KR101728600B1 - 자일로비오스 생산을 위한 β-자일로시다아제 발현 시스템 - Google Patents

Abstract

본 발명은 자일로비오스 생산을 위한 β-자일로시다아제 발현 시스템을 제공한다.
본 발명에 따른 β-자일로시다아제 발현 시스템은 자일로스로부터 자일로비오스로의 생전환율이 높은 β-자일로시다아제를 제공하며, 짧은 시간 동안에 높은 수율로 자일로비오스의 대량 생산이 가능하게 한다. 이에 따라, 신규 설탕 보완재의 대량 확보가 가능하며, 기능성 당 산업뿐만 아니라 이를 이용한 건강식품 소재, 의약용, 화장품용 소재 등에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

자일로비오스 생산을 위한 β-자일로시다아제 발현 시스템 {β-xylosidase expression system for producing xylobiose}

본 발명은 자일로스를 자일로비오스로 전환하는 β-자일로시다아제를 포함하는 자일로비오스 생산용 조성물, 이를 제조하기 위한 발현 컨스트럭트 및 재조합 균주, 자일로스로부터 자일로비오스를 제조하는 방법에 관한 것이다.

자일로-올리고사카라이드(Xylo-oligosaccharide, XOS)는 올리고당의 일종으로 자일로스(xylose)가 β-(1,4)-linkage에 의해 결합된 형태이며, 이는 인체의 소화효소에 의해 분해되지 않아 대장까지 흡수되지 않고 도달한다. 자일로-올리고사카라이드(Xylo-oligosaccharide, XOS)는 장내 유익미생물인 Bifidobateria에 의해 분해되어 선택적으로 Bifidobacteria의 증식을 유도하는 것으로 알려져 있으며, 항암 활성, 정균 활성 등의 건강 기능성을 나타내는 것이 알려져 있다. 또한, 우수한 보습 효과를 가짐으로써, 이를 화장품에 적용하려는 시도가 이루어지고 있다.

이러한 자일로-올리고사카라이드의 상업적 생산을 위해서는 목재, 면실각, 옥수수심 등에 물리화학적인 전처리 과정을 거친 후 엔도-자일라나제(endo-xylanase)와 β-자일로시다아제에 의한 자일란의 분해를 거쳐야한다. 그런데, 자일로-올리고사카라이드 생산 과정 중 전처리 과정은 많은 양의 화학물질 사용을 필요로 하기 때문에, 공정에서 폐수 등의 다량의 오염물질이 발생하는 문제점이 존재한다.

한편, 시판되는 자일로-올리고사카라이드 제품들은 일반적으로 혼합물 형태의 자일로-올리고사카라이드로 제공된다. 즉, 자일로-올리고사카라이드에서 자일로비오스만을 분리, 정제하는데는 어려운 점이 많기 때문에, 시판되는 물질로써 고순도의 자일로비오스 제품은 없다.

그런데, 자일로-올리고사카라이드의 중합도가 높은 경우에는 착색 경향이 낮아지고 Bifidobateria 등에 의한 자화성이 좋지 못하기 때문에, 자일로비오스(xylobiose)와 같은 중합도가 낮은 물질을 선택적으로 생산할 필요성이 있다.

또한, 보존 중에서의 미생물 증식을 방지하기 위해서나, 식품의 본래의 조성을 손상시키지 않기 위해서나, 수송 비용을 저감시키기 위하여, 가능한 고농도의 시럽이 바람직하다. 또한, 분말화한 자일로올리고사카라이드를 제조할 때에 분무 건조시키려면 농축시킨 액체를 사용하는 것이 바람직하다.

하지만, 현재까지 알려진 방법으로 순도가 높은 자일로비오스를 생산하기 어려우며, 이에 따라 자일란에 효소 처리를 통해 고순도 자일로비오스(xylobiose) 시럽을 생산하려는 다양한 시도가 있었으나, 아직까지 관련 성과가 이루어진 것이 없다.

이러한 배경 하에, 자일로-올리고사카라이드가 가지는 모든 생리 활성의 주요인으로 알려진 자일로비오스(xylobiose)를 고순도로 얻기 위한 연구개발이 필요하며, 특히 고부가가치 신규 기능성 감미소재인 자일로비오스(xylobiose) 생산을 위한 효과적인 자일로비오스 생산 공정에 대한 연구 개발이 이루어져야 한다.

본 발명은 자일로스를 자일로비오스로 전환하는 활성을 가지는 신규 β-자일로시다아제를 포함하는 자일로비오스 생산용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 신규 β-자일로시다아제를 제조하는 방법 또는 신규 β-자일로시다아제를 제조하기 위해 필요한 다양한 요소들을 제공한다.

본 발명은 또한 자일로스로부터 자일로비오스를 제조하는 방법 또는 자일로스로부터 자일로비오스를 제조하기 위해 필요한 다양한 요소들을 제공하는데 있다.

