CN101985477A - 用于评价hcv ns3/4a丝氨酸蛋白酶抑制剂的融合蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于评价HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂的融合蛋白及其应用。所述融合蛋白是以萤火虫荧光素酶为报告基因，两个可紧密结合的小分子多肽分别与N端和C端的萤火虫荧光素酶片段结合，中间由NS3/4A丝氨酸蛋白酶作用底物相连，然后将此融合基因插入真核表达载体形成指示载体后表达产生。利用本发明提供的指示载体，不仅可简单、快速、灵敏而且可以定量指示丝氨酸蛋白酶活性，具有较高的实际应用价值，在医学领域具有广阔的应用前景。

Description

用于评价HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂的融合蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物领域，涉及HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂的评价体系，特别是涉及一种可用于评价HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性的融合蛋白及其应用。

背景技术

丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)正严重危害着人类健康。我国HCV感染者已达6000万。HCV急性感染后50-80％转变为慢性感染，其中的10-20％发展成肝硬化，并与肝细胞癌的发生密切相关。HCV为单股正链RNA病毒，属黄病毒科，全长约9600个核苷酸，ORF区编码3010个氨基酸的多聚蛋白前体，经过宿主和病毒本身基因编码的蛋白酶裂解为十个功能性片段，包括4个结构蛋白(核心蛋白C、包膜蛋白E1、E2以及P7)及6个非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。

HCV NS3/4A蛋白具有丝氨酸蛋白酶活性，参与病毒蛋白翻译后加工，在NS4A的辅助下能催化裂解NS3-NS4A、NS4A-NS4B、NS4B-NS5A和NS5A-NS5B的连接点，对HCV非结构蛋白的成熟起到关键作用。因此，抑制HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性，可阻止HCV非结构蛋白的成熟。HCV NS3/4A抑制剂，可成为抗丙型肝炎病毒药物。

多年来，针对HCV NS3/4A抑制剂的研究取得可喜的进展，但由于缺乏理想的评价体系，这些药物抗HCV的作用效果难以作出评估，极大地延缓了这些药物进入临床，因而建立一种理想的适用于HCV NS3/4A蛋白抑制剂筛选及评价体系迫在眉睫。

发明内容

本发明提供了一种用于评价HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性的融合蛋白。

本发明所提供的用于评价HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性的融合蛋白，是以萤火虫荧光素酶为报告基因，两个可紧密结合的小分子多肽分别与N端和C端的萤火虫荧光素酶片段结合，中间由NS3/4A丝氨酸蛋白酶作用底物相连，然后将此融合基因插入真核表达载体形成指示载体后表达产生。

所述两个小分子多肽pepA和pepB为可紧密结合且不影响细胞功能的蛋白分子；所述NS3/4A丝氨酸蛋白酶作用底物为NS3/NS4A、NS4A/4B、NS4B/NS5A、NS5A/NS5B的连接点。

所述指示载体的表达在体外细胞水平表达，或通过转基因的方式在动物体内表达。

具体来讲，所述NS3/4A丝氨酸蛋白酶作用底物为NS5A/NS5B的连接点的融合基因可命名为ANluc-NS5A/B-BCluc，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸序列；

3)与序列表中SEQ ID NO：2限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有评价HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性作用的核苷酸序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。

序列表中的SEQ ID NO：2由1923个碱基组成，其编码序列为自5’端第7位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第10位碱基编码pepA，自5’端第76位碱基编码N端的萤火虫荧光素酶片段，自5’端第1330位碱基编码NS5A/NS5B的连接点，自5’端第1371位碱基编码pepB，自5’端第1461位碱基编码C端的萤火虫荧光素酶片段。

上述融合基因ANluc-NS5A/B-BCluc编码的融合蛋白，是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：1；

2)将序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加并具有评价HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性作用的蛋白质。

序列表中的SEQ ID NO：1由636个氨基酸残基组成，自氨基端第2位氨基酸残基为pepA，自氨基端第24位氨基酸残基为N端的萤火虫荧光素酶片段，自氨基端第442位氨基酸残基为NS5A/NS5B的连接点，自氨基端第455位氨基酸残基为pepB，自氨基端第486位氨基酸残基为C端的萤火虫荧光素酶片段。

由上述融合基因插入真核表达载体构建而成的用于评价HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性的指示载体也是本发明所要保护的。具体的，所述指示载体是将融合基因ANluc-NS5A/B-BNluc插入真核表达载体PCI neo形成的，命名为ANluc(ΔNS5A/B)BNluc，其核苷酸序列如序列表中序列11所示。

本发明的另一个目的是提供一种评价HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性的方法，即所述融合蛋白在HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂的筛选与评价中的应用。

具体的，该应用是在HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂存在的条件下，用上述指示载体转染含有HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶的细胞，收集细胞样品，检测细胞内荧光素酶的表达量，以此测定细胞内HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性的抑制率，得到对HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂效果的评价。

可用含有HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶基因的重组表达载体pCIneo-NS3/4A和指示载体ANluc(ΔNS5A/B)BCluc共转染细胞。

在所述应用中，所述细胞为体外细胞或体内细胞。

HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂主要包括干扰RNA、小分子化合物和多肽。

此外，如果将NS3/4A丝氨酸蛋白酶的作用底物NS5A/5B换成caspase-3的作用底物DEVD，ANluc-DEVD-BCluc可以用来指示细胞凋亡。

具体来讲，用于指示细胞凋亡的融合基因为ANluc-DEVD-BCluc，其核苷酸序列如序列表中序列9所示。

序列表中的SEQ ID NO：9由1893个碱基组成，其编码序列为自5’端第7位碱基，自5’端第10位碱基编码pepA，自5’端第76位碱基编码N端的萤火虫荧光素酶片段，自5’端第1330位碱基编码DEVD，自5’端第1341位碱基编码pepB，自5’端第1431位碱基编码C端的萤火虫荧光素酶片段，。

用于指示细胞凋亡的指示载体是将融合基因ANluc-DEVD-BCluc插入真核表达载体PCI neo形成的，命名为ANluc(DEVD)BCluc，其核苷酸序列如序列表中序列10所示。

用于指示细胞凋亡的方法是用上述指示载体ANluc(DEVD)BCluc转染细胞，收集细胞样品，检测细胞内荧光素酶的表达量，以此指示细胞凋亡。

本发明采用分片段萤火虫荧光素酶策略，将两段荧光素酶分别与两个可紧密结合的小分子多肽结合，并利用NS5A/B是NS3/4A丝氨酸蛋白酶作用底物的特性，将底物片段NS5A/B插在两段萤火虫荧光素酶中间。再将该融合基因插入真核表达载体pCIneo，建立了可用于指示NS34A丝氨酸蛋白酶活性的表达载体ANluc(ΔNS5A/B)BCluc。表达载体在细胞内表达产生融合蛋白，在有NS3/4A丝氨酸蛋白酶共表达的情况下，在NS5A/B处发生切割作用，通过pepA和pepB的相互作用，带动N端和C端的荧光素酶互补结合，从而形成完整的荧光素酶，通过测定荧光素酶活性便可反映出HCVNS3/4A丝氨酸蛋白酶的活性，如图1所示。如果将NS5A/5B换成caspase-3的作用底物DEVD，ANluc(DEVD)BCluc可以用来指示细胞凋亡。利用本发明提供的指示载体，不仅可简单、快速、灵敏而且可以定量指示丝氨酸蛋白酶活性，具有较高的实际应用价值，在医学领域具有广阔的应用前景。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为指示载体ANluc(ΔNS5A/B)BNluc的作用原理示意图

