CN114085861B - 精氨酸脱羧酶生产菌及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种精氨酸脱羧酶生产菌及其构建方法，包括以下步骤：(1)对Pg3启动子进行优化，将质粒pHT304用NdeⅠ和HincⅡ双酶切处理，将优化后的Pg3启动子整合在双酶切处理后的质粒pHT304上，得到质粒pHT304‑Pg3；(2)将步骤(1)得到的质粒pHT304‑Pg3用SphⅠ和SacⅠ双酶切处理，将SpeA基因整合到双酶切处理后的质粒pHT304‑Pg3上，得到重组表达载体；(3)将步骤(2)得到的重组表达载体导入到枯草芽孢杆菌上，构建得到精氨酸脱羧酶生产菌。本发明的生产菌提高了精氨酸脱羧酶的产量。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种精氨酸脱羧酶生产菌及其构建方法。
背景技术
胍基丁胺(Agmatine)又称为鲱精胺，分子式C5H14N4，一种内源性可乐定置换物质(clonidine displacing substance,CDS)，是咪唑啉受体的激动剂α2-肾上腺素能受体的非儿茶酚胺配体。它存在于生物体多种组织和细胞中,在生物体代谢中起到重要作用，具有多种生物学功能。在心血管系统，胍基丁胺能降低心率、平均动脉压、左室压、外周血管阻力指数等；在泌尿系统，胍基丁胺能增加肾小球过滤率和绝对近端冲吸收；在胃肠道，胍丁胺能增加胃酸和胃蛋白酶的分泌，使粘膜厚度变薄，恶化应激引起的粘膜病变等；在糖代谢条件中，胍丁胺能增加胰岛素的分泌，此外，近年的研究表明，胍基丁胺还能抑制多种细胞(包括血管平滑肌细胞、星型胶质细胞、内皮细胞、肝癌细胞和肾小管上皮细胞等)的增殖。随着人们对胍基丁胺生理作用研究的深入，胍基丁胺显示了广阔的临床应用前景，特别是在神经系统中的应用前景尤其引入注意。在食品、化工、药物制备和临床等领域，国内外需求巨大，市场应用前景广阔。胍基丁胺的生产方法主要有化学法和生物酶法。化学法路线步骤多、收率低、成本高、不适合大规模的工业化生产。生物酶法主要是使用精氨酸脱羧酶(Argininedecarboxylase，EC 4.1.1.19)，这是一种5'-磷酸吡哆醛(辅酶PLP)依赖型的脱羧酶。该酶可以L-精氨酸为底物，经脱羧基后生成胍基丁胺。酶法生产胍基丁胺工艺简单，周期短，耗能低，专一性强，收率高，提取方便。但是，在酶法生产胍基丁胺的过程中，如何获得低成本高效的酶源是关键问题。
虽然精氨酸脱羧酶的来源在植物、动物和微生物体内广为分布。但目前精氨酸脱羧酶主要还是通过化学合成法和微生物发酵法两种制备得到，其中化学合成法因其步骤繁复、造成的污染严重，产物收率较低等缺点日益被微生物发酵法所取代。微生物发酵法是通过诱变菌株或重组工程菌株，让微生物发酵产生精氨酸脱羧酶。所以如何构建精氨酸脱羧酶生产菌并能低成本高效的生产精氨酸脱羧酶是需要解决的问题。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种精氨酸脱羧酶生产菌及其构建方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种精氨酸脱羧酶生产菌的构建方法，包括以下步骤：
(1)对Pg3启动子进行优化，将质粒pHT304用NdeⅠ和HincⅡ双酶切处理，将优化后的Pg3启动子整合在双酶切处理后的质粒pHT304上，得到质粒pHT304-Pg3；
(2)将步骤(1)得到的质粒pHT304-Pg3用SphⅠ和SacⅠ双酶切处理，将SpeA基因整合到双酶切处理后的质粒pHT304-Pg3上，得到重组表达载体；
(3)将步骤(2)得到的重组表达载体导入到枯草芽孢杆菌上，构建得到精氨酸脱羧酶生产菌。
优选的，步骤(1)中，优化后的Pg3启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
优选的，步骤(1)中，质粒pHT304-Pg3的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
优选的，步骤(2)中，所述SpeA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的第二方面，提供上述构建方法构建的精氨酸脱羧酶生产菌。
本发明的第二方面，提供精氨酸脱羧酶生产菌在发酵生产精氨酸脱羧酶中的应用。
本发明的有益效果：
(1)为提高精氨酸脱羧酶的产量、降低精氨酸脱羧酶的生产成本，本发明从基因工程菌株入手，构建得到了一种新的精氨酸脱羧酶生产菌。本发明的精氨酸脱羧酶生产菌通过外源转入SpeA基因提高了精氨酸脱羧酶的合成效果，SpeA基因的表达产物为精氨酸脱羧酶，能催化精氨酸生成胍基丁胺，并提高了合成的精氨酸脱羧酶的胞内、外的分泌能力。
(2)虽然枯草芽孢杆菌是外源基因常用的表达宿主菌，但有些外源蛋白往往得不到有效的表达，其原因很可能是枯草芽孢杆菌本身的翻译系统不能满足外源基因表达的需要。为了使SpeA基因能够更适用于原核表达系统，本发明还对上述基因进行了密码子优化，采用优化后的编码基因进行原核表达，进一步提高了精氨酸脱羧酶的表达量。
附图说明
图1：(a)带酶切位点的质粒pHT304的结构图谱，(b)不带酶切位点的质粒pHT304的结构图谱，(c)质粒pHT304-pg3的结构图谱，(d)质粒pHT304-pg3-speA的结构图谱。
图2：优化前SpeA基因的密码子相对适应度图。
图3：优化后SpeA基因的密码子相对适应度图。
图4：本发明实施例2构建的重组表达载体的酶切验证结果；图中，泳道从左至右：Marker，双酶切处理pht 304-pg3-speA，pht 304-pg3，pht 304，speA