본 발명자들은 건강기능성 당류인 자일로비오스(xylobiose)의 효과적인 생산을 위하여, 상업적으로 이용이 가능한 β-자일로시다아제 발현 시스템 및 자일로비오스 생산 방법 기술을 개발하고자 예의 노력한 결과 신규 β-자일로시다아제를 이용하여 자일로스를 자일로비오스로 대량 전환하는데 성공하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 β-자일로시다아제를 포함하는 자일로비오스 생산용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 자일로비오스 생산용 조성물은 자일로스를 자일로비오스로 전환시킬 수 있는 신규 β-자일로시다아제에 관한 것으로, 자일로스의 자일로비오스로의 전환에 대한 최대 활성을 가지고, 짧은 시간 동안에 높은 수율로 자일로비오스의 대량 생산이 가능하다. 상기 β-자일로시다아제는 바실러스 퍼밀러스 (Bacillus pumilus) 유전체 DNA에 존재하는 DNA 중 특정 DNA을 중합효소반응에 의해 증폭시키고, 증폭된 특정 DNA를 발현 컨스트럭트에 삽입하여 재조합 발현 컨스트럭트를 제조한 후, 상기 재조합 발현 컨스트럭트로 숙주 균주를 형질전환시켜 재조합 균주를 제조한 후, 상기 재조합 균주를 배양하여 발현시키는 방법으로 얻어질 수 있다. 보다 바람직하게는 서열번호 12의 바실러스 퍼밀러스 (Bacillus pumilus) IPO xynB 유전자를 합성하고, 이로부터 서열번호 2의 β-자일로시다아제 염기서열을 얻어, 이를 발현 컨스트럭트에 삽입하여 재조합 발현 컨스트럭트를 제조한 후, 상기 재조합 발현 컨스트럭트로 숙주 균주를 형질전환시켜 재조합 균주를 제조한 후, 상기 재조합 균주를 배양하여 발현시키는 방법으로 얻어질 수 있다.

상기 재조합 균주의 숙주 균주는 식품학적으로 안전한 균주인 것이 바람직하다. 상기 식품학적으로 안전한 균주는 일반적으로 안전한 것으로 인정되는 GRAS(generally accepted as safe)급 균주를 의미하며, 예를 들어 사카로마이세스속 균주(Saccharomyces sp.), 바실러스속 균주(Bacillus sp.), 코리네박테리움속 균주(Corynebacterium sp.) 등에서 선택될 수 있다. 상기 균주들은 사료, 의약품 및 식품 등의 분야에서 다양한 용도를 갖는 화학물질을 생산하는 산업용 미생물이다. 이러한 균주들은 유전자 조작 및 대량 배양에 용이하거나, 다양한 공정 조건에서 높은 안정성을 가지는 균주이다. 또한, 이러한 균주들은 다른 세균에 비하여 상대적으로 단단한 세포막 구조를 보유하고 있기 때문에 높은 당 농도 등에 의한 삼투압의 영향 하에서도 균체가 안정적인 상태로 존재하는 생물학적 특성을 보인다. 상기 GRAS(generally accepted as safe)급 균주의 구체적인 예로는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 바실러스 서브틸리스(bacillus subtilis), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 등이 있으며, 바람직하게 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)이다.

본 발명에 따른 β-자일로시다아제는 바람직하게는 분자량이 55 내지 60 kDa이고 최적 활성 온도가 40~60℃, 바람직하게 45 내지 55 ℃의 범위이고, 최적 활성 pH가 5.0~8.0, 바람직하게 6.0 내지 7.0의 범위이다. 본 발명에 따른 β-자일로시다아제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지나, 본 발명에 따른 β-자일로시다아제의 균등 범위는 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따른 β-자일로시다아제의 균등 범위는 자일로스를 자일로비오스로 전환하는 활성이 유지되는 한, 서열번호 1의 아미노산 중 일부가 치환, 삽입 및/또는 결실된 것일 수 있다.

상기 아미노산의 치환은 바람직하게는 단백질의 특성이 바뀌지 않는 보존적 아미노산 치환(conservative amino acid replacement)에 의해 이루어지는 것이 바람직하다. 또한, 상기 아미노산의 변형은 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화 등에 의해 이루어질 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 β-자일로시다아제의 균등 범위는 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 자일로스의 자일로비오스로의 전환에 대한 활성이 증가한 단백질을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 β-자일로시다아제의 균등 범위는 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명은 또한, 자일로스를 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 β-자일로시다아제 또는 β-자일로시다아제를 포함하는 조성물과 반응시키는 단계를 포함하는 자일로비오스 생산 방법을 제공한다.

상기 β-자일로시다아제를 포함하는 조성물은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 β-자일로시다아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환되거나 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 β-자일로시다아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 컨스트럭트에 의해 형질전환된 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양물 또는 상기 재조합 균주의 파쇄물을 포함한다. 이때, 상기 β-자일로시다아제 또는 β-자일로시다아제를 포함하는 조성물의 반응 온도는 40 내지 60 ℃, 바람직하게 45 내지 55 ℃이고, 반응 pH는 5.0 내지 8.0, 바람직하게 6.0 내지 7.0일 수 있으며, 반응을 위한 자일로스 농도는 400 g/L 내지 1000 g/L, 바람직하게 500 내지 800 g/L일 수 있으나, 농도는 특별히 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 서열번호 2의 β-자일로시다아제 염기 서열, GPD 프로모터 염기 서열, His-tag 염기 서열 및 delta 염기 서열을 포함하는 β-자일로시다아제 발현 컨스트럭트를 제공한다. 본 발명의 β-자일로시다아제 발현 컨스트럭트는 형질전환체에서 신규 β-자일로시다아제를 고효율로 발현할 수 있어 저비용으로 대량의 β-자일로시다아제를 생산할 수 있다.

본 발명에 따른 β-자일로시다아제 발현 컨스트럭트는 GPD promoter를 통해 강력하게 β-자일로시다아제가 발현되며, transposon 기능을 가진 delta 서열을 포함하여 세포 내의 지속적인 발현이 가능하며, His-tag 서열을 포함하여 분리 정제가 용이하다.

본 발명에 있어서, 발현 컨스트럭트는 세포 내에서 단백질 발현을 위한 최소의 엘리먼트(elemnet)만을 포함하는 핵산분자를 의미한다. 바람직하게는 본 발명의 발현 컨스트럭트는 상기 언급된 구성요소들을 최소의 필수 구성요소로 포함한다.

