CN108866089A - 提升大肠杆菌角鲨烯含量用质粒pCDAF及其制备和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提升大肠杆菌中角鲨烯含量的方法，具体通过增生大肠杆菌的内膜进行，本发明还公开了一种质粒pCDAF，通过大量表达ATP合酶b亚基基因atpF促使大肠杆菌内膜增生，本发明还公开了该质粒pCDAF的制备和使用方法。本发明的技术方案，通过表达ATP合酶b亚基基因atpF促使细胞内膜增生使角鲨烯及其合成前体物的储存空间增加，最终提高角鲨烯的积累量，通过质粒pCDAF用于促使大肠杆菌中内膜的增生，含有链霉素抗性基因作为筛选标记，以强启动子PT7控制ATP合酶b亚基基因atpF的表达以提高其表达量。

Description

提升大肠杆菌角鲨烯含量用质粒pCDAF及其制备和使用方法

技术领域

本发明属于生物基因工程领域，特别是涉及一种提升大肠杆菌角鲨烯含量的方法，还涉及一种提升大肠杆菌角鲨烯含量用质粒pCDAF，还涉及一种该pCDAF的制备方法，还涉及一种该质粒pCDAF的使用方法。

背景技术

角鲨烯是一种天然存在于多种微生物及动植物细胞内的三萜烯类化合物，具有抗氧化，保护心脏，提高免疫力，降低血脂及抑制癌症发展等多种功效，已被广泛应用于医药及保健品领域。当前，市面上的角鲨烯主要来源于植物种子及动物肝脏的提取，因此价格比较昂贵，另外通过提取的方法获得还具有周期长、成本高、破坏环境等缺点，因此，亟需新的更环保、更廉价的生产方式。

微生物发酵生产活性化合物具有廉价、快速、环保等优点。近年来，诸多研究致力于利用酵母、微藻及沼泽红假单胞菌等微生物进行角鲨烯的发酵生产，但均未实现突破，其产量与工业化生产要求尚有较大差距。究其原因，角鲨烯含量低或发酵密度低等因素限制了角鲨烯的最终产量。

大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)作为模式菌，具有研究透彻、易改造、易培养等特点，是发酵生产活性化合物的理想菌之一。目前，通过大肠杆菌已经生产出青蒿素、类胡萝卜素等多种活性物质。然而，大肠杆菌由于缺乏角鲨烯合酶，不能天然合成角鲨烯。前期申请人通过引入外源角鲨烯合酶成功构建大肠杆菌E.coli CSQ1使其能够合成角鲨烯，然而大肠杆菌E.coli CSQ1中角鲨烯的含量较低，离工业化生产要求尚有较大差距。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种提升大肠杆菌中角鲨烯含量的方法，通过大肠杆菌内膜增生来提高角鲨烯及其合成前体物的贮存空间，以此提高细胞内角鲨烯的积累量。

本发明的第二个目的是提供一种质粒pCDAF，通过大量表达ATP合酶b亚基基因atpF促使大肠杆菌内膜增生。

本发明的第三个目的是提供一种该质粒pCDAF的制备方法，用于制备质粒pCDAF。

本发明的第四个目的是提供一种利用pCDAF提高大肠杆菌中角鲨烯含量的方法，用以实现如何使用该质粒pCDAF促使大肠杆菌合成角鲨烯。

为了达到上述第一个目的，本发明所采用的第一种技术方案是，一种提升大肠杆菌中角鲨烯含量的方法，通过增生大肠杆菌的内膜进行；所述大肠杆菌为可合成角鲨烯的大肠杆菌E.coli CSQ1，所述大肠杆菌E.coli CSQ1是先通过将野生菌株E.coli C43(DE3)制备成氯化钙感受态细胞后，再通过热击法转化质粒pTsqs，最后利用氨苄青霉素抗性筛选和菌落PCR验证获得的，所述质粒pTsqs的核苷酸序列表如序列1所示。

为了达到上述第二个目的，本发明所采用的第二个技术方案是，一种质粒pCDAF，用于增生权利要求1所述大肠杆菌的内膜，包括载体pCDFDuet-1，载体pCDFDuet-1内插入有阻碍蛋白表达基因lacI、大肠杆菌复制起始位点CDF ori、链霉素抗性基因和ATP合酶b亚基基因atpF，ATP合酶b亚基基因atpF上游具有PT7启动子以启动ATP合酶b亚基基因atpF的表达；所述质粒pCDAF的核苷酸序列如序列2所示。

为了达到上述第三个目的，本发明所采用的第三种技术方案是，一种质粒pCDAF的制备方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1，先依据大肠杆菌E.coli CSQ1的基因atpF设计一对引物，之后以基因组为模板通过菌落PCR获得上下游分别含有NdeI与KpnI酶切位点的基因atpF，基因atpF的核苷酸序列表如序列3所示；

步骤2，先后通过酶切和连接方法将将步骤1得到的基因atpF插入载体pCDFDuet-1的NdeI与KpnI酶切位点之间，构建得到质粒pCDAF；

步骤3，利用菌落PCR与双酶切方法对质粒pCDAF进行验证。

本发明的第三种技术方案，还具有以下特点：

在所述步骤1中，所述一对引物如下：

atpF_F_NdeI：5’-GGAATTCCATATGGTGAATCTTAACGCAACAATC-3’

atpF_R_KpnI：5’-CGGGTACCTTACAGTTCAGCGACAAGTT-3’

以基因组为模板，采用atpF_F_NdeI与atpF_F_KpnI引物扩增atpF基因即为上下游分别含有NdeI与KpnI酶切位点的基因atpF。

在所述步骤2中，采用NcoI与EcoRI两种限制性内切酶分别对基因atpFF和载体pCDFDuet-1分别进行双酶切，然后利用T4链接酶将两者进行连接，最终得到质粒pCDAF。

为了达到上述第四个目的，本发明所采用的第四个技术方案是，一种利用质粒pCDAF提高大肠杆菌中角鲨烯含量的方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1，先将大肠杆菌E.coli CSQ1制备成氯化钙感受态细胞，然后通过热击法转化质粒pCDAF，最后利用氨苄青霉素抗性筛选和菌落PCR验证获得重组菌E.coli CSAF1；

