'-2: 5' - GCATGCGCTCGGTCAGGTTA - 3' pckA'3'-1: 5' - AGGCCTGAAGATGGCACTATCG - 3' pckA'3'-2: 5' - CCGGAGAAGCGTAGGTGTTA - 3' 0 ADN cromossómico de E. coli K12 MG1655 usado para o PCR foi isolado com "Qiagen Genomic-tips 100/G" (Qiagen, Hilden, Alemanha), de acordo com as instruções do fabricante. Um fragmento de ADN com aproximadamente 500 pares de bases da região 5' do gene pckA (denotado pckl) e um fragmento de ADN com aproximadamente 600 pares de bases da região 3' do gene pckA (denotado pck2) foram amplificados com as sequências iniciadoras especificas, sob condições de PCR Standard (Innis et al. (1990), PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) usando Taq ADN polimerase (Gibco-BRL, Eggenstein, Alemanha). Os produtos de PCR foram ligados com o vector pCR2.1TOPO (TOPO TA Cloning Kit, Invitrogen, Groningen, 18

Holanda), de acordo com as instruções do fabricante e usados para transformar a estirpe de E. coli TOP10F'. As células que continham o plasmideo foram seleccionadas em LB agar com 50 pg/mL de ampicilina. Após o isolamento do ADN plasmídico, o vector pCR2.lTOPOpck2 foi cortado com as enzimas de restrição StuI e Xbal e, após a separação num gel de agarose a 0,8%, o fragmento pck2 foi isolado com o auxilio do QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden, Alemanha). Após o isolamento do ADN plasmídico, o vector pCR2.lTOPOpckl foi cortado com as enzimas de restrição EcoRV e Xbal e ligado ao fragmento pck2 isolado. A estirpe de E. coli DH5a foi transformada com a mistura de ligação e as células que continham o plasmideo foram seleccionadas em LB agar com 50 pg/mL de ampicilina. Após o isolamento do ADN plasmídico, foram usados cortes de controlo com as enzimas Spel e Xbal, para detectar plasmídeos contendo, em forma clonada, a sequência de ADN mutagénico representada na SEQ ID N°. 3. Um dos plasmídeos foi denominado pCR2.lTOPOApckA.

Exemplo 2

Construção do vector de substituição pMAK705ApckA.

Após a restrição com as enzimas Spel e Xbal e a separação num gel de agarose a 0,8%, o alelo pckA descrito no Exemplo 1 foi isolado do vector pCR2.lTOPOApckA e ligado ao plasmideo pMAK705 (Hamilton et al., Journal of Bacteriology 174, 4617-4622 (1989)), o qual tinha sido previamente digerido com a enzima Xbal. DH5a foi transformada com a mistura de ligação e as célula que continham o plasmideo foram seleccionadas em LB agar com 20 pg/mL de cloranfenicol. Após o isolamento do ADN plasmídico e clivagem com as enzimas de restrição Hpal, Kpnl, HindIII, 19

Sall e PstI, foi detectado se a clonagem teve sucesso. 0 vector de substituição formado, pMAK705ApckA (= pMAK705deltapckA) é apresentado na Figura 1.

Exemplo 3

Mutagénese sitio-especifica do gene pckA na estirpe de E. coli MG4 42. A estirpe de E. coli MG442 produtora de L-treonina é descrita na patente US-A-4,278,765 e está depositada na Colecção Nacional Russa de Microorganismos Industriais (VKPM, Moscovo, Rússia), como CMIM B-1628. A estirpe MG442 tem uma resistência ao ácido a-amino-β-hidroxivalérico e tem uma necessidade opcionalmente parcial e compensável de L-isoleucina.

Para a substituição do gene pckA cromossómico pela deleção codificada pelo plasmideo, a estirpe MG442 foi transformada com o plasmideo pMAK705ApckA. A substituição do gene foi realizada pelo método da selecção descrito por Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 174, 4617-4622 (1989)) e foi verificada por métodos de PCR Standard (Innis et al. (1990), PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press), usando os seguintes oligonucleótidos como sequências de iniciação: pckA'5'-1: 5' - GATCCGAGCCTGACAGGTTA - 3' pckA'3'-2: 5' - CCGGAGAAGCGTAGGTGTTA - 3' A estirpe assim obtida foi denominada MG442ApckA.

Exemplo 4

Preparação de L-treonina com a estirpe MG442ApckA. A estirpe MG442ApckA foi cultivada em meio mínimo com a seguinte composição: 3,5 g/L de Na2HP04.2H20, 1,5 g/L de 20 KH2P04, 1 g/L de NH4CI, 0,1 g/L de MgS04.7H20, 2 g/L de glucose e 20 g/L de agar. A formação da L-treonina foi analisada em culturas em sistema descontinuo de 10 mL, contidas em frascos Erlenmeyer de 100 mL. Estas foram inoculadas com 10 mL de um meio de pré-cultura com a seguinte composição: 2 g/L extracto de levedura, 10 g/L (NH4)2S04, 1 g/L de KH2PO4, 0,5 g/L de MgS04.7H20, 15 g/L de CaC03 e 20 g/L de glucose, e incubadas durante 16 horas a 37 °C e 180 rpm numa incubadora ESR da Kuhner AG (Birsfelden, Suiça). 250 pL desta pré-cultura foram transferidos para 10 mL de um meio de produção (25 g/L de (NH4)2S04, 2 g/L de KH2P04, 1 g/L de MgS04.7H20, 0, 03 g/L de FeS04.7H20, 0,018 g/L de MnS04.lH20, 30 g/L de CaC03, 20 g/L de glucose), e incubadas a 37°C durante 48 horas. Após a incubação, a densidade óptica (OD) da suspensão da cultura foi determinada, com um fotómetro LP2W do Dr. Lange (Berlin, Alemanha) , a um comprimento de onda de medida de 660 nm. A concentração de L-treonina formada foi então determinada no sobrenadante da cultura esterilizado por filtração, com um analisador de aminoácidos da Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemanha), por intermédio de cromatografia de permuta iónica e reacção pós-coluna com a detecção por ninidrina. O resultado da experiência é apresentado na Tabela 1.

Tabela 1

Estirpe OD (660 nm) L-treonina (g/L) MG442 6,0 1,5 MG442ApckA 5,4 3,7

Exemplo 5 21

Preparação de L-treonina com a estirpe MG 4 4 2 Δρ c kA/pMW218 gdhA. 5.1 Amplificação e clonagem do gene gdhA 0 gene da glutamato desidrogenase da Escherichia coli K12 é amplificado usando a reacção em cadeia da polimerase (PCR) e oligonucleótidos sintéticos. Partindo da sequência de nucleótidos do gene gdhA de E. coli K12 MG1655 (biblioteca genómica: N°. de Acesso AE000270 e N°. AE000271) foram sintetizadas as sequências iniciadoras do PCR (MWG Biotech, Ebersberg, Alemanha):

Gdhl: 5' - TGAACACTTCTGGCGGTACG - 3'

Gdh2: 5' - CCTCGGCGAAGCTAATATGG - 3' 0 ADN cromossómico de E. coli K12 MG1655 utilizado para o PCR é isolado de acordo com as instruções do fabricante com "QIAGEN Genomic-tips 100/G" (QIAGEN, Hilden, Alemanha). 0 fragmento de ADN de aproximadamente 2150 pares de bases em tamanho, o qual compreende a região codificante do gene gdhA e aproximadamente 350 pares de bases da sequência da extremidade 5' e aproximadamente 450 pares de bases da sequência da extremidade 3', pode ser amplificado com as sequências de iniciação especificas sob condições de PCR Standard (Innist et al.: PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press) usando a ADN polimerase Pfu (Promega Corporation, Madison, EUA). O produto de PCR é clonado no plasmideo pCR2.1TOPO e transformado na estirpe de E. coli TOP10 (Invitrogen, Leek, Holanda, Descrição do Produto TOPO TA Cloning kit, N°. Catálogo K4500-01). O sucesso da clonagem é demonstrado por clivagem do plasmideo pCR2. lTOPOgdhA com as enzimas de restrição EcoRI e EcoRV. Para tal, o ADN plasmídico é isolado por intermédio do "QIAprep Spin Plasmid Kits" (QIAGEN, Hilden, 22

Alemanha) e, após clivagem, separado num gel de agarose a 0,8%. 5.2 Clonagem do gene gdhA no vector plasmídico pMW218 O plasmídeo pCR2.lTOPOgdhA é clivado com a enzima EcoRI, o plasmídeo cortado é separado num gel de agarose a 0,8% e o fragmento de 2,1 pares de quilobases em tamanho correspondente ao gene gdhA é isolado com o auxílio de "QIAquick Gel Extraction Kit" (QIAGEN, Hilden, Alemanha). O plasmídeo pMW218 (Nippon Gene, Toyama, Japão) é clivado com a enzima EcoRI e ligado com o fragmento gdhA. A estirpe de E. coli DH5a é transformada com o produto da ligação e as células que contém o pMW218 são seleccionadas através do plaqueamento em LB agar (Lennox, Virology 1955, 1: 190), ao qual foi adicionado 20 pg/mL de canamicina. O sucesso da clonagem do gene gdhA pode ser demonstrado após o isolamento do ADN plasmídico e da clivagem controlo com EcoRI e EcoRV. O plasmídeo é denominado pMW218gdhA (Figura 3).

