CN108949795B - 提升大肠杆菌中角鲨烯含量用质粒pCDSP及其制备和使用方法 - Google Patents

提升大肠杆菌中角鲨烯含量用质粒pCDSP及其制备和使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提升大肠杆菌中角鲨烯含量用质粒pCDSP，包括载体pCDFDuet‑1，载体pCDFDuet‑1内插入有阻碍蛋白表达基因lacI、大肠杆菌复制起始位点CDF ori、链霉素抗性基因和Scp‑2蛋白基因scp2，Scp‑2蛋白基因scp2上游具有PT7启动子以启动Scp‑2蛋白基因scp2的表达。本发明开还公开了该质粒pCDSP的制备和使用方法。本发明提供的质粒pCDSP为大肠杆菌发酵生产角鲨烯提供了有效的方法与工具。

Description

提升大肠杆菌中角鲨烯含量用质粒pCDSP及其制备和使用 方法
技术领域
本发明属于生物基因工程领域，特别是涉及一种提升大肠杆菌中角鲨烯含量用质粒pCDSP，还涉及一种该质粒pCDSP的制备方法，还涉及一种该质粒pCDSP的使用方法。
背景技术
角鲨烯是一种天然存在于多种微生物及动植物细胞内的三萜烯类化合物，具有抗氧化，保护心脏，提高免疫力，降低血脂及抑制癌症发展等多种功效，已被广泛应用于医药及保健品领域。当前，市面上的角鲨烯主要来源于植物种子及动物肝脏的提取，因此价格比较昂贵，另外通过提取的方法获得还具有周期长、成本高、破坏环境等缺点，因此，亟需新的更环保、更廉价的生产方式。
微生物发酵生产活性化合物具有廉价、快速、环保等优点。近年来，诸多研究致力于利用酵母、微藻及沼泽红假单胞菌等微生物进行角鲨烯的发酵生产，但均未实现突破，其产量与工业化生产要求尚有较大差距。究其原因，角鲨烯含量低或发酵密度低等因素限制了角鲨烯的最终产量。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种提升大肠杆菌中角鲨烯含量用质粒pCDSP，用于提高大肠杆菌中角鲨烯的合成。
本发明的第二个目的是提供一种上述质粒pCDSP的制备方法，用于制备该质粒pCDSP。
本发明的第三个目的是提供一种利用质粒pCDSP提高大肠杆菌中角鲨烯含量的方法，用以实现如何使用该质粒pCDSP促使大肠杆菌大量合成角鲨烯。
为了达到上述第一个目的，本发明所采用的第一种技术方案是，一种提升大肠杆菌中角鲨烯含量用质粒pCDSP，包括载体pCDFDuet-1，载体pCDFDuet-1内插入有阻碍蛋白表达基因lacI、大肠杆菌复制起始位点CDF ori、链霉素抗性基因和Scp-2蛋白基因scp2，Scp-2蛋白基因scp2上游具有PT7启动子以启动Scp-2蛋白基因scp2的表达，质粒pCDSP的核苷酸序列如序列1所示，Scp-2蛋白基因scp2的核苷酸序列如序列2所示。
为了达到上述第二个目的，本发明所采用的第二个技术方案是，一种质粒pCDSP的制备方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1，依据大鼠Scp-2蛋白的氨基酸序列，并根据大肠杆菌密码子偏好性设计出适合大肠杆菌表达的Scp-2蛋白基因scp2，之后将Scp-2蛋白基因scp2插入载体pUC57中得到质粒pUCSP，Scp-2蛋白基因scp2的核苷酸序列如序列2所示；
步骤2，质粒pUCSP中的Scp-2蛋白基因scp2通过酶切和连接反应插入载体pCDFDuet-1中，形成质粒pCDSP；
步骤3，利用菌落PCR与双酶切方法对质粒pCDSP进行验证。
本发明的第二种技术方案，还具有以下特点：
在所述步骤1中，Scp-2蛋白基因scp2的两端分别添加有NcoI(CCATGG)酶切位点和EcoRI(GAATTC)酶切位点。
在所述步骤2中，先采用NcoI与EcoRI两种限制性内切酶对质粒pUCSP与载体pCDFDuet-1分别进行双酶切，然后通过凝胶电泳回收Scp-2蛋白基因scp2片段与线性化的载体pCDFDuet-1，之后再通过连接反应将Scp-2蛋白基因片段插入线性化的载体pCDFDuet-1并转入大肠杆菌DH5α中，最后利用氨苄青霉素抗性筛选得到质粒pCDSP。
为了达到上述第三个目的，本发明所采用的技术方案是，一种利用质粒pCDSP提高大肠杆菌中角鲨烯含量的方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1，先将野生菌株E.coli C43(DE3)制备成氯化钙感受态细胞，然后通过热击法转化质粒pTsqs，最后利用氨苄青霉素抗性筛选和菌落PCR验证获得能够合成角鲨烯的重组菌E.coli CSQ1，质粒pTsqs的核苷酸序列如序列4所示；
步骤2，热击法转化质粒pCDSP，利用链霉素抗性筛选和菌落PCR验证获得重组菌E.coli CSSP1；
步骤3，分析重组菌E.coli CSSP1中角鲨烯的含量。
本发明的第三种技术方案，还具有以下特点：
所述步骤3具体为：先将采用LB液体培养基培养E.coli CSSP1，并加入诱导剂IPTG诱导Scp-2蛋白基因scp2表达；之后通过皂化法分离、提取合成的角鲨烯；最后通过高效液相色谱法检测该角鲨烯的含量。
本发明的有益效果是：
(1)本发明提供的用于提高大肠杆菌中角鲨烯的含量的方法，通过表达Scp-2蛋白促使角鲨烯从内膜上萃取以增加角鲨烯的储存空间，最终提高了角鲨烯的积累量；
(2)本发明提供的质粒pCDSP用于表达Scp-2蛋白以萃取角鲨烯，含有链霉素抗性基因作为筛选标记，以强启动子PT7通过控制Scp-2蛋白基因scp2的表达来提高Scp-2蛋白的表达量；
(3)本发明提供的质粒pCDSP为大肠杆菌发酵生产角鲨烯提供了有效的方法与工具。
附图说明
图1是本发明所涉及的质粒pCDSP的构建原理图；
图2是本发明所涉及的质粒pCDSP中Scp-2蛋白基因scp2双酶切回收凝胶电泳图；
图3是本发明所涉及的质粒pCDSP及其验证示意图；
图4是本发明所涉及的质粒pCDSP的菌落PCR验证图；
图5是本发明所涉及的质粒pCDSP的双酶切验证凝胶电泳图；
图6是本发明所涉及的标准品、重组菌E.coli CSQ1以及重组菌E.coli CSSP1合成的角鲨烯的验证高效液相色谱图。
具体实施方式
以下结合附图说明和具体实施例对本发明的技术方案作进一步地详细说明。
实施例1
一种提升大肠杆菌中角鲨烯含量用质粒pCDSP，包括载体pCDFDuet-1，载体pCDFDuet-1内插入有阻碍蛋白表达基因lacI、大肠杆菌复制起始位点CDF ori、链霉素抗性基因和Scp-2蛋白基因scp2，Scp-2蛋白基因scp2上游具有PT7启动子以启动Scp-2蛋白基因scp2的表达，质粒pCDSP的核苷酸序列如序列1所示，Scp-2蛋白基因scp2的核苷酸序列如序列2所示。
实施例2
一种上述质粒pCDSP的制备方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1，依据大鼠Scp-2蛋白的氨基酸序列，并根据大肠杆菌密码子偏好性设计出适合大肠杆菌表达的Scp-2蛋白基因scp2，之后将Scp-2蛋白基因scp2插入载体pUC57中得到质粒pUCSP，Scp-2蛋白基因scp2的核苷酸序列如序列2所示；