步骤2，验证重组菌E.coli CSAF1中内膜增生；

步骤3，验证重组菌E.coli CSAF1中角鲨烯的合成。

本发明的第四种技术方案，还具有以下特点：

在步骤2的验证具体为：先采用LB液体培养基培养步骤1得到的重组菌E.coliCSAF1，并加入诱导剂IPTG诱导基因atpF表达，之后离心收集菌体，冷冻干燥过夜，最后通过电子扫面显微镜观察细胞内膜变化。

在步骤3的验证具体为：先通过皂化法分离、提取合成的角鲨烯；再通过高效液相色谱法检测该角鲨烯。

本发明的有益效果是：

(1)本发明提升大肠杆菌中角鲨烯含量的方法，通过表达ATP合酶b亚基基因atpF促使细胞内膜增生使角鲨烯及其合成前体物的储存空间增加，最终提高角鲨烯的积累量。

(2)通过本发明技术方案得到的质粒pCDAF用于促使大肠杆菌中内膜的增生，含有链霉素抗性基因作为筛选标记，以强启动子PT7控制ATP合酶b亚基基因atpF的表达以提高其表达量。

(3)本发明技术方案得到的质粒pCDAF为大肠杆菌发酵生产角鲨烯提供了有效的载体工具。

附图说明

图1是本发明所涉及的质粒pCDAF的构建原理图；

图2是本发明所涉及的质粒pCDAF及其验证示意图

图3是本发明所涉及的质粒pCDAF中ATP合酶b亚基基因atpF的PCR扩增回收凝胶电泳图；

图4是本发明所涉及的质粒pCDAF的菌落PCR验证与双酶切验证凝胶电泳图；

图5是重组菌E.coli CSAF1中内膜增生图；

图6是本发明所涉及的标准品、大肠杆菌E.coli CSQ1以及重组菌E.coliCSSP1合成的角鲨烯的验证高效液相色谱图。

具体实施方式

以下结合附图说明和具体实施例对本发明的技术方案作进一步地详细说明。

实施例1

一种提升大肠杆菌中角鲨烯含量的方法，通过增生大肠杆菌的内膜进行；所述大肠杆菌为可合成角鲨烯的大肠杆菌E.coli CSQ1，所述大肠杆菌E.coli CSQ1是先通过将野生菌株E.coli C43(DE3)制备成氯化钙感受态细胞后，再通过热击法转化质粒pTsqs，最后利用氨苄青霉素抗性筛选和菌落PCR验证获得的，所述质粒pTsqs的核苷酸序列表如序列1所示。

实施例2

一种质粒pCDAF，用于权利要求1所述大肠杆菌的内膜增生包括载体pCDFDuet-1，载体pCDFDuet-1内插入有阻碍蛋白表达基因lacI、大肠杆菌复制起始位点CDF ori、链霉素抗性基因和ATP合酶b亚基基因atpF，ATP合酶b亚基基因atpF上游具有PT7启动子以启动ATP合酶b亚基基因atpF的表达；所述质粒pCDAF的核苷酸序列如序列2所示。

步骤3，利用菌落PCR与双酶切方法对质粒pTsqs进行验证。

实施例3

一种质粒pCDAF的制备方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1，先依据大肠杆菌E.coli CSQ1的基因atpF设计一对引物，之后以基因组为模板通过菌落PCR获得上下游分别含有NdeI与KpnI酶切位点的基因atpF，基因atpF的核苷酸序列表如序列3所示；

所述一对引物如下：

atpF_F_NdeI：5’-GGAATTCCATATGGTGAATCTTAACGCAACAATC-3’

atpF_R_KpnI：5’-CGGGTACCTTACAGTTCAGCGACAAGTT-3’

以基因组为模板，采用atpF_F_NdeI与atpF_R_KpnI引物扩增atpF基因即为上下游分别含有NdeI与KpnI酶切位点的基因atpF；

步骤2，先后通过酶切和连接方法将将步骤1得到的基因atpF插入载体pCDFDuet-1的NdeI与KpnI酶切位点之间，构建得到质粒pCDAF；

采用NcoI与EcoRI两种限制性内切酶分别对基因atpF和载体pCDFDuet-1分别进行双酶切，然后利用T4链接酶将两者进行连接，最终得到质粒pCDAF；

步骤3，利用菌落PCR与双酶切方法对质粒pCDAF进行验证。

实施例4

一种质粒pCDAF提高大肠杆菌中角鲨烯含量的方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1，先将大肠杆菌E.coli CSQ1制备成氯化钙感受态细胞，然后通过热击法转化质粒pCDAF，最后利用氨苄青霉素抗性筛选和菌落PCR验证获得重组菌E.coli CSAF1；

步骤2，验证重组菌E.coli CSAF1中内膜增生，具体为：

先采用LB液体培养基培养步骤1得到的重组菌E.coli CSAF1，并加入诱导剂IPTG诱导基因atpF表达，之后离心收集菌体，冷冻干燥过夜，最后通过电子扫面显微镜观察细胞内膜变化；

步骤3，验证重组菌E.coli CSAF1中角鲨烯的合成，具体为：先通过皂化法分离、提取合成的角鲨烯；再通过高效液相色谱法检测该角鲨烯。

其中，E.coli CSQ1为在野生型E.coli C43(DE3)基础上转入质粒pTsqs构建而来，野生菌株E.coli C43(DE3)的DNA序列为GenBank号，具体为CP011938.1的序列(BCT 17-DEC-2015)；E.coli CSQ1菌株在西安医学院分子病毒与病毒免疫学实验室保藏，载体pTrc99A购自Nonagon公司。质粒pTsqs包括载体pTrc99A，载体pTrc99A内插入有阻碍蛋白表达基因lacIq、复制起始位点pBR_322 ori、氨苄青霉素抗性基因和角鲨烯合酶基因ERG9，角鲨烯合酶基因ERG9的上游有启动子Ptrc，角鲨烯合酶基因ERG9的基因下游包含1个多克隆位点(Multiple cloning site,MCS)，质粒pTsqs的核苷酸序列如序列1所示，角鲨烯合酶基因ERG9的核苷酸序列如序列4所示。