图2为huh-7细胞内NS3/4A丝氨酸蛋白酶对融合蛋白ANluc-NS5A/B-BCluc酶解后Fluc活性检测结果及Western Blot分析NS3/4A对底物的切割作用

图3为复制子细胞中NS3/4A丝氨酸蛋白酶对融合蛋白ANluc-NS5A/B-BCluc酶解后Fluc活性检测结果及Western Blot分析NS3/4A对底物的切割作用

图4为小鼠肝脏内NS3/4A丝氨酸蛋白酶对融合蛋白ANluc-NS5A/B-BCluc酶解后Fluc活性检测结果及Western Blot分析NS3/4A对底物的切割作用

图5为使用干扰素抑制复制子活性后Fluc活性检测结果及Western Blot分析NS3/4A的表达和对底物的切割作用

图6为细胞及小鼠肝脏内分别使用不同NS3/4A siRNA作用后，活体荧光成像检测Fluc活性结果和Western Blot分析NS3/4A的表达

图7为使用药物诱导细胞凋亡，caspase-3对融合蛋白ANluc-DEVD-BCluc酶解后Fluc活性检测结果及Western Blot检测其切割作用

具体实施方式

HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性的检测和评价目前没有一种很理想和直接的方法。本发明通过设计一种融合蛋白作为荧光检测的指示载体，能通过检测荧光素酶的表达量来得到HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性。

本发明融合蛋白的设计，主要采用分片段萤火虫荧光素酶策略，将两段荧光素酶分别与两个可紧密结合的小分子多肽结合，并利用NS5A/B是NS3/4A丝氨酸蛋白酶作用底物的特性，将底物片段NS5A/B插在两段萤火虫荧光素酶中间。再将该融合基因插入真核表达载体pCIneo，建立可用于指示NS34A丝氨酸蛋白酶活性的表达载体ANluc(ΔNS5A/B)BCluc。ANluc(ΔNS5A/B)BCluc表达载体在细胞内表达产生融合蛋白，在有NS3/4A丝氨酸蛋白酶共表达的情况下，在NS5A/B处发生切割作用，通过pepA和pepB的相互作用，带动N端和C端的荧光素酶互补结合，从而形成完整的荧光素酶，通过测定荧光素酶活性便可反映出HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶的活性。

下面以具体实施例详细说明本发明的设计。

应该理解，以下实施例不构成对本发明的限制，基于本发明的设计思想，NS3/4A丝氨酸蛋白酶作用底物NS5A/5B可由NS3-NS4A、NS4A-4B、NS4B-NS5A和NS5A-NS5B的连接点代替。如果将NS5A/5B换成caspase-3的作用底物DEVD，此体系还可以用来指示细胞凋亡。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由奥科合成，所用酶制剂及回收试剂盒均购自TaKaRa公司。

实施例1、指示载体ANluc(ΔNS5A/B)BCluc的构建

根据Fluc(Genebank号：gi|13195703)的cDNA序列设计PCR扩增上述基因片段的引物，引物序列如下：

PA：5-CTCGAGATGAACGAAGCATATGTACATGACGGTCCTGTACGCTCACTGAACAGCGGCCGCAG-3

PB：5-GTCGACAAGGCACGAAAGGAAGCAGAACTGGCAGCAGCAACTGCAGAACAGAGCGGCCGCAG-3

扩增N-luc(N端的萤火虫荧光素酶片段)的引物：

PC：(上游引物)

5-CTCACTGAACAGCGGCCGCAGAAGTATAGCAACAGAAGACGCCAAAAACATAAAGA-3

PD：下游引物5-ATCCTTGTCAATCAAGGCGTTGGTCG-3

扩增C-luc(C端的萤火虫荧光素酶片段)的引物：

PE：(上游引物)

5-CTGCAGAACAGAGCGGCCGCAGACCAGCATGCAAAATACCAGGTTATGTAAACAATCCGGAA-3

PF：(下游引物)5-CCCGGGTTACAATTTGGACTTTCCGCCCT-3

扩增NS5A/B的引物：

PG：(引物-1)5’-AGCAGACGACGTCCTCACTAGCCTCCTCGCCTCCTCCTCCATCCTTGT-3’

PH：(引物-2)5’-GTCGACTCCTCCTCCGTAGGACATCGAGCAGCAGACGACGTCCTCACTA-3’

以含有萤火虫荧光素酶基因的质粒为模板，分别使用引物对PC/PD及引物对PE/PF，PCR扩增N-luc和C-luc。PCR体系如下：10×PCR缓冲液5μl，上下游引物各1μl，dNTP1μl，模板0.5μl，Pyrobest高保真DNA聚合酶0.25μl，去离子双蒸水42.25μl，总体积50μl。PCR反应条件分别为：94℃5min、94℃30s→55℃30s→72℃1min(30cycle)、72℃5min：94℃5min、94℃30s→55℃30s→72℃1min(30cycle)、72℃5min。扩增出的N-luc和C-luc片段分别连接入T载体pGEM-T(购自Promega)，得到分别含有N-luc和C-luc的重组载体，命名为pGEM-T-Nluc和pGEM-T-Cluc。

分别以上述构建的pGEM-T-Nluc和pGEM-T-Cluc为模板，分别使用引物对PA/PG及引物对PB/PF，PCR扩增pepANluc-NS5A/B-1和pepBCluc。扩增出的pepANluc-NS5A/B-1片段连接入T载体，连接体系同上。

以上述构建的pGEM-T-pepANluc-NS5A/B-1质粒为模板，使用引物对PA/PH，PCR扩增pepANluc-NS5A/B。

指示载体ANluc(ΔNS5A/B)BCluc的构建过程：将PCR扩增得到的pepBCluc和pepANluc-NS5A/B基因分别经Xho I/Sal I和Sal I/Sma I双酶切，回收后插入经XhoI/Sma I双酶切处理的载体pCIneo(购自Promega)，得到载体ANluc(ΔNS5A/B)BCluc。

本实施例得到的指示载体ANluc(ΔNS5A/B)BCluc序列见序列表中序列11，其中ANluc-NS5A/B-BCluc基因如序列表中SEQ ID NO：2所示，由1293个碱基组成，其编码序列为自5’端第1097位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1100位碱基编码pepA，自5’端第1166位碱基编码N端的萤火虫荧光素酶片段，自5’端第2420位碱基编码NS5A/NS5B的连接点，自5’端第2461位碱基编码pepB，自5’端第2551位碱基编码C端的萤火虫荧光素酶片段。

