CN114573694B

CN114573694B - 一种抗IL13Rα2抗体及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN114573694B
Application number: CN202110227363.9A
Authority: CN
Inventors: 李大伟; 法哈尔·安·尼萨; 古拉姆·拉扎; 刘国松; 王泽玲
Original assignee: Shenzhen Huabai Biotechnology Co ltd; Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shenzhen Huabai Biotechnology Co ltd; Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2020-12-01
Filing date: 2021-03-01
Publication date: 2023-09-01
Anticipated expiration: 2041-03-01
Also published as: CN114573694A

Abstract

本发明涉及基因免疫学和分子生物学领域，特别是涉及一种抗IL13Rα2抗体及其制备方法和用途。所述抗IL13Rα2抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述抗IL13Rα2抗体具有如下中的一项或多项：<1>重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.58所示的CDR‑H1；<2>重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.59所示的CDR‑H2；<3>重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.60所示的CDR‑H3；<4>轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.50所示的CDR‑L1；<5>轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.51所示的CDR‑L2；<6>轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.52所示的CDR‑L3。

Description

一种抗IL13Rα2抗体及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及基因免疫学和分子生物学领域，特别是涉及一种抗IL13Rα2抗体及其制备方法和用途。

背景技术

白细胞介素-13受体亚基alpha-2(IL13Rα2)，又称CD213A2，是一种由位于X染色体上的IL13RA2基因编码的膜结合蛋白(Xq13.1-q28)。IL13Rα2与IL13Rα1密切相关，IL13Rα1是白细胞介素-13受体复合物的一个亚基。该蛋白与IL13高亲和力结合，但缺乏任何显著的细胞质结构域，似乎不发挥信号介质的作用。IL13Rα1对IL-13的亲和力较低，但在与IL-13结合后，它会招募IL-4Rα形成高亲和力的IL-13R复合物(II型IL-13R)，并通过JAK-STAT通路介导信号转导(O'Shea,J.J.，et al.，Cell,2002,109:121-31)。另一方面，IL13Rα2与IL-13高亲和力结合并内化，但它不介导信号转导(Kawakami,K.，et al.，Blood,2001,97:2673-9)。也有报道称，它在IL13的内化过程中发挥作用。IL13Rα2被发现在多种癌症中过表达，包括胰腺癌、卵巢癌、黑素瘤和恶性胶质瘤，因此，它可以作为疾病的生物标志物和癌症治疗的靶点(Kioi,M.，et al.，Cancer,2006,107:1407-18；Kornmann，M.，1999,19-125-31)。IL-13在炎症和免疫反应中发挥核心作用，并与两个受体亚基IL13Rα1和IL13Rα2结合(Joshi,B.H.，et al.，Vitam Horm.,2006,74:479-504)。有推测认为IL13Rα2的胞外结构域可能作为II型IL-13R复合物的诱骗受体(Chiaramonte,M.G.，et al.，J Exp Med.，Rahaman,S.O.,et al.,Cancer Res.,2002,62:1103–9)。有报道称IL-13在小鼠巨噬细胞系中可以通过IL13Rα2发出信号，且其信号不依赖于STAT6，并通过AP-1途径诱导转化生长因子β1活性的激活(Fichtner-Feigl,S.，et al.，Nat Med.，2006,12:99-106)。IL-13Rα2在某些类型的人类癌症中过度表达，包括胶质母细胞瘤、头颈癌、肾癌、卵巢癌、成神经管细胞瘤和卡波西肉瘤，最近的一项DNA微阵列研究表明，IL13Rα2基因在乳腺癌肺转移灶中表达增加(Minn，A.J.，et al.，Nature 2005,436:518-24)。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供抗IL13Rα2抗体及其制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种抗IL13Rα2抗体，所述抗IL13Rα2抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述抗IL13Rα2抗体具有如下技术特征中的一项或多项：