图5：本发明实施例3所得到的阳性转化子的Western bolt检测结果；图中，71kDa为凝血酶溶液切割前精氨酸脱羧酶的分子量，70.8kDa为凝血酶溶液切割后精氨酸脱羧酶的分子量。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例和对比例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
其中：本发明中实施例和对比例所使用的枯草芽孢杆菌购自中国微生物菌种查询网(https://www.biobw.org/China-strain/bio-81799.html)，菌种的编号为bio-81799，菌株名称为枯草芽胞杆菌168。
质粒pHT304为枯草芽孢杆菌表达载体，其结构图谱如图1所示。
需要说明的是，本发明精氨酸脱羧酶生产菌的构建方法，是本领域技术人员能够重复实施的方法，故无需对生产菌进行生物保藏。
实施例1：密码子优化
发明人从现有数据库中获得的SpeA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
为了使SpeA基因能够更适用于原核表达系统，本发明分别对上述基因的核苷酸序列组成进行了密码子优化，并在优化后的SpeA基因的末端增加了Gly-Arg-Gly-8His序列，如SEQ ID NO.2所示；得到优化后的SpeA基因(即目的基因)，如SEQ ID NO.3所示；优化前的密码子相对适应度图如图2所示；优化后的密码子相对适应度图如图3所示。
由图2-图3可以看出，经密码子优化后的SpeA基因的密码子相对适应度可以达到1.0，显著提高了蛋白编码基因在原核表达系统中的适应性。
实施例2：重组表达载体的构建
对Pg3启动子进行优化得到优化后的Pg3启动子(SEQ ID NO.4所示)，将质粒pHT304用NdeⅠ和HincⅡ双酶切处理，将优化后的Pg3启动子整合在双酶切处理后的质粒pHT304上，得到质粒pHT304-Pg3(SEQ ID NO.5所示)；
将质粒pHT304-Pg3用SphⅠ和SacⅠ双酶切处理，将目的基因(SEQ ID NO.3所示)整合到双酶切处理后的质粒pHT304-Pg3上，得到重组表达载体(SEQ ID NO.6所示)。
将构建的重组表达载体用SphⅠ、SacⅠ两个酶进行酶切验证，结果如图4所示。结果表明：和目的基因(SEQ ID NO.3所示)已成功整合到质粒pHT304上。
实施例3：精氨酸脱羧酶生产菌的构建
将实施例2构建的重组表达载体导入枯草芽孢杆菌中，获得转化子。
将转化子在LB平板上涂布，等长出单菌落之后在AMP平板(含50μg/ml AMP的LB平板)上接种，待抗性平板上长出单菌落之后，AMP平板中挑出生长的单菌落，将其作为阳性转化子。
将阳性转化子接种至含有含50μg/ml AMP的甘油琼脂培养基中，37℃培养至OD600＝50，加入IPTG(使IPTG的终浓度为0.2mM)，诱导培养30h。诱导培养结束后，超声破菌，离心，分离上清液，采用Western bolt检测，其结果如图5所示，在71KDa处有表达条带，与外源插入的目的基因SpeA所表达蛋白的理论计算得到的分子量一致。
将阳性转化子接种于发酵培养基(发酵培养基的组成为：蛋白胨12g/L、酵母膏8g/L、氯化钠3g/L、硫酸铵2.5g/L、三水磷酸氢二钾4g/L、柠檬酸铁铵0.3g/L、柠檬酸2.1g/L、甘油10g/L、七水硫酸镁0.5g/L、硫酸卡那霉素100ppm、消泡剂0.5g/L，接种前用氨水调发酵培养基pH至6.9-7.0)中，37℃下进行培养，培养结束后采用相同的条件进行破菌处理，检测破菌处理后的液体中的精氨酸脱羧酶含量。结果表明：阳性转化子生产得到了大量精氨酸脱羧酶。
由此证明：本实施例已成功构建得到稳定的精氨酸脱羧酶生产菌。
对比例1：
以枯草芽胞杆菌168作为精氨酸脱羧酶生产菌A。
对比例2：
以枯草芽胞杆菌168作为受体菌，将实施例1中的目的基因(SEQ ID NO.3所示)通过SphⅠ和SacⅠ双酶切处理整合到实施例2中的质粒pHT304上，得到重组表达载体。将重组表达载体导入到受体菌中，按实施例3的方法筛选阳性转化子，构建精氨酸脱羧酶生产菌B。
对比例3：
以枯草芽胞杆菌168作为受体菌，将实施例1中的SpeA基因(SEQ ID NO.1所示)通过SphⅠ和SacⅠ双酶切处理整合到实施例2中的质粒pHT304-Pg3上，得到重组表达载体。将重组表达载体导入到受体菌中，按实施例3的方法筛选阳性转化子，构建精氨酸脱羧酶生产菌C。
试验例：
将实施例3、对比例1-对比例3构建的精氨酸脱羧酶生产菌接入同样组成的发酵培养基中(接种量均为4wt％)，发酵培养基的组成为：蛋白胨12g/L、酵母膏8g/L、氯化钠3g/L、硫酸铵2.5g/L、三水磷酸氢二钾4g/L、柠檬酸铁铵0.3g/L、柠檬酸2.1g/L、甘油10g/L、七水硫酸镁0.5g/L、硫酸卡那霉素100ppm、消泡剂0.5g/L；发酵培养基121℃，25min灭菌(七水硫酸镁需要单独灭菌，121℃灭菌20min)，接种前用氨水调发酵培养基pH至6.9-7.0。
在相同条件下进行发酵培养，发酵培养的温度为36.5～37℃，pH为6.9～7.0，溶氧(DO)为20～40％；OD为20％时，降温至28℃，加入0.2mM IPTG诱导发酵；保证诱导培养时间不少于14h，待OD增长缓慢或不长时发酵结束。
将发酵液过高压匀质机进行细胞破碎，浓盐酸调pH为4.4，然后4000r/min离心15min，收集上清液；将上清液浓缩后依次经活性炭脱色和陶瓷膜过滤(陶瓷膜的孔径是100nm，压力0.5MPa)处理，得到滤液；