具体操作中，酶切及连接：所有限制性内切酶均为Takana公司产品，限制性内切酶的消化时间和酶与底物的浓度依酶的活性单位灵活决定，选取获得最高活性所需缓冲液，酶解时间依据酶活性和酶与底物的用量以及所用酶是否具有星号活力灵活决定，酶切产物的连接使用Promega公司的T4 DNA连接酶，连接反应的体积为10μl，10×连接缓冲液体积为1μl，3u/μl连接酶的体积为1μl，质粒和PCR酶解产物的量依各自的浓度灵活决定，连接条件为4℃过夜连接。PCR产物经凝胶电泳回收后与pGEM-T载体的连接使用Promega pGEM-T载体连接试剂盒，10×快速连接缓冲液(T4 DNAligase)1μl，pGEM-T载体1μl，3u/μl连接酶的体积为1μl，PCR回收产物的量依浓度灵活加入，加入双蒸水至终体积为10μl，4℃过夜连接。

转化感受态菌：取一管感受态菌，在超净工作台中，加入连接产物，连接产物的加入量依浓度灵活决定，轻轻旋转混匀，冰浴30min。立即转移到42℃水浴中放置1.5min，迅速置于冰浴，每管加入0.5ml无抗性LB培养基，37℃水浴摇床培养45min后，涂布相应抗性的琼脂糖平板，室温晾干后，置37℃恒温箱倒置培养过夜。涂板的转化产物的量以及是否离心浓缩依据转化效率灵活决定。

实施例2、利用细胞内及小鼠肝脏中共转染NS3/4A蛋白验证指示系统

一、载体pCIneo-NS3/4A和pCIneo-mNS3/4A的构建

根据NS3/4A(Genebank号：gi|28921568)的cDNA序列(参见序列表12)设计PCR扩增上述基因片段的引物，引物序列如下：

扩增NS3/4A的引物

PE(上游引物)：GCTAGCATGGCGCCTATTACGGCCTACTC

PF(下游引物)：GAATTCTGTTCGATGTAAGGGAGGTG

扩增mNS3/4A的引物

PG(上游引物)：TGAAGGGCGCCGCGGGCGGTC

PH(下游引物)：GACCGCCCGCGGCGCCCTTCA

以质粒FL-neo(Highly Permissive Cell Lines for Subgenomic and GenomicHepatitis C Virus RNA Replication；JOURNAL OF VIROLOGY.2002.76：13001-13014)为模板，扩增NS3/4A、mNS3/4A基因(阴性对照)，PCR体系如下：10×PCR缓冲液5μl，上下游引物各1μl，dNTP 1μl，模板0.5μl，Pyrobest高保真DNA聚合酶0.25μl，去离子双蒸水42.25μl，总体积50μl，PCR反应条件为：94℃5min、94℃30s→55℃30s→72℃1min(30cycle)、72℃5min。将克隆得到的NS3/4A基因片断通过Nhe I/EcoR I插入经相同双酶切处理后的真核表达载体pCIneo(购自Promega)，构建了真核表达载体pCIneo-NS3/4A和pCIneo-mNS3/4A。

二、利用Huh-7细胞内共转染NS3/4A蛋白验证指示系统

Huh-7细胞培养基选用含有10％的胎牛血清(HyClone公司)、10mM的HEPES、25U/ml的青霉素、25μg/ml的链霉素的DMEM(Gibcol公司)，细胞用含0.25％的胰酶和0.02％的EDTA的消化液常规消化传代，置于37℃含5％CO2的孵箱中培养)，转染使用Lipofectamine2000(Invetrogen life technologies)，转染的步骤按照厂家说明书，简言之，等细胞生长至70％融合成片时，将1μg质粒和3μl脂质体用50μl不含血清的DMEM培养基稀释后完全混合，室温孵育20min，在24孔板中的细胞用不含血清的DMEM洗三遍，然后将孵育好的混合物加入到相应孔中，补加450μl不含血清的DMEM，将转染细胞置于37℃含5％CO2的孵箱中培养，6h后补加20％的胎牛血清，或者将细胞洗涤后加入完全DMEM培养基。

用指示载体ANluc(ΔNS5A/B)BCluc分别与真核表达载体pCIneo-NS3/4A和pCIneo-mNS3/4A共转染Huh-7细胞，48h后收集细胞，分别使用双荧光素酶检测试剂盒(Promega，Madison，WI，USA)和细胞活体荧光成像检测细胞中荧光素酶活性，结果参见图2显示，在共转染NS3/4A丝氨酸蛋白酶的Huh-7细胞中，Fluc活性要明显高于对照组(P＜0.05)。同时，免疫印迹Western blot(参见图2，泳道1为ANluc(ΔNS5A/B)BCluc与pCIneo共转染后的Huh-7细胞，泳道2为ANluc(ΔNS5A/B)BCluc与pCIneo-mNS3/4A共转染后的Huh-7细胞，泳道3为ANluc(ΔNS5A/B)BCluc与pCIneo-mNS3/4A共转染后的Huh-7细胞)分析，可以看到NS3/4A对ANluc(ΔNS5A/B)BCluc发生了切割作用。说明该指示质粒可以用来指示NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性。

三、利用复制子细胞(C5B)内表达的NS3/4A蛋白验证指示系统

C5B细胞培养时在培养基中加入500μg/ml浓度的G418(Invitrogen，Carlsbad，Calif.)，其余培养方法及转染的步骤同Huh-7细胞。

指示载体ANluc(ΔNS5A/B)BCluc分别转染到Huh-7和C5B细胞中，48h后收集细胞样品，用双荧光素酶检测试剂盒检测细胞荧光素酶活性。结果表明，复制子细胞中荧光素酶活性比Huh-7细胞上升12倍左右。Western blot结果显示，在含有复制子的细胞中ANluc(ΔNS5A/B)BCluc产生切割条带(参见图3)。

四、利用小鼠肝脏中表达的NS3/4A蛋白验证指示系统

4～6周龄Balb/c小鼠12只，随机分为2组，将10μg真核表达载体pCIneo(对照，Control)和pCIneo-NS3/4A分别与10μg指示质粒ANluc(ΔNS5A/B)BCluc混合于相当于小鼠体重10％的生理盐水，在五秒钟以内通过尾静脉转染至Balb/c小鼠(购自军事医学科学院实验动物中心)肝脏，分别于注射后第1、4天通过活体荧光成像技术检测小鼠肝脏内荧光素酶活性。在共表达NS3/4A丝氨酸蛋白酶的小鼠体内，Fluc活性要明显高于对照组(P＜0.05)，且Western blot结果中有切割条带。说明该指示质粒可以用来指示NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性(参见图4)。

实施例3、指示体系在药物评价中的应用

一、指示体系在IFN-α抑制HCV复制中的应用

C5B细胞用不同浓度的IFN-α处理(0，20，100，200，500units/ml，Schering-Plough Corp.，Kenilworth，NJ，USA)，72h后使用Lipofectamine2000将指示质粒ANluc(ΔNS5A/B)BCluc转染到细胞中。转染48h后收集细胞并检测细胞中荧光素酶活性。结果参见图5，随着IFN-α处理浓度的增加，荧光素酶活性逐渐降低。Western blot结果显示，NS3随IFN-α处理浓度的增加被逐渐抑制，且切割条带强弱与NS3/4的表达量有剂量依赖效应。说明该指示质粒可以用来监测IFN-α对复制子细胞中NS3/4A的抑制作用。