<1>重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.58所示的CDR-H1；

<2>重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.59所示的CDR-H2；

<3>重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.60所示的CDR-H3；

<4>轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.50所示的CDR-L1；

<5>轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.51所示的CDR-L2；

<6>轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.52所示的CDR-L3。

<7>在以上抗体序列基础上进行有限氨基酸改变的优化抗体。

<8>以上抗体序列基础上优化产生，结合相同抗原表位的抗体。

本发明还提供一种多核苷酸，编码所述抗IL13Rα2抗体的重链可变区和/或轻链可变区或全长氨基酸。

本发明还提供一种构建体，含有所述的分离的多核苷酸。

本发明还提供一种抗体的表达系统，所述表达系统含有所述的构建体或基因组中整合有外源的所述的多核苷酸。

本发明还提供所述的抗IL13Rα2抗体的制备方法，包括如下步骤：在适合表达所述IL13Rα2抗体的条件下，培养所述的抗体的表达系统，从而表达出所述IL13Rα2抗体，纯化分离出所述IL13Rα2抗体。

本发明还提供所述的抗IL13Rα2抗体在制备治疗抗肿瘤药物或制备诊断抗肿瘤药物中的用途。

本发明还提供一种抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物的药效成分包括所述的IL13Rα2抗体。

本发明还提供一种肿瘤诊断试剂盒，包含所述的抗IL13Rα2抗体和/或其免疫偶联物。

本发明还提供一种肿瘤的诊断或治疗方法，所述治疗方法包括向患者给予有效剂量的抗IL13Rα2抗体，和/或所述的抗肿瘤药物；所述诊断方法包括向患者或提取至患者的样本施加所述的抗IL13Rα2抗体，和/或所述的抗肿瘤药物。

如上所述，本发明的抗IL13Rα2抗体，具有以下有益效果：可以阻断IL13Rα2的激活，具有抗肿瘤活性，且无毒性。这种抗体打开了一个独特的机会来研究其治疗潜力。

附图说明

图1显示为IL13Rα2抗原3个不同结构域的图示。(A)人源IL13Rα2的cDNA编码一个含有380个氨基酸的蛋白。从结构上，它的N端的1-26位氨基酸形成一个信号肽，后跟一个包含317个氨基酸的胞外结构域。该胞外结构域包括一个N端的S-型Ig区域(D1 loop)、两个纤连蛋白III样结构域(D2和D3 loop)、以及一个WXSWS盒。胞外结构域后是包含20个氨基酸的跨膜结构域以及包含17个氨基酸的短的胞内结构域。(B)蛋白质的三维结构(Swiss modelSoftware)显示IL13Rα2抗原有三个胞外纤维连接蛋白III结构域。

图2显示为间接ELISA法检测mAb15D8亲和力。

图3显示为Western blot方法检测IL13Rα2抗体的结合特异性。(A)带His标签和不带His标签的IL13Rα2抗原在pMAL表达载体中进行表达并用m15D8抗体进行检测。左图使用一抗为mAb15D8及商品化Rabbit anti-IL13Rα2多克隆抗体(Abcam)，二抗分别为偶联了800CW的Goat anti-Mouse二抗(绿色)以及偶联了/>680RD的Goat anti-Rabbit二抗(红色)。右图使用一抗为商品化Mouse anti-6*His tag单克隆抗体以及商品化Rabbit anti-IL13Rα2多克隆抗体，二抗分别为偶联了/>800CW的Goat anti-Mouse二抗(绿色)以及偶联了/>680RD的Goat anti-Rabbit二抗(红色)(B)Western blot法检测IL13Rα2抗原。小鼠脾脏和Jurkat细胞裂解液用mAb15D8进行孵育，用商品化兔抗IL13Rα2多克隆抗体重新孵育同一膜。在另一个Western blot实验中，将IL13Rα2抗原点在平板凝胶上，将膜切成4片，其中两片用兔抗IL13Rα2的多克隆抗体孵育，其他两片用小鼠抗IL13Rα2的抗体mAb15D8孵育。

