MXPA06007721A - Procedimiento para la preparacion de l-aminoacidos mediante el uso de cepas de la familia enterobacteriaceae. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a un procedimiento para la preparacion de L-aminoacidos, en particular L-treonina, en el cual se llevan a cabo los siguientes pasos: a) fermentacion de los microorganismos de la familia Enterobacteriaceae que producen los L-aminoacidos deseados y en los cuales el gen malT o las secuencias de nucleotidos o alelos que codifican para el producto de gen del mismo son mejorados, b) concentracion del L-aminoacido deseado en el medio o en las celulas de los microorganismos y c) aislamiento del L-aminoacido deseado.

Description

PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DE L-AMINOACIDOS MEDIANTE EL USO DE CEPAS DE LA FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere, a un" procedimiento para la preparación de L-aminoácidos, en particular L-treonina mediante el uso de microorganismos recombinantes de la familia Enterobacteriaceae en la cual el gen malT es mejorado, en particular sobreexpresado, y a estos microorganismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los L-aminoácidos, en particular L-treonina, se usan en medicina humana y en la industria farmacéutica, en la industria de alimentos • y muy particularmente en nutrición animal . Se sabe que los L-aminoácidos se preparan por fermentación de cepas de Enterobacteriaceae, en particular Escherichia coli (E. coli) y Serratia marcescens . Debido a su gran importancia, constantemente se realiza trabajo para mejorar los procedimientos de preparación. Mejoras al procedimiento se pueden relacionar con medidas de fermentación, tales como v.gr., agitación y suministro de Ref. 174044 oxígeno, o la composición del medio de nutrientes, tal como v.gr., la concentración de azúcar durante la fermentación, o el tratamiento hasta- la forma de producto, v.gr., mediante cromatografía de intercambio de iones, o las propiedades de salida intrínsecas del microorganismo mismo. Métodos de mutagénesis, selección y selección de mutantes se usan para mejorar las propiedades de salida de estos microorganismos . Las cepas que son resistentes a antimetabolitos, tales como v.gr., el análogo, de treonina ácido cc-amino-ß-hidroxivalérico (AHV) , o son auxotróficas para metabolitos de importancia reguladora y producen L-aminoácidos, tales como" v.gr., L-treonina, se obtienen de esta manera. Métodos de la técnica de ADN recombinante también se han usado desde hace algunos años para mejorar la cepa o cepas de la familia Enterobacteriaceae que producen L-aminoácidos, al amplificar los genes de biosíntesis de aminoácidos individuales e investigar el efecto sobre la producción. Información resumida sobre la biología celular y molecular de Escherichia coli y Salmonella se han de encontrar en Neidhardt (ed) : Escherichia coli and Salmonell , Cellular and Molecular Biology, 2a. Edición, ASM Press, Washington, D.C., EUA (1996). El sistema de maltosa de Escherichia coli contiene 10 genes que regulan la asimilación y metabolismo de maltosa y maltodextrina (Boos, W. y Shuntan, H.A.; Microbiology and Molecular Biology Reviews 16: 204-229 (1998)). Estos genes están bajo el control de MalT, un activador transcripcional con 901 aminoácidos y un tamaño de 103 kDa, MalT pertenece a una familia de transactivadores bacterianos, la familia MalT o LAL (Dannot. O.; Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America 98: 435-440 (2001)). La familia tiene 0Las características comunes de un tamaño de Z90 kDa, u sitio desunión a ATP en la región del C terminal. La actividad de MalT requiere la presencia de ATP y maltodextrina co o un efector (Raibaud, O. y Richet, E. y Raibaud, O.; EMBO Reports 8: 981-987 (1989)). En la célula, MalT está presente en la forma no ligada como un monómero y es convertido en la forma activa oligomérica en presencia de ATP y maltotriosa, que hace posible la unión cooperativa a secuencias de los promotores mal (Vidal-Ingigliardi et al.; The Journal of Biological Chemistry 286: 24527-24530 (1993)). En comparación con los efectores positivos, se conocen tres proteínas que pueden influir negativamente en la actividad de MalT: MalK como una subunidad hidrolizante de ATP del sistema de transporte de maltodextrina ) Hofnung et al.; Genetics 76: 169-184 (1974) y Reyes, M y Suman H.A. ; Journal of Bacteriology 170: 4598-4602 (1998)). Las mutaciones nulas de malK conducen a expresión constitutiva del reguión, pero si sobreexpresión conduce a expresión escasamente medible . Un segundo represor de reguión de maltosa es malY.. 'MalY compite con MalT para la unión de maltotriosa, y por lo tanto inhibe la actividad transcripcional y estabiliza MalT en su forma monomérica inactiva (Schreiber et al.; The Journal of Biological Chemistry 35: 765-776 (2000). Una tercera proteína que inhibe actividad de MalT es la proteína Aes, una enzima que, codificada por plásmido con su propio promotor, reduce la expresión del gen mal. (Peist et al.; Journal of Bacteriology 161: 1201-1208 (1985).

OBJETO DE LA INVENCIÓN Los inventores tienen el objeto de proveer nuevas medidas para la preparación fermentativa mejorada de L-aminoácidos, en particular L-treonina.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención provee microorganismos recombinantes de la familia Enterobacteriaceae que contienen un gen malT mejorado o sobreexpresado, que codifica para el activador transcripcional positivo del reguión de maltosa, o alelos del mismo, y que produce L-aminoácidos, en particular L-treonina, de una manera mejorada.