主要试剂和材料：限制性内切酶(NdeI与KpnI)、T4连接酶、ExTaq聚合酶、DH5α感受态细胞以及250bp DNA Marker等均购自Takara公司，质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自天根生物科技有限公司，无水Na₂SO₄、色谱级甲醇、己烷及二氯甲烷等化学试剂均购自海默生物科技有限公司，角鲨烯标准品购自Sigma公司。

质粒pCDAF的构建：先设计合成两对引物，并以E.coli CSQ1基因组为模板扩增基因atpF，通过凝胶电泳及切胶回收获取含有酶切位点的基因atpF片段，然后，同时对载体pCDFDuet-1与基因atpF片段进行双酶切处理并回收，之后进一步通过连接反应将基因atpF插入载体pCDFDuet-1，形成质粒pCDAF并转入大肠杆菌DH5α中利用链霉素抗性筛选，最后经过菌落PCR与双酶切验证得到重组质粒pCDAF质粒，构建过程如图1所示。具体按照以下步骤进行：

步骤1.引物的设计与合成：

根据E.coli CSQ1菌株基因组中基因atpF序列设计并合成如下两对引物：

atpF_F_NdeI：5’-GGAATTCCATATGGTGAATCTTAACGCAACAATC-3’(下划线之前部分为保护碱基，下划线部分为NdeI酶切位点识别序列，其后序列为GenBank：CP011938.1的第3788278-3788298位,对应序列2的1-21位)。

atpF_R_KpnI：5’-CGGGTACCTTACAGTTCAGCGACAAGTT-3’(下划线之前部分为保护碱基，下划线部分为KpnI酶切位点识别序列，其后序列为GenBank：CP011938.1的第3788729-3788748位，对应序列2的452-471位反相互补序列)。

步骤2.基因atpF插入质粒pCDFD：

(1)依照基因组提取试剂盒对出发菌株基因组(大肠杆菌E.coli CSQ1的基因atpF)进行提取；

(2)以基因组为模板，采用atpF_F_NdeI与atpF_R_KpnI引物扩增atpF基因；

PCR反应体系：2×GC Buffer，25μl；dNTP，4μl；PrimerSTAR，1μl；atpF_F_NdeI(10μM)，1μl；atpF_R_KpnI(10μM)，1μl；基因组，1μl；ddH₂O，17μl。

PCR反应条件为：先在98℃下进行3min保温；再依次循环32次以下过程：98℃下保温10s，68℃下保温1min；之后72℃下保温5min；最后保持4℃的反应条件。

PCR结果：PCR产物上样电泳，基因atpF片段为492bp，采用胶回收试剂盒切胶回收目的条带，PCR结果如图3所示。

(3)atpF基因片段及载体pCDFDuet-1的双酶切；

采用限制向内切酶NdeI与KpnI对atpF基因片段及载体pCDFDuet-1分别进行双酶切；

酶切反应体系为：10×QC Buffer，10μl；NdeI，2μl；KpnI，2μl；atpF或pCDFDuet-1，20或40μl；ddH₂O，66或46μl；总体积为100μl。

酶切反应条件为：37℃水浴条件下，基因atpF放置16h，载体pCDFDuet-1放置8h；

实验结果为：酶切反应液进行凝胶电泳后，基因atpF酶切后获得一条477bp条带，载体pCDFDuet-1酶切后获得一条3737bp的条带。

依照凝胶回收试剂盒操作说明对基因atpF与载体pCDFDuet-1片段进行回收并通过酶标仪对浓度进行测定，并放入-20℃冰箱保存备用。

(4)采用T4连接酶将基因atpF与载体pCDFDuet-1进行连接；

连接反应体系：10×T4Buffer，2μl；T4Ligase，1μl；基因atpF，7μl；载体pCDFDuet-1，1.5μl；ddH₂O，8.5μl。

反应条件为：与16℃下温育12h；

反应完成后将得到的连接产物通过热击法转入大肠杆菌DH5α，并涂布于含30mg/l卡那霉素的LB固体平板上筛选单克隆；

(5)将连接产物(质粒pCDAF)转入大肠杆菌DH5α：

①取10μl连接反应液加入至100μl DH5α感受态细胞中轻轻混匀，于冰上放置30min，得到混合液A；

②将混合液A放入42℃水浴热击90s，冰上放置3min；

③往混合液A中加入700μl LB液体培养基，于37℃培养箱放置50min；

④对混合液进行5min的6000g离心，收集菌体，吸出650μl上清液，将沉淀与剩余的上清液混合均匀后涂布于含50mg/链霉素的LB固体培养基上；

步骤3，质粒pCDAF的筛选与验证：于LB固体培养基上挑取阳性单克隆，利用设计的验证引物Check_pCDAF_up和Check_pCDAF_down进行菌落PCR验证，含有质粒pCDAF的单克隆将获得一条954bp的扩增条带，即为目标条带。随后将获得目标条带的单克隆接种于含链霉素的LB液体培养基，于37℃下培养16h后提取质粒。最后对提取的质粒进行双酶切验证并将正确的质粒送往生物公司测序，验证原理如图2所示。具体操作为：

(1)验证引物的设计与合成：

根据质粒pCDAF上的NdeI与KpnI酶切位点两端序列设计并合成一对验证引物如下：

Check_pCDAF_up：5’-GGATCTCGACGCTCTCCCTT-3’(该序列对应序列1的第41-60位)

Check_pCDAF_down：5’-ATGCTAGTTATTGCTCAGCGGT-3’(该序列为序列1的第547-568位的反向互补序列)；

(2)菌落PCR验证：

PCR反应体系：ExTaq Mix，25μl；Check_pCDAF_up(10μM)，1μl；Check_pCDAF_down(10μM)，1μl；ddH₂O，23μl；反应体系总体积为50μl，采用20μl枪头挑取单克隆混入反应液中；