본 발명의 발현 컨스트럭트는 재조합 벡터일 수 있다. 바람직하게, 당업계에 알려진 벡터 재조합 방법에 따라 GPD 프로모터 염기 서열을 His-tag 염기 서열이 첨가된 서열번호 2의 β-자일로시다아제 염기 서열 상류에 연결하고, delta 염기 서열을 포함하는 재조합 벡터일 수 있다. 여기서, 상기 GPD 프로모터 염기 서열은 서열번호 3의 염기서열을 포함할 수 있으며, His- tag 염기 서열은 서열번호 4의 염기서열을 포함할 수 있으며, delta 염기서열은 서열번호 5의 염기 서열을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 발현 컨스트럭트는 서열번호 6의 2-micron 염기 서열, 서열번호 7의 암피실린 저항성 유전자 염기 서열, 서열번호 8의 CYC.1 터미네이터 염기 서열 및 서열번호 9의 TRP 염기 서열 중 어느 하나 이상을 더 포함하는 β-자일로시다아제 발현 컨스트럭트이다.

상기 언급된 염기서열들은 기능적으로 동등한 성질을 가지는 이상, 상기 각각의 염기 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95%이상, 또는 99% 이상의 상동성을 가지는 염기서열을 본 발명의 범주에 포함하는 것이다.

예컨대, 본원 발명에 따른 β-자일로시다아제 발현 컨스트럭트는 2-micron, 암피실린 저항성 유전자, GPD 프로모터, His-Tag, CYC.1 터미네이터, Delta 및 TRP1 서열을 가지는 발현벡터에 서열번호 2의 β-자일로시다아제 염기 서열이 삽입된 것으로, 도 1에 기재된 재조합 발현 벡터 구조를 가진다. 재조합 벡터의 모식도는 도 1에 나타내었다. 상기 β-자일로시다아제 삽입을 위한 컨스트럭트는 서열번호 10의 염기서열을 가질 수 있다. 또한, 일실시예에 따르면, β-자일로시다아제 발현 컨스트럭트는 서열번호 11의 염기서열을 가진다.

본 발명은 또한, β-자일로시다아제 발현 컨스트럭트를 포함하는 β-자일로시다아제 생산용 형질전환 균주를 제공한다. 상기 재조합 균주의 숙주 균주는 식품학적으로 안전한 균주인 것이 바람직하다. 식품학적으로 안전한 균주는 일반적으로 안전한 것으로 인정되는 GRAS(generally accepted as safe)급 균주를 의미하며, 예를 들어 사카로마이세스속 균주(Saccharomyces sp.), 바실러스속 균주(Bacillus sp.), 코리네박테리움속 균주(Corynebacterium sp.) 등에서 선택될 수 있다. 구체적인 예로는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 바실러스 서브틸리스(bacillus subtilis), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 등이 있으며, 바람직하게 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)이다. 가장 바람직하게 본 발명에 따른 β-자일로시다아제 생산용 형질전환 균주는 기탁번호 KCTC 18382P로 2015년 4월 29일 자에 한국생명공학 연구원 미생물자원센터에 기탁된 형질전환 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) pTSY01-XynB이다.

본 발명에 있어서, 상기 β-자일로시다아제 발현 컨스트럭트를 균주에 형질전환하는 방법은 당업계에 공지된 형질전환하는 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들어, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리 법, 유전자 밤바드먼트, 초산-리튬 DMSO법 등을 포함한다.

본 발명은 또한, (a) β-자일로시다아제 생산용 형질전환 균주를 배지 총 중량에 대하여 0.5 내지2 중량 %의 효모 추출물(yeast extract), 1 내지 3 중량 %의 펩톤(peptone) 및 1 내지 4 중량 %의 글루코즈를 포함하는 YPD 배지에 접종하는 단계;

(b) 반응 온도 25 내지 35 ℃ 및 반응 pH 7.5 내지 8.5로 배양하는 단계; 및

(c) 상기 (b) 단계의 배양액으로부터 β-자일로시다아제를 분리하는 단계를 포함하는 β-자일로시다아제의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 β-자일로시다아제의 제조방법은 (a) β-자일로시다아제 생산용 형질전환 균주를 배지 총 중량에 대하여 0.5 내지2 중량 %의 효모 추출물(yeast extract), 1 내지 3 중량 %의 펩톤(peptone) 및 1 내지 4 중량 %의 글루코즈를 포함하는 YPD 배지에 접종하는 단계를 포함한다. 본 발명에 있어서, YPD 배지는 상기 함량 범위의 효모 추출물, 펩톤 및 글루코즈를 포함하여 배양시에 균주의 빠른 성장 및 β-자일로시다아제 생산에 효과를 보인다. 본 발명에 따른 형질전환 균주는 바람직하게 형질전환 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 보다 바람직하게 기탁번호 KCTC 18382P의 형질전환 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) pTSY01-XynB이다.

본 발명에 따른 β-자일로시다아제의 제조방법은 (b) 반응 온도 25 내지 35 ℃, 바람직하게 28 내지 32 ℃ 및 반응 pH 7.5 내지 8.5, 바람직하게 pH 7.8 내지 8.2로 배양하는 단계를 포함한다. 본 발명에 있어서, 상기 배양은 100 rpm 내지 400 rpm의 조건하에서 수행하는 것이 바람직하며, 상기 온도 및 pH 조건 하에서 빠른 성장 및 β-자일로시다아제 생산에 효과를 보인다.