El punto de partida para la comparación son en cada caso los microorganismos que no son recombinantes para el gen malT.y no contienen gen malT mejorado. Estos microorganismos incluyen, en particular, microorganismos de la familia Enterobacteriaceae en la cual el polinucleótido que codifica para un polipéptido del cual la secuencia de aminoácidos es idéntica al grado de por lo menos 9O%0 en particular al grado de por lo menos 95%, preferiblemente al grado de por lo menos 98% o por lo menos 99%, particularmente preferiblemente al grado de 99.7% y muy particularmente preferiblemente al grado de 100% a una secuencia de aminoácidos escogida del grupo que consiste de SEQ ID No. 4 y SEQ ID No . 6 es mejorada. Las secuencias de aminoácidos que son idénticas a las de SEQ ID No. 4 o SEQ ID No. 6 son preferidas. Los microorganismos mencionados contienen polinucleótidos mejorados o sobreexpresados escogidos del grupo que consiste de: a) polinucleótido con la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 3 o SEQ ID No . 5; b) polinucleótido con una secuencia de nucleótidos que corresponde a SEQ ID No. 3 o SEQ ID No. 5 dentro del contexto de degeneración del código genético; c) secuencia de polinucleótidos con una secuencia que híbrida bajo condiciones astringentes con la secuencia complementaria a SEQ ID No. 3 o SEQ ID No. 5; d) polinucleótido con una secuencia SEQ ID No. 3 o SEQ ID No. 5 que contiene mutantes de sentido de función neutra, en donde los polinucleótidos codifican para el activador transcripcional positivo del reguión de maltosa. La invención también provee un procedimiento para la preparación fermentativa de L-aminoácidos, en particular L-treonina, mediante el uso de microorganismos recombinantes de la familia Enterobacteriaceae que, en particular, ya produce L-aminoácidos. y en la cual por lo menos el gen malT o secuencias de nucleótido que codifican para el producto del gen del mismo es o son mejoradas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los microorganismos descritos se utilizan preferiblemente . En donde los L-aminoácidos o aminoácidos se mencionan en lo siguiente, esto significa uno o más aminoácidos, que incluyen sus sales, escogidos del grupo que consiste de L-asparagina, L-treonina, L-serina, L-glutamato, L-glicina, L-alanina, L-cisteína, L-valina, L-metionina, L-prolina, L-isoleucina, L-leucina, L-tirosina, L-fenilalanina, L-histidina, L-lisina, L-triptofano, L-arginina y L- homoserina. La L-treonina es particularmente preferida. El término "mejora" en conexión a esto describe el incremento en la actividad o concentración intracelular de una o más enzimas o proteínas en un microorganismo que son codificadas por el ADN correspondiente, por ejemplo al incrementar el número de copias del gen o genes por lo menos por una (1) copia, que enlaza un promotor, potente funcionalmente al gen o que usa un gen o alelo que codifica para una enzima o protelna correspondiente con una actividad alta, y opcionalmente al combinar estas medidas. En general, los alelos se entienden como formas alternativas de un gen -dado. Las formas se distinguen por diferencias en la secuencia de nucleótidos. La proteína codificada por una secuencia de nucleótidos, es decir, una ORF, un gen o un alelo, o un ácido ribonucleico codificado en general se llama el producto del gen. Mediante medidas mejoradas, la actividad o concentración de la proteína correspondiente es en general incrementada por lo menos en 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% o 500%, hasta un máximo de 1,000% o 2,000%, con base en el de la proteína de tipo silvestre o en la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo o cepa progenitora que no es recombinante para la enzima o proteína correspondiente . El microorganismo o cepa progenitora que no es recombinante se entiende como el microorganismo sobre el cual se llevan a cabo las medidas inventivas . La invención también provee un procedimiento para la preparación de L-aminoácidos por fermentación de microorganismos recombinantes de la familia Enterobacteriaceae, caracterizado porque a) los microorganismos de la familia Enterobacteriaceae que producen el L-aminoácido deseado y en el cual el gen malT o alelos del mismo es/son mejorados, en particular sobreexpresados , se cultivan en un medio bajo condiciones adecuadas para formación de producto de gen malT (activador transcripcional del reguión de maltosa) , b) el L-aminoácido deseado es concentrado en el medio o en las células de los microorganismos, y c) el L-aminoácido deseado es aislado, constituyentes del caldo de fermentación y/o la biomasa en una cantidad de > 0 a 100% de la misma que permanecen opcionalmente en el producto que ha sido asilado o que es completamente removido . Los microorganismos, en particular microorganismos recombinantes, con un gen malT mejorado que la presente invención también provee pueden producir L-aminoácidos a partir de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melaza, opcionalmente almidón, opcionalmente celulosa o a partir de glicerol y etanol . Son representativos de la familia Enterobacteriaceae escogidos de los géneros Escherichia, Erwinia, Providencia y Serratia . Los géneros Escherichia y Serratia son preferidos . Del género Escherichia, en particular la especie Escherichia coli y del género Serratia en particular la especie Serratia marcescens se han de mencionar. Los microorganismos recombinantes en general se producen por transformación, transducción o conjugación, o una combinación de estos métodos, con un vector que contiene el gen deseado, un alelo de este gen o partes del mismo y/o un promotor que mejora la expresión de gen. Este promotor puede ser el promotor que se origine al incrementar la mutación a partir de la secuencia reguladora endógena hacia el extremo 5' del gen, o un promotor eficiente que haya sido fusionado con el gen. Cepas adecuadas, que producen L-treonina en particular, del género Escherichia, en particular de la especie Escherichia coli , son, por ejemplo: - Escherichia coli H4581 (EP 0 301 572) - Escherichia coli KY10935 (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61 (11) : 1877-1882 (1997) - Escherichia coli VNIIgenetika MG442 (US-A-4278 , 765) - Escherichia coli VNIIgenetika Ml (US-A-4 , 321, 325) - Escherichia coli VNIIgenetika 472T23 (US-A-5, 631, 157) - Escherichia coli BKIIM B-3996 (US-A-5, 175, 107) - Escherichia coli kat 13 (WO 98/04715) - Escherichia coli KCCM-10132 (WO 00/09660) . Cepas productoras de L-treonina adecuadas del género Serratia, en particular de la especie Serratia marcescens, son por ejemplo Serratia marcescens HNr21 (Applied and Environmental Microbiology 38 (6) : 1045-1051 (1979) ) - Serratia marcescens TLrl56 (Gene 57 (2-3) : 151-158 (1987) ) Serratia marcescens T-2000 (Applied Biochemistry and Biotechnology 37 (3) : 255-265 (1992) ) . Cepas de la familia Enterobacteriaceae que producen L-treonina preferiblemente tienen, entre otros, un o más rasgos genéticos o fenotípicos escogidos del grupo que consiste de: resistencia a ácido a-amino-ß-hidroxivalérico, resistencia a tialisina, resistencia a etionina, resistencia a a-metilserina, resistencia a ácido diaminosuccínico, resistencia a ácido a-aminobut írico , resistencia a borrelidina, resistencia a ácido ciclopentan-carboxílico, resistencia a rifampicina, resistencia a análogos de valina, tales como, por ejemplo, hidroxamato de valina, resistencia a análogos de purina, tales como, por ejemplo, 6-dimetilaminopurina, una necesidad de L-metionina, opcionalmente una necesidad parcial y compensable de L-isoleucina, una necesidad de ácido meso- diaminopimélico, auxotrofia con respecto a dipéptidos que contienen treonina, resistencia a L-treonina, resistencia a rafinato de treonina, resistencia a L - omos erina, resistencia a L-lisina, resistencia a L-metionina, resistencia a ácido L- glutámico, resistencia a L-aspartato, resistencia a L- leucina, resistencia a L- fenilalanina, resistencia a L- serina, resistencia a L-cisteína, resistencia a L-valina, sensibilidad a f luoropiruvato, treonina deshidrogenasa defectuosa, opcionalmente una capacidad para utilización de sacarosa, mej ora del operón de treonina, mej ora de homoserina deshidrogenasa I-aspartato cinasa I , preferiblemente de la forma resistente a retroalimentación, y mejora de homoserina cinasa, mej ora de treonina sintasa , mej ora de aspartato cinasa , opcionalmente de la forma resi stente a retroalimentación , mej ora de aspartato semialdehído deshidrogenasa , mej ora de fos foenol piruvato carboxilasa, opcionalmente la forma resistente a retroalimentación, mejora de fosfoenol piruvato sintasa, mej ora de transhidrogenasa, mej ora del producto de gen RhtB , mej ora del producto de gen RhtC , mej ora del producto de gen Yf iK , mej ora de una piruvato carboxilasa , y atenuac ión de la formación de ácido acético .

Se ha encontrado que los microorganismos de la familia Enterobacteriaceae producen L-aminoácidos, en particular L-treonina de una manera mejorada después de la mejora, en particular sobreexpresión, del gen malT o alelos del mismo. Las secuencias de nucleótidos de los genes de Escherichia coli pertenecen a -la técnica anterior (véanse las siguientes referencias de texto) y también se puede encontrar en la secuencia de genoma de Escherichia coli publicada por Blattner et al." (Science 277: 1453-1462 (1997)). Se sabe que las enzimas- endógenas en el hospedero (metionina aminopeptidasa) pueden dividir el aminoácido N-terminal metionina. Las secuencias de nucleótidos para el gen malT también se conocen de Salmonella typhimurium, que también pertenecen a la familia Enterobacteriaceae. El gen malT se describe, entre otros, por los siguientes datos.