图4显示为纯化的抗IL13Rα2的单克隆抗体mAb15D8最小结合浓度的检测结果。通过Dot blot检测抗体与IL13Rα2抗原的最小特异性结合浓度。

图5显示为纯化抗体的SDS-PAGE电泳结果。M表示蛋白大小的标尺。第1泳道和第2泳道分别为鼠源的样本mAb15D8和mAb18A4。左图为还原凝胶电泳，右图为非还原凝胶电泳，凝胶染色使用考马斯蓝染色法。

图6显示为利用Roche公司的商用试纸对mAb15D8和mAb18A4抗体进行亚型检测，结果显示，mAb15D8重链为IgG1亚型，轻链为kappa亚型。而阳性对照mAb18A4重链为IgG2b亚型，轻链为kappa亚型。

图7显示为免疫荧光检测mAb15D8特异性。(A、B)将SKOV3、A549、3T3、H460细胞用多聚甲醛固定，用0.3％Triton X渗透后，5％BSA室温封闭2h，在4℃条件下与mAb15D8孵育2h。以山羊多克隆抗体，稀释1000后作为二抗。用Alexa fluor 594phalloidin反染F-actin60min，用DAPI染色5min以上。处理后的细胞在荧光显微镜下进行观察，抗体在核膜外显示出IL13Rα2结合活性，细胞形态和细胞骨架组织被破坏。标尺为50μm。

图8显示为MTT法检测抗体在体外抑制肺癌细胞H460和成纤维细胞3T3生长能力。

图9显示为mAb15D8抗体在体外抑制细胞迁移，减少细胞增殖，改变细胞形态。血清饥饿的A549、H460、SKOV3、B16F10细胞经mAb15D8处理48h后进行划痕实验，并计数细胞迁移数。在划痕实验0、24和48h对划痕面积进行量化。借助Graph Pad Prism对三个平行组之间进行2-tail T检验统计分析，*、**和***分别表示P<0.05、P<0.02和P<0.001。

图10显示为在Jurkat T细胞和肺癌H460细胞共培养物中，mAb15D8抗体显著增强颗粒酶和穿孔素的分泌。以PMA和IONOMYCIN(各1μg/ml)处理Jurkat T细胞，在37℃的CO₂(5％)培养箱中孵育过夜，以激活Jurkat T细胞。然后与肺癌H460细胞共培养，IgG作为对照。IgG以及mAb15D8(20μg/ml和50μg/ml)孵育24h后，在原始放大倍数20倍(TUNELAssay)下采集图像。

图11显示为mAb15D8与IL13Rα2蛋白特定结构域结合位点的测定。分别删除13Rα2的3个不同结构域，表达并纯化突变蛋白，检测mAb15D8抗体的结合结构域。[-]表明mAb15D8未与标定域缺失突变体IL13Rα2结合。[+]表明mAb15D8与标定域缺失突变体IL13Rα2结合。

图12显示为mAb15D8抗体阻断表位分析。上方的图谱是抗原性分析，使用预测抗原肽软件(1-pap)进行。下方的图谱为使用1-pap软件进行的IL13Rα2的D1-1c缺失突变体的抗原表位的抗原性分析。

图13显示为使用Swiss model蛋白质建模软件分析IL13Rα2的1-380氨基酸的三维结构。

图14(A)和(B)显示为mAb15D8与IL13Rα2缺失突变的IL13Rα2突变体的结合分析。

图15显示为经甘氨酸扫描得到的IL13Rα2突变体的理论序列分析。

图16(A)和(B)显示为mAb15D8与未突变的原始IL13Rα2以及通过缺失突变和甘氨酸扫描生成的IL13Rα2突变体的结合分析。

图17显示为mAb15D8可抑制C57BL/6小鼠的黑色素瘤转移，且无明显毒性。(A)小鼠静脉接种2×10⁵个B16F10细胞3天后，每周2次静脉注射20mg/kg mAb15D8。实验结束时(16天)收集到的具有代表性的肺图像如图所示(n＝9)。(B)抗体对小鼠体重无影响。(C)组织学分析显示，对照组肺内有大面积肿瘤细胞转移(虚线标记)，而mAb15治疗组肺内肿瘤细胞较少。右侧为肺肿瘤结节的量化数据。用GraphPad Prism对信号进行量化。*、**、***分别表示P<0.05、P<0.02、P<0.001。标尺为100μm。