二、指示体系在NS3/4A抑制剂筛选中的应用

针对HCV NS3/4A的结构序列设计了3对siRNA，分别命名为sh-1948(序列表中序列3和序列4)，sh-2052(序列表中序列5和序列6)和sh-3532(序列表中序列7和序列8)。

退火形成发夹型siRNA及msiRNA模板寡核苷酸模板，与质粒pSilencer TM2.1-U6neo(购自Ambion公司)连接，应用Invitrogen公司LipofectamineTM2000分别将3种siRNA表达质粒与ANluc(ΔNS5A/B)BCluc，NS3/4A表达质粒共转染Huh-7细胞。结果参见图6，3种siRNA均对NS3/4A的活性产生了一定的抑制作用。

此外，将4～6周龄Balb/c小鼠12只随机分为2组，分别将含5μg sh-2052及其空载表达质粒与5μg ANluc(ΔNS5A/B)BCluc，5μgNS3/4A表达质粒混合后加至相当于Balb/c小鼠体重10％的生理盐水，在五秒钟以内通过尾静脉转染至Balb/c小鼠(购自军事医学科学院实验动物中心)肝脏，分别在转染1d和4d活体荧光成像检测荧光素酶活性，可见到siRNA表达质粒对HCV NS3/4A有很强的抑制作用(图6)。说明融合基因ANluc(ΔNS5A/B)BCluc表达后不仅能够指示NS3/4A丝氨酸蛋白酶的活性，同时在抗HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性评价中具有很好的指示作用。

实施例4、指示载体ANluc(DEVD)BCluc的构建及其对细胞凋亡的指示作用

一、指示ANluc(DEVD)BCluc载体的构建

扩增DEVD的引物：

5-GTCGACTCCTCCTCCATCGACTTCGTCGCCTCCTCCTCCATCCTTGTCAATCAAGGC-3

ANluc(DEVD)BCluc载体构建过程同ANluc(ΔNS5A/B)BCluc，其核苷酸序列如序列表中如序列表中序列10所示，其中用于指示细胞凋亡的融合基因为ANluc-DEVD-BCluc，其核苷酸序列如序列表中序列9所示，序列表中的SEQ ID NO：10由7325个碱基组成，其编码序列为自5’端第1097位碱基，自5’端第1100位碱基编码pepA，自5’端第1166位碱基编码N端的萤火虫荧光素酶片段，自5’端第2420位碱基编码DEVD，自5’端第2431位碱基编码pepB，自5’端第2521位碱基编码C端的萤火虫荧光素酶片段。

二、细胞使用药物诱导凋亡

Huh-7细胞中转染ANluc(DEVD)BCluc质粒，同时转染海肾荧光素酶表达质粒pRL-TK(Promega)作为内参，转染24h后，使用不同浓度(0，0.8，1.5，2μg/ml)的凋亡诱导剂处理细胞24h，收集细胞并检测荧光素酶活性，结果见图7，随着凋亡诱导剂浓度升高，荧光素酶活性升高。同时，western结果表明，切割条带依次增强。实验结果表明此体系可以用来指示细胞凋亡。

序列表

<160>12

<210>1

<211>636

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

Met Asn Glu Ala Tyr Val His Asp Gly Pro Val Arg Ser Leu Asn Ser

1               5                   10                  15

Gly Arg Arg Ser Ile Ala Thr Glu Asp Ala Lys Asn Ile Lys Lys Gly

            20                  25                  30

Pro Ala Pro Phe Tyr Pro Leu Glu Asp Gly Thr Ala Gly Glu Gln Leu

        35                  40                  45

His Lys Ala Met Lys Arg Tyr Ala Leu Val Pro Gly Thr Ile Ala Phe

    50                  55                  60

Thr Asp Ala His Ile Glu Val Asn Ile Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Glu

65                  70                  75                  80

Met Ser Val Arg Leu Ala Glu Ala Met Lys Arg Tyr Gly Leu Asn Thr

                85                  90                  95

Asn His Arg Ile Val Val Cys Ser Glu Asn Ser Leu Gln Phe Phe Met

            100                 105                 110

Pro Val Leu Gly Ala Leu Phe Ile Gly Val Ala Val Ala Pro Ala Asn

        115                 120                 125

Asp Ile Tyr Asn Glu Arg Glu Leu Leu Asn Ser Met Asn Ile Ser Gln

    130                 135                 140

Pro Thr Val Val Phe Val Ser Lys Lys Gly Leu Gln Lys Ile Leu Asn

145                 150                 155                 160

Val Gln Lys Lys Leu Pro Ile Ile Gln Lys Ile Ile Ile Met Asp Ser

                165                 170                 175

Lys Thr Asp Tyr Gln Gly Phe Gln Ser Met Tyr Thr Phe Val Thr Ser

            180                 185                 190

His Leu Pro Pro Gly Phe Asn Glu Tyr Asp Phe Val Pro Glu Ser Phe

        195                 200                 205

Asp Arg Asp Lys Thr Ile Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr

    210                 215                 220

Gly Leu Pro Lys Gly Val Ala Leu Pro His Arg Thr Ala Cys Val Arg

225                 230                 235                 240

Phe Ser His Ala Arg Asp Pro Ile Phe Gly Asn Gln Ile Ile Pro Asp

                245                 250                 255

Thr Ala Ile Leu Ser Val Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe

            260                 265                 270

Thr Thr Leu Gly Tyr Leu Ile Cys Gly Phe Arg Val Val Leu Met Tyr

        275                 280                 285

Arg Phe Glu Glu Glu Leu Phe Leu Arg Ser Leu Gln Asp Tyr Lys Ile

    290                 295                 300

Gln Ser Ala Leu Leu Val Pro Thr Leu Phe Ser Phe Phe Ala Lys Ser

305                 310                 315                 320

Thr Leu Ile Asp Lys Tyr Asp Leu Ser Asn Leu His Glu Ile Ala Ser

                325                 330                 335

Gly Gly Ala Pro Leu Ser Lys Glu Val Gly Glu Ala Val Ala Lys Arg

            340                 345                 350

Phe His Leu Pro Gly Ile Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr

        355                 360                 365

Ser Ala Ile Leu Ile Thr Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Val

    370                 375                 380

Gly Lys Val Val Pro Phe Phe Glu Ala Lys Val Val Asp Leu Asp Thr

385                 390                 395                 400

Gly Lys Thr Leu Gly Val Asn Gln Arg Gly Glu Leu Cys Val Arg Gly

                405                 410                 415

Pro Met Ile Met Ser Gly Tyr Val Asn Asn Pro Glu Ala Thr Asn Ala

            420                 425                 430

Leu Ile Asp Lys Asp Gly Gly Gly Gly Glu Glu Ala Ser Glu Asp Val

        435                 440                 445

Val Cys Cys Ser Met Ser Tyr Gly Gly Gly Val Asp Lys Ala Arg Lys

    450                 455                 460

Glu Ala Glu Leu Ala Ala Ala Thr Ala Glu Gln Ser Gly Arg Arg Pro

465                 470                 475                 480

Ala Cys Lys Ile Pro Gly Tyr Val Asn Asn Pro Glu Ala Thr Asn Ala

                485                 490                 495

Leu Ile Asp Lys Asp Gly Trp Leu His Ser Gly Asp Ile Ala Tyr Trp

            500                 505                 510

Asp Glu Asp Glu His Phe Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile

        515                 520                 525

Lys Tyr Lys Gly Tyr Gln Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser Ile Leu