Descripción: activador transcripcional positivo del reguión de maltosa Función: Esencial para transcripción de los genes, es inducida por maltotriosa y ATP Referencia: Colé S.T. y Raibaud 0.; Gene 42(2): 201-208 (1986), Richet E." y Raibaud 0.; The EMBO Journal 8 (3) : 981-987 (1989) , Schreiber et al.; Molecular Microbiology 35(4) : 765-776 (2001) Schlegel et al.;' The Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology; 4(3): 301- 307 (2002) No. de acceso: AE000418 Las secuencias de ácido nucleótido se pueden encontrar en los bancos de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI) de la National Library of Medicine (Bethesda, MD, EUA) , el banco de datos de secuencia de nucleótidos de European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Alemania o Cambridge, RU) o el banco de datos de ADN de Japón (DDBJ, Mishima, Japón) . Para mejor claridad, la secuencia de nucleótidos conocida del gen malT de Escherichia coli se ha de encontrar en SEQ ID No . 3 y las secuencias conocidas para el gen malT de Salmonella typhimurium (AE008862.1) se han de encontrar bajo SEQ ID No. 5. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas codificadas por estos marcos de lectura se muestran como SEQ ID No. 4 o SEQ ID No. 6.

Los genes descritos en las referencias de texto mencionadas se pueden usar de conformidad con la invención. Alelos de los genes que resultan de la degeneración del código genético o debido a "mutaciones de sentido" de la función neutra se pueden usar adicionalmente . El uso de genes endógenos es preferido. Por "genes endógenos" o "secuencias de nucleótidos endógenas" se entienden los genes o alelos o secuencias de nucleótidos presentes en la población de una especie . Alelos adecuados del gen malT que contienen mutaciones de sentido de función neutra incluyen, entre otros, aquellos que conducen a cuando mucho 100 o a cuando mucho 90 o a cuando mucho 80 o a cuando mucho 70 o a cuando mucho 60 o a cuando mucho 50 o a cuando mucho 40 o a cuando mucho 30 o a cuando mucho 20, preferiblemente a cuando mucho 10 o a cuando mucho 5, muy particularmente preferiblemente a cuando mucho 3 o a cuando mucho 2 o a por lo menos un (1) intercambio de aminoácido conservativo en la proteína codificada por los mismos. En el caso de aminoácidos aromáticos, los intercambios conservadores son referidos a cuando la fenilalanina, triptofano y tirosina son intercambiados uno por otro. En el caso de aminoácidos hidrofóbicos, los intercambios conservativos son referidos a cuando la leucina, isoleucina y valina son intercambiadas una por otra. En el caso de aminoácidos polares, los intercambios conservativos son referidos a cuando la glutamina y asparagina son intercambiadas una por otra.- En el caso de aminoácidos básicos, los intercambios conservativos son referidos a cuando la arginina, lisina e histidina son intercambiadas una por otra. En el caso de aminoácidos ácidos, los intercambios conservativos son referidos a cuando el ácido aspártico y ácido glutámico son intercambiados uno por otro . En el caso de aminoácidos que contienen grupos hidroxilo, los intercambios conservativos son referidos a cuando la serina y treonina son intercambiadas una por otra. Todos los otros intercambios de aminoácidos se denominan intercambios de aminoácidos no conservativos . De la misma manera, aquellas secuencias de nucleótidos que codifican para variantes de la proteína mencionada que adicionalmente contiene un alargador o acortador por lo menos por un (1) aminoácido en el N o C-terminal también se pueden usar. Este alargamiento o acortamiento es de no más de 50, 40, 30, 20, 10, 5, 3 ó 2 aminoácidos o radicales aminoácido. Los alelos adecuados también incluyen aquellos • que codifican para proteínas en las cuales por lo menos un (1) aminoácido es insertado (inserción) o removido (deleción) . El número máximo de esos cambios, llamados indelos, se pueden relacionar con 2, 3, 5, 10, 20 pero en ningún caso más de 30 aminoácidos . Los alelos adecuados además incluyen aquellos que ' pueden obtener por hibridación, en particular bajo condiciones astringentes, mediante el uso de SEQ ID No. 3 o SEQ ID No. 5 o partes de las mismas, en particular las regiones de codificación o las secuencias complementarias a las mismas . Instrucciones para identificar secuencias de ADN por medio de hibridación pueden ser encontradas por el experto, entre otras cosas, en el manual "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" de Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemania, 1993) y en Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991)). La hibridación tiene lugar bajo condiciones astringentes, es decir sólo híbridos en los cuales se forman la sonda y secuencia objetivo, es decir, los polinucleótidos tratados con la sonda son por lo menos 80% -idénticos. Se sabe que la astringencia de la hibridación, que incluye los pasos de lavado es influenciada o determinada al variar la composición de regulador de pH, la temperatura y la concentración de sal . La reacción de hibridación en general se lleva a cabo bajo una astringencia relativamente baja en comparación con los pasos de lavado (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, RU, 1996) . Un regulador de pH correspondiente al regulador de pH 5x SSC a una temperatura de aproximadamente 50°C-68°C, por ejemplo, se puede utilizar para la reacción de hibridación. Las sondas también pueden hibridar aquí con polinucleótidos que son menores que 80% idénticos a la secuencia de la sonda. Esos híbridos son menos estables y son removidos al lavar bajo condiciones astringentes. Esto se puede lograr, por ejemplo, al reducir la concentración de sal a 2x SSC y opcionalmente, despué's a 0.5x SSC (The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania, 1995) una temperatura de aproximadamente 50°C-68°C, aprox. 52°C-68°C, aprox. 54°C-68°C, aprox. 56°C- 68°C, aprox. 58°C-68°C,~ aprox. 60°C-68°C, aprox. 62-68°C, aprox. 64°C-68°C, aprox. 66°C-68°C es estabilizada. La temperatura varía de aprox. 64°C-68°C o se prefiere aprox. 66°C-68°C. Es opcionalmente posible reducir la concentración de sal a una concentración correspondiente a 0.2x SSC o 0. lx SSC . Los fragmentos de polinucleótido que son, por ejemplo, por lo menos 80% o por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98% o por lo menos 99% idénticos a la secuencia de la sonda utilizada o a la secuencia de nucleótido mostradas en SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 o SEQ ID No . 7 se pueden aislar al incrementar la temperatura de hibridación paso a paso de 50°C a 68°C en pasos de aprox. 1-2°C. Instrucciones adicionales sobre la hibridación se pueden obtener en el mercado en forma de los llamados equipos (v.gr., DIG Easy Hyb de Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, Catálogo No. 1603558) . Las secuencias de nucleótidos obtenidas de esta manera codifican para polipéptidos que son por lo menos 90% idénticos, en particular idénticos al grado de por lo menos 95%, preferiblemente al grado de por lo menos 98% o por lo menos 99%, muy particularmente preferiblemente al grado de 99.8% a las secuencias de aminoácido mostradas en SEQ ID No. 4 o SEQ ID No. 6. Para lograr una sobreexpresión, por ejemplo, la expresión de los genes o las propiedades catalíticas de las proteínas de enzima se pueden incrementar. Las dos medidas se pueden combinar opcionalmente. Por lo tanto, por ejemplo, el número de copias de los genes correspondientes se puede incrementar, o la región del promotor y regulación o el sitio de unión a ribosoma hacia el extremo 5 ' del gen estructural pueden ser mutados .