图18显示为动物体内实验测定小鼠存活时间。与IgG对照组相比，抗IL13Rα2的mAb15D8通过抑制B16F10黑素瘤肺转移，显著提高了C57BL/6小鼠的生存时间。

图19显示为C57BL/6小鼠注射B16F10细胞后形成小鼠黑色素瘤肺转移模型所需时间探究。(A)C57BL/6小鼠经静脉接种2×10⁵个B16F10细胞3天后，每周2次给予20mg/kgmAb15D8。细胞接种第8天、第10天、第12天采集肺部的代表性图片。(B)定量数据显示B16F10细胞接种后第10天肺部出现肿瘤结节。量化数据表示均值±标准差(n＝9)，数据用GraphPad Prism处理。(*P<0.05，**P<0.01)。

图20显示为药物动力学分析。C57BL/6小鼠静脉注射单剂量mAb15D8(20mg/kg)，采集血清样品，采用ELISA法测定血清样品中的抗体浓度。间接ELISA检测不同时间点(30min、2h、6h、1d、2d、3d、5d、7d)小鼠血清中mAb15D8的滴度。

图21显示为mAb15D8对C57BL/6小鼠的毒理学研究。静脉注射20mg/kg mAb15D8，每周2次，连续使用5周。在实验结束时，收集重要器官进行苏木精和伊红染色。具有代表性的H&E图片显示，在mAb15D8处理的小鼠的重要器官中没有发现明显的毒性。标尺为100μm。

图22显示为mAb15D8抗体轻、重链序列的扩增结果。

图23显示为单克隆抗体15D8的重组表达。

图24显示为重组表达单克隆抗体mAb15D8与IL13Rα2的结合研究。(A)重组表达单克隆抗体mAb15D8结合结果。(B)Rabbit Anti-IL13Rα2antibody(Abcam)结合结果。(C)(A)和(B)通道的融合图像。

图25显示为重组表达单克隆抗体mAb15D8与缺失突变产生的IL13Rα2突变体的结合研究。(A)重组表达单克隆抗体mAb15D8结合结果。(B)Rabbit Anti-IL13Rα2antibody(Abcam)结合结果。

图26显示为重组表达单克隆抗体mAb15D8与原始IL13Rα2以及通过缺失突变和甘氨酸扫描所得的IL13Rα2突变体结合情况研究。(A)重组表达单克隆抗体mAb15D8结合结果。(B)Rabbit Anti-IL13Rα2antibody(Abcam)结合结果。

具体实施方式

本发明首先提供一种抗IL13Rα2抗体，所述抗IL13Rα2抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述抗IL13Rα2抗体具有如下技术特征中的一项或多项：

<1>重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.58所示的CDR-H1；

<2>重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.59所示的CDR-H2；

<3>重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.60所示的CDR-H3；

<4>轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.50所示的CDR-L1；

<5>轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.51所示的CDR-L2；

<6>轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.52所示的CDR-L3。

在一种实施方式中，所述抗IL13Rα2抗体能够特异性结合IL13Rα2蛋白的SEQ IDNO.13所示的区域。

“IL13Rα2”和“Interleukin-13受体亚基α2”可以互换使用，这表明分子家族拥有完整的人源IL13Rα2天然氨基酸序列且属于白介素受体家族，包括潜在形式和前体，以及成熟IL13Rα2的相关或不相关的复合物。本发明中的IL13Rα2应该被理解为目前任何一个已知的以及未来将要确认的IL13Rα2，以及任何来自IL13Rα2序列的多肽，要求至少有75％的同源性，优选为至少80％，优选为至少85％左右，更优选为少90％左右，甚至更优选为至少95％的同源性。