본 발명에 따른 β-자일로시다아제의 제조방법은 (c) 상기 (b) 단계의 배양액으로부터 β-자일로시다아제를 분리하는 단계를 포함하는 β-자일로시다아제의 제조방법을 제공한다. 상기 β-자일로시다아제를 분리하는 단계는 동결-해동 반복, 초음파 처리, 기계적 파괴 또는 세포 분해제와 같은 다양한 물질적 또는 화학적 수단에 의해 파괴될 수 있으며, 통상적인 생화학 분리 기술에 의해서 분리 또는 정제가 가능하다. 예를 들어, 균주에 의해 발현된 단백질의 분리 또는 정제방법으로는 전기영동, 원심분리, 겔 여과, 침전, 투석, 크로마토그래피(이온교환크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 면역흡착 친화력 크로마토그래피, 역상 HPLC, 겔 침투 HPLC), 등전성 포커스 및 이의 다양한 변화 또는 복합 방법을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 한편, 본 발명에서 형질전환 균주의 파쇄물로부터 β-자일로시다아제를 분리하는 것은 바람직하게는 펩티드 태그를 이용한 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)에 의해 수행될 수 있다. 상기 펩티드 태그로는 HA 태그, FLAG 태그, His 태그, BCCP (biotin carboxyl carrier protein), c-myc 태그, V5 태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라아제 (GST) 또는 MBP(maltose binding protein) 등과 같이 공지의 다양한 태그를 사용할 수 있으며, 이중 His 태그인 것이 바람직하다. His-태깅된 단백질은 Ni-NTA(니켈-니트릴로트리아세트산) 수지의 칼럼 상에 특이적으로 트랩핑되어 분리가능하다. 또한, 상기 분리된 β-자일로시다아제는 사용을 위하여 투석 후 농축시키는 단계가 더 수행될 수 있다.

본 발명에 따른 β-자일로시다아제 발현 시스템은 자일로스로부터 자일로비오스로의 생전환율이 높은 β-자일로시다아제를 제공하며, 짧은 시간 동안에 높은 수율로 자일로비오스의 대량 생산이 가능하게 한다. 이에 따라, 신규 설탕 보완재의 대량 확보가 가능하며, 기능성 당 산업뿐만 아니라 이를 이용한 건강식품 소재, 의약용, 화장품용 소재 등에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 β-자일로시다아제 발현 컨스트럭트의 일모식도를 나타낸다.
도 2는 온도 조건에 따른 β-자일로시다아제 발현 최적화 조건 확인 결과를 나타낸다.
도 3은 pH 조건에 따른 β-자일로시다아제 발현 최적화 조건 확인 결과를 나타낸다.
도 4는 탄소원 조건에 따른 β-자일로시다아제 발현 최적화 조건 확인 결과를 나타낸다.
도 5는 자일로스 600 g/L 및 β-자일로시다아제 1 U 처리시 자일로비오스 생합성 전환율 결과를 나타낸다.
도 6은 자일로스 600 g/L 및 β-자일로시다아제 2 U 처리시 자일로비오스 생합성 전환율 결과를 나타낸다.
도 7은 자일로스 700 g/L 및 β-자일로시다아제 1 U 처리시 자일로비오스 생합성 전환율 결과를 나타낸다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

<실시예 1> β-자일로시다아제 ( XynB ) 발현 벡터 클로닝 및 발현 시스템 제작

서열번호 12의 Bacillus pumilus IPO xynB의 DNA (2,201 bp)를 합성한 후, 제한효소 자리가 첨가된 primer를 제작하여 PCR을 통해 β-자일로시다아제 DNA를 제조하였다.

발아 효모에서 강력하게 발현되는 GPD promoter를 포함하는 벡터(pTSY01)에 β-자일로시다아제를 삽입하기 위하여 합성된 double-stranded β-자일로시다아제 DNA를 template로 하여 다음의 서열을 가진 primer set로 PCR을 수행하였다. 상기 GPD promoter를 포함하는 벡터는 서열번호 13의 염기 서열을 가진다.

상기, PCR기법으로 amplification한 XynB를 pTSY01 내 삽입하기 위하여 BamHI, XhoI으로 double enzyme cutting을 수행하였다. 벡터에 삽입되는 β-자일로시다아제 서열은 서열번호 2의 염기 서열을 가진다. 또한, pTSY01 벡터 역시 같은 제한효소로 cutting을 수행하였다. Cutting한 XynB와 pTSY01를 gel elution을 통해 정제한 뒤, T4 ligase를 이용하여 ligation을 수행하였다. Ligation한 DNA 샘플을 E.coli에 transformation한 뒤, ampicillin-resistant colony를 선별하고, 다음의 primer set을 이용한 DNA sequencing을 통해 XynB의 염기서열에 대한 서열 분석을 정확히 수행하였다.

또한, GPD promoter를 통해 강력하게 발현되는 XynB의 발아효모 세포 내의 지속적인 발현을 위해 transposon 기능을 가진 delta sequence를 삽입하기 위하여 발아효모의 gDNA를 template으로 하여 다음의 서열을 가진 primer set으로 PCR을 수행하였다.

PCR기법으로 amplification한 delta sequence를 pTSY01-XynB 내 삽입을 위하여 NgoMIV로 enzyme cutting을 수행하였다. 동시에, pTSY01-XynB 역시 같은 제한효소로 cutting을 진행하였다. Cutting한 delta sequence와 pTSY01-XynB를 gel elution을 통해 정제한 뒤, T4 ligase를 이용하여 ligation을 진행하였다. Ligation한 DNA 샘플을 E.coli에 transformation한 뒤, ampicillin-resistant colony를 선별하고, 다음의 primer set을 이용한 DNA sequencing을 통해 delta의 삽입여부를 확인하고 β-자일로시다아제 (XynB) 발현 벡터를 완성하였다. β-자일로시다아제 발현 벡터의 모식도는 도 1에 나타내었으며, 서열번호 11의 염기서열을 가진다.