PCR反应条件：先在98℃下进行3min保温；再依次循环32次以下过程：98℃下保温10s，62℃下保温30s，72℃下保温1min，72℃下保温5min；最后保持4℃的反应条件；

PCR结果：PCR反应液进行凝胶电泳后获得一条954bp的条带，结果如图4所示；

(3)将获得的目标条带的单克隆接种于含有50mg/l链霉素的LB液体培养基中，于37℃培养16h；

(4)取上述培养菌液3ml并提取质粒；

(5)双酶切验证重组质粒pCDAF：

酶切反应体系为：10×QC Buffer，10μl；NdeI，2μl；KpnI，2μl；质粒pCDAF，20μl；ddH₂O，66μl；总体积为100μl；

酶切反应条件为：于37℃水浴锅放置2h；

实验结果为：酶切反应液进行凝胶电泳后分别获得一条477bp(基因atpF)和一条3730bp(载体pCDFDuet-1)的条带，证明基因atpF被成功插入载体pCDFDuet-1，表明质粒pCDAF构建成功，双酶切结果如图4所示。

重组菌E.coli CSAF1的构建及内膜增生验证：首先将质粒pCDAF载体转入大肠杆菌E.coli CSQ1中形成重组菌E.coli CSAF1，然后将重组菌E.coli CSAF1接种到液体培养基中进行培养，当OD₆₀₀为0.3时加入IPTG诱导基因atpF的表达，最后离心收集菌体，冷冻干燥过夜，并利用电子扫描显微镜观察内膜变化。具体实施步骤如下：

步骤1，重组菌E.coli CSAF1的构建：

(1)大肠杆菌E.coli CSQ1感受态细胞的制备：

①野生菌株E.coli C43(DE3)感受态细胞的制备：先将野生菌株E.coli C43(DE3)接种于10ml LB培养液中，于37℃下振荡培养3h使菌体的密度达到OD₆₀₀＝0.4，得到溶液A；之后将溶液A冰浴10min，之后进行5min的4000g离心，最后收集菌体；然后将收集的菌体重悬于10ml的CaCl₂(50mmol/L)溶液中，冰浴10min，再次进行5min的4000g离心，收集菌体；最后将收集的菌体再次重悬于2ml预冷的CaCl₂溶液(50mmol/L)中，使菌液浓缩，继续冰浴15min，使菌体受敏成感受态细胞，得到野生菌株E.coli C43(DE3)感受态细胞。

②质粒pTsqs转入野生菌株E.coli C43(DE3)感受态细胞中：先取1μl质粒pTsqs加入至100μl野生型菌株E.coli C43(DE3)感受态细胞中轻轻混匀，冰上放置30min，得到混合液B；之后将混合液B在42℃下进行90s的水浴热击，并将其放置于冰上3min，然后往混合液B中加入700μl LB液体培养基得到混合液C，并于37℃培养箱放置50min，最后对混合液C进行5min的6000g离心，收集菌体，吸出650μl的上清液，将沉淀与剩余的上清液混合均匀后涂布于含50mg/l氨苄青霉素的LB固体培养基上，筛选获得重组菌E.coli CSQ1。

③先将重组菌E.coli CSQ1接种于10ml LB培养液中，于37℃下振荡培养3h使菌体密度达到OD₆₀₀＝0.4，得到溶液D，之后将溶液D冰浴10min，之后进行5min的4000g离心，最后收集菌体；然后将收集的菌体重悬于10ml的CaCl₂(50mmol/L)溶液中，冰浴10min，再次进行5min的4000g离心，再次收集菌体；最后将收集的菌体再次重悬于2ml预冷的CaCl₂溶液(50mmol/L)中，使菌液浓缩，继续冰浴15min，使菌体受敏成感受态细胞，得到重组菌E.coliCSQ1感受态细胞。

(2)质粒pCDAF转入大肠杆菌E.coli CSQ1：

①取1μl质粒pCDAF加入至100μl E.coli CSQ1感受态细胞中轻轻混匀，并于冰上放置30min，得到混合液E；

②将混合液放入42℃水浴热击90s，并于冰上放置3min；

③往混合液中加入700μl LB液体培养基得到混合液F，于37℃培养箱放置50min；

④对混合液F进行5min的6000g离心后收集菌体，吸出650μl上清液，将沉淀与剩余的上清液混合均匀后涂布于含50mg/l链霉素与50mg/l氨苄青霉素的LB固体培养基上，筛选获得重组菌E.coli CSAF1；

步骤2，重组菌.E.coli CSAF1细胞内膜增生验证：

(1)将重组菌E.coli CSAF1接种至含50mg/l链霉素与50mg/l氨苄青霉素的LB液体培养基将大肠杆菌E.coli CSQ1接种于含50mg/l氨苄青霉素的LB液体培养基，于37℃培养3h至OD₆₀₀＝0.4，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导蛋白的表达；

(2)取10ml菌液，进行12000g离心后收集菌体，并放入离心管中，于冷冻干燥机中过夜；

(3)采用H-600型电子显微镜查看重组菌E.coli CSAF1与大肠杆菌E.coli CSQ1两种菌的细胞内膜，加速电压为75kv，放大倍数为120000倍。

结果显示，重组菌E.coli CSAF1细胞的内膜发生增生(图5中A)，而大肠杆菌E.coli CSQ1细胞未发生内膜增生(图5B)，此结果证明在重组菌E.coli CSAF1中过量表ATP合酶b亚基基因atpF使内膜发生增生。

内膜增生对角鲨烯含量影响验证：

(1)大肠杆菌E.coli CSQ1及重组菌E.coli CSAF1中角鲨烯的提取：

对诱导培养后的重组菌E.coli CSAF1与大肠杆菌E.coli CSQ1做同样的提取处理，以大肠杆菌E.coli CSQ1为对照验证重组菌E.coli CSAF1角鲨烯的合成，方法如下：