白介素IL-13是一种细胞因子，通过调节免疫系统在过敏和特应性疾病中发挥重要作用。它有两个受体，IL13Rα1和IL13Rα2，其中单体IL13Rα1与IL-13低亲和力结合，并通过与IL4受体配对介导其细胞功能。IL-13结合到IL13Rα1/IL4Rα异质二聚体上，导致Janus激酶(JAKs)激活信号转导子和转录激活子(STAT)6。IL13Rα2以高亲和力结合IL-13，但由于其细胞质尾较短且没有信号基序，因此不介导IL-13的细胞功能。IL13Rα2的基因首先从人肾癌细胞系中分离出来。Caput等从Caki-1细胞系中克隆出IL13Rα2的cDNA。它被认为是一种诱饵受体，因为IL13Rα2阻止IL-13与IL13Rα1的结合，从而抑制过度表达的IL-13信号。然而，最近的一些研究已经说明了IL13Rα2的IL-13依赖性和IL-13非依赖性功能，表明该受体可能不仅仅是诱饵受体。IL13Rα2也被称为癌症/睾丸抗原19(CT19)，因为它是睾丸特异性抗原之一，在高级别癌症如胶质母细胞瘤中表达增加。CT抗原在癌症中具有高免疫原性和高表达，因此它们是癌症免疫治疗中有前途的靶点。

IL13Rα2在人体组织中表达较少，但在胎盘、睾丸、肝脏、肺、胸腺和脑中发现了其在mRNA水平的表达。在小鼠的脾脏、肝脏、骨髓、大脑、结肠和皮肤中发现了IL13Rα2的转录物。有多篇报道显示，IL13Rα2在胶质母细胞瘤、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌和卡波西肉瘤等多种癌症中高表达。已经表明，IL13Rα2的表达可以被过敏原或Th2细胞因子刺激。Zheng等研究表明，炎症介质如IL-4、IL-10和IFN-g(除了IL-13之外)可以上调IL13Rα2基因的表达。IL13Rα2在小鼠中以膜和可溶形式存在，在人类中也以膜形式存在。它定位于细胞表面和细胞内小泡膜，而可溶性形式显示细胞外定位。在单核细胞和呼吸上皮细胞中，IL13Rα2主要存在于细胞内，已被证明在干扰素(IFN)-g刺激后可移动到细胞表面。在小鼠体内，可在循环中检测到可溶性形态，并已被证明在调节IL-13生物活性方面发挥重要作用。

然而，在人血清或支气管肺泡灌洗液中未检测到可溶性IL13Rα2。人的IL13Rα2基因位于X染色体(Xq13.1-q28)上，包含10个外显子。有趣的是，小鼠的IL13Rα2也位于同一条染色体上。在小鼠中，IL13Rα2基因转录物经历交替剪接产生两个离散的mRNAs，一个编码受体的膜形式(全长)，另一个是缺失外显子10的较短转录物，外显子10编码可溶性形式。尽管人和小鼠IL13Rα2之间的同源性从外显子2到外显子8是保守的，但编码跨膜区和胞质区的下游外显子是不同的。事实上，人类缺乏可溶性形式的IL13Rα2可能是由于人类IL13Rα2外显子9(编码跨膜区)和小鼠IL13Rα2外显子10和11之间的同源性较低。相比之下，整个IL13Rα2基因在人和猴之间非常保守。

由于IL13Rα2以比IL13Rα1高50倍的亲和力结合IL-13，并且在其细胞质短尾中缺乏任何信号基序，因此它充当诱饵受体，并通过IL13Rα1/IL-4RA复合物抑制对IL-13的任何细胞反应。据Kawakami等报道，在IL-13结合时，IL13Rα2在细胞内再循环区室中清除IL-13后内化并再循环回细胞表面。因此，该受体降低IL-13对IL13Ra1/IL-4Ra复合物的利用率，从而抑制IL-13的生物活性。他们的研究得出结论，位于跨膜区的三个亮氨酸基序对IL-13通过IL13Rα2的内化至关重要。