    530                 535                 540

Leu Gln His Pro Asn Ile Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Leu Pro Asp

545                 550                 555                 560

Asp Asp Ala Gly Glu Leu Pro Ala Ala Val Val Val Leu Glu His Gly

                565                 570                 575

Lys Thr Met Thr Glu Lys Glu Ile Val Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val

            580                 585                 590

Thr Thr Ala Lys Lys Leu Arg Gly Gly Val Val Phe Val Asp Glu Val

        595                 600                 605

Pro Lys Gly Leu Thr Gly Lys Leu Asp Ala Arg Lys Ile Arg Glu Ile

    610                 615                 620

Leu Ile Lys Ala Lys Lys Gly Gly Lys Ser Lys Leu

625                 630                 635

<210>2

<211>1923

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

ctcgagatga acgaagcata tgtacatgac ggtcctgtac gctcactgaa cagcggccgc     60

agaagtatag caacagaaga cgccaaaaac ataaagaaag gcccggcgcc attctatcct    120

ctagaggatg gaaccgctgg agagcaactg cataaggcta tgaagagata cgccctggtt    180

cctggaacaa ttgcttttac agatgcacat atcgaggtga acatcacgta cgcggaatac    240

ttcgaaatgt ccgttcggtt ggcagaagct atgaaacgat atgggctgaa tacaaatcac    300

agaatcgtcg tatgcagtga aaactctctt caattcttta tgccggtgtt gggcgcgtta    360

tttatcggag ttgcagttgc gcccgcgaac gacatttata atgaacgtga attgctcaac    420

agtatgaaca tttcgcagcc taccgtagtg tttgtttcca aaaaggggtt gcaaaaaatt    480

ttgaacgtgc aaaaaaaatt accaataatc cagaaaatta ttatcatgga ttctaaaacg    540

gattaccagg gatttcagtc gatgtacacg ttcgtcacat ctcatctacc tcccggtttt    600

aatgaatacg attttgtacc agagtccttt gatcgtgaca aaacaattgc actgataatg    660

aattcctctg gatctactgg gttacctaag ggtgtggccc ttccgcatag aactgcctgc    720

gtcagattct cgcatgccag agatcctatt tttggcaatc aaatcattcc ggatactgcg    780

attttaagtg ttgttccatt ccatcacggt tttggaatgt ttactacact cggatatttg    840

atatgtggat ttcgagtcgt cttaatgtat agatttgaag aagagctgtt tttacgatcc    900

cttcaggatt acaaaattca aagtgcgttg ctagtaccaa ccctattttc attcttcgcc    960

aaaagcactc tgattgacaa atacgattta tctaatttac acgaaattgc ttctgggggc   1020

gcacctcttt cgaaagaagt cggggaagcg gttgcaaaac gcttccatct tccagggata   1080

cgacaaggat atgggctcac tgagactaca tcagctattc tgattacacc cgagggggat   1140

gataaaccgg gcgcggtcgg taaagttgtt ccattttttg aagcgaaggt tgtggatctg   1200

gataccggga aaacgctggg cgttaatcag agaggcgaat tatgtgtcag aggacctatg   1260

attatgtccg gttatgtaaa caatccggaa gcgaccaacg ccttgattga caaggatgga   1320

ggaggaggcg aggaggctag tgaggacgtc gtctgctgct cgatgtccta cggaggagga   1380

gtcgacaagg cacgaaagga agcagaactg gcagcagcaa ctgcagaaca gagcggccgc   1440

agaccagcat gcaaaatacc aggttatgta aacaatccgg aagcgaccaa cgccttgatt   1500

gacaaggatg gatggctaca ttctggagac atagcttact gggacgaaga cgaacacttc   1560

ttcatagttg accgcttgaa gtctttaatt aaatacaaag gatatcaggt ggcccccgct   1620

gaattggaat cgatattgtt acaacacccc aacatcttcg acgcgggcgt ggcaggtctt   1680

cccgacgatg acgccggtga acttcccgcc gccgttgttg ttttggagca cggaaagacg   1740

atgacggaaa aagagatcgt ggattacgtc gccagtcaag taacaaccgc gaaaaagttg   1800

cgcggaggag ttgtgtttgt ggacgaagta ccgaaaggtc ttaccggaaa actcgacgca   1860

agaaaaatca gagagatcct cataaaggcc aagaagggcg gaaagtccaa attgtaaccc   1920

ggg

1923

<210>3

<211>29

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

aagacagucc aacacacgcc accugucuc    29

<210>4

<211>29

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

aauggcgugu guuggacugu cccugucuc    29

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

ccaggaccuc gucggcugg           19

<210>6

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

ccagccgacg agguccugg           19

<210>7

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

cgagguuacu accacacac           19

<210>8

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

guguguggua guaaccucg                                                  19

<210>9

<211>1893

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>9

ctcgagatga acgaagcata tgtacatgac ggtcctgtac gctcactgaa cagcggccgc     60

agaagtatag caacagaaga cgccaaaaac ataaagaaag gcccggcgcc attctatcct    120

ctagaggatg gaaccgctgg agagcaactg cataaggcta tgaagagata cgccctggtt    180

cctggaacaa ttgcttttac agatgcacat atcgaggtga acatcacgta cgcggaatac    240

ttcgaaatgt ccgttcggtt ggcagaagct atgaaacgat atgggctgaa tacaaatcac    300

agaatcgtcg tatgcagtga aaactctctt caattcttta tgccggtgtt gggcgcgtta    360

tttatcggag ttgcagttgc gcccgcgaac gacatttata atgaacgtga attgctcaac    420

agtatgaaca tttcgcagcc taccgtagtg tttgtttcca aaaaggggtt gcaaaaaatt    480

ttgaacgtgc aaaaaaaatt accaataatc cagaaaatta ttatcatgga ttctaaaacg    540

gattaccagg gatttcagtc gatgtacacg ttcgtcacat ctcatctacc tcccggtttt    600

aatgaatacg attttgtacc agagtccttt gatcgtgaca aaacaattgc actgataatg    660

aattcctctg gatctactgg gttacctaag ggtgtggccc ttccgcatag aactgcctgc    720

gtcagattct cgcatgccag agatcctatt tttggcaatc aaatcattcc ggatactgcg    780

attttaagtg ttgttccatt ccatcacggt tttggaatgt ttactacact cggatatttg    840

atatgtggat ttcgagtcgt cttaatgtat agatttgaag aagagctgtt tttacgatcc    900

cttcaggatt acaaaattca aagtgcgttg ctagtaccaa ccctattttc attcttcgcc    960

aaaagcactc tgattgacaa atacgattta tctaatttac acgaaattgc ttctgggggc   1020

gcacctcttt cgaaagaagt cggggaagcg gttgcaaaac gcttccatct tccagggata   1080

cgacaaggat atgggctcac tgagactaca tcagctattc tgattacacc cgagggggat   1140

gataaaccgg gcgcggtcgg taaagttgtt ccattttttg aagcgaaggt tgtggatctg   1200

gataccggga aaacgctggg cgttaatcag agaggcgaat tatgtgtcag aggacctatg   1260

attatgtccg gttatgtaaa caatccggaa gcgaccaacg ccttgattga caaggatgga   1320

ggaggaggcg acgaagtcga tggaggagga gtcgacaagg cacgaaagga agcagaactg   1380

gcagcagcaa ctgcagaaca gagcggccgc agaccagcat gcaaaatacc aggttatgta   1440