5.3 Preparação da estirpe MG442ApckA/pMW218gdhA A estirpe MW442ApckA obtida no Exemplo 3 e a estirpe MW442 são transformadas com o plasmídeo pMW218gdhA e os transformantes são seleccionados em LB agar, o qual é suplementado com 20 pg/mL de canamicina. As estirpes MG442ApckA/pMW218gdhA e MG442/pMW218gdhA são assim produzidas. 5.4 Preparação de L-treonina A preparação de L-treonina pelas estirpes MG442ApckA/pMW2l8gdhA e MG442/pMW218gdhA é testada tal com descrito no Exemplo 4. O meio mínimo e o meio de pré- 23 cultura são suplementados adicionalmente com 20 pg/mL de canamicina. O resultado da experiência é sumarizado na Tabela 2.

Tabela 2

Estirpe OD (660 nm) L-treonina (g/L) MG442 6,0 1,5 MG442ApckA 5,4 3,7 MG4 4 2/pMW218 gdhA 5, 6 2,6 MG442ApckA/pMW218gdhA 5,5 4,0

Exemplo 6

Preparação de L-treonina com as estirpes MG442ApckA/pMW219rhtC.

6.1 Amplificação do gene rhtC O gene rhtC de Escherichia coli K12 é amplificado usando a reacção em cadeia de polimerase (PCR) e oligonucleótidos sintéticos. Partindo da sequência de nucleótidos do gene rhtC de E. coli K12 MG1655 (biblioteca genómica: N°. de Acesso AE000458, Zakataeva et al. (FEBS Letters 452, 228-232 (1999)), as sequências iniciadoras do PCR são sintetizadas (MWG Biotech, Ebersberg, Alemanha):

RhtCl: 5' - CTGTTAGCATCGGCGAGGCA - 3'

RhtC2: 5' - GCATGTTGATGGCGATGACG - 3' O ADN cromossómico de E. coli K12 MG1655 utilizado para o PCR é isolado de acordo com as instruções do fabricante, usando "QIAGEN Genomic-tips 100/G" (QIAGEN, Hilden, Alemanha). O fragmento de ADN de aproximadamente 800 pares de bases em tamanho pode ser amplificado com as sequências de iniciação específicas sob condições de PCR Standard 24 (Innis et al.: PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press) usando a ADN polimerase Pfu (Promega Corporation, Madison, EUA). 6.2 Clonagem do gene rhtC no vector plasmídico pMW219 O plasmideo pMW219 (Nippon Gene, Toyama, Japão) é clivado com a enzima SamI e ligado com o fragmento de PCR rhtC. A estirpe de E. coli DH5a é transformada com o produto da ligação e as células que contêm pMW219 são seleccionadas em LB agar, o qual é suplementado com 20 pg/mL de canamicina. O sucesso da clonagem pode ser demonstrado após o isolamento do ADN plasmídico e da clivagem controlo com Kpnl, HindIII e Ncol. O plasmideo pMW219rhtC é apresentado na Figura 4.

6.3 Preparação da estirpe MG442ApckA/pMW219rhtC A estirpe MW442ApckA obtida no Exemplo 3 e a estirpe MW442 são transformadas com o plasmideo pMW219rhtC e os transformantes são seleccionados em LB agar, o qual é suplementado com 20 pg/mL de canamicina. As estirpes MG442ApckA/pMW219rhtC e MG442/pMW219rhtC são assim produzidas. 6.4 Preparação de L-treonina A preparação de L-treonina pelas estirpes MG442ApckA/pMW219rhtC e MG442/pMW219rhtC é testada tal com descrito no Exemplo 4. O meio mínimo e o meio de pré-cultura são suplementados adicionalmente com 20 pg/mL de canamicina. O resultado da experiência é sumarizado na Tabela 3. 25

Tabela 3

Estirpe OD (660 nm) L-treonina (g/L) MG442 6,0 1,5 MG442ApckA 5,4 3,7 MG4 4 2/pMW219 rhtC 5,2 2,9 MG44 2ApckA/pMW219rhtC 4,8 4,4

Exemplo 7

Preparação de L-treonina com as estirpes B-3996kurAtdhApckA/pVIC40. A estirpe de E. coli B-3996 produtora de L-treonina é descrita na patente US-A-5,175,107 e está depositada na Colecção Nacional Russa para Microorganismos Industriais (VKMP, Moscovo, Rússia). A estirpe B-3996 apresenta, designadamente, resistência ao ácido a-amino-p-hidroxivalérico, treonina desidrogenase atenuada, em particular desligada ou deficiente, homoserina desidrogenase I aspartato quinase I melhorada na forma resistente a feedback, necessidade opcionalmente parcial e compensável de L-isoleucina e a capacidade para utilizar sucrose. 7.1 Preparação da estirpe B-3996kurAtdhApckA/pVIC40

Após cultura em meio completo livre de antibióticos durante aproximadamente 10 gerações, um derivado da estirpe B-3996 que já não contém o plasmídeo pVIC40, é isolado. A estirpe formada é sensível a estreptomicina e é designada B-3996kur. O método descrito por Hamilton et al. (Journal of Bacteriology (1989) 171:4617-4622), o qual é baseado na 26 utilização do plasmideo pMAK705 com um replicador sensível à temperatura, foi usado para a incorporação de uma deleção no gene tdh. 0 plasmideo pDR121 (Ravnikar e Somerville, Journal of Bacteriology (1987) 169:4716-4721) contém um fragmento de ADN de E. coli com 3,7 pares de quilobases em tamanho, no qual o gene tdh é codificado. Para gerar uma deleção da região do gene tdh, o plasmideo pDRl21 é clivado com as enzimas de restrição Ciai e EcoRV, e o fragmento de ADN isolado com 5 pares de quilobases em tamanho é ligado, após tratamento com a enzima Klenow. 0 produto de ligação é usado para transformar a estirpe de E. coli DH5a, e as células que contêm o plasmideo são seleccionadas em LB agar, ao qual se adicionou 50 pg/mL de ampicilina. O sucesso da deleção no gene tdh pode ser demonstrado após o isolamento do ADN plasmídico e clivagem controlo com EcoRI. O fragmento EcoRI de 1,7 pares de quilobases em tamanho é isolado e ligado com o plasmideo pMAK705, o qual é parcialmente digerido com EcoRI. O produto de ligação é usado para transformar DH5a e as células que contêm o plasmideo são seleccionadas em LB agar, ao qual se adicionou 20 pg/mL de cloranfenicol. O sucesso da clonagem é demonstrado após isolamento do ADN plasmídico e clivagem com EcoRI. O derivado de pMAK705 formado é designado por pDM32.

Para a substituição do gene, a estirpe B-3996kur é transformada com o plasmideo pDM32. A substituição do gene tdh cromossómico pela deleção codificada pelo plasmideo é levada a cabo pelo processo de selecção descrito por Hamilton et al. e é verificada por métodos de PCR Standard (Innis et al. (1990), PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) com os seguintes oligonucleótidos como sequências de iniciação:

Tdhl: 5' - TCGCGACCTATAAGTTTGGG - 3' 27

Tdh2: 5' ~ AATACCAGCCCTTGTTCGTG - 3' A estirpe obtida é testada relativamente à sua sensibilidade a canamicina e é designada por B-3996kurAtdh.

Para a mutagénese sitio-específica do gene pckA, a estirpe B-3996kurAtdh é transformada com o vector de substituição pMAK705ApckA descrito no Exemplo 2. A substituição do gene pckA cromossómico pela deleção codificada pelo plasmideo é levada a cabo como descrito no Exemplo 3. A estirpe obtida é designada B-3996kurAtdhApckA. B-3996kurAtdh e B-3996kurAtdhApckA são transformadas com o plasmideo pVIC40 isolado de B-3996 e as células que contêm plasmideo são seleccionadas em LB agar com 20 pg/mL de estreptomicina. Em cada caso, uma colónia individual seleccionada é designada B-3996kurAtdh/pVIC40 e B- 3996kurAtdhApckA/pVIC40. 7.2 Preparação de L-treonina A preparação de L-treonina pelas estirpes B-3996kurAtdh/pVlC40 e B-3996kurAtdhApckA/pVlC40 é testada tal com descrito no Exemplo 4. O meio minimo e o meio de pré-cultura são suplementados adicionalmente com 20 pg/mL de estreptomicina. O resultado da experiência é sumarizado na Tabela 4.