所述抗IL13Rα2抗体为单链抗体，和/或单克隆抗体。进一步的，所述单克隆抗体为IgG1抗体。

“抗体”包括完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两个完整的抗体(如双重特异性抗体)形成的多特异性抗体以及抗体片段。

靶向特性抗原的抗体，如IL13Rα2抗原，是指能够以足够的亲和力结合目标抗原的抗体，使该抗体可作为靶向表达该抗原的细胞的治疗药物。如果抗体是结合IL13Rα2的抗体，那么它通常优先结合IL13Rα2，而不是白细胞介素家族的其他成员，并且它不与该家族中的其他蛋白质(例如激活蛋白等)发生显著交叉反应。具有给定抗体的“生物学特性”的抗体，如标记为15D8的单克隆抗体，是指具有一种或多种生物学特性的抗体，其与其他抗体的不同之处在于其结合相同的抗原(如IL13Rα2)。例如，具有15D8生物学特性的抗体可以阻断IL13Rα2的激活和/或与15D8结合相同的IL13Rα2细胞外结构域表位。

本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即构成该群体的各种抗体是相同的，除了通常以极少量存在的可能的天然存在的突变体。单克隆抗体具有高度特异性，即针对抗原上的单个表位。此外，不同于包含针对不同决定区(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定区。除了它们的特异性外，单克隆抗体的一个优点是，它们现在可以在合成时不受其他抗体的污染。修饰词“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体中获得的抗体的性质，不应解释为需要任何特定的方法来产生抗体。鼠15D8抗体的例子如实施例9所示。“表位”是IL13Rα2胞外结构域中与单克隆抗体15D8结合的区域。

本文中的单克隆抗体明确地包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类型或亚型的相应序列相同或同源，剩余部分与衍生自另一特定物种或属于另一特定抗体类型或亚型的相应序列相同或同源，以及这些抗体的片段，只要它们表现出所需的生物活性即可。

一个完整的抗体包括结合可变区(V)以及恒定区(C)。恒定区包括轻链恒定区(LC)和重链恒定区(HC)。恒定区可以是天然序列的恒定区或其氨基酸序列的变体。天然序列的恒定区例如为哺乳动物天然序列的恒定区。可变区包括重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)。优选地，完整的抗体具有一种或多种效应功能。“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区或可变区。例如，抗体片段包括Fab、Fab'、F(ab')、F(ab')2和Fv片段。Fv片段是包含完整抗原识别和结合位点的抗体片段。这个区域由一个相互紧密相连的重链可变区和一个轻链可变区组成，而这个连接可以是共价的(比如在SchV中)。在这样的构象中，每个可变区的三个CDR相互作用来确定V-V二聚体的表面的抗原结合位点。“Fab”片段包括轻链的可变区和恒定区，重链的可变区和第一恒定区(CH1)。一个F(ab’)抗体片段包括一对Fab片段，它们通常通过它们之间的铰链半胱氨酸在羧基末端附近共价连接。

所述抗IL13Rα2抗体的重链可变区的氨基酸序列包括如SEQ ID No.57所示的氨基酸序列；和/或，所述抗IL13Rα2抗体的轻链可变区的氨基酸序列包括如SEQ ID No.49所示的氨基酸序列。

所述抗IL13Rα2抗体轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO.53。所述抗IL13Rα2抗体重链的氨基酸序列为SEQ ID NO.61。

所述抗IL13Rα2抗体轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.56所示。

所述抗IL13Rα2抗体重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.64所示。

本文使用的术语“抗体可变区”包含互补决定区(CDR，即CDR1、CDR2和CDR3)和框架区(FRs)。根据本发明所使用的方法，CDRs和FRs的指定氨基酸位置可由Kabat等人(编号系统在Sequences of Proteins of Immunological Interest一书中有描述,5"Edition,PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。