步骤2，质粒pUCSP中的Scp-2蛋白基因scp2通过酶切和连接反应插入载体pCDFDuet-1中，形成质粒pCDSP，具体为：
先采用NcoI与EcoRI两种限制性内切酶对质粒pUCSP与载体pCDFDuet-1分别进行双酶切，然后通过凝胶电泳回收从质粒pUCSP中切下的Scp-2蛋白基因scp2片段与线性化的载体pCDFDuet-1，之后再通过连接反应将Scp-2蛋白基因插入线性化的载体pCDFDuet-1并转入大肠杆菌DH5α中，利用氨苄青霉素抗性筛选得到质粒pCDSP；
步骤3，利用菌落PCR与双酶切方法对质粒pCDSP进行验证。
实施例3
一种利用上述质粒pCDSP提高大肠杆菌中角鲨烯含量的方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1，先将野生菌株E.coli C43(DE3)制备成氯化钙感受态细胞，然后通过热击法转化质粒pTsqs，最后利用氨苄青霉素抗性筛选和菌落PCR验证获得重组菌E.coli CSQ1，质粒pTsqs的核苷酸序列如序列3所示；
步骤2，热击法转化质粒pCDSP，利用链霉素抗性筛选和菌落PCR验证获得重组菌E.coli CSSP1；
步骤3，分析重组菌E.coli CSSP1中角鲨烯的含量，具体为：
先采用LB液体培养基培养E.coli CSSP1，之后加入诱导剂IPTG诱导Scp-2蛋白基因scp2表达；之后通过皂化法分离、提取合成的角鲨烯；最后通过高效液相色谱法检测该角鲨烯的含量。
其中，E.coli CSQ1为在野生型E.coli C43(DE3)基础上转入质粒pTsqs构建而来，野生菌株E.coli C43(DE3)的DNA序列为GenBank号，具体为CP011938.1的序列(BCT 17-DEC-2015)；E.coli CSQ1菌株在西安医学院分子病毒与病毒免疫学实验室保藏，载体pTrc99A购自Nonagon公司。载体pCDFDuet-1购自Nonagon公司，质粒pUCSP(pUC57质粒中插入合成的scp-2基因)由华大基因科技有限公司提供；限制性内切酶(NcoI与EcoRI)、T4连接酶、ExTaq聚合酶、DH5α感受态细胞以及250bp DNA Marker等均购自Takara公司；质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自天根生物科技有限公司；无水Na2SO4、色谱级甲醇、己烷及二氯甲烷等化学试剂均购自海默生物科技有限公司；角鲨烯标准品购自Sigma公司。质粒pTsqs包括载体pTrc99A，载体pTrc99A内插入有阻碍蛋白表达基因lacIq、复制起始位点pBR_322ori、氨苄青霉素抗性基因和角鲨烯合酶基因ERG9，角鲨烯合酶基因ERG9的上游有启动子Ptrc，角鲨烯合酶基因ERG9的基因下游包含1个多克隆位点(Multiple cloning site,MCS)，质粒pTsqs的核苷酸序列如序列3所示，角鲨烯合酶基因ERG9的核苷酸序列如序列4所示。
Scp-2蛋白基因scp2的设计与合成：
(1)在美国国立生物技术信息中心(NCBI)网站查找到GenBank号为AAH81 713.1(ROD 15-JUL-2006)大鼠的Scp-2蛋白的氨基酸序列(序列2)；
(2)依据大肠杆菌密码子偏好性设计出适合大肠杆菌中表达的Scp-2蛋白基因scp2，Scp-2蛋白基因scp2的氨基酸序列如序列3所示，在Scp-2蛋白基因scp2的序列两端分别加上NcoI(CCATGG)与EcoRI(GAATTC)酶切位点后，将该序列送往华大基因合成并将其插入载体pUC57形成质粒pUCSP。
质粒pCDSP的制备：构建过程如图1所示，首先，采用NcoI与EcoRI两种限制性内切酶对质粒pUCSP进行双酶切，通过凝胶电泳回收Scp-2蛋白基因scp2片段；然后同样对载体pCDFDuet-1进行双酶切并进行回收，进一步通过连接反应将Scp-2蛋白基因scp2插入载体pCDFDuet-1并转入大肠杆菌DH5α中；最后利用氨苄青霉素抗性筛选，再经过菌落PCR与双酶切验证得到质粒pCDSP。
具体来说：
步骤1，获取带粘性末端的Scp-2蛋白基因scp2：
(1)采用NcoI与EcoRI两种限制性内切酶对质粒pUCSP进行酶切反应；
酶切反应体系为：10×QC Buffer，10μl；NcoI，2μl；EcoRI，2μl；pUCSP，30μl；ddH2O，56μl；总体积为100μl。
酶切反应条件为：37℃水浴锅放置6h；
实验结果为：酶切反应液进行凝胶电泳后分别获得一条1653bp(Scp-2蛋白基因scp2)和一条2704bp(载体pUC57)的条带，结果如图2所示。
(2)依照凝胶回收试剂盒操作说明对Scp-2蛋白基因scp2进行回收；
(3)通过酶标仪对回收的Scp-2蛋白基因scp2进行浓度测定，并将其放入-20℃冰箱保存备用。
步骤2，将Scp-2蛋白基因scp2插入载体pCDFDuet-1：
(1)分别采用NcoI与EcoRI两种限制性内切酶分别对载体pCDFDuet-1进行双酶切并回收；
酶切反应体系与条件，除将加入的质粒pUCSP替换为载体pCDFDuet-1外，其它条件同步骤1中所述酶切反应体系，酶切反应后获得一条3744bp的条带，采用凝胶电泳回收并测定浓度。
(2)采用T4连接酶将Scp-2蛋白基因scp2与载体pCDFDuet-1连接，得到质粒pCDSP；
连接反应体系：10×T4Buffer，2μl；T4Ligase，1μl；Scp-2蛋白基因scp2，6μl；pCDFDuet-1，2μl；ddH2O，9μl；总体积为20μl。
反应条件：在16℃下保温12h。
(3)将连接产物质粒pCDSP转入大肠杆菌DH5α：
①取10μl连接反应体系的反应液加入至100μl大肠杆菌DH5α的感受态细胞中轻轻混匀，冰上放置30min，得到混合液A；
②将混合液A放入42℃的水浴中热击90s，之后冰上放置3min；
③之后向混合液A中加入700μl LB液体培养基，并于37℃培养箱中放置50min，得到混合液B；
④对混合液B进行5min的6000g离心，之后收集菌体，吸出650μl上清液，将沉淀与剩余的上清液混合均匀后涂布于含50mg/l氨苄青霉素的LB固体培养基上。
步骤3，质粒pCDSP的筛选与验证：
于LB固体培养基上挑取阳性单克隆，利用设计的验证引物Check__pCDSP_up和Check__pCDSP_down进行菌落PCR验证，含有质粒pCDSP的单克隆在菌落PCR验证后将获得一条2134bp的扩增条带；随后将该扩增条带的单克隆接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基，在37℃下培养16h后提取质粒；最后对提取的质粒进行双酶切、测序验证，验证原理如图3所示。
(1)验证引物的设计与合成；
Check_pCDAF_up：5’-GGATCTCGACGCTCTCCCTT-3’(该序列对应序列1的第41-60位)
Check_pCDSP_down：5’-ATGCTAGTTATTGCTCAGCGGT-3’(该序列为序列3的第2153-2174位的反向互补序列)
(2)菌落PCR验证；
PCR反应体系：ExTaq Mix，25μl；Check_pCDSP_down(10μM)，1μl；Check_pCDSP_down(10μM)，1μl；ddH2O，23μl；PCR反应体系的总体积为50μl，采用20μl枪头挑取单克隆混入PCR反应体系组成的PCR反应液中。