①取20ml相同浓度的菌液，进行5min的12000g离心，倒掉上清液，加入20ml ddH₂O重悬菌体，再次离心并倒掉上清液，重复2次，得到菌泥；

②将收集的菌泥放入离心管中，冷冻干燥过夜；

③往离心管中加入5ml 60％氢氧化钾/水溶液(w/v)，7.5ml甲醇，7.5ml 0.5％焦性没食子酸/甲醇溶液(w/v)，最后放入45℃摇床150rpm温育10h；

④往离心管中加入10ml己烷并震荡5min，用分液漏斗分离收集上层己烷，重复三次，将所有己烷收集到同一个新的离心管中；

⑤往己烷中加入5g无水Na₂SO₄，在通风橱中于40℃蒸干己烷，得到固体粗提物；

(3)HPLC法分析角鲨烯合成：

①将上述固体粗提物溶解于1ml甲醇/二氯己烷(9:1，v/v)中；

②采0.22μm孔径的有机系无菌滤膜过滤甲醇/二氯己烷溶液；

③通过HPLC法对标准品、大肠杆菌E.coli CSQ1的提取物及重组菌重组菌E.coliCSAF1的提取物分别进行检测分析，检测条件：柱体为C₁₈，柱温为40℃，样品注入体积为10μl，流动相为甲醇/水溶液(9:1，v/v)，流速为1.0ml/min；

④将标准品、大肠杆菌E.coli CSQ1的提取物及重组菌重组菌E.coliCSAF1的提取物的检测结果进行对比分析，结果如图6所示。

结果显示，由标准品的分析证明了角鲨烯的出峰时间约为27.2min(图6A)。同样干重的细胞条件下，大肠杆菌E.coli CSQ1与重组菌E.coli CSAF1的提取物在27.2min附近均出现一个吸收峰，但是大肠杆菌E.coli CSQ1的吸收峰(图6B)明显低于重组菌E.coliCSAF1的吸收峰(图6C)。换算结果显示，出大肠杆菌E.coli CSQ1中角鲨烯含量为0.74mg/g(细胞干重，DCW)而重组菌E.coli CSAF1中角鲨烯的含量为1.36mg/g DCW。结果证明，重组菌E.coli CSAF1中内膜增生使角鲨烯及其合成前体物的储存空间增大，进一步导致角鲨烯含量提高了83％。

序列表

<110> 西安医学院

<120> 提升大肠杆菌角鲨烯含量用质粒pCDAF及其制备和使用方法

<130> 2018

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5502

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

gtttgacagc ttatcatcga ctgcacggtg caccaatgct tctggcgtca ggcagccatc 60

ggaagctgtg gtatggctgt gcaggtcgta aatcactgca taattcgtgt cgctcaaggc 120

gcactcccgt tctggataat gttttttgcg ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc 180

tgaaatgagc tgttgacaat taatcatccg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga 240

taacaatttc acacaggaaa cagaccatgg atgggcggta aactgctgca gctggctctg 300

cacccggttg aaatgaaagc tgctctgaaa ctgaaattct gccgtacccc gctgttctct 360

atctacgacc agtctacctc tccgtacctg ctgcactgct tcgaactgct gaacctgacc 420

tctcgttctt tcgctgctgt tatccgtgaa ctgcacccgg aactgcgtaa ctgcgttacc 480

ctgttctacc tgatcctgcg tgctctggac accatcgaag acgacatgtc tatcgaacac 540

gacctgaaaa tcgacctgct gcgtcacttc cacgaaaaac tgctgctgac caaatggtct 600

ttcgacggta acgctccgga cgttaaagac cgtgctgttc tgaccgactt cgaatctatc 660

ctgatcgaat ttcacaaact gaaaccggaa taccaggaag ttatcaaaga aatcaccgaa 720

aaaatgggta acggtatggc tgactacatc ctggacgaaa actacaacct gaacggtctg 780

cagaccgttc acgactacga cgtttactgc cactacgttg ctggtctggt tggtgacggt 840

ctgacccgtc tgatcgttat cgctaaattc gctaacgaat ctctgtactc taacgaacag 900

ctgtacgaat ctatgggtct gttcctgcag aaaaccaaca tcatccgtga ctacaacgaa 960

gacctggttg acggtcgttc tttctggccg aaagaaatct ggtctcagta cgctccgcag 1020

ctgaaagact tcatgaaacc ggaaaacgaa cagctgggtc tggactgcat caaccacctg 1080

gttctgaacg ctctgtctca cgttatcgac gttctgacct acctggctgg tatccacgaa 1140

cagtctacct tccagttctg cgctatcccg caggttatgg ctatcgctac cctggttctg 1200

gttttcaaca accgtgaagt tctgcacggt aacgttaaaa tccgtaaagg tactacctgc 1260

tacctgatcc tgaaatctcg taccctgcgt ggttgcgttg aaatcttcga ctactacctg 1320

cgtgacatca aatctaaact ggctgttcag gacccgaact tcctgaaact gaacatccag 1380

atctctaaaa tcgaacagtt catggaagaa atgtaccagg acaaactgcc gccgaacgtt 1440

aaaccgaacg aaaccccgat cttcctgaaa gttaaagaac gttctcgtta cgacgacgaa 1500

ctggttccga cccagcagga agaagaatac aaattcaaca tggttctgtc tatcatcctg 1560

tctgttctgc tgggtttcta ctacatctac accctgcacc gtgcttaagg tacccgggga 1620

tcctctagag tcgacctgca ggcatgcaag cttggctgtt ttggcggatg agagaagatt 1680

ttcagcctga tacagattaa atcagaacgc agaagcggtc tgataaaaca gaatttgcct 1740

ggcggcagta gcgcggtggt cccacctgac cccatgccga actcagaagt gaaacgccgt 1800

agcgccgatg gtagtgtggg gtctccccat gcgagagtag ggaactgcca ggcatcaaat 1860

aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc ctttcgtttt atctgttgtt tgtcggtgaa 1920