Tabela 4

Estirpe OD (660 nm) L-treonina (g/L) B-3996kurAtdh/pVIC40 4,7 6,26 B-3996kurAtdhApckA/pVIC40 4,9 8,92 28

Exemplo 8

Preparação de L-lisina com a estirpe T0C21RApckA. A estirpe de E. coli pDAl/T0C2lR produtora de L-lisina é descrita no pedido de patente F-A-2511032 e está depositada na Collection Nationale de Culture de Microorganisme (CNCM = Colecção Nacional de Microorganismos de Cultura, Instituto Pasteur, Paris, França), com o número 1-167. A estirpe e o hospedeiro sem plasmideo são também descritos por Dauce-Le Reverend et al. (European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology 15:227-231 (1982)) sob o nome T0CR21/pDAl.

8.1 Mutagénese sitio-específica do gene pckA na estirpe de E. coli T0C21R

Após a cultura em meio LB sem antibióticos durante aproximadamente seis gerações, é isolada uma estirpe derivada da estirpe pDAl/T0C21R, que já não contém o plasmideo pDAl. A estirpe obtida é sensível a tetraciclina e é designada T0C21R.

Para a substituição do gene pckA cromossómico pela deleção codificada pelo plasmideo, a estirpe T0C21R é transformada com o plasmideo pMAK705ApckA (Exemplo 2) . A substituição do gene é realizada pelo método de selecção descrito por Hamilton et al. (1989) Journal of Bacteriology 174: 4617-4622) e é verificada por métodos de PCR Standard (Innis et al. (1990), PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) usando Taq ADN polimerase (Gibco-BRL, Eggenstein, Alemanha), com os seguintes oligonucleótidos como sequências iniciadoras: pckA'5'-1: 5' - GATCCGAGCCTGACAGGTTA - 3' pckA'3'-2: 5' - CCGGAGAAGCGTAGGTGTTA - 3' A estirpe obtida é designada TOC21RApckA. 29

8.2 Preparação de L-lisina com a estirpe T0C21RApckA

A formação de L-lisina pelas estirpes T0C2lRApckA e T0C21R é analisada em culturas em sistema descontinuo de 10 mL, contidas em frascos de 100 mL. Para isto, inocula-se 10 mL de meio de pré-cultura com a seguinte composição: 2 g/L extracto de levedura, 10 g/L (NH4)2S04, 1 g/L de KH2P04, 0,5 g/L de MgS04.7H20, 15 g/L de CaCC>3 e 20 g/L de glucose, e a cultura é incubada durante 16 horas a 37°C e 180 rpm numa incubadora ESR da Kuhner AG (Birsfelden, Suíça). 250 pL desta pré-cultura foram transferidos para 10 mL de um meio de produção (25 g/L de (NH4)2S04, 2 g/L de KH2P04, 1 g/L de MgS04.7H20, 0,03 g/L de FeS04.7H20, 0,018 g/L de MnS04.lH20, 30 g/L de CaCC>3, 20 g/L de glucose, 25 mg/L de L-isoleucina e 5 mg/L de tiamina), e a cultura é incubada a 37°C durante 72 horas. Após a incubação, foi determinada a densidade óptica (OD) da suspensão da cultura, com um fotómetro LP2W do Dr. Lange (Berlin, Alemanha), a um comprimento de onda de medida de 660 nm. A concentração de L-lisina formada foi então determinada no sobrenadante da cultura esterilizado por filtração, com um analisador de aminoácidos da Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemanha), por intermédio de cromatografia de permuta iónica e reacção pós-coluna com a detecção por ninidrina. O resultado da experiência é apresentado na Tabela 5.

Tabela 5

Estirpe OD (660 nm) L-lisina (g/L) TOC21R 1,0 1,14 TOC21RApckA 1,0 1,27 30

Exemplo 9

Preparação de L-isoleucina com a estirpe B- 3996kurAtdhilvA+ApckA/pVIC40. 9.1 Preparação da estirpe B-3996kurAtdhilvA+ApckA/pVIC40 A estirpe B-3996kurAtdh, a qual requer L-isoleucina, obtida no Exemplo 7.1, é transduzida por intermédio do fago Plkc (Lennox, Virology 1, 190-206 (1955); Miller,

Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory 1972) e as bactérias transduzidas L-isoleucina-prototróficas são isoladas.

Para tal, o fago Plkc é multiplicado na estirpe MG1655 (Guyer et al., Cold Spring Harbor Symposium of Quantitative Biology 45, 135-140 (1981) e Blattner et al., Science 277, 1453-1462 (1997)) e o lisado de fagos é utilizado para a transdução da estirpe B-3996kurAtdh. A multiplicidade da infecção é aproximadamente de 0,2. A selecção das bactérias transduzidas L-isoleucina-prototróficas é realizada em agar minimo, o qual contém 2 g/L de glucose e 10 mg/L de L-treonina. Uma estirpe transduzida L-isoleucina-prototrófica é isolada, procede-se a um esfregaço em LB agar para purificação e isolamento, e é designada B-3996kurAtdhilvA+. O gene pckA da estirpe B-3996kurAtdhilvA+ é então substituído, tal como descrito no Exemplo 3, pelo alelo ApckA preparado nos Exemplos 1 e 2. A estirpe obtida é designada B-3996kurAtdhilvA+ApckA.

As estirpes B-3996kurAtdhilvA+ e B-3996kurAtdhilvA+ApckA são transformadas com o plasmídeo pVIC40, isolado da estirpe B-3996 e as células que contêm o plasmídeo são seleccionadas em LB agar, o qual é suplementado com 20 pg/mL de estreptomicina. Em cada um dos casos, uma colónia individual seleccionada é designada B- 3996kurAtdhilvA+ApckA/pVIC40 e B-3996kurAtdhilvA+/pVIC40. 31 9.2 Preparação de L-isoleucina A preparação de L-isoleucina pelas estirpes B-3996kurAtdhilvA+/pVIC40 e B-3996kurAtdhilvA+ApckA/pVIC40 é testada sob as condições de teste descritas no Exemplo 4. 0 meio minimo, o meio de pré-cultura e o meio de produção são adicionalmente suplementados com 20 pg/mL de estreptomicina. O resultado da experiência é apresentado na Tabela 6.

Tabela 6

Estirpe OD (660 nm) L-isoleucina (mg/L) B-3996kurAtdhilvA+/pVIC40 5,8 57 B-3996kurAtdhilvA+ApckA/pVIC40 5,7 70

Exemplo 10

Preparação de L-valina com a estirpe B-12288ApckA. A estirpe de E. coli AJ 11502 produtora de L-valina é descrita na descrição de patente US-A-4391907 e está depositada no Centro Nacional para Investigação em Utilização Agrícola (Peoria, Illinois, EUA) como NRRL B-12288. 10.1 Mutagénese sítio-específica do gene pckA na estirpe de E. coli B-12288

Após a cultura em meio LB sem antibióticos durante aproximadamente seis gerações, uma estirpe derivada da estirpe AJ 11502, que não contém plasmídeo, é isolada. A estirpe obtida é sensível à ampicilina e é designada AJ11502kur. 32

Para a substituição do gene pckA cromossómico pela deleção codificada pelo plasmideo, a estirpe AJ11502kur é transformada com o plasmideo pMAK705ApckA (ver Exemplo 2) . A substituição do gene é realizada pelo método de selecção descrito por Hamilton et al. (1989) Journal of Bacteriology 174, 4617-4622) e é verificada por métodos de PCR Standard (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) com os seguintes oligonucleótidos como sequências iniciadoras: pckA'5'-l: 5' - GATCCGAGCCTGACAGGTTA - 3' pckA'3'-2: 5' - CCGGAGAAGCGTAGGTGTTA - 3' A estirpe obtida é designada AJ11502kurApckA. O plasmideo descrito na descrição de patente US-A-4391907, o qual contém a informação genética para a produção de valina, é isolado a partir da estirpe NRRL B-12288. A estirpe AJ11502kurApckA é transformada com este plasmideo. Um dos transformantes obtido é designado B-12288ApckA.