PCR反应条件：先在98℃下进行3min保温；再依次循环32次以下过程：98℃下保温10s，62℃下保温30s，72℃下保温2.5min，72℃下保温5min；最后保持4℃的反应条件。
PCR结果：PCR反应液进行凝胶电泳后获得一条2134bp的条带，结果如图4所示。
(3)将获得扩增条带的单克隆接种于含有50mg/l氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃下培养16h，得到培养菌液；
(4)取上述培养菌液3ml并提取质粒pCDSP；
(5)双酶切验证质粒pCDSP：
酶切反应体系为：10×QC Buffer，10μl；NcoI，2μl；EcoRI，2μl；pCDSP，20μl；ddH2O，66μl；总体积为100μl。
酶切反应条件为：37℃水浴锅放置2h；
实验结果为：酶切反应液进行凝胶电泳后分别获得一条1649bp(Scp-2蛋白基因scp2)和一条3738bp(pCDFDuet-1)的条带，证明Scp-2蛋白基因scp2被成功插入载体pCDFDuet-1，表明质粒pCDSP构建成功，双酶切结果如图5所示。
应用质粒pCDSP提高大肠杆菌中的角鲨烯含量：
步骤1，重组菌E.coli CSSP1的构建：
(1)重组菌E.coli CSQ1感受态细胞的制备：
①野生菌株E.coli C43(DE3)感受态细胞的制备：先将野生菌株E.coli C43(DE3)接种于10ml LB培养液中，于37℃下振荡培养3h使菌体的密度达到OD600＝0.4，得到溶液A；之后将溶液A冰浴10min，之后进行5min的4000g离心，最后收集菌体；然后将收集的菌体重悬于10ml的CaCl2(50mmol/L)溶液中，冰浴10min，再次进行5min的4000g离心，收集菌体；最后将收集的菌体再次重悬于2ml预冷的CaCl2溶液(50mmol/L)中，使菌液浓缩，继续冰浴15min，使菌体受敏成感受态细胞，得到野生菌株E.coli C43(DE3)感受态细胞。
②质粒pTsqs转入野生菌株E.coli C43(DE3)感受态细胞中：先取1μl质粒pTsqs加入至100μl野生型菌株E.coli C43(DE3)感受态细胞中轻轻混匀，冰上放置30min，得到混合液B；之后将混合液B在42℃下进行90s的水浴热击，并将其放置于冰上3min，然后往混合液B中加入700μl LB液体培养基得到混合液C，并于37℃培养箱放置50min，最后对混合液C进行5min的6000g离心，收集菌体，吸出650μl的上清液，将沉淀与剩余的上清液混合均匀后涂布于含50mg/l氨苄青霉素的LB固体培养基上，筛选获得重组菌E.coli CSQ1。
③先将重组菌E.coli CSQ1接种于10ml LB培养液中，于37℃下振荡培养3h使菌体密度达到OD600＝0.4，得到溶液D，之后将溶液D冰浴10min，之后进行5min的4000g离心，最后收集菌体；然后将收集的菌体重悬于10ml的CaCl2(50mmol/L)溶液中，冰浴10min，再次进行5min的4000g离心，再次收集菌体；最后将收集的菌体再次重悬于2ml预冷的CaCl2溶液(50mmol/L)中，使菌液浓缩，继续冰浴15min，使菌体受敏成感受态细胞，得到重组菌E.coliCSQ1感受态细胞。
(2)质粒pCDSP转入重组菌E.coli CSQ1：
①先取1μl质粒pCDSP加入至100μl E.coli CSQ1感受态细胞中轻轻混匀，冰上放置30min，得到混合液E；之后将混合液E在42℃下进行90s的水浴热击，并将其放置于冰上3min；
③然后向混合液E中加入700μl LB液体培养基得到混合液F，并于37℃培养箱放置50min；
④最后对混合液F进行5min的6000g离心，收集菌体，吸出650μl上清液，将沉淀与剩余的上清液混合均匀后涂布于同时含50mg/l氨苄青霉素与50mg/l链霉素的LB固体培养基上，筛选获得重组菌E.coli CSSP1。
步骤2.蛋白表达及角鲨烯的提取：
(1)将E.coli CSQ1接种至含50mg/l氨苄青霉素LB液体培养基，将E.coli CSSP1接种至含50mg/l氨苄青霉素与50mg/l链霉素的LB液体培养基，于37℃下培养3h至菌体的浓度达到OD600＝0.3，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导蛋白表达；
(2)重组菌E.coli CSSP1及重组菌E.coli CSQ1中角鲨烯的提取；
分别对重组菌E.coli CSSP1及重组菌E.coli CSQ1做以下相同的提取处理，方法如下：
①取20ml菌液，然后对其进行5min的12000g离心，之后倒掉上清液，加入20mlddH2O重悬菌体，再次进行5min的12000g离心并倒掉上清液，重复2次收集得到菌泥；
②将收集的菌泥放入离心管中，冷冻干燥过夜；
③往离心管中加入5ml 60％氢氧化钾/水溶液(w/v)，7.5ml甲醇，7.5ml0.5％焦性没食子酸/甲醇溶液(w/v)，最后放入45℃摇床150rpm温育10h；
④往离心管中加入10ml己烷并震荡5min，用分液漏斗分离收集上层己烷，重复三次，将所有己烷收集到同一个新的50ml离心管中；
⑤往己烷中加入5g无水Na2SO4，在通风橱中于40℃下蒸干己烷，得到固体粗提物。
(3)HPLC法分析角鲨烯合成，按照以下步骤依次进行：
①将上述固体粗提物溶解于1ml甲醇/二氯己烷(9:1，v/v)中；
②采用0.22μm孔径的有机系无菌滤膜过滤甲醇/二氯己烷溶液；
③通过HPLC法对标准品、重组菌E.coli CSSP1的提取物及重组菌E.coli CSQ1的提取物分别进行检测分析，检测条件：柱体为C18，柱温为40℃，样品注入体积为10μl，流动相为甲醇/水溶液(9:1，v/v)，流速为1.0ml/min；
④将标准品、重组菌E.coli CSSP1的提取物及重组菌E.coli CSQ1的提取物的检测结果进行对比分析，结果如图6所示。
结果显示，由标准品的分析证明了角鲨烯合成的出峰时间约为27.2min(图6中A)。同样干重的细胞条件下，重组菌E.coli CSQ1的提取物与重组菌E.coli CSSP1的提取物在27.2min附近均出现一个吸收峰，但是重组菌E.coli CSQ1的吸收峰(图6中B)明显低于重组菌E.coli CSSP1的吸收峰(图6中C)。换算结果显示，重组菌E.coli CSQ1中角鲨烯含量为0.74mg/g(细胞干重，DCW)而重组菌E.coli CSSP1中角鲨烯的含量为1.17mg/g DCW。结果证明，重组菌E.coli CSSP1中Scp-2蛋白的表达使角鲨烯含量提高了58％。
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<210> 1
<211> 5387
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
gccataccgc gaaaggtttt gcgccattcg atggtgtccg ggatctcgac gctctccctt 60