cgctctcctg agtaggacaa atccgccggg agcggatttg aacgttgcga agcaacggcc 1980

cggagggtgg cgggcaggac gcccgccata aactgccagg catcaaatta agcagaaggc 2040

catcctgacg gatggccttt ttgcgtttct acaaactctt tttgtttatt tttctaaata 2100

cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga 2160

aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca 2220

ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat 2280

cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag 2340

agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc 2400

gcggtattat cccgtgttga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct 2460

cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca 2520

gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt 2580

ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat 2640

gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt 2700

gacaccacga tgcctacagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta 2760

cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga 2820

ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt 2880

gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc 2940

gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct 3000

gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata 3060

ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt 3120

gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc 3180

gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg 3240

caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact 3300

ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg 3360

tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 3420

ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 3480

tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 3540

cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga 3600

gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 3660

ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct 3720

gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg 3780

agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct 3840

tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc 3900

tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc 3960

gaggaagcgg aagagcgcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca 4020

caccgcatat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagtat 4080

acactccgct atcgctacgt gactgggtca tggctgcgcc ccgacacccg ccaacacccg 4140

ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg 4200

tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgaggcagc 4260

agatcaattc gcgcgcgaag gcgaagcggc atgcatttac gttgacacca tcgaatggtg 4320

caaaaccttt cgcggtatgg catgatagcg cccggaagag agtcaattca gggggtgaat 4380

gtgaaaccag taacgttata cgatgtcgca gagtatgccg gtgtctctta tcagaccgtt 4440

tcccgcgtgg tgaaccaggc cagccacgtt tctgcgaaaa cgcgggaaaa agtggaagcg 4500

gcgatggcgg agctgaatta cattcccaac cgcgtggcac aacaactggc gggcaaacag 4560

tcgttgctga ttggcgttgc cacctccagt ctggccctgc acgcgccgtc gcaaattgtc 4620

gcggcgatta aatctcgcgc cgatcaactg ggtgccagcg tggtggtgtc gatggtagaa 4680

cgaagcggcg tcgaagcctg taaagcggcg gtgcacaatc ttctcgcgca acgcgtcagt 4740

gggctgatca ttaactatcc gctggatgac caggatgcca ttgctgtgga agctgcctgc 4800

actaatgttc cggcgttatt tcttgatgtc tctgaccaga cacccatcaa cagtattatt 4860

ttctcccatg aagacggtac gcgactgggc gtggagcatc tggtcgcatt gggtcaccag 4920

caaatcgcgc tgttagcggg cccattaagt tctgtctcgg cgcgtctgcg tctggctggc 4980

tggcataaat atctcactcg caatcaaatt cagccgatag cggaacggga aggcgactgg 5040

agtgccatgt ccggttttca acaaaccatg caaatgctga atgagggcat cgttcccact 5100

gcgatgctgg ttgccaacga tcagatggcg ctgggcgcaa tgcgcgccat taccgagtcc 5160

gggctgcgcg ttggtgcgga tatctcggta gtgggatacg acgataccga agacagctca 5220

tgttatatcc cgccgttaac caccatcaaa caggattttc gcctgctggg gcaaaccagc 5280

gtggaccgct tgctgcaact ctctcagggc caggcggtga agggcaatca gctgttgccc 5340

gtctcactgg tgaaaagaaa aaccaccctg gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc 5400

gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag 5460

tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagcg cgaattgatc tg 5502

<210> 2

<211> 4207

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

gccataccgc gaaaggtttt gcgccattcg atggtgtccg ggatctcgac gctctccctt 60

atgcgactcc tgcattagga aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa 120