<실시예 2> β-자일로시다아제 생산 Saccharomyces cerevisiae 재조합 균주 제조

상기 제조된 β-자일로시다아제 (XynB) 발현 벡터는 하기 방법에 의해 Saccharomyces cerevisiae SK1 균주에 형질전환되었다.

30 ℃ 조건, 밤샘으로 YPG 플레이트에서 Saccharomyces cerevisiae SK1 균주를 배양하고, 5 ml YPD배지에 콜로니를 접종한 후 30 ℃에서 밤샘으로 배양하였다. 1: 50으로 10 ml YPD배지에 희석하고 4시간 동안 30 ℃에서 배양한 다음, 세포를 수거하여 3,000 rpm으로 5분간 원심분리를 수행하였다. 세포 펠렛은 1 ml 증류수에 현탁되고 3,000 rpm으로 5분간 원심분리를 수행하였다. 세포 펠렛은 10 mM LiAc 1 ml에 현탁되고 다시 3,000 rpm으로 5분간 원심분리를 수행하였다. 배지는 제거되고 세포에 50% PEG 480 ul, 100mM LiAc 72ul, 2mg/ml single-stranded salmon sperm DNA 50ul 및 transforming plasmid DNA 1.0ug이 첨가되었다. 그 후 30분 동안 42 ℃에서 Heat shock 처리하고 0.7 ml 증류수가 첨가되었다. 세포는 5분간 3,000 rpm으로 원심분리되어 수거되었다. 배지는 제거되고 1 ml YPD에 세포 펠렛은 현탁된 후 추가의 1 ml YPD를 포함하는 유리 배양 튜브에 옮겨졌다. 4시간 동안 30 ℃에서 더 배양한 후 세포는 수거되었다. 세포는 300 ul 증류수에서 현탁된 후 selective plate에서 30 ℃ 조건으로 3 내지 4일간 배양되었다.

제조된 균주는 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 수탁번호 KCTC18382P으로 2015년 4월 29일자에 자에 기탁되었다.

<실시예 3> S.cerevisiae 재조합 균주의 β-자일로시다아제 발현 최적화 배양 조건 확립

상기 S.cerevisiae 재조합 균주의 β-자일로시다아제 발현 최적화 배양 조건 확립을 위하여 온도, pH, 탄소원 조건을 달리하면서 배양을 수행하였다.

β-자일로시다아제 활성 검정은 다음 방법을 통해 수행되었다.

1 mM p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside 200 uL와 β-자일로시다아제 200 uL를 넣고, 37℃에서 10분 동안 반응시킨 후 400mM sodium bicarbonate 400 uL를 넣어 반응을 종료하였다. p-nitrophenol을 표준물질로 사용하여 405 nm에서 흡광도 측정을 통해 효소의 활성을 측정하고, 1 Unit은 1 분에 p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside로부터 1 uM의 p-nitrophenol을 생성하는데 필요한 β-자일로시다아제의 양으로 정의하였다.

YPD 배지 (1 % yeast extract, 2 % peptone, 2 % glucose)에서 온도, pH, 탄소원 조건에 따른 β-자일로시다아제 발현 변화 결과를 도 2 내지 도 4에 나타내었다.

도 2는 온도 조건에 따른 β-자일로시다아제 발현 최적화 조건 확인 결과를 나타내며, 약 30 ℃ 정도에서 가장 높은 발현 효율을 보이는 것이 확인되었다.

도 3은 pH 조건에 따른 β-자일로시다아제 발현 최적화 조건 확인 결과를 나타내며, 약 pH 8 정도에서 가장 높은 발현 효율을 보이는 것이 확인되었다.

도 4는 탄소원 조건에 따른 β-자일로시다아제 발현 최적화 조건 확인 결과를 나타내며, 배양 4 시간 시점에 기본 배지에 1 % 탄소원을 첨가하여 발현 결과를 확인한 것이다. 그 결과, 글루코스 사용시 가장 높은 발현 효율을 보이는 것이 확인되었다.

상기 결과로부터, YPD 배지 (1 % yeast extract, 2 % peptone, 2 % glucose)에 4 % 접종 후 30 ℃, 200 rpm, pH 8로 22 시간 동안의 본 배양 조건을 확립하였다.

<실시예 4> S.cerevisiae 재조합 균주로부터 β-자일로시다아제 정제

상기 S.cerevisiae 재조합 균주로부터 자일로비오스 생산을 위한 β-자일로시다아제를 정제하였다.

상기 실시예 3의 본 배양 조건에서 배양된 세포를 회수하여 50 mM Tri-HCl buffer (pH 7)를 넣고 cell을 균질화 하였다. 초음파 세포파쇄기를 이용하여 세포벽을 파쇄하고 cell extract를 얻었다. 다음으로, Ni-NTA column을 이용하여 효소를 정제하고, 정제한 효소는 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7)를 사용하여 투석한 후 농축함으로써 β-자일로시다아제를 얻었다.

<실시예 5> β-자일로시다아제의 자일로비오스 생합성 반응

상기 실시예 4에서 제조된 β-자일로시다아제를 상업적으로 판매하는 Megazyme의 효소인 xynB(E-BXSEBP)와 대비하여 자일로비오스 생합성 효율을 확인하였다.