atgcgactcc tgcattagga aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa 120
caattcccct gtagaaataa ttttgtttaa ctttaataag gagatatacc atgggcccgt 180
ctgttgctct gaactctccg cgtctgcgtc gtgttttcgt tgttggtgtt ggtatgacca 240
aattcatgaa accgggtggt gaaaactctc gtgactaccc ggacctggct aaagaagctg 300
gtcagaaagc tctggctgac gctcagatcc cgtactctgc tgttgaacag gcttgcgttg 360
gttacgttta cggtgaatct acctgcggtc agcgtgctat ctaccactct ctgggtctga 420
ccggtatccc gatcatcaac gttaacaaca actgctctac cggttctacc gctctgttca 480
tggctcagca gctggttcag ggtggtctgg ctaactgcgt tctggctctg ggtttcgaaa 540
aaatggaaaa aggttctctg ggtactaaat actctgaccg ttctaacccg ctggaaaaac 600
acatcgacgt tctgatcaac aaatacggta tgtctgcttg cccgttcgct ccgcagctgt 660
tcggttctgc tggtaaagaa cacatggaaa cctacggtac taaagttgaa cacttcgcta 720
aaatcggttg gaaaaaccac aaacactctg ttaacaaccc gtactctcag ttccaggacg 780
aatactctct ggacgaaatc atgaaatctc gtccggtttt cgacttcctg accgttctgc 840
agtgctgccc gacctctgac ggtgctgctg ctgctatcgt ttcttctgaa gaatttgttc 900
agaaacacgg tctgcagtct aaagctgttg aaatcgttgc tcaggaaatg gttaccgaca 960
tgccgtctac cttcgaagaa aaatctgtta tcaaaatggt tggttacgac atgtctaaag 1020
aagctgctcg taaatgctac gaaaaatctg gtctgggtcc gtctgacgtt gacgttatcg 1080
aactgcacga ctgcttctct accaacgaac tgctgaccta cgaagctctg ggtctgtgcc 1140
cggaaggtca gggtggtgct ctggttgacc gtggtgacaa cacctacggt ggtaaatggg 1200
ttatcaaccc gtctggtggt ctgatctcta aaggtcaccc gctgggtgct accggtctgg 1260
ctcagtgcgc tgaactgtgc tggcagctgc gtggtgaagc tggtaaacgt caggttccgg 1320
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aactggaaga agaaggtgaa gaatttgtta aaaaaatcgg tggtatcttc gctttcaaag 1560
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gttctgttct gccggactct gacaaaaaag ctgactgcac catcactatg gctgactctg 1680
acctgctggc tctgatgacc ggtaaaatga acccgcagtc tgctttcttc cagggtaaac 1740
tgaaaatcgc tggtaacatg ggtctggcta tgaaactgca gtctctgcag ctgcagccgg 1800
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gcataatgct taagtcgaac agaaagtaat cgtattgtac acggccgcat aatcgaaatt 1920
aatacgactc actatagggg aattgtgagc ggataacaat tccccatctt agtatattag 1980
ttaagtataa gaaggagata tacatatggc agatctcaat tggatatcgg ccggccacgc 2040
gatcgctgac gtcggtaccc tcgagtctgg taaagaaacc gctgctgcga aatttgaacg 2100
ccagcacatg gactcgtcta ctagcgcagc ttaattaacc taggctgctg ccaccgctga 2160
gcaataacta gcataacccc ttggggcctc taaacgggtc ttgaggggtt ttttgctgaa 2220
acctcaggca tttgagaagc acacggtcac actgcttccg gtagtcaata aaccggtaaa 2280
ccagcaatag acataagcgg ctatttaacg accctgccct gaaccgacga ccgggtcatc 2340
gtggccggat cttgcggccc ctcggcttga acgaattgtt agacattatt tgccgactac 2400
cttggtgatc tcgcctttca cgtagtggac aaattcttcc aactgatctg cgcgcgaggc 2460
caagcgatct tcttcttgtc caagataagc ctgtctagct tcaagtatga cgggctgata 2520
ctgggccggc aggcgctcca ttgcccagtc ggcagcgaca tccttcggcg cgattttgcc 2580
ggttactgcg ctgtaccaaa tgcgggacaa cgtaagcact acatttcgct catcgccagc 2640
ccagtcgggc ggcgagttcc atagcgttaa ggtttcattt agcgcctcaa atagatcctg 2700
ttcaggaacc ggatcaaaga gttcctccgc cgctggacct accaaggcaa cgctatgttc 2760
tcttgctttt gtcagcaaga tagccagatc aatgtcgatc gtggctggct cgaagatacc 2820
tgcaagaatg tcattgcgct gccattctcc aaattgcagt tcgcgcttag ctggataacg 2880