caattcccct gtagaaataa ttttgtttaa ctttaataag gagatatacc atgggcagca 180

gccatcacca tcatcaccac agccaggatc cgaattcgag ctcggcgcgc ctgcaggtcg 240

acaagcttgc ggccgcataa tgcttaagtc gaacagaaag taatcgtatt gtacacggcc 300

gcataatcga aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccca 360

tcttagtata ttagttaagt ataagaagga gatatacata tggtgaatct taacgcaaca 420

atcctcggcc aggccatcgc gtttgtcctg ttcgttctgt tctgcatgaa gtacgtatgg 480

ccgccattaa tggcagccat cgaaaaacgt caaaaagaaa ttgctgacgg ccttgcttcc 540

gcagaacgag cacataagga ccttgacctt gcaaaggcca gcgcgaccga ccagctgaaa 600

aaagcgaaag cggaagccca ggtaatcatc gagcaggcga acaaacgccg ctcgcagatt 660

ctggacgaag cgaaagctga ggcagaacag gaacgtacta aaatcgtggc ccaggcgcag 720

gcggaaattg aagccgagcg taaacgtgcc cgtgaagagc tgcgtaagca agttgctatc 780

ctggctgttg ctggcgccga gaagatcatc gaacgttccg tggatgaagc tgctaacagc 840

gacatcgtgg ataaacttgt cgctgaactg taaggtaccc tcgagtctgg taaagaaacc 900

gctgctgcga aatttgaacg ccagcacatg gactcgtcta ctagcgcagc ttaattaacc 960

taggctgctg ccaccgctga gcaataacta gcataacccc ttggggcctc taaacgggtc 1020

ttgaggggtt ttttgctgaa acctcaggca tttgagaagc acacggtcac actgcttccg 1080

gtagtcaata aaccggtaaa ccagcaatag acataagcgg ctatttaacg accctgccct 1140

gaaccgacga ccgggtcatc gtggccggat cttgcggccc ctcggcttga acgaattgtt 1200

agacattatt tgccgactac cttggtgatc tcgcctttca cgtagtggac aaattcttcc 1260

aactgatctg cgcgcgaggc caagcgatct tcttcttgtc caagataagc ctgtctagct 1320

tcaagtatga cgggctgata ctgggccggc aggcgctcca ttgcccagtc ggcagcgaca 1380

tccttcggcg cgattttgcc ggttactgcg ctgtaccaaa tgcgggacaa cgtaagcact 1440

acatttcgct catcgccagc ccagtcgggc ggcgagttcc atagcgttaa ggtttcattt 1500

agcgcctcaa atagatcctg ttcaggaacc ggatcaaaga gttcctccgc cgctggacct 1560

accaaggcaa cgctatgttc tcttgctttt gtcagcaaga tagccagatc aatgtcgatc 1620

gtggctggct cgaagatacc tgcaagaatg tcattgcgct gccattctcc aaattgcagt 1680

tcgcgcttag ctggataacg ccacggaatg atgtcgtcgt gcacaacaat ggtgacttct 1740

acagcgcgga gaatctcgct ctctccaggg gaagccgaag tttccaaaag gtcgttgatc 1800

aaagctcgcc gcgttgtttc atcaagcctt acggtcaccg taaccagcaa atcaatatca 1860

ctgtgtggct tcaggccgcc atccactgcg gagccgtaca aatgtacggc cagcaacgtc 1920

ggttcgagat ggcgctcgat gacgccaact acctctgata gttgagtcga tacttcggcg 1980

atcaccgctt ccctcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat 2040

tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat agctagctca 2100

ctcggtcgct acgctccggg cgtgagactg cggcgggcgc tgcggacaca tacaaagtta 2160

cccacagatt ccgtggataa gcaggggact aacatgtgag gcaaaacagc agggccgcgc 2220

cggtggcgtt tttccatagg ctccgccctc ctgccagagt tcacataaac agacgctttt 2280

ccggtgcatc tgtgggagcc gtgaggctca accatgaatc tgacagtacg ggcgaaaccc 2340

gacaggactt aaagatcccc accgtttccg gcgggtcgct ccctcttgcg ctctcctgtt 2400

ccgaccctgc cgtttaccgg atacctgttc cgcctttctc ccttacggga agtgtggcgc 2460

tttctcatag ctcacacact ggtatctcgg ctcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg 2520