비교를 위해 각각 반응액의 최종 농도가 1 U 또는 2 U이 되도록 첨가하고, Xylose 농도는 각각 600 g/L, 700 g/L으로 하고, 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7), 온도 50℃에서 반응을 시키며 배양 3, 6, 9, 24 시간에 샘플링을 수행하였다. 샘플링한 시료는 반응한 후 99℃, 10 분 동안 효소를 불활성화 시킨 후 생성된 자일로비오스의 농도를 Sugar-Pak I Column (Waters, USA)을 이용하여 HPLC로 정량 분석하였다.

그 결과를 도 5 내지 도 7 및 표 1 내지 3에 나타내었다.

도 5 및 표 1은 자일로스 600 g/L 및 β-자일로시다아제 1 U 처리시의 결과를 나타낸다.

[표 1] 자일로비오스 생합성 전환율 (Xylose 600 g/L, 효소 1U 처리)

Xylose 600 g/L 조건에서 효소를 1U으로 처리하여 24 시간 동안 자일로비오스 생합성 전환율을 평가한 결과 pTSY01-XynB 발현 효소(Y_1U)는 8.1%의 전환율을 나타내었다. 반면, 시약으로 판매되는 상용 효소인 (M_1U)는 6.3%의 전환율만을 나타내, 본원 발명에 따른 β-자일로시다아제가 시약으로 판매되는 상용효소(M_1U) 대비 약 130% 높은 생합성 전환율을 보이는 것을 확인하였다.

도 6 및 표 2는 자일로스 600 g/L 및 β-자일로시다아제 2 U 처리시의 결과를 나타낸다.

[표 2] 자일로비오스 생합성 전환율 (Xylose 600 g/L, 효소 2U 처리)

Xylose 600 g/L 조건에서 효소를 2U으로 처리하여 24 시간 동안 자일로비오스 생합성 전환율을 평가한 결과 pTSY01-XynB 발현 효소(Y_2U)는 9.0%의 전환율을 나타내었다. 반면, 시약으로 판매되는 상용 효소인 (M_2U)는 5.8 %의 전환율만을 나타내 본원 발명에 따른 β-자일로시다아제가 시약으로 판매되는 상용효소(M_2U) 대비 약 156% 높은 생합성 전환율을 보이는 것을 확인하였다.

도 7 및 표 3은 자일로스 700 g/L 및 β-자일로시다아제 1 U 처리시의 결과를 나타낸다.

[표 3] 자일로비오스 생합성 전환율 (Xylose 700 g/L, 효소 1 U 처리)

Xylose 700 g/L 조건에서 효소를 1 U으로 처리하여 24 시간 동안 자일로비오스 생합성 전환율을 평가한 결과 pTSY01-XynB 발현 효소(Y_1U)는 10.5%의 전환율을 나타내었다. 반면, 시약으로 판매되는 상용 효소인 (M_1U)는 5.6 %의 전환율만을 나타내 본원 발명에 따른 β-자일로시다아제가 시약으로 판매되는 상용효소(M_1U) 대비 약 186% 높은 생합성 전환율을 보이는 것을 확인하였다.

상기 결과로부터 본원 발명의 β-자일로시다아제가 타 효소와 대비하여 우수한 자일로비오스 생합성 전환율을 보이는 것을 확인하였다.