将滤液采用镍柱进行亲和层析，结合缓冲液为50mM的PBS。挂柱后先用凝血酶溶液切割，消化缓冲液采用150mM NaCl，ph7.0，消化温度30℃，切割10h。凝血酶溶液是将2000000U的凝血酶(thrombin，要求比活大于2000U/mgpr)用生理盐水溶解。再用生理盐水洗脱，得到精氨酸脱羧酶+凝血酶的混合液。
混合液过苯甲眯-琼脂糖凝胶树脂，所用平衡缓冲液：50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，pH7.4，用结合缓冲液(50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，pH7.4100cm/h 0.3MPa)除去凝血酶，洗脱后收集洗脱液，电渗析脱盐(电渗析的pH控制在5.9，温度控制在40℃以下；淡室电导≤1000μs/cm时，关闭电渗析，将淡水放出)，对电渗析放出的淡水进行旋转蒸发，温度50℃，50℃下干燥，得到提取纯化得到精氨酸脱羧酶。精氨酸脱羧酶产量和酶活结果见表1。
精氨酸脱羧酶产量＝提取纯化得到的精氨酸脱羧酶的质量/发酵液的体积。本发明中精氨酸脱羧酶产量是指1L发酵液中提取纯化得到的精氨酸脱羧酶的克数。
精氨酸脱羧酶酶活测定方法：
在2mL反应体系中，添加50mM Tris-HCL buffer(pH7.5)，1mM PLP，0.1mM DTT，4mMMgS04，10mM L-Arg，40℃水浴，取100mg冻干后的酶用纯水溶解，定容至100mL，用移液枪吸取1mL加入体系后开始反应，15min后加入1/5体积40％三氯乙酸终止反应。用HPLC测定产物胍基丁胺含量。1个酶活力单位(U)定义为：在40℃，pH7.5条件下，每min生成1umol胍基丁胺所需的酶量为1个酶活力单位。
表1：
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 新泰市佳禾生物科技有限公司，汕头市佳禾生物科技有限公司
<120> 精氨酸脱羧酶生产菌及其构建方法
<130> 2021
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1914
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 2280
ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct 2340
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agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct 2460
tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc 2520
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gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat 2640
taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt 2700
aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt 2760
atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat 2820
tacgccaagc ttgcatgcct gcaggtcgac tctagaggat ccccgggtac cgagctcgaa 2880
ttcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa 2940
tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga 3000
tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg cgcctgatgc ggtattttct 3060
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tgatgccgca tagttaagcc agccccgaca cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg 3180
ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat 3240
gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgaga cgaaagggcc tcgtgatacg 3300
cctattttta taggttaatg tcatgataat aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt 3360
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 3420
tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa t 3461
<210> 6
<211> 5378
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