ccacggaatg atgtcgtcgt gcacaacaat ggtgacttct acagcgcgga gaatctcgct 2940
ctctccaggg gaagccgaag tttccaaaag gtcgttgatc aaagctcgcc gcgttgtttc 3000
atcaagcctt acggtcaccg taaccagcaa atcaatatca ctgtgtggct tcaggccgcc 3060
atccactgcg gagccgtaca aatgtacggc cagcaacgtc ggttcgagat ggcgctcgat 3120
gacgccaact acctctgata gttgagtcga tacttcggcg atcaccgctt ccctcatact 3180
cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat 3240
atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat agctagctca ctcggtcgct acgctccggg 3300
cgtgagactg cggcgggcgc tgcggacaca tacaaagtta cccacagatt ccgtggataa 3360
gcaggggact aacatgtgag gcaaaacagc agggccgcgc cggtggcgtt tttccatagg 3420
ctccgccctc ctgccagagt tcacataaac agacgctttt ccggtgcatc tgtgggagcc 3480
gtgaggctca accatgaatc tgacagtacg ggcgaaaccc gacaggactt aaagatcccc 3540
accgtttccg gcgggtcgct ccctcttgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgtttaccgg 3600
atacctgttc cgcctttctc ccttacggga agtgtggcgc tttctcatag ctcacacact 3660
ggtatctcgg ctcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtaagcaa gaactccccg 3720
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acggtaaaac gccactggca gcagccattg gtaactggga gttcgcagag gatttgttta 3840
gctaaacacg cggttgctct tgaagtgtgc gccaaagtcc ggctacactg gaaggacaga 3900
tttggttgct gtgctctgcg aaagccagtt accacggtta agcagttccc caactgactt 3960
aaccttcgat caaaccacct ccccaggtgg ttttttcgtt tacagggcaa aagattacgc 4020
gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tactgaaccg ctctagattt 4080
cagtgcaatt tatctcttca aatgtagcac ctgaagtcag ccccatacga tataagttgt 4140
aattctcatg ttagtcatgc cccgcgccca ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct 4200
caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta atgagtgagc taacttacat taattgcgtt 4260
gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg 4320
ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca 4380
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ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga 4500
tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt atcccactac cgagatgtcc gcaccaacgc 4560
gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca 4620
gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca 4680
tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt 4740
tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg agacagaact taatgggccc gctaacagcg 4800
cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat 4860
gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa 4920
cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg catcctggtc atccagcgga tagttaatga 4980
tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc 5040
cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa 5100
tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca gggccagact ggaggtggca acgccaatca 5160
gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg 5220
ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca 5280
cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg catactctgc gacatcgtat aacgttactg 5340
gtttcacatt caccaccctg aattgactct cttccgggcg ctatcat 5387
<210> 2
<211> 1644
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