ctgtaagcaa gaactccccg ttcagcccga ctgctgcgcc ttatccggta actgttcact 2580

tgagtccaac ccggaaaagc acggtaaaac gccactggca gcagccattg gtaactggga 2640

gttcgcagag gatttgttta gctaaacacg cggttgctct tgaagtgtgc gccaaagtcc 2700

ggctacactg gaaggacaga tttggttgct gtgctctgcg aaagccagtt accacggtta 2760

agcagttccc caactgactt aaccttcgat caaaccacct ccccaggtgg ttttttcgtt 2820

tacagggcaa aagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc 2880

tactgaaccg ctctagattt cagtgcaatt tatctcttca aatgtagcac ctgaagtcag 2940

ccccatacga tataagttgt aattctcatg ttagtcatgc cccgcgccca ccggaaggag 3000

ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta atgagtgagc 3060

taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc 3120

cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgccag 3180

ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca ccgcctggcc 3240

ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa aatcctgttt 3300

gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt atcccactac 3360

cgagatgtcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg cgcccagcgc 3420

catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca gcatttgcat 3480

ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta tcggctgaat 3540

ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg agacagaact 3600

taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat gctccacgcc 3660

cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct ggtcagagac 3720

atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg catcctggtc 3780

atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat tgtgcaccgc 3840

cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc tggcacccag 3900

ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca gggccagact 3960

ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg ccacgcggtt 4020

gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt tcgcagaaac 4080

gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg catactctgc 4140

gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct cttccgggcg 4200

ctatcat 4207

<210> 3

<211> 1335

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

atgggaaagc tattacaatt ggcattgcat ccggtcgaga tgaaggcagc tttgaagctg 60

aagttttgca gaacaccgct attctccatc tatgatcagt ccacgtctcc atatctcttg 120

cactgtttcg aactgttgaa cttgacctcc agatcgtttg ctgctgtgat cagagagctg 180

catccagaat tgagaaactg tgttactctc ttttatttga ttttaagggc tttggatacc 240

atcgaagacg atatgtccat cgaacacgat ttgaaaattg acttgttgcg tcacttccac 300

gagaaattgt tgttaactaa atggagtttc gacggaaatg cccccgatgt gaaggacaga 360

gccgttttga cagatttcga atcgattctt attgaattcc acaaattgaa accagaatat 420

caagaagtca tcaaggagat caccgagaaa atgggtaatg gtatggccga ctacatctta 480

gatgaaaatt acaacttgaa tgggttgcaa accgtccacg actacgacgt gtactgtcac 540

tacgtagctg gtttggtcgg tgatggtttg acccgtttga ttgtcattgc caagtttgcc 600

aacgaatctt tgtattctaa tgagcaattg tatgaaagca tgggtctttt cctacaaaaa 660

accaacatca tcagagatta caatgaagat ttggtcgatg gtagatcctt ctggcccaag 720

gaaatctggt cacaatacgc tcctcagttg aaggacttca tgaaacctga aaacgaacaa 780

ctggggttgg actgtataaa ccacctcgtc ttaaacgcat tgagtcatgt tatcgatgtg 840

ttgacttatt tggccggtat ccacgagcaa tccactttcc aattttgtgc cattccccaa 900

gttatggcca ttgcaacctt ggctttggta ttcaacaacc gtgaagtgct acatggcaat 960

gtaaagattc gtaagggtac tacctgctat ttaattttga aatcaaggac tttgcgtggc 1020

tgtgtcgaga tttttgacta ttacttacgt gatatcaaat ctaaattggc tgtgcaagat 1080

ccaaatttct taaaattgaa cattcaaatc tccaagatcg aacagtttat ggaagaaatg 1140

taccaggata aattacctcc taacgtgaag ccaaatgaaa ctccaatttt cttgaaagtt 1200

aaagaaagat ccagatacga tgatgaattg gttccaaccc aacaagaaga agagtacaag 1260

ttcaatatgg ttttatctat catcttgtcc gttcttcttg ggttttatta tatatacact 1320

ttacacagag cgtga 1335

<210> 4

<211> 1338

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

atgggcggta aactgctgca gctggctctg cacccggttg aaatgaaagc tgctctgaaa 60

ctgaaattct gccgtacccc gctgttctct atctacgacc agtctacctc tccgtacctg 120

ctgcactgct tcgaactgct gaacctgacc tctcgttctt tcgctgctgt tatccgtgaa 180

ctgcacccgg aactgcgtaa ctgcgttacc ctgttctacc tgatcctgcg tgctctggac 240

accatcgaag acgacatgtc tatcgaacac gacctgaaaa tcgacctgct gcgtcacttc 300

cacgaaaaac tgctgctgac caaatggtct ttcgacggta acgctccgga cgttaaagac 360

cgtgctgttc tgaccgactt cgaatctatc ctgatcgaat ttcacaaact gaaaccggaa 420

taccaggaag ttatcaaaga aatcaccgaa aaaatgggta acggtatggc tgactacatc 480

ctggacgaaa actacaacct gaacggtctg cagaccgttc acgactacga cgtttactgc 540

cactacgttg ctggtctggt tggtgacggt ctgacccgtc tgatcgttat cgctaaattc 600

gctaacgaat ctctgtactc taacgaacag ctgtacgaat ctatgggtct gttcctgcag 660

aaaaccaaca tcatccgtga ctacaacgaa gacctggttg acggtcgttc tttctggccg 720

aaagaaatct ggtctcagta cgctccgcag ctgaaagact tcatgaaacc ggaaaacgaa 780

cagctgggtc tggactgcat caaccacctg gttctgaacg ctctgtctca cgttatcgac 840

gttctgacct acctggctgg tatccacgaa cagtctacct tccagttctg cgctatcccg 900

caggttatgg ctatcgctac cctggttctg gttttcaaca accgtgaagt tctgcacggt 960

aacgttaaaa tccgtaaagg tactacctgc tacctgatcc tgaaatctcg taccctgcgt 1020

ggttgcgttg aaatcttcga ctactacctg cgtgacatca aatctaaact ggctgttcag 1080

gacccgaact tcctgaaact gaacatccag atctctaaaa tcgaacagtt catggaagaa 1140

atgtaccagg acaaactgcc gccgaacgtt aaaccgaacg aaaccccgat cttcctgaaa 1200

gttaaagaac gttctcgtta cgacgacgaa ctggttccga cccagcagga agaagaatac 1260

aaattcaaca tggttctgtc tatcatcctg tctgttctgc tgggtttcta ctacatctac 1320

accctgcacc gtgcttaa 1338

Claims (8)

1.一种提升大肠杆菌中角鲨烯含量的方法，其特征在于，通过增生大肠杆菌的内膜进行；所述大肠杆菌为可合成角鲨烯的大肠杆菌E.coli CSQ1，所述大肠杆菌E.coli CSQ1是先通过将野生菌株E.coli C43(DE3)制备成氯化钙感受态细胞后，再通过热击法转化质粒pTsqs，最后利用氨苄青霉素抗性筛选和菌落PCR验证获得的，所述质粒pTsqs的核苷酸序列表如序列1所示。

2.一种质粒pCDAF，用于权利要求1所述大肠杆菌的内膜增生，其特征在于，包括载体pCDFDuet-1，载体pCDFDuet-1内插入有阻碍蛋白表达基因lacI、大肠杆菌复制起始位点CDFori、链霉素抗性基因和ATP合酶b亚基基因atpF，ATP合酶b亚基基因atpF上游具有PT7启动子以启动ATP合酶b亚基基因atpF的表达；所述质粒pCDAF的核苷酸序列如序列2所示。

3.一种权利要求2所述质粒pCDAF的制备方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：

步骤1，先依据大肠杆菌E.coli CSQ1的基因atpF设计一对引物，之后以基因组为模板通过菌落PCR获得上下游分别含有NdeI与KpnI酶切位点的基因atpF，基因atpF的核苷酸序列表如序列3所示；

步骤2，先后通过酶切和连接方法将将步骤1得到的基因atpF插入载体pCDFDuet-1的NdeI与KpnI酶切位点之间，构建得到质粒pCDAF；

步骤3，利用菌落PCR与双酶切方法对质粒pCDAF进行验证。

4.根据权利要求3所述的质粒pCDAF的制备方法，其特征在于，在所述步骤1中，所述一对引物如下：

atpF_F_NdeI：5’-GGAATTCCATATGGTGAATCTTAACGCAACAATC-3’

atpF_R_KpnI：5’-CGGGTACCTTACAGTTCAGCGACAAGTT-3’

以基因组为模板，采用atpF_F_NdeI与atpF_R_KpnI引物扩增atpF基因即为上下游分别含有NdeI与KpnI酶切位点的基因atpF。

5.根据权利要求4所述的质粒pCDAF的制备方法，其特征在于，在所述步骤2中，采用NcoI与EcoRI两种限制性内切酶分别对基因atpF和载体pCDFDuet-1分别进行双酶切，然后利用T4链接酶将两者进行连接，最终得到质粒pCDAF。

6.一种利用权利要求2中所述质粒pCDAF提高大肠杆菌中角鲨烯含量的方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：

步骤1，先将大肠杆菌E.coli CSQ1制备成氯化钙感受态细胞，然后通过热击法将质粒pCDAF转入E.coli CSQ1，最后利用氨苄青霉素抗性筛选和菌落PCR验证获得重组菌E.coliCSAF1；

步骤2，验证重组菌E.coli CSAF1中内膜增生；

步骤3，验证重组菌E.coli CSAF1中角鲨烯的合成。

7.根据权利要求6所述的利用质粒pCDAF提高大肠杆菌中角鲨烯含量的方法，其特征在于，在步骤2的验证具体为：先采用LB液体培养基培养步骤1得到的重组菌E.coli CSAF1，并加入诱导剂IPTG诱导基因atpF表达，之后离心收集菌体，冷冻干燥过夜，最后通过电子扫面显微镜观察细胞内膜变化。

8.根据权利要求6所述的利用质粒pCDAF提高大肠杆菌中角鲨烯含量的方法，其特征在于，在步骤3的验证具体为：先通过皂化法分离、提取合成的角鲨烯；再通过高效液相色谱法检测该角鲨烯。