aacaatccgg aagcgaccaa cgccttgatt gacaaggatg gatggctaca ttctggagac   1500

atagcttact gggacgaaga cgaacacttc ttcatagttg accgcttgaa gtctttaatt   1560

aaatacaaag gatatcaggt ggcccccgct gaattggaat cgatattgtt acaacacccc   1620

aacatcttcg acgcgggcgt ggcaggtctt cccgacgatg acgccggtga acttcccgcc   1680

gccgttgttg ttttggagca cggaaagacg atgacggaaa aagagatcgt ggattacgtc   1740

gccagtcaag taacaaccgc gaaaaagttg cgcggaggag ttgtgtttgt ggacgaagta   1800

ccgaaaggtc ttaccggaaa actcgacgca agaaaaatca gagagatcct cataaaggcc   1860

aagaagggcg gaaagtccaa attgtaaccc ggg                                1893

<210>10

<211>7325

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>10

tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta     60

ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc    120

aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg    180

gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc    240

gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat    300

agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc    360

ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga    420

cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg    480

gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac    540

caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt    600

caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactg    660

cgatcgcccg ccccgttgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata    720

agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc actagaagct ttattgcggt agtttatcac    780

agttaaattg ctaacgcagt cagtgcttct gacacaacag tctcgaactt aagctgcagt    840

gactctctta aggtagcctt gcagaagttg gtcgtgaggc actgggcagg taagtatcaa    900

ggttacaaga caggtttaag gagaccaata gaaactgggc ttgtcgagac agagaagact    960

cttgcgtttc tgataggcac ctattggtct tactgacatc cactttgcct ttctctccac   1020

aggtgtccac tcccagttca attacagctc ttaaggctag agtacttaat acgactcact   1080

ataggctagc ctcgagatga acgaagcata tgtacatgac ggtcctgtac gctcactgaa   1140

cagcggccgc agaagtatag caacagaaga cgccaaaaac ataaagaaag gcccggcgcc   1200

attctatcct ctagaggatg gaaccgctgg agagcaactg cataaggcta tgaagagata   1260

cgccctggtt cctggaacaa ttgcttttac agatgcacat atcgaggtga acatcacgta   1320

cgcggaatac ttcgaaatgt ccgttcggtt ggcagaagct atgaaacgat atgggctgaa   1380

tacaaatcac agaatcgtcg tatgcagtga aaactctctt caattcttta tgccggtgtt   1440

gggcgcgtta tttatcggag ttgcagttgc gcccgcgaac gacatttata atgaacgtga   1500

attgctcaac agtatgaaca tttcgcagcc taccgtagtg tttgtttcca aaaaggggtt   1560

gcaaaaaatt ttgaacgtgc aaaaaaaatt accaataatc cagaaaatta ttatcatgga   1620

ttctaaaacg gattaccagg gatttcagtc gatgtacacg ttcgtcacat ctcatctacc   1680

tcccggtttt aatgaatacg attttgtacc agagtccttt gatcgtgaca aaacaattgc   1740

actgataatg aattcctctg gatctactgg gttacctaag ggtgtggccc ttccgcatag   1800

aactgcctgc gtcagattct cgcatgccag agatcctatt tttggcaatc aaatcattcc   1860

ggatactgcg attttaagtg ttgttccatt ccatcacggt tttggaatgt ttactacact   1920

cggatatttg atatgtggat ttcgagtcgt cttaatgtat agatttgaag aagagctgtt   1980

tttacgatcc cttcaggatt acaaaattca aagtgcgttg ctagtaccaa ccctattttc   2040

attcttcgcc aaaagcactc tgattgacaa atacgattta tctaatttac acgaaattgc   2100

ttctgggggc gcacctcttt cgaaagaagt cggggaagcg gttgcaaaac gcttccatct   2160

tccagggata cgacaaggat atgggctcac tgagactaca tcagctattc tgattacacc   2220

cgagggggat gataaaccgg gcgcggtcgg taaagttgtt ccattttttg aagcgaaggt   2280

tgtggatctg gataccggga aaacgctggg cgttaatcag agaggcgaat tatgtgtcag   2340

aggacctatg attatgtccg gttatgtaaa caatccggaa gcgaccaacg ccttgattga   2400

caaggatgga ggaggaggcg acgaagtcga tggaggagga gtcgacaagg cacgaaagga   2460

agcagaactg gcagcagcaa ctgcagaaca gagcggccgc agaccagcat gcaaaatacc   2520

aggttatgta aacaatccgg aagcgaccaa cgccttgatt gacaaggatg gatggctaca   2580

ttctggagac atagcttact gggacgaaga cgaacacttc ttcatagttg accgcttgaa   2640

gtctttaatt aaatacaaag gatatcaggt ggcccccgct gaattggaat cgatattgtt   2700

acaacacccc aacatcttcg acgcgggcgt ggcaggtctt cccgacgatg acgccggtga   2760

acttcccgcc gccgttgttg ttttggagca cggaaagacg atgacggaaa aagagatcgt   2820

ggattacgtc gccagtcaag taacaaccgc gaaaaagttg cgcggaggag ttgtgtttgt   2880

ggacgaagta ccgaaaggtc ttaccggaaa actcgacgca agaaaaatca gagagatcct   2940

cataaaggcc aagaagggcg gaaagtccaa attgtaaccc gggcggccgc ttccctttag   3000

tgagggttaa tgcttcgagc agacatgata agatacattg atgagtttgg acaaaccaca   3060

actagaatgc agtgaaaaaa atgctttatt tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt   3120

gtaaccatta taagctgcaa taaacaagtt aacaacaaca attgcattca ttttatgttt   3180

caggttcagg gggagatgtg ggaggttttt taaagcaagt aaaacctcta caaatgtggt   3240

aaaatccgat aaggatcgat ccgggctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc   3300

cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg aatggacgcg ccctgtagcg gcgcattaag   3360

cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc   3420

cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc   3480

tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa   3540

aaaacttgat tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg   3600

ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac   3660

actcaaccct atctcggtct attcttttga tttataaggg attttgccga tttcggccta   3720

ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattttaaca aaatattaac   3780

gcttacaatt tcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc   3840

atacgcggat ctgcgcagca ccatggcctg aaataacctc tgaaagagga acttggttag   3900

gtaccttctg aggcggaaag aaccagctgt ggaatgtgtg tcagttaggg tgtggaaagt   3960

ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca   4020

ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt   4080

agtcagcaac catagtcccg cccctaactc cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt   4140

ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg   4200

cctcggcctc tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc ctaggctttt   4260

gcaaaaagct tgattcttct gacacaacag tctcgaactt aaggctagag ccaccatgat   4320

tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta   4380

tgactgggca caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca   4440

ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactgcagga   4500

cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga   4560

cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct   4620

cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg   4680

gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga   4740

gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca   4800

tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag gcgcgcatgc ccgacggcga   4860

ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg   4920

cttttctgga ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc   4980

gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt   5040

gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga   5100

gttcttctga gcgggactct ggggttcgaa atgaccgacc aagcgacgcc caacctgcca   5160

tcacgatggc cgcaataaaa tatctttatt ttcattacat ctgtgtgttg gttttttgtg   5220

tgaatcgata gcgataagga tccgcgtatg gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc   5280

cgcatagtta agccagcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg   5340

tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca   5400

gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gagacgaaag ggcctcgtga tacgcctatt   5460

tttataggtt aatgtcatga taataatggt ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg   5520

aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct   580

catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat   5640

tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc   5700

tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg   5760

ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg   5820

ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga   5880

cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta   5940

ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc   6000

tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc   6060

gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg   6120

ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc   6180

aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca   6240

acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct   6300

tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat   6360

cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg   6420

gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat   6480

taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact   6540

tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat   6600

cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc   6660

ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct   6720

accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg   6780

cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt taggccacca   6840

cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc   6900

tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga   6960

taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac   7020

gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga   7080

agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag   7140

ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg   7200

acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag   7260

caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tggctcgaca   7320

gatct

7325

<210>11

<211>7355

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>11

tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta     60

ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc    120

aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg    180

gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc    240

gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat    300

agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc    360

ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga    420

cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg    480

gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac    540

caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt    600

caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactg    660

cgatcgcccg ccccgttgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata    720

agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc actagaagct ttattgcggt agtttatcac    780

agttaaattg ctaacgcagt cagtgcttct gacacaacag tctcgaactt aagctgcagt    840

gactctctta aggtagcctt gcagaagttg gtcgtgaggc actgggcagg taagtatcaa    900

ggttacaaga caggtttaag gagaccaata gaaactgggc ttgtcgagac agagaagact    960

cttgcgtttc tgataggcac ctattggtct tactgacatc cactttgcct ttctctccac   1020

aggtgtccac tcccagttca attacagctc ttaaggctag agtacttaat acgactcact   1080

ataggctagc ctcgagatga acgaagcata tgtacatgac ggtcctgtac gctcactgaa   1140

cagcggccgc agaagtatag caacagaaga cgccaaaaac ataaagaaag gcccggcgcc   1200

attctatcct ctagaggatg gaaccgctgg agagcaactg cataaggcta tgaagagata   1260

cgccctggtt cctggaacaa ttgcttttac agatgcacat atcgaggtga acatcacgta   1320

cgcggaatac ttcgaaatgt ccgttcggtt ggcagaagct atgaaacgat atgggctgaa   1380

tacaaatcac agaatcgtcg tatgcagtga aaactctctt caattcttta tgccggtgtt   1440

gggcgcgtta tttatcggag ttgcagttgc gcccgcgaac gacatttata atgaacgtga   1500

attgctcaac agtatgaaca tttcgcagcc taccgtagtg tttgtttcca aaaaggggtt   1560

gcaaaaaatt ttgaacgtgc aaaaaaaatt accaataatc cagaaaatta ttatcatgga   1620

ttctaaaacg gattaccagg gatttcagtc gatgtacacg ttcgtcacat ctcatctacc   1680

tcccggtttt aatgaatacg attttgtacc agagtccttt gatcgtgaca aaacaattgc   1740

actgataatg aattcctctg gatctactgg gttacctaag ggtgtggccc ttccgcatag   1800

aactgcctgc gtcagattct cgcatgccag agatcctatt tttggcaatc aaatcattcc   1860

ggatactgcg attttaagtg ttgttccatt ccatcacggt tttggaatgt ttactacact   1920

cggatatttg atatgtggat ttcgagtcgt cttaatgtat agatttgaag aagagctgtt   1980

tttacgatcc cttcaggatt acaaaattca aagtgcgttg ctagtaccaa ccctattttc   2040

attcttcgcc aaaagcactc tgattgacaa atacgattta tctaatttac acgaaattgc   2100

ttctgggggc gcacctcttt cgaaagaagt cggggaagcg gttgcaaaac gcttccatct   2160

tccagggata cgacaaggat atgggctcac tgagactaca tcagctattc tgattacacc   2220

cgagggggat gataaaccgg gcgcggtcgg taaagttgtt ccattttttg aagcgaaggt   2280

tgtggatctg gataccggga aaacgctggg cgttaatcag agaggcgaat tatgtgtcag   2340

aggacctatg attatgtccg gttatgtaaa caatccggaa gcgaccaacg ccttgattga   2400

caaggatgga ggaggaggcg aggaggctag tgaggacgtc gtctgctgct cgatgtccta   2460

cggaggagga gtcgacaagg cacgaaagga agcagaactg gcagcagcaa ctgcagaaca   2520

gagcggccgc agaccagcat gcaaaatacc aggttatgta aacaatccgg aagcgaccaa   2580

cgccttgatt gacaaggatg gatggctaca ttctggagac atagcttact gggacgaaga   2640

cgaacacttc ttcatagttg accgcttgaa gtctttaatt aaatacaaag gatatcaggt   2700

ggcccccgct gaattggaat cgatattgtt acaacacccc aacatcttcg acgcgggcgt   2760

ggcaggtctt cccgacgatg acgccggtga acttcccgcc gccgttgttg ttttggagca   2820

cggaaagacg atgacggaaa aagagatcgt ggattacgtc gccagtcaag taacaaccgc   2880

gaaaaagttg cgcggaggag ttgtgtttgt ggacgaagta ccgaaaggtc ttaccggaaa   2940

actcgacgca agaaaaatca gagagatcct cataaaggcc aagaagggcg gaaagtccaa   3000

attgtaaccc gggcggccgc ttccctttag tgagggttaa tgcttcgagc agacatgata   3060

agatacattg atgagtttgg acaaaccaca actagaatgc agtgaaaaaa atgctttatt   3120

tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa taaacaagtt   3180

aacaacaaca attgcattca ttttatgttt caggttcagg gggagatgtg ggaggttttt   3240

taaagcaagt aaaacctcta caaatgtggt aaaatccgat aaggatcgat ccgggctggc   3300

gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg   3360

aatggacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt   3420

gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct   3480

cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg   3540

atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat tagggtgatg gttcacgtag   3600

tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa   3660

tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct atctcggtct attcttttga   3720

tttataaggg attttgccga tttcggccta ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa   3780

atttaacgcg aattttaaca aaatattaac gcttacaatt tcctgatgcg gtattttctc   3840

cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atacgcggat ctgcgcagca ccatggcctg   3900

aaataacctc tgaaagagga acttggttag gtaccttctg aggcggaaag aaccagctgt   3960

ggaatgtgtg tcagttaggg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc   4020

aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag   4080

gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac catagtcccg cccctaactc   4140

cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa   4200

ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg cctcggcctc tgagctattc cagaagtagt   4260

gaggaggctt ttttggaggc ctaggctttt gcaaaaagct tgattcttct gacacaacag   4320

tctcgaactt aaggctagag ccaccatgat tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc   4380

ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa tcggctgctc   4440

tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga   4500

cctgtccggt gccctgaatg aactgcagga cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac   4560

gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct   4620

gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa   4680

agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc   4740

attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct   4800

tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc   4860

caggctcaag gcgcgcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg   4920

cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact gtggccggct   4980

gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct   5040

tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca   5100

gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga gcgggactct ggggttcgaa   5160

atgaccgacc aagcgacgcc caacctgcca tcacgatggc cgcaataaaa tatctttatt   5220

ttcattacat ctgtgtgttg gttttttgtg tgaatcgata gcgataagga tccgcgtatg   5280

gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagcccc gacacccgcc   5340

aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc   5400

tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc   5460

gagacgaaag ggcctcgtga tacgcctatt tttataggtt aatgtcatga taataatggt   5520

ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt   5580

tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca   5640

ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt   5700

ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga   5760

tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa   5820

gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct   5880

gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat   5940

acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga   6000

tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc   6060

caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat   6120

gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa   6180

cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac   6240

tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg aggcggataa   6300

agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc   6360

tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc   6420

ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag   6480

acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta   6540

ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa   6600

gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc   6660

gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat   6720

ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga   6780

gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt   6840

tcttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata   6900

cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac   6960

cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg   7020

ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg   7080

tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag   7140

cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct   7200

ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc   7260

aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt   7320

ttgctggcct tttgctcaca tggctcgaca gatct                              7355

<210>12

<211>1308

<212>DNA

<213>HCV NS3/4A

<400>12

atggcgccta ttacggccta ctcccaacag acgcgaggcc tacttggctg catcatcact     60

agcctcacag gccgggacag gaaccaggtc gagggggagg tccaagtggt ctccaccgca    120

acacaatctt tcctggcgac ctgcgtcaat ggcgtgtgtt ggactgtcta tcatggtgcc    180

ggctcaaaga cccttgccgg cccaaagggc ccaatcaccc aaatgtacac caatgtggac    240

caggacctcg tcggctggca agcgcccccc ggggcgcgtt ccttgacacc atgcacctgc    300

ggcagctcgg acctttactt ggtcacgagg catgccgatg tcattccggt gcgccggcgg    360

ggcgacagca gggggagcct actctccccc aggcccgtct cctacttgaa gggctcttcg    420

ggcggtccac tgctctgccc ctcggggcac gctgtgggca tctttcgggc tgccgtgtgc    480

acccgagggg ttgcgaaggc ggtggacttt gtacccgtcg agtctatgga aaccactatg    540

cggtccccgg tcttcacgga caactcgtcc cctccggccg taccgcagac attccaggtg    600

gcccatctac acgcccctac tggtagcggc aagagcacta aggtgccggc tgcgtatgca    660

gcccaagggt ataaggtgct tgtcctgaac ccgtccgtcg ccgccaccct aggtttcggg    720

gcgtatatgt ctaaggcaca tggtatcgac cctaacatca gaaccggggt aaggaccatc    780

accacgggtg cccccatcac gtactccacc tatggcaagt ttcttgccga cggtggttgc    840

tctgggggcg cctatgacat cataatatgt gatgagtgcc actcaactga ctcgaccact    900

atcctgggca tcggcacagt cctggaccaa gcggagacgg ctggagcgcg actcgtcgtg    960

ctcgccaccg ctacgcctcc gggatcggtc accgtgccac atccaaacat cgaggaggtg   1020

gctctgtcca gcactggaga aatccccttt tatggcaaag ccatccccat cgagaccatc   1080

aaggggggga ggcacctcat tttctgccat tccaagaaga aatgtgatga gctcgccgcg   1140

aagctgtccg gcctcggact caatgctgta gcatattacc ggggccttga tgtatccgtc   1200

ataccaacta gcggagacgt cattgtcgta gcaacggacg ctctaatgac gggctttacc   1260

ggcgatttcg actcagtgat cgactgcaat acatgtgtca cccagaca                1308    

Claims (10)

1.用于评价HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性的融合蛋白，是以萤火虫荧光素酶为报告基因，两个可紧密结合的小分子多肽分别与N端和C端的萤火虫荧光素酶片段结合，中间由NS3/4A丝氨酸蛋白酶作用底物相连形成融合基因，然后将此融合基因插入真核表达载体形成指示载体后表达产生。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述两个小分子多肽为可紧密结合且不影响细胞功能的蛋白分子；所述NS3/4A丝氨酸蛋白酶作用底物为NS3/NS4A、NS4A/4B、NS4B/NS5A、NS5A/NS5B的连接点；所述指示载体的表达在体外细胞水平表达，或通过转基因的方式在动物体内表达。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述NS3/4A丝氨酸蛋白酶作用底物为NS5A/NS5B的连接点的融合基因为ANluc-NS5A/B-BCluc，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；

3)与序列表中SEQ ID NO：2限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有评价HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性作用的核苷酸序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：1；

2)将序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加并具有评价HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性作用的蛋白质。

5.由权利要求1所述融合基因插入真核表达载体构建而成的用于评价HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性的指示载体。

6.根据权利要求5所述的指示载体，其特征在于：所述指示载体是将权利要求4所述融合基因ANluc-NS5A/B-BNluc插入真核表达载体PCI neo形成的ANluc(ΔNS5A/B)BNluc，其核苷酸序列如序列表中序列11所示。

7.权利要求1-4所述融合蛋白在HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性检测与评价中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：为一种HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂的筛选与评价的方法，是在HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂存在的条件下，用权利要求6或7所述的指示载体转染含有HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶的细胞，收集细胞样品，检测细胞内荧光素酶的表达量，以此得到细胞内HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性的抑制率，进而得到对HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂效果的评价。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：用含有HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶基因的重组表达载体pCIneo-NS3/4A和指示载体ANluc(ΔNS5A/B)BCluc共转染细胞。

10.用于指示细胞凋亡的融合基因，为ANluc-DEVD-BCluc，其核苷酸序列如序列表中序列9所示；用于指示细胞凋亡的指示载体，是将所述融合基因ANluc-DEVD-BCluc插入真核表达载体PCI neo形成的ANluc(DEVD)BCluc，其核苷酸序列如序列表中序列10所示；用于指示细胞凋亡的方法，是所述指示载体ANluc(DEVD)BCluc转染细胞，收集细胞样品，检测细胞内荧光素酶的表达量，以此指示细胞凋亡。

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