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ttatcaaatt ttcgttgatt taatagaaac atagcggtaa aattagcagt aacttaatag 120
aacggaaatg aaaaaagcca ctctcatatg agcactcttt ccactatccc tacagtgtta 180
tggcttgaac aatcacgaaa caataattgg tacgtacgat ctttcagccg actcaaacat 240
caaatcttac aaatgtagtc tttgaaagta ttacatatgt aagatttaaa tgcaaccgtt 300
ttttcggaag gaaatgatga cctcgtttcc accggaatta gcttggtacc agctattgta 360
acataatcgg tacgggggtg aaaaagctaa cggaaaaggg agcggaaaag aatgatgtaa 420
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gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc 1800
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tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 2040
ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 2100
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gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataat 5378
Claims (3)
1.一种精氨酸脱羧酶生产菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对Pg3启动子进行优化，将质粒pHT304用NdeⅠ和HincⅡ双酶切处理，将优化后的Pg3启动子整合在双酶切处理后的质粒pHT304上，得到质粒pHT304-Pg3；优化后的Pg3启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
(2)将步骤(1)得到的质粒pHT304-Pg3用SphⅠ和SacⅠ双酶切处理，将SpeA基因整合到双酶切处理后的质粒pHT304-Pg3上，得到重组表达载体；所述SpeA基因的核苷酸序列如SEQID NO.3中第5-1924位核苷酸所示；
(3)将步骤(2)得到的重组表达载体导入到枯草芽孢杆菌上，构建得到精氨酸脱羧酶生产菌。
2.由权利要求1所述的构建方法构建的精氨酸脱羧酶生产菌。
3.权利要求2所述的精氨酸脱羧酶生产菌在发酵生产精氨酸脱羧酶中的应用。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202111164277.4A CN114085861B (zh) | 2021-09-30 | 2021-09-30 | 精氨酸脱羧酶生产菌及其构建方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111164277.4A CN114085861B (zh) | 2021-09-30 | 2021-09-30 | 精氨酸脱羧酶生产菌及其构建方法 |
Publications (2)
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|---|---|
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| CN114085861B true CN114085861B (zh) | 2024-04-05 |
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ID=80296481
Family Applications (1)
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105861529A (zh) * | 2016-05-27 | 2016-08-17 | 江南大学 | 一种精氨酸脱羧酶及其应用 |
| CN111748548A (zh) * | 2020-07-29 | 2020-10-09 | 江南大学 | 一种精氨酸脱羧酶突变体及其在生产胍基丁胺中的应用 |
-
2021
- 2021-09-30 CN CN202111164277.4A patent/CN114085861B/zh active Active
Patent Citations (2)
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| CN111748548A (zh) * | 2020-07-29 | 2020-10-09 | 江南大学 | 一种精氨酸脱羧酶突变体及其在生产胍基丁胺中的应用 |
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| CN114085861A (zh) | 2022-02-25 |
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