atgccgtctg ttgctctgaa ctctccgcgt ctgcgtcgtg ttttcgttgt tggtgttggt 60
atgaccaaat tcatgaaacc gggtggtgaa aactctcgtg actacccgga cctggctaaa 120
gaagctggtc agaaagctct ggctgacgct cagatcccgt actctgctgt tgaacaggct 180
tgcgttggtt acgtttacgg tgaatctacc tgcggtcagc gtgctatcta ccactctctg 240
ggtctgaccg gtatcccgat catcaacgtt aacaacaact gctctaccgg ttctaccgct 300
ctgttcatgg ctcagcagct ggttcagggt ggtctggcta actgcgttct ggctctgggt 360
ttcgaaaaaa tggaaaaagg ttctctgggt actaaatact ctgaccgttc taacccgctg 420
gaaaaacaca tcgacgttct gatcaacaaa tacggtatgt ctgcttgccc gttcgctccg 480
cagctgttcg gttctgctgg taaagaacac atggaaacct acggtactaa agttgaacac 540
ttcgctaaaa tcggttggaa aaaccacaaa cactctgtta acaacccgta ctctcagttc 600
caggacgaat actctctgga cgaaatcatg aaatctcgtc cggttttcga cttcctgacc 660
gttctgcagt gctgcccgac ctctgacggt gctgctgctg ctatcgtttc ttctgaagaa 720
tttgttcaga aacacggtct gcagtctaaa gctgttgaaa tcgttgctca ggaaatggtt 780
accgacatgc cgtctacctt cgaagaaaaa tctgttatca aaatggttgg ttacgacatg 840
tctaaagaag ctgctcgtaa atgctacgaa aaatctggtc tgggtccgtc tgacgttgac 900
gttatcgaac tgcacgactg cttctctacc aacgaactgc tgacctacga agctctgggt 960
ctgtgcccgg aaggtcaggg tggtgctctg gttgaccgtg gtgacaacac ctacggtggt 1020
aaatgggtta tcaacccgtc tggtggtctg atctctaaag gtcacccgct gggtgctacc 1080
ggtctggctc agtgcgctga actgtgctgg cagctgcgtg gtgaagctgg taaacgtcag 1140
gttccgggtg ctaaagttgc tctgcagcac aacctgggtc tgggtggtgc tgctgttgtt 1200
accctgtacc gtatgggttt cccggaagct gcttcttctt tccgtaccca ccagatctct 1260
gctgctccga cctcttctgc tggtgacggt ttcaaagcta acctgatctt caaagaaatc 1320
gaaaaaaaac tggaagaaga aggtgaagaa tttgttaaaa aaatcggtgg tatcttcgct 1380
ttcaaagtta aagacggtcc gggtggtaaa gaagctacct gggttgttga cgttaaaaac 1440
ggtaaaggtt ctgttctgcc ggactctgac aaaaaagctg actgcaccat cactatggct 1500
gactctgacc tgctggctct gatgaccggt aaaatgaacc cgcagtctgc tttcttccag 1560
ggtaaactga aaatcgctgg taacatgggt ctggctatga aactgcagtc tctgcagctg 1620
cagccggaca aagctaaact gtaa 1644
<210> 3
<211> 5502
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
gtttgacagc ttatcatcga ctgcacggtg caccaatgct tctggcgtca ggcagccatc 60
ggaagctgtg gtatggctgt gcaggtcgta aatcactgca taattcgtgt cgctcaaggc 120
gcactcccgt tctggataat gttttttgcg ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc 180
tgaaatgagc tgttgacaat taatcatccg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga 240
taacaatttc acacaggaaa cagaccatgg atgggcggta aactgctgca gctggctctg 300
cacccggttg aaatgaaagc tgctctgaaa ctgaaattct gccgtacccc gctgttctct 360
atctacgacc agtctacctc tccgtacctg ctgcactgct tcgaactgct gaacctgacc 420
tctcgttctt tcgctgctgt tatccgtgaa ctgcacccgg aactgcgtaa ctgcgttacc 480
ctgttctacc tgatcctgcg tgctctggac accatcgaag acgacatgtc tatcgaacac 540
gacctgaaaa tcgacctgct gcgtcacttc cacgaaaaac tgctgctgac caaatggtct 600
ttcgacggta acgctccgga cgttaaagac cgtgctgttc tgaccgactt cgaatctatc 660
ctgatcgaat ttcacaaact gaaaccggaa taccaggaag ttatcaaaga aatcaccgaa 720
aaaatgggta acggtatggc tgactacatc ctggacgaaa actacaacct gaacggtctg 780
cagaccgttc acgactacga cgtttactgc cactacgttg ctggtctggt tggtgacggt 840
ctgacccgtc tgatcgttat cgctaaattc gctaacgaat ctctgtactc taacgaacag 900