Los cassettes de expresión que se incorporan hacia el extremo 5' del gen estructural actúan de la misma manera. Por promotores inducibles, es posible además incrementar la expresión en el curso de producción de L-treonina fermentativa, y además puede ser ventajoso también usar promotores para la expresión de gen que permita la expresión de otro gen con respecto al tiempo. La expresión es asimismo mejorada por medidas para prolongar la vida del ARNm. Además, la actividad de enzima también es incrementada al prevenir la degradación de la proteína de enzima. Los genes o construcciones de genes pueden estar ya sea presentes en plásmidos con un número variable de copias, o pueden ser integrados y amplificados en el cromosoma. Alternativamente, una sobreexpresión de los genes en cuestión se puede lograr además al cambiar la composición de los medios y el procedimiento de cultivo. Los métodos de sobreexpresión se describen en forma adecuada en la técnica anterior -por ejemplo en Makrides et al. (Microbiological Reviews 60 (3), 512-538 (1996)). Al usar-vectores, el número de copias se incrementa por lo menos por una (1) copia. Los vectores que se pueden usar son plásmidos que se describen, por ejemplo, en el documento US 5,538,873. Los vectores que también se pueden usar son fagos, por ejemplo el fago Mu, como se describe en el documento EP 0332448, o el fago lambda (?) . Un incremento en el número de copias también se puede lograr al incorporar una copia adicional en un sitio adicional del cromosoma -por ejemplo en el sitio att del fago ? (Yu y Court, Gene 223, 77-81 (1998)). El documento US 5,939,307 describe que al incorporar cassettes de expresión o promotores, tales como, por ejemplo, el promotor tac, promotor trp, promotor Ipp, o promotor PL y el promotor PR del fago ? por ejemplo hacia el extremo 5' del operón de treonina cromosomal fue posible lograr un incremento en la expresión. Los promotores del fago T7, los promotores de tipo caja de engrane o - el promotor nar se pueden usar de la misma manera. Esos cassettes de expresión o promotores también se pueden usar, como se describe en el documento EP 0 593 792, para sobreexpresar genes de unión a plásmido. Al usar el alelo lacIQ, la expresión de los genes unidos a plásmido a su vez pueden ser controlados (Glascock y Weickert, Gene 223, 221-231 (1998)). Además, es posible que la actividad de los promotores sea incrementada por modificación de su secuencia por medio . de uno o más intercambio de nucleótidos, por inserción (es) y/o deleción (es) . Otra expresión de gen con respecto al tiempo se puede lograr, por ejemplo, como se describe en Walker et al. (Journal of Bacteriology 181: 1269-80 (1999)) al usar el promotor fis dependiente de fase de crecimiento. El experto puede encontrar instrucciones generales a este respecto, entre otros, en Chang y Cohén (Journal of Bacteriology 134: 1141-1156 (1978)), en Hartley y Gregori (Gene 13: 347-353 (1981)), en Amann y Brosius (Gene 40: 183- 190 (1985)), en de Broer et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 80: 21-25 (1983)), en LaVallie et al. (BIO/TECHNOLOGY 11: 187-193 (1993)), en PCT/US97/13359, en Llosa et al. (Plasmid 26: 222-224 (1991)), en Quandt y Klipp (Gene 80: 161-169 (1989)), en Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 171: 4617-4622 (1989) ) , en Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191-195 (1998)) y en libros, de texto conocidos de genética y biología molecular. Los vectores de plásmido que se pueden replicar en Enterobacteriaceae, tales como v.gr., vectores de clonación derivados de pACYC184 (Bartolomé et al.; Gene 102: 75-78 (1991)), pTrc99A (Amann et al.; Gene 69: 301-315 (1988)) o derivadlos de pSClOl (Vocke y Bastía; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80 (21): 6557-6561 (1983)) se pueden usar. Una cepa transformada con un vetor de plásmido, en donde el vector de plásmido porta por lo menos el gen malT o una secuencia de nucleótidos que codifica para el producto de gen del mismo o un alelo, se puede utilizar en un proceso de conformidad- con la invención. El término transformación se entiende como la asimilación de un ácido nucleico aislado por un hospedero (microorganismo) . También es posible transferir mutaciones que afectan la expresión de los genes particulares en varias cepas por intercambio de secuencia (Hamilton et al.; (Journal of Bacteriology 171: 4617-4622 (1989)), conjugación o transducción. Explicaciones más detalladas de los términos en genética y biología molecular • se encuentran en los libros de texto conocidos de genética y biología molecular, tales como, por ejemplo, el libro de texto de Birge (Bacterial and Bacteriophage Genetics, 4a ed. , . Springer Verlag, New York (USA) , 2000) o el libro de texto de Berg, Tymoczko y Stryer (Biochemistry, 5a ed. , Freeman and Company, New York (USA) , 2002) o el libro de texto de Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (juego de 3 volúmenes) , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA) , 2001) . Además puede ser ventajoso para la producción de L-aminoácidos, en particular L-treonina, con cepas de la familia Enterobacteriaceae mejorar una o más enzimas de la vía de biosíntesis de treonina conocida o enzimas del metabolismo anaplerótico o enzimas para la producción de nicotinamida -adenina - dinucleótido fosfato o enzimas de glicólisis o enzimas de PTS o enzimas del metabolismo del azufre, además de la mejora del gen malT. El uso de genes endógenos es en general preferido. Por lo tanto, por ejemplo, al mismo tiempo uno o más de los genes escogidos del grupo consisten de • por lo menos un gen del operón thrABC que codifica para aspartato cinasa, homoserina deshidrogenasa, homoserina cinasa y treonina sintasa (US-A-4, 278, 765) , • el gen pyc de Corvuebacterium glutamicum que codifica para piruvato carboxilasa (WO 99/18228) , • el gen pps que codifica para fosfoenol piruvato sintasa (Molecular and General Genetics 231 (2) : 332-336 (1992)), • el gen ppc que codifica para -fosfoenol piruvato carboxilasa (WO 02/064808) , • los genes pntA y pntB que codifican para subunidades de piridina transhidrogenasa (European Journal of Biochemistry 158: 647-653 (1986)), • el gen rhtB que codifica para la proteína que imparte resistencia a homoserina (EP-A-0 994 190) , • el gen rhtC que codifica para la proteína que imparte resistencia a treonina (EP-A-1 013 765) , • el gen thrE de Coryne acteriurri glutamicum que codifica para la proteína portadora de exportación de treonina (WO 01/92545), • el gen gdhA que codifica para glutamato deshidrogenasa (Nucleic Acids Research 11: 5257-5266 (1983); Gene 23: 199-209 (1983)), • el gen pgm que codifica para fosfoglucomutasa (WO 03/004598) , • el gen fba que codifica para bifosfato de fructosa aldolasa (WO 03/004664) , el gen ptsH para el operón ptsHIcrr que codifica para la proteína de fosfohistidina hexosa fosfotransferasa del sistema de fosfotransferasa PTS (WO 03/004674) , • el