10.2 Preparação de L-valina com a estirpe B-12288ApckA A formação de L-valina pelas estirpes B-12288ApckA e NRRL B-12288 é verificada em culturas em sistema descontinuo de 10 mL contidas em frascos de 100 mL. Para isto, inocula-se 10 mL de meio de pré-cultura com a seguinte composição: 2 g/L extracto de levedura, 10 g/L (NH4)2S04, 1 g/L de KH2P04, 0,5 g/L de MgS04.7H20, 15 g/L de CaC03, 20 g/L de glucose e 50 mg/L de ampicilina, e a cultura é incubada durante 16 horas a 37°C e 180 rpm numa incubadora ESR da Kuhner AG (Birsfelden, Suíça). 250 pL desta pré-cultura foram inoculados em 10 mL de um meio de produção (25 g/L de (NH4)2S04, 2 g/L de KH2P04, 1 g/L de MgS04.7H20, 0,03 g/L de FeS04.7H20, 0,018 g/L de MnS04.lH20, 30 g/L de CaC03, 20 g/L de glucose, 5 mg/L de tiamina e 50 mg/L de ampicilina), e a cultura é incubada a 37°C durante 33 72 horas. Após a incubação, foi determinada a densidade óptica (OD) da suspensão da cultura, com um fotómetro LP2W do Dr. Lange (Berlin, Alemanha), a um comprimento de onda de medida de 660 nm. A concentração de L-valina formada foi então determinada no sobrenadante da cultura esterilizado por filtração, com um analisador de aminoácidos da Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemanha), por intermédio de cromatografia de permuta iónica e reacção pós-coluna com a detecção por ninidrina. O resultado da experiência é apresentado na Tabela 7.

Tabela 7

Estirpe OD (660 nm) L-valina (g/L) NRRL B-12288 5, 6 0,93 B-12288ApckA 5,5 1,12

Exemplo 11 (não é parte da invenção)

Construção das mutações de tipo deleção na região genética ytfP-yjfA. A região genética ytfP-yjfA é amplificada a partir da Escherichia coli K12, usando a reacção em cadeia da polimerase (PCR) e oligonucleótidos sintéticos. As seguintes sequências iniciadoras de PCR são sintetizadas partindo da sequência de nucleótidos da região genética ytfP-yjfA em E. coli K12 MG1655 (SEQ ID N°. 5): ytfP-1: 5' - GGCGATGTCGCAACAAGCTG - 3' yftp-2: 5' - CTGTTCATGGCCGCTTGCTG - 3' O ADN cromossómico de E. coli K12 MG1655 utilizado para o PCR é isolado de acordo com as instruções do fabricante com "QIAGEN Genomic-tips 100/G" (QIAGEN, Hilden, Alemanha). 34

Um fragmento de ADN de aproximadamente 1330 pares de bases em tamanho pode ser amplificado com as sequências iniciadoras especificas sob condições de PCR Standard (Innis et al. (1990), PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) usando Taq ADN polimerase (Gibco-BRL, Eggenstein, Alemanha). O produto de PCR é ligado com o vector pCR2.lTOPO (TOPO TA Cloning Kit, Invitrogen, Groningen, Holanda), de acordo com as instruções do fabricante e usado para transformar a estirpe de E. coli TOP10F'. A selecção de células que contêm plasmideo decorre em LB agar, ao qual se adiciona 50 pg/mL de ampicilina. Após isolamento do ADN plasmídico, o sucesso da clonagem do produto de PCR é verificado com as enzimas de restrição EcoRI e Nsil.

Para produzir uma deleçâo de 337 pares de bases na região ytfP-yjfA, o vector pCR2.lTOPOytfP-yjfA é clivado com as enzimas de restrição Ndel e SspI e o fragmento de ADN de 4,8 pares de quilobases em tamanho é ligado, após tratamento com a enzima Klenow.

Para produzir uma deleção de 90 pares de bases, o vector pCR2.lTOPOytfP-yjfA é clivado com as enzimas de restrição Ndel e SspI e o fragmento de ADN de 5 pares de quilobases é ligado, após tratamento com a enzima Klenow. A estirpe de E. coli DH5a é transformada com os produtos da ligação e as células que contêm o plasmideo são seleccionadas em LB agar, ao qual se adicionou 50 pg/mL de ampicilina. Após isolamento do ADN plasmidico, os plasmideos nos quais a sequência de ADN mutante apresentada na SEQ ID N°. 6 e SEQ ID N°. 7 é clonada são detectados por clivagem controlo com a enzima EcoRI. Os plasmideos são designados pCR2.lTOPOAyjfA e pCR2.lTOPOA90bp. 35

Exemplo 12 (não é parte da invenção)

Construção dos vectores de substituição pMAK705AyjfA e pMAK705A90bp.

Os alelos ytfP-yjfA descritos no Exemplo 11 são isolados a partir dos vectores pCR2.lTOPOAyjfA e pCR2.lTOPOA90bp após restrição com as enzimas Saci e Xbal e separação em gel de agarose a 0,8%, e ligados com o plasmideo pMAK705 (Hamilton et al. (1989) Journal of Bacteriology 174, 4617-4622), o qual é digerido com as enzimas Saci e Xbal. Os produtos de ligação são transformados em DH5a e as células que contêm plasmideo são seleccionadas em LB agar, ao qual foi adicionado 20 pg/mL de cloranfenicol. O sucesso da clonagem foi demonstrado após o isolamento do ADN plasmidico e clivagem com as enzimas Saci e Xbal. Os vectores de substituição formados, pMAK705AyjfA ( = pMAK705deltayjfA) e pMAK705A90bp ( = pMAK705delta90bp) são apresentados na Figura 2 e na Figura 5.

Exemplo 13 (não é parte da invenção)

Mutagénese sítio-específica da região genética ytfP-yjfA na estirpe de E. coli MG442.

Para a substituição da região genética ytfP-yjfA cromossómica com a deleção de 90 pares de bases codificada pelo plasmideo, a estirpe MG442 foi transformada com o plasmideo pMAK705A90bp. A substituição do gene é levada a cabo pelo método de selecção descrito por Hamilton et al. (1989) Journal of Bacteriology 174, 4617-4622) e é verificada por métodos de PCR Standard (Innis (1990), PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic 36

Press), com os seguintes oligonucleótidos como sequências iniciadoras: ytfP-1: 5' - GGCGATGTCGCAACAAGCTG - 3' yftp-2: 5' - CTGTTCATGGCCGCTTGCTG - 3' A estirpe obtida é designada MG442A90yjfA.

Exemplo 14 (não é parte da invenção)

Preparação de L-treonina com a estirpe MG442A90yjfA. A preparação de L-treonina pela estirpe MG442A90yjfA é testada como descrito no Exemplo 4. O resultado da experiência é sumarizado na Tabela 8.

Tabela 8

Estirpe OD (660 nm) L-treonina (g/L) MG442 6,0 1,5 MG442A90yjfA 5,7 2,1

Exemplo 15

Preparação de L-treonina com a estirpe MG442A90yj fAApckA.

15.1 Preparação da estirpe MG442A90yjfAApckA 0 gene pckA da estirpe MG442A90yjfA é substituído, tal como descrito no Exemplo 3, pelo alelo ApckA (ver Exemplos 1 e 2). A estirpe obtida é designada MG442A90yjfAApckA. 15.2 Preparação de L-treonina A preparação de L-treonina com a estirpe MG442A90yjfAApckA é realizada tal como descrito no Exemplo 4. 0 resultado é apresentado na Tabela 9. 37

Tabela 9

Estirpe OD (660 nm) L-treonina (g/L) MG442A90yjfA 5,7 2,1 MG442A90yj fAApckA 5,3 3,9

Breve Descrição das Figuras: • Figura 1: pMAK705ApckA ( = pMAK705deltapckA) • Figura 2: pMAK705AyjfA ( = pMAK705deltayjfA)

• Figura 3: pMW218gdhA

• Figura 4: pMW219rhtC • Figura 5: pMAK705A90bp ( = pMAK705delta90bp)

Os dados relativos ao comprimento deve ser entendidos como aproximações. As abreviaturas e designações usadas têm o seguinte significado: • cat: Cloranfenicol • rep-ts: Regiões de replicação do plasmideo pSClOl sensíveis à temperatura

• pckl: Parte da região 5' do gene pckA

• pck2: Parte da região 3' do gene pckA • ytfP'-yjfA': Sequências de ADN contendo regiões de codificação de ytfP e yjfA truncadas • kan: Canamicina • gdhA: Gene da glutamato desidrogenase • rhtC: Gene que confere resistência à treonina