한국생명공학연구원 KCTC18382P 20150429

<110> TS Corporation <120> Beta xylosidase expression system for producing xylobiose <130> P15-071-DHJ <160> 21 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 535 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> beta xylosidase <400> 1 Met Lys Ile Thr Asn Pro Val Leu Lys Gly Phe Asn Pro Asp Pro Ser 1 5 10 15 Ile Cys Arg Ala Gly Glu Asp Tyr Tyr Met Ala Val Ser Thr Phe Glu 20 25 30 Trp Phe Pro Gly Val Gln Ile Tyr His Ser Lys Asp Leu Ile His Trp 35 40 45 Arg Leu Ala Ala Arg Pro Leu Gln Lys Thr Ser Gln Leu Asp Met Lys 50 55 60 Gly Asn Pro Asp Ser Gly Gly Val Trp Ala Pro Cys Leu Ser Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Gly Gln Phe Trp Leu Ile Tyr Ser Asp Ile Lys Val Val Asp Gly 85 90 95 Pro Phe Lys Asp Gly His Asn Tyr Leu Val Thr Ala Asp Ala Val Asp 100 105 110 Gly Glu Trp Ser Asp Pro Val Arg Leu Asn Ser Ser Gly Phe Asp Pro 115 120 125 Ser Leu Phe His Asp Pro Ser Gly Lys Lys Tyr Val Leu Asn Met Leu 130 135 140 Trp Asp His Arg Glu Lys His His Ser Phe Ala Gly Ile Ala Leu Gln 145 150 155 160 Glu Tyr Ser Val Ser Glu Lys 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120 cactcgaagg atctcatcca ttggcggctc gccgcgcgtc ccttgcaaaa aacttctcaa 180 ctcgatatga aaggaaatcc tgattccggc ggggtatggg caccgtgttt aagttatgcg 240 gatggtcagt tttggctcat ctattcagat attaaagtag tagatggtcc gtttaaggat 300 ggtcataatt atttggtcac agctgatgca gtagatggtg agtggagcga tccggttcgg 360 ctcaatagtt ctgggtttga tccttccttg ttccatgatc caagcggaaa gaaatacgtg 420 ttgaatatgc tgtgggacca tcgagaaaaa catcactcct ttgcaggtat agccttgcag 480 gaatatagtg tatctgaaaa aaaactggtc ggtgagcgga aggtcatttt taaaggcacg 540 ccaatcaaac tcacagaagc cccgcatctt tattacatca atgatgtcta ttatttatta 600 acagctgaag ggggaacacg ttacgaacat gcagccacaa tcgcccgttc ctcgcgtatt 660 gatgggccgt acgaggttca tcctgacaac ccaattttaa cggcttttca cgcgcctagc 720 catccactac aaaaatgcgg gcatgcttcc attgtacaaa cgcatacaaa tgaatggtat 780 ttggctcatc tgactggccg cccaattcat tcaagtaagg aatccatttt tcagcaaaga 840 ggctggtgcc ctttaggaag agagacagcc atacaaaagc ttgaatggaa agatggctgg 900 ccgtatgtgg taggcggaaa agaggggctc ctagaggttg aagcgcctgc gatgagcgta 960 aaagagttct ctccaaccta tcacatagtc gatgaattta aagattcatc gttaaataga 1020 catttccaaa cattaagaat cccatttacg gatcagattg gttcagtgac ggaaaatcct 1080 catcatttaa ggctgtatgg gcaggaatct ttaacgtcta aatttaccca agcgtttgtt 1140 gcgaggcgct ggcaaagctt ttattttgaa gcagagacag cggtttcctt ctttccgaaa 1200 aactttcagc aagcggcagg tcttgtgaat tattataata cggaaaattg gactgcactt 1260 caggtgactt atgacgatgc gcttggccgt atccttgagt tatctgtgtg tgaaaacctg 1320 gccttttctc agccgctaat taaaaaaatc atcatcccag acgagattcc gtatgtgtat 1380 ttaaaagtga ccgttcagag agagacgtac acgtattctt attcttttga tcaacaagag 1440 tgggaaaaaa tagatgtacc gcttgaatcg acccatttgt cagatgattt tattcgagga 1500 ggggggttct ttacaggggc ttttgttgga atgcagtgcc aagacacaag cggtgaacgt 1560 ctgcctgccg attttaagta ttttcgatac gaagaaacaa ctgaataa 1608 <210> 3 <211> 673 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPD promoter <400> 3 acaaaagctg gagctcagtt tatcattatc aatactcgcc atttcaaaga atacgtaaat 60 aattaatagt agtgattttc ctaactttat ttagtcaaaa aattagcctt ttaattctgc 120 tgtaacccgt 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ctacattttt tatgtttatc 600 tctagtatta ctctttagac aaaaaaattg tagtaagaac tattcataga gtgaatcgaa 660 aacaatacga aaatgtaaac atttcctata cgtagtatat agagacaaaa tagaagaaac 720 cgttcataat tttctgacca atgaagaatc atcaacgcta tcactttctg ttcacaaagt 780 atgcgcaatc cacatcggta tagaatataa tcggggatgc ctttatcttg aaaaaatgca 840 cccgcagctt cgctagtaat cagtaaacgc gggaagtgga gtcaggcttt ttttatggaa 900 gagaaaatag acaccaaagt agccttcttc taaccttaac ggacctacag tgcaaaaagt 960 tatcaagaga ctgcattata gagcgcacaa aggagaaaaa aagtaatcta agatgctttg 1020 ttagaaaaat agcgctctcg ggatgcattt ttgtagaaca aaaaagaagt atagattctt 1080 tgttggtaaa atagcgctct cgcgttgcat ttctgttctg taaaaatgca gctcagattc 1140 tttgtttgaa aaattagcgc tctcgcgttg catttttgtt ttacaaaaat gaagcacaga 1200 ttcttcgttg gtaaaatagc gctttcgcgt tgcatttctg ttctgtaaaa atgcagctca 1260 gattctttgt ttgaaaaatt agcgctctcg cgttgcattt ttgttctaca aaatgaagca 1320 cagatgcttc gttcagg 1337 <210> 7 <211> 931 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ampicillin resistance gene (amp) <400> 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120 aggagtggca gcatatagaa cagctaaagg gtagtgctga aggaagcata cgataccccg 180 catggaatgg gataatatca caggaggtac tagactacct ttcatcctac ataaatagac 240 gcatataagt acgcatttaa gcataaacac gcactatgcc gttcttctca tgtatatata 300 tatacaggca acacgcagat ataggtgcga cgtgaacagt gagctgtatg tgcgcagctc 360 gcgttgcatt ttcggaagcg ctcgttttcg gaaacgcttt gaagttccta ttccgaagtt 420 cctattctct agaaagtata ggaacttcag agcgcttttg aaaaccaaaa gcgctctgaa 480 gacgcacttt caaaaaacca aaaacgcacc ggactgtaac gagctactaa aatattgcga 540 ataccgcttc cacaaacatt gctcaaaagt atctctttgc tatatatctc tgtgctatat 600 ccctatataa cctacccatc cacctttcgc tccttgaact tgcatctaaa ctcgacctct 660 acatttttta tgtttatctc tagtattact ctttagacaa aaaaattgta gtaagaacta 720 ttcatagagt gaatcgaaaa caatacgaaa atgtaaacat ttcctatacg tagtatatag 780 agacaaaata gaagaaaccg ttcataattt tctgaccaat gaagaatcat caacgctatc 840 actttctgtt cacaaagtat gcgcaatcca catcggtata gaatataatc ggggatgcct 900 ttatcttgaa aaaatgcacc cgcagcttcg ctagtaatca gtaaacgcgg gaagtggagt 960 caggcttttt 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tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg 2640 gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga 2700 gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac 2760 tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt 2820 ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag 2880 cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc 2940 gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag 3000 gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca 3060 gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt 3120 cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc 3180 tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc 3240 cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc 3300 cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa 3360 ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac 3420 tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt acctcactca ttaggcaccc 3480 caggctttac actttatgct tccggctcct atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa 3540 tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat tacgccaagc gcgcaattaa ccctcactaa 3600 agggaacaaa agctggagct cagtttatca ttatcaatac tcgccatttc aaagaatacg 3660 taaataatta atagtagtga ttttcctaac tttatttagt caaaaaatta gccttttaat 3720 tctgctgtaa cccgtacatg cccaaaatag ggggcgggtt acacagaata tataacatcg 3780 taggtgtctg ggtgaacagt ttattcctgg catccactaa atataatgga gcccgctttt 3840 taagctggca tccagaaaaa aaaagaatcc cagcaccaaa atattgtttt cttcaccaac 3900 catcagttca taggtccatt ctcttagcgc aactacagag aacaggggca caaacaggca 3960 aaaaacgggc acaacctcaa tggagtgatg caacctgcct ggagtaaatg atgacacaag 4020 gcaattgacc cacgcatgta tctatctcat tttcttacac cttctattac cttctgctct 4080 ctctgatttg gaaaaagctg aaaaaaaagg ttgaaaccag ttccctgaaa ttattcccct 4140 acttgactaa taagtatata aagacggtag gtattgattg taattctgta aatctatttc 4200 ttaaacttct taaattctac ttttatagtt agtctttttt ttagttttaa aacaccagaa 4260 cttagtttcg 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tagagcacat tctgcggcct ctgtgctctg caagccgcaa actttcacca 6000 atggaccaga actacctgtg aaattaataa cagacatact ccaagctgcc tttgtgtgct 6060 taatcacgta tactcacgtg ctcaatagtc accaatgccc tccctcttgg ccctctcctt 6120 ttcttttttc gaccgaatta attcttaatc ggcaaaaaaa gaaaagctcc ggatcaagat 6180 tgtacgtaag gtgacaagct atttttcaat aaagaatatc ttccactact gccatctggc 6240 gtcataactg caaagtacac atatattacg atgctgtcta ttaaatgctt cctatattat 6300 atatatagta atgtcgttta tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt 6360 taagccagcc ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc 6420 cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt 6480 caccgtcatc accgaaacgc gcga 6504 <210> 14 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KK510(BamH1) primer <400> 14 atatggatcc atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc atttgaagat 60 tactaatcca gtgct 75 <210> 15 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KK511(Xho1) primer <400> 15 atatctcgag ttattcagtt gtttcttcgt at 32 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KK518 primer <400> 16 agccccgcat ctttattaca 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KK519 primer <400> 17 ctcttttccg cctaccacat 20 <210> 18 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KK563(NgoMIV) primer <400> 18 atatgccggc tgttggaata gaaatcaact atcat 35 <210> 19 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KK564(NgoMIV) primer <400> 19 atatgccggc tgagaattgg gtgaatgttg agata 35 <210> 20 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KK484 primer <400> 20 atatagatct tgagaattgg gtgaatgttg agata 35 <210> 21 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KK485 primer <400> 21 atatcatatg tgttggaata gaaatcaact atcat 35