gen ptsl del operón ptsHIcrr que codifica para enzima I del sistema de fosfotransferasa PTS (WO 03/004674), • el gen crr del operón ptsHIcrr que codifica para el componente de IIA específico de glucosa del sistema de fosfotransferasa PTS (WO 03/004674) , • el gen ptsG que codifica para el componente IIBC específico de glucosa (WO 03/004670)., • el gen lrp que codifica para el regulador del reguión de leucina (WO 03/004665) , • el gen fadR que codifica para el regulador del reguión fad (WO 03/038106) , • el gen iclR que codifica para el regulador del metabolismo de intermediario central (WO 03/038106) , • el gen ahpC del operón ahpCF que codifica para la subunidad pequeña de alquil hidroperóxido reductasa (WO 03/004663), • el gen ahpF del operón ahpCF que codifica para la subunidad grande de alquil hidroperóxido reductasa (WO 03/004663), • el gen cysK que codifica para cisteína sintasa A (WO 03/006666) , • el gen cysB que codifica para el regulador del reguión cys (WO 03/006666) , • el gen cysJ del operón cysJIH que codifica para la flavoproteína de NADPH sulfito reductasa (WO 03/006666) , • el gen cysl del operón cysJIH que codifica para la hemoproteína de NADPH sulfito reductasa (WO 03/006666) , « el gen cysH del operón cysJIH que codifica para el adenilil sulfato reductasa (WO 03/006666) , • el gen rseA del operón rseABC que codifica para la proteína de membrana con actividad anti-sigmaE (WO 03/008612) , • el gen rseC del operón rseABC que codifica para el regulador global del factor sigmaE (WO 03/008612) , • el gen sucA del operón sucABCD que codifica para la subunidad descarboxilasa de 2-cetoglutarato deshidrogenasa (WO 03/008614) , • el gen sucB del operón sucABCD que codifica para la subunidad de dihidrolipolitranssuccinasa E2 de 2-cetoglutarato deshidrogenasa (WO 03/008614) , • el gen sucC del operón sucABCD que codifica para la subunidad ß de succinil-CoA sintetasa (WO 03/008615) , • el gen sucD del operón sucABCD que codifica para la subunidad a de succinil-CoA sintetasa (WO 03/008615) , • el gen aceE que codifica para el componente El del complejo piruvato deshidrogenasa (WO 03/076635) , • el gen aceF que codifica para el componente E2 del complejo piruvato deshidrogenasa (WO 03/076635) , y • el gen rseB que codifica para el regulador de actividad de factor sigmaE (Molecular Microbiology 24 (2) : 355-371 (1997)), • el producto de gen del marco de lectura abierto (ORF) yodA de Escherichia coli (número de acceso AE000288 del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Betesda, MD, USA), DE10361192.4) , y « el producto de gen del marco de lectura abierto (ORF) yaaU de Escherichia coli (número de acceso AE005181 del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Betesda, MD, USA), DE10361268.8) se pueden mejorar. Además, puede ser ventajoso para la producción de L-aminoácidos, en particular L-treonina, además de la mejora de gen malT, que uno o más de los genes escogidos del grupo que consiste de • el gen tdh que codifica para treonina deshidrogenasa (Journal of Bacteriology 169: 4716-4721 (1987)) , • el gen mdh que codifica para malato deshidrogenasa (E.C. 1.1.1.37) (Archives in Microbiology 149: 36-42 (1987)), • el producto de gen del marco de lectura abierto (orf) yjfA de Escherichia coli (número de acceso AAC77180 del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Betesda, MD, USA), WO 02/29080)), • el producto de gen del marco de lectura abierto (orf) yTFp de Escherichia coli (número de acceso AAC77179 del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Betesda, MD, USA), WO 02/29080)), • El gen pckA que codifica para la enzima fosfoenol piruvato carboxicinasa (WO 02/29080) , • el gen poxB que codifica para piruvato oxidasa (WO 02/36797) , • el gen dgsA que codifica para el regulador DgsA del sistema de fosfotransferasa (WO 02/081721) y también conocido bajo el nombre del gen mic, • el gen fruR que codifica para el represor de fructosa (WO 02/081698) y también conocido bajo el nombre del gen era, • el gen rpoS que codifica para el factor sigma38 (WO 01/05939) y también se conoce bajo el nombre del gen katF, y • el gen aspA que codifica para aspartato-amonio liasa (WO 03/008603) pueden ser atenuados, en particular eliminados o que la expresión de los mismos sea reducida. El término "atenuación" en conexión a esto describe la reducción o eliminación de la actividad o concentración intracelular de una o más enzimas o proteínas en un microorganismo que son codificadas por el ADN correspondiente, por ejemplo al usar un promotor más débil que el del microorganismo o cepa progenitora que no es recombinante para la enzima o proteína correspondiente a un gen o alelo que codifica para una enzima o proteína correspondiente con una baja actividad o inactivación de la enzima . (proteína) correspondiente o el marco de lectura abierto o el gen y opcionalmente al combinar estas medidas. Por medidas de atenuación, la actividad o concentración de la proteína correspondiente es en general reducida a 0 a 75%, 0 a 50%, 0 a 25%, 0 a 10% o 0 a 5% de la actividad o concentración de la proteína de tipo silvestre o la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo o cepa progenitora que no es recombinante para la enzima o proteína correspondiente. El microorganismo o cepa progenitora que no es recombinante se entiende que significa el microorganismo sobre el cual se llevan a cabo las medidas inventivas . Para lograr una atenuación, por ejemplo, la expresión de los genes o marcos de lectura abiertos de las propiedades catalíticas de las proteínas de enzima pueden ser reducidas o eliminadas . Las dos medidas se pueden combinar opcionalmente.

La reducción en la expresión de gen puede tener lugar mediante cultivo adecuado, por modificación genética (mutación) de las estructuras de señal de la expresión de gen o también por la técnica de ARN de antisentido. Las estructuras de señal de expresión de gen son, por ejemplo, genes represores, genes activadores, operadores, promotores, atenuadores, sitio de unión a ribosoma, el codón de inicio y terminadores . El experto puede encontrar información a este respecto, entre otros, por ejemplo, en Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191-195 (1998)), en Carrier y Keasling (Biotechnology Progress 15: 58-64 (1999)), Franch y Gerdes (Current Opinión in Microbiology 3: 159-164 (2000) ) y en libros de texto de genética y biología molecular, tales como, por ejemplo, el libro" de texto de Knippers ("Molekulare Genetik [Molecular Genetics]", 6a edición, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 1995) o el de Winnacker ("Gene und Klone [Genes and Clones]", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990) . Mutaciones que conducen a un cambio o reducción en las propiedades catalíticas de propiedades de enzima se conocen de la técnica anterior. Ejemplos que se pueden mencionar son los trabajos de Qiu y Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)),' Yano et al.