As abreviaturas para as enzimas de restrição têm o seguinte significado: 38 • BamHI: endonuclease de restrição de Bacillus amyloliquefaciens • BglIII: endonuclease de restrição de Bacillus globigii • Ciai: endonuclease de restrição de Caryphanon latum • EcoRI: endonuclease de restrição de Escherichia coli • EcoRV: endonuclease de restrição de Escherichia coli • HindIII: endonuclease de restrição de Haemophilus influenzae • Kpnl: endonuclease de restrição de Klebsiella pneumoniae • PstI: endonuclease de restrição de Providencia stuartii • Pvul: endonuclease de restrição de Proteus vulgaris • Saci: endonuclease de restrição de Streptomyces achromogenes • Sall: endonuclease de restrição de Streptomyces albus • Smal: endonuclease de restrição de Serratia marcescens • Xbal: endonuclease de restrição de Xanthomonas badrii • Xhol: endonuclease de restrição de Xanthomonas holcicola 39 39 por fermentação de estirpes da familía

Protocolo de Sequências <110> Degussa AG <120> Processo para a preparação aminoácidos usando Enterobacteriaceas. <130> 000425 BT <140> <141> <160> 19 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1622 <212> ADN <220>

<221> CDS <222> (1) .. (1622) <223> pckA <4 0 0> 1 li das gaa «te 3*g gct tat ggt 4S Glu 18U 61a Ala Tyr Giy 15 CCS age fcac gac ctg ctg 96 Pro Ser Tyr As» Leu Lea 30 ggt tat gac Cgc 999 gtg U4 Sly Tyr 31« Arg (Sly Val 45 aee 339 ate ttc 8CC ggt' m Thr Sly 50 11® Pfe® Thr Sly gac gat scc act ege gat 240 Asp Asp Thr Thr Atg Ãap 75 50 aag ase gae aas aaa cct 268 tys &w> Aap Aan Lys m Sjío ggc ctg 9tg acc agg cag 336 SXy Ma Val Tbr Atg S.ln 11D cct ttc tgt. 59* gcg aac 3M Ala Fb» Cys Sly Ala tea 12S· atg egs qit aae aat ggt ttg aoe ecg caa Mel ;3. Arg Vai Mn Asn s SXy Mu Tfcr Pro 61a 10: ate sgt gae 8 ta dat gat ate gtt tae aac. n* ãar Àsp vai Ris Ά&ρ lie Vsl Tyr Asn 30 25 fcãt C*Sf gsa g»g etc gat «cg age stg Leu aca Tysf Oln Qi-U Lau Sap Pro Ser fhr 35 40 tta act aat ctg ogt gCs gtt gee gtc gat Leu The Mn «ay Ala Val Ala V*1 Asp SO 55 ogt tCS csâ âaâ gat sag tat ate gte ogt Arç Ser ?xo Lya Aap tys Tyr Xle Val Ãrg 65 70 áct ttc tgg t««F goa qaç aar· 53® Í5S& ggt Thr 2he Vrp À1& &j3J> liys tiy Lys Gly 65 SO' etc tefc gaa .soe tgg cag eat ctg èââ Leu. Ser &IO élu %r ΐΧρ CItí Bis Ij&u. tya 100 105 çtt tcc 59® aas egt Ctg ttc gtt gtc gac LÉU Ser Slv Lys Atg Lsa Fhs Vsl Val Asp as 120 40 eeg gst set1 eyt cfct teç gte egt ttc «te áec gaa gtg gee tgg caç 4.32 Fre Aap Thr Arg Lsu Ser Vsl Arg Fhe 11® Thr Slu Vai Ala Trp Glfô 130 135 140 s^g Sât ttt gtc ass SSC atç ttt att sçe ceg age gat gsà gaa ctg 480 Ala His Phc Vai lys As« Met Fh® 3le ftrg Pro Ser Asp Slu Glu Leu 145 ISO 135 160 gca 98t tio aaa cca gac ttt ate gtt atg aae ggc g«g aag tge aet 528. Ala Sly Phe Lya Pro ftsp Phe lie Vai Mst Ãea Sly Ala Lys Cys Thr 165 170 173 aac eeg çag tgg eaa gaa eag ggt ct© aae tce gsá aac ttc gtg gcg 576 Asn Pro Gin Trp Lys Qlu Sln siy L«u Asa Ser Glu Ase Phe Vai Ala ISO 185 150 fctt aac etg ase 0vg ege atg cag ctg att vov aee tgg tae gge 624 Phe Ase Leu fhr Slu Arg Met Sln Lee Ile Giy Gly thr ΐερ tyr Gly 195 250 205 gttc gaa afcg aag aaa VS? atg ttc teg alg atg aac tae Ctg ctg ceg 672 Sly Sl« Mut Lys LyS Sly Met Ph® Ser fifet Met. Asr. Tyr Leu Lee FE© 210 215 220 efcg aaa ggt ate get tet atg eae tgc tee gee aac gtt ggt gag asa 720 Leu Lys Sly Ik ftla Ser Het ais Cys Ser ÀlA Asti Vai Gly Glu Lys 235 230 235 240 99« gat gtt gcg gt« ttc ttc gge ctt tec gge aeç ggt aaa acc acc 76§ Sly Asp Vai Ala Vai Phe Phe Sly Leu Ser Gl.y fhr Sly Lya Thr Thr 245 250 2S5 ett tce ase gas eeg a&a egt ege ctg att ggc gat iJKC gaa c«e ggc 816 Leu Ser Thr Asp Pro Lya Arg Arg Leu Xle eiy Ásp Asp Glu ais Oiy 260 265 270 tgg· gae S»t gac gge gtg ttt aac ttc cisa ggc ggc tgc tac gea aaa tu Tsp Asp Aap Asp Sly vai Fhe Ãsn Ph® Slu Gly Sly Cys Tyr Ala Lys 275 280 285 aot ate mg cte tsg aas gaa gcg gas ect gaâ ate tac aac gct ate 912 Tfcr lie Lys Leu Ser lys Glu Ala Slu Pra Giú Ϊ1® fyr Asa Ala Sis 390 29$ 300 egt Cfft g&t 9<=gr ttg etg gaa aae gte age çtg egt gas gat ggc aet 360 Arg Arg Aáp Ala Lsu Leu Sltt Asa Vai Thr Vai Arg Glu Asp Gly Thr. 305 310 313 320 ate gae ttt gat gat ggt fcea aaa ase gag ase aee age gtt tet fcs:fc 1008 Ile Asp Phç- &sp Asp «y Ser Lys Thr Slu Mn Thr Arg Vai Ser Tyr 325 330 33S ccg ate tat cae ate gst aae att gtt aag eeg gtt tec a&a gcg ggc 1056 Pre Ils Tyr Ms 51« Asp Asa Ilá Vãl Lys Pro Vai Ser Lys Ala Gly 340 345 3S0 cac gcg aet sag gtt ate ttc efcg aet gct gat gct ttc gçe gtg ttg 1104 His Ala Thr lys Vai 11« Phe Lee Thr Ale Asp Ala Fhe sly Vai hm. 355 360 363 41 ccg ceg gtt tefc ege ctg a et gee gat caà áce eag tat cae ttc ctc 1152 Pro Pro Vai Ssr Arg leu Thr Ala ftsp Gin Thr Gin Tyr Kís Pfee Leu 370 375 380 tet gge ttc ase gee asa ctg gee 09t aot gag cgt gtte ate ace gas 1200 Ser Gly Pha fbr Ala tys L«u Àla Gly Thr Gin arg 61y lie Thr Glu 385 390 335 400 ecg acg CCS aec fcte tec gcfc tgc ttc gge gcg gea ttc ctg teg ctg 1248 Pr» Thr Pro Tíir Ph«» Ser Ala Cy.s Pile 6Iy Ma Ala Pbe Le« Sei' Leu 405 410 415 esc ccg set eag tac gea gaa gtf ctg gtg aaa egt atg cag geg geg 1296 Bis Pro Thr Glti Tyr Ala Glu Vai Léu. Vai Lys Mg Met G1Ã Alá Ala 420 42S 430 ggc esg çct fcat ctg gtt aac »ct ggc tgg ssc ggc act. mc aaa 1344 S.!y Áia Gle áia Tyr Leu Vai As« Thr Gly Tip ftsn Gly Tbr Gly Lys 435 440 445 ogt sfcc teg afcfc áa.a gat. ecc ege gee att ate gac gee: ate etc aac 1382 ftrg Jle S«r lie Lys ASp Thr Arg Ma Xle Xis Mp Ala Ile Léu As» 450: 4 55 460· ggt Gly tcg atf g«t ast gea gaa âCC ttc act ctg oeg atg ttt aac ctg 1440 Leu Mp Asa Áia Glu thr Phe Thr Lee pr o Met PIlS Asn Leu 4$?. 470 47S '480 gcg ate ÚÇà acc gaa ctg esg W gfce gac acg· aag att ctc gat esg 1.4 OS Ala lie Pro Thr 61U Leu Pro ciy Vai ftsp Thr Lys n® L«n Asp Pro 405 490; 495 cgt s«c acc tac got tet eeg gaa c<se: tgg cag gsa aaa qcc g&a SCO 1336 Mg Asm Thr Tyr Ala Ser Pro Gl« eifí Ttp Gin Gin Lys Ma ela Thr 500 505 510 ctg gcg ctg tt.t ate gac aac ttc gst a&â tac aee gac õ-CC cct 15«« Lê» Ala Lys t®s Kha Xis Asp Asft Phé Aâp Lys Tyr Thr Asp TAr Pro 535 520 525 gffc >5«c geg ctg gta gcg gct sst ccg aaa etg tsa Xfi23 Ala •sly Ma Ala Leu Vai Ma Ma siy Prp Lys Len 530 535 540