ctgtacgaat ctatgggtct gttcctgcag aaaaccaaca tcatccgtga ctacaacgaa 960
gacctggttg acggtcgttc tttctggccg aaagaaatct ggtctcagta cgctccgcag 1020
ctgaaagact tcatgaaacc ggaaaacgaa cagctgggtc tggactgcat caaccacctg 1080
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gttttcaaca accgtgaagt tctgcacggt aacgttaaaa tccgtaaagg tactacctgc 1260
tacctgatcc tgaaatctcg taccctgcgt ggttgcgttg aaatcttcga ctactacctg 1320
cgtgacatca aatctaaact ggctgttcag gacccgaact tcctgaaact gaacatccag 1380
atctctaaaa tcgaacagtt catggaagaa atgtaccagg acaaactgcc gccgaacgtt 1440
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tctgttctgc tgggtttcta ctacatctac accctgcacc gtgcttaagg tacccgggga 1620
tcctctagag tcgacctgca ggcatgcaag cttggctgtt ttggcggatg agagaagatt 1680
ttcagcctga tacagattaa atcagaacgc agaagcggtc tgataaaaca gaatttgcct 1740
ggcggcagta gcgcggtggt cccacctgac cccatgccga actcagaagt gaaacgccgt 1800
agcgccgatg gtagtgtggg gtctccccat gcgagagtag ggaactgcca ggcatcaaat 1860
aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc ctttcgtttt atctgttgtt tgtcggtgaa 1920
cgctctcctg agtaggacaa atccgccggg agcggatttg aacgttgcga agcaacggcc 1980
cggagggtgg cgggcaggac gcccgccata aactgccagg catcaaatta agcagaaggc 2040
catcctgacg gatggccttt ttgcgtttct acaaactctt tttgtttatt tttctaaata 2100
cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga 2160
aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca 2220
ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat 2280
cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag 2340
agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc 2400
gcggtattat cccgtgttga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct 2460
cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca 2520
gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt 2580
ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat 2640
gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt 2700
gacaccacga tgcctacagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta 2760
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tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 3420
ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 3480
tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 3540
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gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 3660
ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct 3720
gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg 3780
agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct 3840
tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc 3900
tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc 3960
gaggaagcgg aagagcgcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca 4020
caccgcatat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagtat 4080
acactccgct atcgctacgt gactgggtca tggctgcgcc ccgacacccg ccaacacccg 4140
ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg 4200
tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgaggcagc 4260
agatcaattc gcgcgcgaag gcgaagcggc atgcatttac gttgacacca tcgaatggtg 4320
caaaaccttt cgcggtatgg catgatagcg cccggaagag agtcaattca gggggtgaat 4380