(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95: 5511-5515 (1998)), Wente y Schachmann (Journal of Biological Chemistry 266: 20833-20839 (1991) ) . Descripciones resumidas se pueden encontrar en libros de texto conocidos de genética y biología molecular tales como, v.gr., el de Hagemann ("Allgemeine Genetik [General Genetics]", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986). Posibles mutaciones son transiciones, transversiones, inserciones y deleciones de por lo menos un (1) par de bases o nucleótido. Según el efecto del intercambio de . aminoácido causado por la mutación sobre la actividad de la enzima, "mutaciones de sentido erróneo" o "mutaciones sin sentido" se refieren a mutación de sentido erróneo que conduce a un intercambio de un aminoácido dado en una proteína por otra, que es, en particular, una intercambio de aminoácidos no conservativo. La capacidad o actividad funcional de la proteína es mejorada por este medio y reducida a un valor de 0 a 75%, 0 a 50%, o a 25%, 0 a 10% ó 0 a 5%. La mutación sin sentido conduce a un codón de interrupción en la región codificadora de gen y por lo tanto a una interrupción prematura en la traducción. Las inserciones o deleciones de por lo menos un par de bases en un gen conducen a mutaciones de cambio de marco, que conducen a aminoácidos incorrectos que son incorporados o traducción que es interrumpida prematuramente . Si un codón de interrupción se forma en la región codificadora como consecuencia de la mutación, esto también conduce a una terminación prematura de la traducción. Las deleciones de por lo menos uno (1) o más codones típicamente conducen a una pérdida completa de la actividad de la enzima. Instrucciones sobre la generación de esas mutaciones son técnica anterior y se pueden encontrar en libros de texto conocidos de genética y biología molecular, tales como, v.gr., el libro de texto de Knippers ("Molekulare Genetik (Molecular Genetics", 6a edición, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 1995), el de Winnacker ("Gene und Klone" , VCH Verlagsgesellschaft , Weinheim, Alemania, 1990) o "el de Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) . Las mutaciones adecuadas en los genes se pueden incorporar en cepas adecuadas por reemplazo de genes o alelos . Un método común es el método descrito por Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 171: 4617-4622 (1989)), de reemplazo de gen con la ayuda de un derivado de pSClOl, pM$K705_ condicionalmente replicante. También se pueden usar otros métodos descritos en la técnica anterior, tales como, por ejemplo, el de Martínez-Morales et al. (Journal of Bacteriology 181: 7143-7148 (1999)) o el de Boyd et al. (Journal of Bacteriology 182: 842-847 .(,2000)). También es posible transferir mutaciones en los genes particulares o mutaciones que afectan la expresión de los genes particulares o marcos de lectura abierta en varias cepas por conjugación o transducción. Además de mejorar el gen malT puede ser ventajoso para la producción de L-aminoácidos, en particular L- treonina, eliminar reacciones colaterales indeseables (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", en: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, RU, 1982). Los microorganismos producidos de conformidad con la invención se pueden cultivar en el procedimiento intermitente (cultivo intermitente) , en el lote de alimentación (procedimiento de alimentación) , en el procedimiento intermitente de alimentación repetido (procedimiento de alimentación repetido) o en un procedimiento continuo (DE102004028859.3 o US5, 763 , 230) . Un resumen de métodos de cultivo conocidos se describe en el libro de texto de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991) ) o en el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/ Wiesbaden, 1994) ) . El medio de cultivo que se ha de usar debe satisfacer los requerimientos de las cepas particulares de una manera adecuada. Descripciones de medio de cultivo para varios microorganismos están contenidos en el manual "Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington D.C., EUA, 1981). Azúcares y carbohidratos tales como, v.gr., glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melaza, almidón y opcionalmente celulosa, aceites y grasas, tales como v.gr., aceite de soya, aceite de girasol, aceite de nuez molida y grasa de coco, ácidos grasos tales como v.gr., ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes tales como, v.gr., .glicerol y etanol, y ácidos orgánicos tales como v.gr., ácido acético, se pueden usar como la fuente de carbono . Estas sustancias se pueden usar individualmente o como una mezcla. Los compuestos que contienen nitrógeno orgánico, tales como peptonas, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, licor de infusión de maíz, harina de frijol de soya y urea, o compuestos inorgánicos tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio, se pueden usar como la fuente de nitrógeno. Las fuentes de nitrógeno se pueden usar individualmente o como una mezcla. El ácido fosfórico, fosfato diácido de potasio o fosfato ácido de dipotasio o las sales que contienen sodio correspondientes se pueden usar como la fuente de fósforo. El medio de cultivo además debe comprender sales de metales, tales como, v.gr., sulfato de magnesio o sulfato de hierro, que son necesarios para el crecimiento. Finalmente, las sustancias de crecimiento esenciales, tales como ' aminoácidos o vitaminas , se pueden utilizar además de las sustancias antes mencionadas . Los precursores adecuados pueden añadirse también al medio de cultivo. Las sustancias de partida mencionadas se pueden añadir al cultivo en forma de un lote individual, o se pueden alimentar durante el cultivo de una manera adecuada. La fermentación en general se lleva a cabo a un pH de 5.5 a 9._0, en particular 6.0 a 8.0. Compuestos básicos, tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoniaco o amoniaco acuoso, o compuestos ácidos, tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico, se pueden utilizar de una manera adecuada para controlar el pH del .cultivo. Antiespumas, tales como v.gr., esteres poliglicólicos de ácido graso, se pueden utilizar para controlar el desarrollo de la espuma. Sustancias adecuadas que tienen una acción selectiva, v.gr., antibióticos, se pueden añadir al medio para mantener la estabilidad de los plásmidos . Para mantener las ' condiciones aeróbicas, oxígeno o mezclas de gas que contienen oxígeno, tales como, v.gr., aire, se introducen en el cultivo. La temperatura del cultivo es usualmente de 25°C a 45°C, y preferiblemente de 30°C a 40°C. El cultivo se continúa hasta que se ha formado un máximo de L-aminoácidos o L-treonina. Este objetivo usualmente se alcanza dentro de 10 horas a 160 horas . El análisis de L-aminoácidos se puede llevar a cabo mediante cromatografía de intercambio de aniones con derivación de ninhidrina subsecuente, como se describe en Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30: 1190-1206 (1958)) o se puede llevar a cabo por HPLC de fase inversa como se describe en Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51: 1167- 1174 (1979) ) . El procedimiento de conformidad con la invención se usa para la preparación fermentativa de L-aminoácidos, tales como, por ejemplo, L-treonina, L-isoleucina, L-valina, L-metionina, L-homoserina, L-triptofano y L-lisina, en particular L-treonina. El siguiente microorganismo ha sido depositado en Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = Depósito Alemán de Microorganismos y Cultivos de Células, Braunschweig, Alemania) de conformidad con el Tratado de Budapest Treaty: • Escherichia coli cepa E. coli MG442 como DSM 16574. La presente invención se explica con más detalle a continuación con la ayuda de ejemplos de modalidad. Los medios mínimo (M9) y completo (LB) para Escherichia coli usados se describen en J.H. Miller (A Short Course in Bacterial Genetics (1992) , Cold Spring Harbor Laboratory Press) . El aislamiento del ADN de plásmido de Escherichia coli y todas las técnicas de restricción, ligación, tratamiento de Klenow y con fosfatasa alcalina se llevan a cabo por el método de Sambrook et al . (Molecular Cloning - A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press) . A menos que se describa de otra manera, la transformación de Escherichia coli se lleva a cabo por el método de Chung et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 86: 2172-2175 (1989) ) . La temperatura de incubación para la preparación de cepas y transformaciones es de 37°C.

Ejemplo 1 Construcción del plásmido de expresión pTrc99AmalT El gen malT de E. coli K12 es amplificado mediante el uso de reacción de cadena de polimerasa (PCR) y oligonucleótidos sintéticos. Al empezar a partir de la secuencia de nucleótidos del gen malT en E. coli K12 MG1655 (número de acceso AE000418, Blattner et al. (Science 277: 1453-1474 (1997)), se sintetizan iniciadores de PCR (MWG Biotech, Ebersberg, Alemania) . Los iniciadores contienen secuencias para enzimas de restricción que son marcados al subrayar la secuencia de nucleótidos mostrada a continuación. El iniciador malTl contiene el sitio de digestión por restricción para Xabl, el iniciador malT2 contiene el de HindIII . malT: 5 ' -CCTCATTCTAGACAGTGAAGTGATTAA-3 ' (SEQ ID No. 1) malT2 : 5' -GGCGCGTTATCAAGCTTAACTTACAC -3' (SEQ ID No. 2) El ADN de E. coli K12 MG1655 cromosómico para la PCR se aisla de conformidad con las instrucciones del fabricante con "Qiagen Genomic-tips 100/G" (QIAGEN, Hilden, Alemania) . Un fragmento de ADN de aproximadamente 2,755 pb de tamaño se puede amplificar con los iniciadores específicos bajo condiciones de PCR estándares (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) con Vent-AND polimerasa (New England BioLabs, Frankfurt, Alemania) (SEQ ID No. 3) . El fragmento malT amplificado es restringido con las enzimas de restricción HindIII y Xbal y después de la purificación (Purification Kit, QIAGEN, Hilden, Alemania) 'verificado en un gel de agarosa al 0.8%. El vector pTrc99A (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) es digerido con las enzimas HindIII y Xbal y la ligación se lleva a cabo con el fragmento malT restringido. La cepa TOP10 One Shot® de E. coli (TOPO TA Cloning Kit, Invitrogen, Groningen, Holanda) es transformado con el lote de ligación y las células portadoras de plásmido se seleccionan en agar LB, al cual se añade 50 µg/ml de ampicilina. La clonación exitosa se puede demostrar después de aislamiento de ADN de plásmido por digestión de control con las enzimas HindIII/Xbal y Pvul. El plásmido se denomina pTrc99AmalT (figura 1) .