<210> 2 <211> 540 <212> PRT <213> Escherichia coli < 4 0 0 > 2

Mefc Mg vai Mn Asm Qly Usn ftot fto 81a 6la X<«su <Slu Ma Tyr ®.y

l S 10 IS lie Ser Asp Vai Bis Mp 11« Vai Tyr Aea Tx» Saac Tyr &sp Leu Leti 20 iS 30

Tyr Gin £51« 61« Leu asp Pro Set Leu T?tr Giy Tyr Siu Arg Sly Vai 35 40 45 42 li© li Thr Asn Leu Gly Ala Vai Aiã Vsl Asp Thr Gly SO lie Fbe Thr Gly 50' S5 Arg S«E Pro Lys Asp lys Tyr lia Vai Arg Aap Asp Thr Thr Arg Asp 65 70 75 SÕ Thr Fh® Trp Trp Ala Asp Lys Gly Lys Gly Lys Aso Asp Aso. Lys ?ro 05 90 35 Leu ser Fr* Sly Thr Trp Gin His La© lys Gly Lss Vai Thr Are Gin 100 105 110 leu Ser Gly Lys ASf Leu Pise Vai Vai Asp &J.3 Fhe Cys Gly Ais Asn 115 120 125 Fr© Asp Thr Arg Leu Ser Vai Arg Phe XI® Thr Glu Vai Ais Trp Gin 130 135 140 Ala Mia Phe Vai lys Asn Ket Phs lis Arg Pro Ser Aso Glu. Glu Leu 145 ISO 155 160 Ala eiy Phs Ay» Pr* As p Fhe IÍ8 Vai Met Asn Gly Ala Lys Cys Thr 165 170 175 Asn Fr* Gin Trp Lys Glu GlU Gly Leu Asn Bar Glu Asn Pb® Vai Ala 100 165 130 Fhe Asa l®» Thr Glu ftrcí m% G.ln Leu lie Gly Gly Thr Trp Tyr Gly 195 200 205 Gly Glu Mst. Lys Ly$ Siy ífet Bba Bar Met Met Asn Tyr Leu Léu Pxô 210 215 220 Leu lys 01·/ lia Ala Ser Mftt HiS Cys Ser Ala Asn Vai Gly Glu Lys 225 230 235 240 Gly Asp Vsl Ata Vai Phe Phe Gly liSU Ser Gly Thr Gly Lys Thr Thr 245 25Q 255 Leu Ser Thr Asp Fr* iys Arg Arg léu lie Gly Asp Asp Glu Sis 81y 260 205 270 Típ Asp Asp Asp Gly Vai Fh® Asn Phe Glu Gly Gly Cys Tyr AÍS Lys 27 a aeo 205 Thr 11© Lys L®« Ser Lys Glu Ala Pro Glu. lie Tyr Asn Ala lie 290 295 300 Ar* Arg Asp Ala Leu Leu Glu Asn Vâi Thr Vsl Arg Glu Asp Giy Thr 305 310 315 320 11« Asp Ffce Asp Asp Gly Ser Lys Thr 01« Asn Thr Arg Vai Ser Tyr 325 330 335 Fro lis tyr Bis Ile ASS lie Vai Lys Pro Vai Ser Lys Ala Gly 340 34S 350 fiis àia Thr lys Vai lie Fhe IiêU Thr Ala Asp MS Phe Gly Vai Léu

3SS 360 3SS 43

Pro Pro Vai Ser Arg Leu Thr Ala tep Gin Thr Glfc '£yr Eis Phe Leu 370 375 380 Sfcr sly Pfee Thr Má Lys Leu Ma Giy Thr Slu Arg Sly lie Thr Êia 3SS 350 305 400 Pre Thr Peo TLr Phe $er Me Cys Ph.e Giy Ais Ma Phe Leu Ser Leu 405 410 415 Sis Pr© fhr Gin Tyr Ala Gííj Vai Leu Vai tys Arg Eefc Gin Ala Ala 420 425 430 eiy Ala Glfi Alá fyr Leu vai Asn Thr Sly **P As» βΐγ Tfer Sly Lys 435 440 445 ÍZf Bs Ser Ile Lys Ajjp Thr &rg Me ile Ile Asp Âla Ile Leu ASii 450 4SS 480 Ç.ly Sér Leu Ά&ρ Asn Ais Slu Thr Phe Thr Leu Pro Het Ph© Asn Leu 465 4?s 475 480 Ile Pre Thr <31 u Lee Prâ $ly vai Asp Thx Lys lie Leu Asa Pro 48S 400 455 Ãrq As» Thr Tyr Ala Ser Pr© Slu Gin Ttp Gin Slu Lys Alá Slu Thr SOO 505 S10 Leu &JLâ Lys Leu Phe Ile Asp Man She Mp Lys Tyr Thr Asp Thr Pro 515 520 525 Ais Giy Ma Ma Leu ¥al Ale MXm My Pro Lys Leu 530 535 54Õ

<210> 3 <211> 1156 <212> ADN <213> Escherichia coli <2 2 0> <221> carácter_mist <222> (1) . . (1156) <223> ADN mutagénico <2 2 0> <221> carácter_mist <222> (1)..(35) <223> ADN técnico/resíduos da sequência polilinker <220> <221> carácter_mist <222> (36)..(522) <223> Parte da região 5' (pckl) do gene pckA <220> 44 <221> carácter mist <222> <223> <220> <221> <222> <22 3> <220> <221> (523) . . (542) ADN técnico/resíduos da sequência polilinker carácter_mist (543) .. (1105)

Parte da região 3' (pck2) do gene pckA carácter mist <222> (1106) . . (1156) <223> ADN técnico/residuos <400> 3 çtagtáaegg eegceagtgt gçtggaâttc çcggg^tgtt aaetaatctg ggtgcogttg catrea&íisga taagtatatc gtecgtgacg afiaaaggcaa aggtsaaaae gacascasac a&gggctggt gacejsggcag ctttccggca gtçeg*ftc.cc çgateeiegt ctttccgtcc attttgtcsa aãácstgtfct attegceegs àctttètcgt tatgs.ae.gge gegaagtgca sstcsgaaaa ettegtggeg tttãacctga cetgaagatg geacfcatcga etttgstgat tateogatot ateacatcga taacafctgfct aaggttatct icetgaetge tgatgsttte gcegatcasa crocagfcatfca etteètetct sgtggcatcs eégs&ecg&ç gceaaeefctçs ctgcaecçga efceagtaeçe ága&gtgetg gcttatetgg ttaacactgg ctggaaegge cgçgecstta rcgsegcicat ccteaacggt ccgatgttta aggtggogat cccaaecgaa ccgogtaacft eetaggctte tccggaagcc ccgctegage stgeat da sequência polilinker

Sgcttfãtee gagectgaea ggttatgage 50 cegfcegatac cgggatettç sceggtègtt 120 ataçcaetcg egstaettte tggtgggcsg ISO etetctctec ggaaacafcgsf eagcatcfcga 240 aacgtctgtt cgttgtegac gcttretgtg 300 gttteatçse egasgtggcc ttgeaggegè 360 gcgatgaags aetggeaggt ttcsaacc&g 420 atasecegea gtggaaaçaa eagggtetca 4ÔG «cgagcgcat gcsagcog*» fctcfcgcagai 540 ggttaa&asa cegsgaacftc ccgegtttet 600 asgeeggttt ccaaagcggg ecãogcgact 6S0 gçegtgtt.jc cgccggttte tçgcctçact 720: ggetteaceg ceãaadtgge cçgtaetgsg 780: tccgcttgct tcggcgcggç atteetgtcg 840 gtgasaegt® fcçcaggegge ggtjegogcsg SGG actggesaae gtatetegat taaagatacç 960 tcgetggsta atgeagaaac tstteaetetg 1020 ctgocgggcg t&gscacgaa gattctcçat 108G gaattetgca·gatatocatc acaefeggcgg 1140 USÉ