Claims (14)

1. 바실러스 퍼밀러스(Bacillus pumilus) 유래의 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 β-자일로시다아제를 포함하는 자일로비오스 생산용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 β-자일로시다아제는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것인 자일로비오스 생산용 조성물.
3. 자일로스를 바실러스 퍼밀러스(Bacillus pumilus) 유래의 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 β-자일로시다아제 또는 상기 β-자일로시다아제를 포함하는 조성물과 반응시키는 단계를 포함하며,
   여기에서, 상기 반응 온도는 40 내지 60℃이고, 반응 pH는 5.0 내지 8.0이며, 상기 자일로스 농도는 400 g/L 내지 1000 g/L인, 자일로비오스 생산 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 β-자일로시다아제는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것인 자일로비오스 생산 방법.
5. 삭제
6. 삭제
7. 서열번호 2의 β-자일로시다아제 염기서열, 서열번호 3의 GPD 프로모터 염기서열, 서열번호 4의 His-tag 염기 서열 및 서열번호 5의 delta 염기 서열을 포함하는 β-자일로시다아제 발현 컨스트럭트.
8. 삭제
9. 제7항에 있어서, 서열번호 6의 2-micron 염기 서열, 서열번호 7의 암피실린 저항성 유전자 염기 서열, 서열번호 8의 CYC1 터미네이터 염기 서열 및 서열번호 9의 TRP 염기 서열을 더 포함하는 β-자일로시다아제 발현 컨스트럭트.
10. 제7항 또는 제9항에 따른 β-자일로시다아제 발현 컨스트럭트를 포함하는 β-자일로시다아제 생산용 형질전환 균주.
11. 제10항에 있어서, 상기 균주는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 바실러스 서브틸리스(bacillus subtilis) 또는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 중 선택된 어느 하나인 β-자일로시다아제 생산용 형질전환 균주.
12. 제11항에 있어서, 상기 형질전환 균주는 기탁번호 KCTC 18382P의 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) pTSY01-XynB인 β-자일로시다아제 형질전환 균주.
13. (a) 제10항에 따른 β-자일로시다아제 생산용 형질전환 균주를 배지 총 중량에 대하여 0.5 내지2 중량 %의 효모 추출물(yeast extract), 1 내지 3 중량 %의 펩톤(peptone) 및 1 내지 4 중량 %의 글루코즈를 포함하는 YPD 배지에 접종하는 단계;
    (b) 반응 온도 25 내지 35 ℃ 및 반응 pH 7.5 내지 8.5로 배양하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계의 배양액으로부터 β-자일로시다아제를 분리하는 단계를 포함하는 β-자일로시다아제의 제조방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 β-자일로시다아제 생산용 형질전환 균주는 기탁번호 KCTC 18382P의 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) pTSY01-XynB인 β-자일로시다아제의 제조방법.

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