Ejemplo 2 Preparación de L-treonina con la cepa MG442/pTrc99AmalT La cepa MG442 de E. coli- productora de L-treonina se describe en la especificación de patente US-A-4 , 278, 765 y es depositada como CMIM B-1628 en el Depósito Nacional Ruso para Microorganismos Industriales (VKPM, Moscow, Rusia) y como DSM 16574 en el Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = Depósito Alemán de Microorganismos y Cutlivos de Células, Braunschweig, Alemania) de conformidad con el Tratado de Budapest. La cepa MG442 es transformada con el plásmido de expresión pTrc99AmalT descrito en el ejemplo 1 y con el vector pTrc99A y las células portadores de plásmido se seleccionan sobre agar LB con 50 µg/ml de ampicilina. Las transformaciones exitosas se pueden demostrar después de aislamiento de ADN de plásmido por digestiones de control con las enzimas Hpal, HindIII/Xbal y EcoRV. Las cepas MG442/pTrc99AmalT y MG442/pTrc99A se forman de esta manera. Colonias individuales seleccionadas son después multiplicadas adicionalmente en medio mínimo con la siguiente composición: 3.5 g/1 de Na2HP04*2H20, 1.5 g/1 de KH2P04, 1 g/1 de NH4C1, 0.1 g/1 de MgS04*7H20, 2 g/1 de glucosa, 20 g/1 de agar, 50 mg/1 de ampicilina. La formación de L-treonina es verifica en cultivos de lotes de 10 ml contenidos en matraces cónicos de 100 ml. Para esto, 10 ml de medio de precultivo de la siguiente composición: 2 g/1 de extracto de levadura, 10 g/1 de (NH4)2S04, 1 g/1 de KH2P04, 0.5 g/1 de MgSO4*7H20, 15 g/1 de CaC03, 20 g/1 de glucosa, 50 mg/1 de ampicilina son inoculados y el lote es incubado durante 16 horas a 37°C y 180 rpm en una incubadora ESR de Kühner AG (Birsfelden, Suiza) . Porciones de 250 µl de este precultivo son transinoculadas en 10 ml de medio de producción (25 g/1 de (NH4)2S04, 2 g/1 de KH2P04, 1 g/1 de MgSO4*7H20, 0.03 g/1 de FeS04*7H20, 0.018 g/1 de MnS04*lH20, 30 g/1 de CaC03, 20 g/1 de glucosa, 50 mg/1 de ampicilina) y el lote es incubado durante 48 horas a 37°C. Para inducción completa de la expresión de gen malT, 100 mg/1 de ß-D-tiogalactopiranosido de isopropilo (IPTG) se añaden en lotes paralelos. La formación de L-treonina por la cepa de partida MG442 se investigan de la misma manera, pero sin que tenga lugar adición de ampicilina al medio. Después de la incubación se determina la densidad óptica (DO) de la suspensión de cultivo con un fotómetro LP2W de Dr. Lange (Dusseldorf, Alemania) a una longitud de onda de medición de 660 nm. La concentración de L-treonina formada se determina después en el sobrenadante de cultivo filtrado en forma estéril con un analizador de aminoácido de Eppendorf- BioTronik (Hamburg, Alemania) por cromatografía de intercambio de iones y- reacción de postcolumna con detección de ninhidrina. El resultado del experimento se muestra en la tabla 1.

Tabla 1 Breve Descripción de la Figura Figura 1: Mapa del plásmido pTrc99AmalT que contiene el gen malT Los datos de. longitud se deben entender como datos aproximados. Las abreviaturas y designaciones usadas tienen el siguiente significado: • Amp: gen de resistencia a la ampicilina • lacl : gen para la proteína represora del promotor tre • Ptrc : región de promotor tre, inducible por IPTG • malT : región codificadora para gen malT • 5S: región de ARNr 5S • rrnBT: región terminadora de ARNr Las abreviaturas para las enzimas de restricción tienen el siguiente significado. • EcoRV: endonucleasa de restricción de Escherichia coli B945 • HindIII: endonucleasa de restricción de Haemophilus influenzae Rc • Hpal : endonucleasa de restricción de Haemophilus parainfluenzae • Paul: endonucleasa de restricción de. Paracoccus alcaliphilus • Xbal: endonucleasa de restricción de Xanthomonas campestris . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (22)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Microorganismos recombinantes de la familia Enterobacteriaceae caracterizados porque contienen un gen malT mejorado o sobreexpresado, que codifica para activador transcripcional positivo del reguión de maltosa, y que producen L-aminoácidos, de una manera mejorada. 2. Los microorganismos de conformidad con la reivindicación 1, caracterizados porque un polinucleótido que codifica para un polipéptido del cual la secuencia de aminoácidos es idéntica al grado de por lo menos 90% a una secuencia de aminoácidos escogida del grupo que consiste de SEQ ID No. 4 y SEQ ID No . 6 es mejorado.
3. 3. Los microorganismos de conformidad con la reivindicación 2, caracterizados porque contienen un polinucleótido sobreexpresado o mejorado correspondiente al gen malT escogido del grupo que consiste de: a) polinucleótido con la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 3 o SEQ ID No. 5; b) polinucleótido con una secuencia de nucleótidos que corresponde a SEQ ID No . 3 o SEQ ID - No . 5 dentro del contexto de degeneración del código genético; c) secuencia de polinucleótidos con una secuencia que híbrida bajo condiciones astringentes con la secuencia complementaria a SEQ ID No. 3 o SEQ ID No. 5; d) polinucleótido con una secuencia SEQ ID No. 3 o SEQ ID No. 5 que contiene mutantes de sentido de función neutra .
4. 4. Los microorganismos de conformidad con la reivindicación 2, caracterizados porque el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica al grado de por lo menos 95% a una de las secuencias escogidas del grupo que consiste de SEQ ID No. 4 y SEQ ID No. 6.
5. 5. Los microorganismos de conformidad con la reivindicación 2, caracterizados porque el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que es 100% idéntica a la de SEQ ID No. 4 o SEQ ID No . 6.
6. 6. Los microorganismos de conformidad con las reivindicaciones 1 a 5, caracterizados porque se producen por transformación, transducción o conjugación, o una combinación de estos métodos, con un vector que contiene el gen malT, un alelo de este gen o partes del mismo y/o un promotor.
7. 7. Los microorganismos de conformidad con las reivindicaciones 1 a 6, caracterizados porque el número de copias del gen malT o de los alelos es por lo menos por 1.
8. 8. Los microorganismos de conformidad con la reivindicación 7, caracterizados porque el incremento en el número de copias del gen malT por lo menos por 1 es efectuado por la integración del ORF o los alelos en el cromosoma de los microorganismos .
9. 9. Los microorganismos de conformidad con la reivindicación 7, caracterizados porque el incremento en el número de copias del gen malT por lo menos por 1 es logrado por un vector que se replica extracromosómicamente .