<210> 4 <211> 1294 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> carácter_mist <222> (1) . . (3) <223> Codão de iniciação do alelo pckA delta <220> <221> carácter mist 45 <222> (1)..(598) <223> região 5' do alelo pckA delta <220> <221> carácter mist s da sequência polilinker <222> (599) . . (618) <223> ADN técnico/residui <220> <221> carácter_mist <222> (619) . . (1291) <223> região 3' do alelo <220> <221> carácter_mist <222> (1292) . . (1294) <223> Codão de finalização < 4 0 0 > 4 afcgogcgtta asa&tfgtfct gaccccgcaa o&tgatatcg tilacaaeec sagCfcacgac ctgacsggtt atgagcgegg ggtgttasct atot tcaccg çtcgetcâcc aasagatââg actttefcggt gggeagacaa figgç&aaogt áeetggcagç átctgaaggg ectfgtgscc gtcgôegctt tctgtggtgc gaacocggat gtggccfcgge «ggcçcattt tgte&aaaac gceqgtttça aascsgaeti tatcçttafcg aaagaaç&gg qiçtcaactc cgaaaactto gscgasttefc geíagatcctg aagatggeac gascaeccgc gtfctcttatc cgatctatca sgcgggec&e gcgaetââgg fctatcttect ggtttctçgc ctgaetgceg ate&a&cces aetçgecçgt &ctg&gcgtg gcatcacega çgcggeattç et§tcgçtgc aeecgsctca ggzqqcggqc gcgcsggatt atctggtfcaa etegati**» gatseecgeg ocattategr* agaaaccttc actctgocga tgtttaacgt çacgâagatt «tegatccgc gtaaeaeeta cgãaaccctg gcgaaactgfc fctstcgaeaa tgoogcgctg gtagegfctg gteegaaáct delta do alelo pckA delta g&actcgagg cttatggtat cagtgacgta otgetçtstc âggaagagct egatocgagc astctgggtg cegttgcogt eqátaceqgg tatategtçc gtgãCgáfeae cactcgcgafc aagaacgaea aeasaeetet ctetccggaa âggcagcttt eeçgcaaacg tctgttcçfct acfecgtcfctt ecqtccgttt eetcacegea ãtgtttafctc gccsgágcga tgaagaaetf aacgqqgçga sgfcgcactaa eetapagtfg qtggegtttà avctgaccga gcgeatgcas tatefacttt: gefcgatggtt caaaaaçegs c-atcgataac attgttaagc eggtfcteââa gaatgctgat gctttcggcg tgfctgccgce gtateacttc etetetgget tcaocgecaa acegsegeca acettetceg ettgefctegg gtacgs&gaa gtgctggtga aacgtstgea cactçgetgg aacfjgcectg gesEsaegtat cgccêtcctc aacqçttcgg tggataãtgc çeegâ&ceea accgsãetgc cgggegfcaçrá cgcttctccg gaacagtqgc aggaaaaage Gttcgattâãa fcagaccgeca ccocigcggg gtaa eo· 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 800 960 1020 1080 1140 1200 1260 1294

<210> 5 <211> 1248 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> gene 46 <222> (376) . . (714) <223> ORF ytfP <2 2 Ο > <221> gene <222> Complementar (461). . (727) <223> ORF yjfA <400> 5 tggagagegs. 60 cgesaagtgg 120 tcgscaccca 180 gtcfcgeaaet 240 ãtOfõctgat 300 tgctctatca 360 acaaggcaas 420 etaceagttg 430 cggtgaagtt 54Q gggcggtgaa 600 ttãteàacfa 660 taagtâacca 720 tfcebgtfcttg 730 &acgeafcsaa 840 acegfcgagtt 300 gggggaàcag SOO eggggcagag 1020 ggcgctacte 1050 agçaggâtgt 1140 âtttgaacçg 2200 1243 ggega&çte? caacsaçcfcg eettgtçtts tttgetãsft ggaeaagggc teagagcgac agtgeggoag tgscstcgat gefcgettggt ttgggggttg ecagattgtg qgtãaaateg gcQag&egtt fcggcftaafe aatttagcfc gggâgtãfgc gactcefecac aggtsgtfgt s&çjcggctat; gt&ttgccàg gaaatâõggc gtgggtatat ttgâcfcctat agaaacsctc acgttacgtt goctaaigcta tatotggaag cegtgtctfg fcgfcaggççag gcàetggsti gttcgagttt tôgcaatgcg aatatifcgtc tasggcagtt tacgeeasaa Ãgtcãetggã tgaeeaatge ecsgfctactf ggcgatttca gtatcg&ias tatafeatgg gctíaotetcc. mçgcgssgtt Gcggggascg gaâcggtac^ tatcgtatfcg scaasgccac gctggccgas ettgatgccr tçcgeaccag tadfègsgcc agttgattc® gaegssft&e gggagtgcat gçatgtaeçrt cçggtcgatg gattaaâget aattge&agc ggcgactggt fcagseaggga tstgsatacf ccaccttcgg gtggcgtfcgt tttfctfcgig aegacfccgea t«ttccctc «cefctttget tttetctç«.g agccgrcttfcc «atatetatfc aasçtctgct ggeatteaee aatgegeagg ggtaasacgt ttcctgtags atãGtttgta taâcttaagg aggtgcagst gcgtattacc staaaaagat tgcaggtatg gtcattacca âtstcgtaat gaaagaàctt aacttacage egfcggaggcg ceagtgagca aeasfceaact gattetgac-a eccatctecá gefctgalgas etgctggeâc agtgtgaeat fsacçccgcg gaacttsgcg etggggtsaa teeacccctg cgggtgacga aatatggtaa agaaaagfcga ggsgacattç tgctggttgg ctttgatceâ gcaegcggcc atgaaeag

<210> 6 <211> 911 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> carácter_mist <222> (1)..(911) <223> região ytfP-yjfA com a deleção <220> <221> carácter mist <222> (1) . . (383) <223> extremidade 5' da região ytfP-yjfA <220> <221> carácter mist 47 <222> (384)..(911) <223> extremidade 3' da região ytfP-yjfA <220> <221> carácter_mist <222> (376)..(378) <223> codão ATG da ORF ytfP truncada <220> <221> carácter_mist <222> Complemento (388) . . (390) <223> codão ATG da ORF yjfA truncada <400> 6 ggcgatgteg caacsagctg eattçtctfca tttgctacft ggaeaagggc tggagsgsga 60 teagaçeg&ts agtgçggesa tgacctcgat gctçattggt ttgggçgtfcç cgeâaagtgg 120 ccagatfcgtg ggtasaafccg gcgagacgtt tgfcgtasqe: aatttãgcgç teg&caccca ISO gggagt;aggç gactcctecc aggt&gtçgt esgcggctat gtattgccag gfcctgcaagt 240 gaaafcacgge gtgggtatât fctgaetqfcat agcãacactç açgttaegtt atcgcctgfct 300 gcstaageta tafcGtggaag ccgfcgtíjtgg fcgtagaçesg geactggatt tscfcctetca 360 «ttcgagttt tsgcaatçfcg aaitatgeat acgeeaeett cgggtggcgt fcgttfctttge 420 gagâcgaetc gcattcfcgtt ttgtaattec ctoaectttt getfcfcfcetoi eegsgeégei 400 ttccatatct «ttsacgcst asaaaaetet getggestie seaaafcgcgc sggQgtêasa 540 agtttecfcgt; agcacegtga gttatacttt gtat&aetta aggâggfcgea ggtgcçtatt 600 eeeataa&àa gatgggçgas cagtgeaggt afcggteattc çtaaiatggfe aatgaaagaa 660 cttaaottac agççggggça gagcgtggag gcgcaagtga gesacaãfcca aetgattctg 720 ácacecatct ccsggcgefca etcgcttgafc gaastgctgg cac-agtgfega catgaacgcc 780 gcgg&setta gcgagcagga. tgtctffggt aaetccaccc cfcgçgggtga cgsaafcatgg 840 tãaagsaaag tg&atttgas eggggagaqa ttgtgctggt tgfctfctgèt ccaacaagçç SOO g&eatgaaca g Sll