gtgaaaccag taacgttata cgatgtcgca gagtatgccg gtgtctctta tcagaccgtt 4440
tcccgcgtgg tgaaccaggc cagccacgtt tctgcgaaaa cgcgggaaaa agtggaagcg 4500
gcgatggcgg agctgaatta cattcccaac cgcgtggcac aacaactggc gggcaaacag 4560
tcgttgctga ttggcgttgc cacctccagt ctggccctgc acgcgccgtc gcaaattgtc 4620
gcggcgatta aatctcgcgc cgatcaactg ggtgccagcg tggtggtgtc gatggtagaa 4680
cgaagcggcg tcgaagcctg taaagcggcg gtgcacaatc ttctcgcgca acgcgtcagt 4740
gggctgatca ttaactatcc gctggatgac caggatgcca ttgctgtgga agctgcctgc 4800
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tggcataaat atctcactcg caatcaaatt cagccgatag cggaacggga aggcgactgg 5040
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gggctgcgcg ttggtgcgga tatctcggta gtgggatacg acgataccga agacagctca 5220
tgttatatcc cgccgttaac caccatcaaa caggattttc gcctgctggg gcaaaccagc 5280
gtggaccgct tgctgcaact ctctcagggc caggcggtga agggcaatca gctgttgccc 5340
gtctcactgg tgaaaagaaa aaccaccctg gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc 5400
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<210> 4
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
atgggcggta aactgctgca gctggctctg cacccggttg aaatgaaagc tgctctgaaa 60
ctgaaattct gccgtacccc gctgttctct atctacgacc agtctacctc tccgtacctg 120
ctgcactgct tcgaactgct gaacctgacc tctcgttctt tcgctgctgt tatccgtgaa 180
ctgcacccgg aactgcgtaa ctgcgttacc ctgttctacc tgatcctgcg tgctctggac 240
accatcgaag acgacatgtc tatcgaacac gacctgaaaa tcgacctgct gcgtcacttc 300
cacgaaaaac tgctgctgac caaatggtct ttcgacggta acgctccgga cgttaaagac 360
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gctaacgaat ctctgtactc taacgaacag ctgtacgaat ctatgggtct gttcctgcag 660
aaaaccaaca tcatccgtga ctacaacgaa gacctggttg acggtcgttc tttctggccg 720
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atgtaccagg acaaactgcc gccgaacgtt aaaccgaacg aaaccccgat cttcctgaaa 1200
gttaaagaac gttctcgtta cgacgacgaa ctggttccga cccagcagga agaagaatac 1260
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accctgcacc gtgcttaa 1338

Claims (1)

1.一种利用质粒pCDSP提高大肠杆菌中角鲨烯含量的方法，其特征在于，所述质粒pCDSP包括载体pCDFDuet-1，载体pCDFDuet-1内插入有阻碍蛋白表达基因lacI、大肠杆菌复制起始位点CDF ori、链霉素抗性基因和Scp-2蛋白基因scp2，Scp-2蛋白基因scp2上游具有PT7启动子以启动Scp-2蛋白基因scp2的表达，质粒pCDSP的核苷酸序列如序列1所示，Scp-2蛋白基因scp2的核苷酸序列如序列2所示；
质粒pCDSP的制备方法具体按照以下步骤实施：
步骤1，依据大鼠Scp-2蛋白的氨基酸序列，并根据大肠杆菌密码子偏好性设计出适合大肠杆菌表达的Scp-2蛋白基因scp2，之后将Scp-2蛋白基因scp2插入载体pUC57中得到质粒pUCSP，Scp-2蛋白基因scp2的核苷酸序列如序列2所示；
步骤2，质粒pUCSP中的Scp-2蛋白基因scp2通过酶切和连接反应插入载体pCDFDuet-1中，形成质粒pCDSP；
步骤3，利用菌落PCR与双酶切方法对质粒pCDSP进行验证；
在所述步骤1中，Scp-2蛋白基因scp2的两端分别添加有NcoI酶切位点和EcoRI酶切位点；
在所述步骤2中，先采用NcoI和 EcoRI两种限制性内切酶分别对质粒pUCSP与载体pCDFDuet-1进行双酶切，然后通过凝胶电泳回收Scp-2蛋白基因scp2片段与线性化的载体pCDFDuet-1，之后再通过连接反应将Scp-2蛋白基因片段插入线性化的载体pCDFDuet-1并转入大肠杆菌DH5α中，最后利用氨苄青霉素抗性基因筛选得到质粒pCDSP；
所述利用质粒pCDSP提高大肠杆菌中角鲨烯含量的方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1，先将野生菌株E. coli C43(DE3)制备成氯化钙感受态细胞，然后通过热击法转化质粒pTsqs，最后利用氨苄青霉素抗性筛选和菌落PCR验证获得能够合成角鲨烯的重组菌E. coli CSQ1，质粒pTsqs的核苷酸序列如序列4所示；
步骤2，热击法将质粒pCDSP转入E. coli CSQ1，利用链霉素抗性筛选和菌落PCR验证获得重组菌E. coli CSSP1；
步骤3，分析重组菌E. coli CSSP1中角鲨烯的含量；具体为：先采用LB液体培养基培养重组菌E. coli CSSP1，之后加入诱导剂IPTG诱导Scp-2蛋白基因scp2表达；之后通过皂化法分离、提取合成的角鲨烯；最后通过高效液相色谱法检测该角鲨烯的含量。
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