10. 10. Los microorganismos de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizados porque, para lograr la mejora, a) el promotor y región de regulación o el sitio de unión a ribosoma hacia el extremo 5' del gen malT es mutado, o b) los cassettes de expresión o promotores son incorporados hacia el extremo 5' del gen malT.
11. 11. Los microorganismos de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizados porque el gen malT está bajo el control de un promotor que mejora la expresión del gen.
12. 12. Los microorganismos de conformidad con las reivindicaciones 1 a 11, caracterizados porque la concentración o actividad del producto de gen malT (proteína) se incrementa por lo menos en 10%, con base en la actividad o concentración del producto de gen en el microorganismo o cepa progenitora que no es recombinante para el gen malT, por la mejora del gen malT.
13. 13. Los microorganismos de conformidad con las reivindicaciones 1 a 12, caracterizados porque los microorganismos se escogen de los géneros Escherichia, Erwinia, Providencia y Serratia .
14. 14. Los microorganismos de conformidad con la reivindicación 13 , caracterizados porque además los genes de la vía de biosíntesis de los L-aminoácidos son adicionalmente mejorados, en particular sobreexpresados.
15. 15. Los microorganismos de conformidad con las reivindicaciones 1 a 14 , caracterizados porque producen L-treonina.
16. 16. Un procedimiento para la preparación de L-aminoácidos por fermentación de microorganismos recombinantes de la familia Enterobacteriaceae, caracterizado porque a) los microorganismos que producen el L-aminoácido deseado y en los cuales el gen malT o secuencias de nucleótidos o alelos que codifican para el producto de gen del mismo son mejorados, en particular sobreexpresados, se cultivan en un medio bajo condiciones bajo las cuales el L-aminoácido deseado es concentrado en el medio o en las células, y b) el L-aminoácido deseado es aislado, constituyentes del caldo de fermentación y/o la biomasa en su totalidad o porciones (> 0 a 100%) de la misma que permanecen en el producto que ha sido asilado o que es completamente removido .
17. 17. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque se utilizan los microorganismos de conformidad con las reivindicaciones 1 a 15. 18. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 16 ó 17, caracterizado porque para la preparación de L-treonina, microorganismos de la familia Enterobacteriaceae en los cuales adicionalmente al mismo tiempo uno o más de los genes escogidos del grupo que consiste de: 18.1 por lo menos un gen del operón thrABC que codifica para aspartato cinasa, homoserina deshidrogenasa, homoserina cinasa y treonina sintasa, 18.2 el gen pyc de Corynebacterium glutamicum que codifica para piruvato carboxilasa, 18.3 el gen pps que codifica para fosfoenol piruvato sintasa, 18.4 el gen ppc que codifica para fosfoenol piruvato carboxilasa, 18.5 los genes pntA y pntB que codifican para subunidades de piridina transhidrogenasa, 18.6 el gen rhtB que codifica para la proteína que imparte resistencia a homoserina, 18.7 el gen rhtC que codifica para la proteína que imparte resistencia a treonina, 18.8 el gen thrE de Corynebacterium que codifica para la proteína portadora de exportación de treonina, 18.9 el gen gdhA que codifica para glutamato deshidrogenasa, 18.10 el gen pgm que codifica para fosfoglucomutasa, 18.11 el gen fba que codifica para bifosfato de fructosa aldolasa, 18.12 el gen ptsH que codifica para la proteína de fosfohistidina hexosa fosfotransferasa, 18.13 el gen ptsl que codifica para enzima I del sistema de fosfotransferasa, 18.14 el gen crr que codifica para el componente de IIA específico de glucosa, 18.15 el gen ptsG que codifica para el componente IIBC específico de glucosa, 18.16 el gen lrp que codifica para el regulador del reguión de leucina, 18.17 el gen fadR que codifica para el regulador del reguión fad, 18.18 el gen iclR que codifica para el regulador del metabolismo de intermediario central, 18.19 el gen ahpC que codifica para la subunidad pequeña de alquil hidroperóxido reductasa, 18.20 el gen ahpF que codifica para la subunidad grande de alquil hidroperóxido reductasa, 18.21 el_. gen cysK que codifica para cisteína sintasa A, 18.22 el gen cysB que codifica para el regulador del reguión cys, 18.23 el gen cysJ que codifica para la flavoproteína de NADPH sulfito reductasa, 18.24 el gen cysl que codifica para la hemoproteína de NADPH sulfito reductasa, 18.25 el gen cysH que codifica para la adenilil sulfato reductasa, 18.26 el gen rseA que codifica para una proteína de membrana con actividad anti-sigmaE, 18.27 el gen rseC que codifica para un regulador global del factor sigmaE, 18.28 el gen sucA que codifica para la subunidad descarboxilasa de 2-cetoglutarato deshidrogenasa, 18.29 el gen sucB que codifica para la subunidad de dihidrolipolitranssuccinasa E2 de 2-cetoglutarato deshidrogenasa, 18.30 el gen sucC que codifica para la subunidad ß de succinil-CoA sintetasa,
18. 18.31 el gen sucD que codifica para la subunidad a de succinil-CoA sintetasa, 18.32 el gen aceE que codifica para el componente El del complejo piruvato deshidrogenasa, 18.33 el gen aceF que codifica" para el componente
19. E2 del complejo piruvato deshidrogenasa, 18.34 el gen rseB que codifica para el regulador de actividad de factor sigmaE, 18.35 el producto de gen del -marco de lectura abierto (ORF) yodA de Escherichia coli , y 18.36 el producto de gen del marco de lectura abierto (ORF) yaaU de Escherichia coli , es o son mejorados, en particular sobreexpresados, son fermentados. 19. El procedimiento de conformidad con las reivindicaciones 16 a 18, caracterizado porque se utilizan los microorganismos en los cuales las vías metabólicas que reducen la formación del L-aminoácido deseado son por lo menos parcialmente atenuadas . 20. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque para la preparación de L-tronina, los microorganismos de la familia Enterobacteriaceae en los cuales adicionalmente al mismo tiempo uno o más de los genes escogidos del grupo que consiste de:
20. 20.1 el gen tdh que codifica para treonina deshidrogenasa, 20.2 el gen mdh que codifica para malato deshidrogenasa, 20.3 el producto de gen del marco de lectura abierto (orf) yjfA de Escherichia coli , 20.4 el producto de gen del marco de lectura abierto (orf) ytFp de Escherichia' coli , 20.5 el gen . pckA que codifica para la enzima fosfoenol -piruvato carboxicinasa, 20.6 el gen poxB que codifica para piruvato oxidasa, 20.7 el gen dgsA que codifica para el regulador DgsA del sistema de fosfotransferasa, 20.8 el gen fruR que codifica para el represor de fructosa, 20.9 el. gen rpoS que codifica para el factor sigma38 y 20.10 el gen aspA que codifica para aspartato-amonio liasa es o son atenuados, en particular eliminados o reducidos en expresión, son fermentados
21. 21. El procedimiento de conformidad con las reivindicaciones 16 a 20, caracterizado porque se preparan L-aminoácidos escogidos del grupo que consiste de L-asparagina, L-serina, L-glutamato, L-glicina, L-alanina, L-cisteína, L-valina, L-metionina, L-prolina, L-isoleucina, L-leucina, L-tirosina, L-fenilalanina, L-histidina, L-lisina, L-triptofano, L-arginina y L-homoserina.
22. 22. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque se preparan los L-aminoácidos escogidos del grupo que consiste de L-isoleucina, L- alina, L-metionina, L-homoserina, L-triptofano y L-lisina.