<210> 7 <211> 1158 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> carácter_mist <222> (1) .. (1158) <223> região ytfP-yjfA com a deleção <220> <221> carácter_mist <222> (1).. (630) <223> extremidade 5' da região ytfP-yjfA <220> 48 <221> carácter_mist <222> (631) .. (1158) <223> extremidade 3' da região ytfP-yjfA <2 2 0> <221> carácter_mist <222> (376)..(378) <223> codão ATG da ORF ytfP truncada <2 2 0> <221> carácter_mist <222> Complemento (658)..(637) <223> codão ATG da ORF yjfA truncada < 4 0 0 > 7 ggegatgtcg caaeaagctg ccttgtctta tttgctacgfc ggacaagggo tggagãgcga 60 tcãgagcgaç agtgcggoãâ tgeccfccgat gctgattggt ttgggggttg cgcaaagtgg X20 «eagatfcgfcg ggtaaaateg geg&gaegtt tggcgtaãge aattfcagcgc togacacesa ISO gçgagtagge gaetccfcccc aggtagfcggt Gãgsiggofcat gtattgccag gtctgcaagt 240 gaaatacgfc gtgggtatat ttgactctat agcaacacfcc asgtfcacgtfc ategeetgat 300 geetss greta tatctggaag eegfcgfcetgg fcgtâgâeesg gcãêtggratt tgetetaftea 360 gttcgagttt tagsaatgeg sstatfctgtc tecggeagfct tacgeeaeaa aea&ffea&c 420 sgtoacfcgça tgaessstgc eeagfctaetg ggegàttfcça gtatcgatsa ctaccragttg 480 tataggctçg gccactatcc aggcgcagtfc ccggggsaeg gãácggtaoa eeçfcgaagfct 540 fcatcgtattg «caacgcoao getggocgaa cttgafcgaot igcgeaccag gggcggfcga* 600 taogcgegcc agfctgatfcc* gacgccgtás tatçeafcaog eeaccttegg gfcggegttgt 660 tttttgogag acgactcgca ttetgitttg fcaatteectc aecttttget ittctcteesg 720 agcogcbttc catatctatt â&egcataaa aaactetget ggcattcaea aatgcgcagg 780 ggta&aaggt tteetgtagc scegtgagtt atacttfcgfca taacttaagg aggtgcagat 840 gegtsttacc stsaaaasafc gggtjg&acag tgc&ggtatg gfceattcceà átategtâat 800 gaaagasctt aacfctacagc çggggcâgag cgtggsggeg caagtg&gca aeaatcaact 860 gattctgaes cocatcteea ggcgctaetc gottgatgaa cfcgctggeac agtgtgaeat ÍÔ20 ga&egccgeg gaacfcfc&geg agcaggatgt ctggggtaaa tccaccéstg cgçgtgacga XOSO aatatggtaa agaaaagtga atttgaacgg fgagaeáttg tgcstggttgg ctttgateca Π40 geasgeggeç atgaacag ' 1IS8

<210> 8 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência de iniciação pckA'5'-l <400> 8 gatccgagcc tgacaggtta <210> 9 49

<211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <2 2 0 > <223> Descrição da sequência artificial: sequência de iniciação pckA'5'-2 <4 00> 9 çcatgogotc ggtcaggtta

<210> 10 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência de iniciação pckA'3'-1 < 4 0 0 > 10

aggcetgaag atggsactat og <210> 11 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência de iniciação pckA'3'-2 <400> 11 ccggagasgc gtaggtgtta

<210> 12 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> 50 <223> Descrição da sequência artificial: sequência de iniciação Gdhl < 4 0 0 > 12 tgaacaettc tggcggtacg

<210> 13 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência de iniciação Gdh2 <4 0 0> 13 cctcggcgaa getaatatgg

<210> 14 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência de iniciação RhtCl < 4 0 0 > 14 ctgttagcat cggcgaggca

<210> 15 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <2 2 3> Descrição da sequência artificial: sequência de iniciação RhtC2 <400> 15 gcatgttgat ggcgatgaeg <210> 16 51

<211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência de iniciação Tdhl <400> 16 tcgcgaecta fcaagtttggg

<210> 17 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência de iniciação Tdh2 <4 0 0> 17 aataceagcc cttgttcgtg

<210> 18 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência de iniciação ytfP-1 <400> 18 ggcgatgtcg caacaagctg

<210> 19 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> sequência <223> Descrição da sequência artificial: iniciação ytfP-2 < 4 0 0 > 19 ctgtteatgg ccgcttgctg

Lisboa, 27 de Janeiro de 2010

Claims (16)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Processo de fermentação para a preparação de L-aminoácidos, em que os seguintes passos são realizados: a) fermentação pelos microorganismos da família das Enterobacteriaceas produzindo o L-aminoácido desejado, em cujos microorganismos pelo menos o gene pckA ou sequências de nucleótidos que codificam para o produto do gene pckA estão atenuados, b) enriquecimento do L-aminoácido no meio ou nas células bacterianas, e c) isolamento do L-aminoácido, ou d) constituintes do meio de fermentação e a biomassa na sua totalidade ou em porções da mesma, sendo isolada como produto sólido juntamente com o L-aminoácido.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que são usados microorganismos nos quais outros genes da via bio-sintética do L-aminoácido desejado são adicionalmente amplificados.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que microorganismos são usados nos quais as vias metabólicas que reduzem a formação do L-aminoácido desejado são, pelo menos, parcialmente desligadas.

4. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a expressão do(s) polinucleótido (s) que codificam para o produto do gene pckA, é desligado.

5. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que as propriedades reguladoras e/ou catalíticas do polipéptido 2 (proteína tipo enzima) codificado pelo polinucleótido pckA são reduzidas.

6. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que microorganismos da família das Enterobacteriaceas são fermentados, nos quais são simultaneamente amplificados um mais genes seleccionados do grupo compreendendo: 6.1 o operão thrABC, que codifica para a aspartato quinase, homoserina desidrogenase, homoserina quinase e treonina sintase, 6.2 o gene pyc, que codifica para a piruvato carboxilase, 6.3 o gene pps, que codifica para a fosfoenolpiruvato sintase, 6.4 o gene ppc, que codifica para a fosfoenolpiruvato carboxilase, 6.5 o gene pntA e pntB, que codificam para a transhidrogenase, 6.6 o gene rhtB para a resistência à homoserina, e 6.7 o gene rhtC para a resistência à treonina, 6.8 o gene gdhA que codifica para a glutamato desidrogenase.

7. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que microorganismos da família das Enterobacteriaceas são fermentados, nos quais um ou mais genes seleccionados do grupo compreendendo: 7.1 o gene tdh, que codifica para a treonina desidrogenase, 7.2 o gene mdh, que codifica para a malato desidrogenase, 3 7.3 o produto do gene da grelha de leitura aberta (orf) yjfA, e 7.4 o produto do gene da grelha de leitura aberta (orf) ytfp, são atenuados, ou a sua expressão é reduzida.

8. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que é preparado L-isoleucina, L-valina, L-lisina ou L-treonina.

9. 0 plasmideo pMAK705ApckA, contendo partes das regiões 5' e 3' do gene pckA, correspondendo à SEQ ID N°. 3.

10. O polinucleótido isolado a partir de microorganismos da família das Enterobacteriaceas, contendo uma sequência de polinucleótidos que codifica para as regiões 5' e 3' do gene pckA, apresentada na SEQ ID N°. 4, a qual é particularmente adequada para constituinte de plasmídeos para a mutagénese sítio-específica do gene pckA.

11. Estirpes da família das Enterobacteriaceas produtoras de L-treonina, contendo uma mutação do tipo deleção no gene pckA, correspondendo à SEQ ID N°. 4.

12. Estirpes da família das Enterobacteriaceas produtoras de L-treonina, de acordo com a reivindicação 11, contendo adicionalmente uma mutação do tipo deleção na grelha de leitura aberta ytfP, correspondendo à SEQ ID N°. 6 ou 7.

13. Estirpes da família das Enterobacteriaceas produtoras de L-treonina, de acordo com a reivindicação 11, contendo adicionalmente uma mutação do tipo deleção na grelha de leitura aberta yjfA, correspondendo à SEQ ID N°. 6 ou 7. 4

14. Estirpes da família das Enterobacteriaceas produtoras de L-treonina, de acordo com a reivindicação 11, em que estas possuem uma ou mais características seleccionadas do grupo compreendendo: uma resistência ao ácido a-amino-β-hidroxivalérico, uma amplificação da homoserina desidrogenase I-aspartato quinase I na forma resistente a feedback., necessidade opcionalmente parcial e compensável de L-isoleucina, treonina desidrogenase atenuada e a capacidade para utilizar sucrose.

15. A estirpe de Escherichia coli K-12 MG442ApckA, depositada sob o número DSM 13761 no Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkultur (Colecção Alemã de Microorganismos e Culturas Celulares).

16. A estirpe de Escherichia coli K-12 B3996kurAtdhpckA/PVIC40, depositada sob o número DSM 14150 no Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkultur (Colecção Alemã de Microorganismos e Culturas Celulares). Lisboa, 27 de Janeiro de 2010