本文使用的术语“互补决定区”(CDR：即CDR1、CDR2和CDR3)是指抗体可变区中的氨基酸残基，其存在是抗原结合所必需的。

在本发明某些实施方式中，所述框架区可以位于互补决定区之间，也可以位于互补决定区的两端。在本发明某些具体实施方式中，所述框架区的序列为人源单抗可变区，或为鼠源单抗可变区的框架区序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、或1-3个)氨基酸而得到的框架区序列，该框架区序列与人源单抗可变区序列的框架区序列可以具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、或99％以上的同源性。

在本发明某些实施方式中，所述抗IL13Rα2抗体为单链抗体(single chain Fv,scFv)。单链抗体通常可以为包括抗体的VH(重链可变区)和VL(轻链可变区)的多肽链。通常来说，单链抗体还可以包括连接肽(linker)，连接肽通常位于VH和VL之间，以使scFv形成能与抗原结合的期望结构。例如，所述抗IL13Rα2抗体可以包括VH和VL，VH和VL之间可以设有连接肽，所述单链抗IL13Rα2抗体自N端至C端可以依次包括VL、连接肽和VH，所述抗IL13Rα2单链抗体自N端至C端也可以依次包括VH、连接肽和VL。所述连接肽可以是本领域中各种适用于形成scFv的连接肽，例如，所述连接肽可以是G4S3 linker，所述G4S3 linker的选择或设计可以参考文献Michel Sadelain etc，Science Translational Medicine，2013；CarlH.June etc,Science Translational Medicine,2015。

本发明还提供一种分离的多核苷酸，编码所述抗IL13Rα2抗体的重链可变区和/或轻链可变区或全长氨基酸。

本发明还提供一种构建体，含有所述的分离的多核苷酸。

据报道，血清中可溶性IL13Rα2的高浓度与患有寄生虫感染的患者之间存在联系，Mentink-Kane等人报告了曼氏血吸虫感染人群中IL13Rα2水平的升高，结论认为IL13Rα2可能是血吸虫病慢性和恶性炎症的信号。

IL13Rα2已被证明在多种恶性肿瘤中过表达，包括脑肿瘤、肾细胞癌、头颈部鳞状细胞癌、卵巢细胞癌、胰腺癌、乳腺癌和前列腺癌。此外，它是在睾丸中表达的CT抗原(CT19)之一，具有高免疫原性。因此，IL13Rα2作为治疗癌症的可能药物靶点引起了人们的极大兴趣。Wykosky等人报道，IL13Rα2在75％的世卫组织四级多形性胶质母细胞瘤(GBM)患者中过度表达。

本发明的抗体具有非治疗用途。例如，抗IL13Rα2单克隆抗体也可用于检测IL13Rα2蛋白在特定细胞、组织或血清中的表达。为了诊断的目的，通常可以使用检测部分，如放射性同位素、荧光标记或酶-底物标记来标记抗体。本发明的抗体可用于任何已知的实验，如竞争性结合实验、直接和间接夹心实验和免疫沉淀实验。

本发明还提供一种抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物包括所述的IL13Rα2抗体和药学上可接受的辅料。

所述肿瘤为病理性血管生成有关的肿瘤。例如为皮肤癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、骨肉瘤、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、肾癌、头颈癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤。

所述抗肿瘤药物包括抗血管生成药物、化疗药物和细胞毒性药物。

所述抗肿瘤药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。

所述抗肿瘤药物主要针对的对象为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。

所述辅料可以是载体、稀释剂或赋形剂等。

本发明还提供一种肿瘤诊断试剂盒，包含诊断有效剂量的所述的抗IL13Rα2抗体、抗IL13Rα2抗体免疫偶联物或抗肿瘤药物中的一种或几种。

本发明还提供一种肿瘤的诊断或治疗方法，所述治疗方法包括向患者给予有效剂量的抗IL13Rα2抗体，和/或所述的抗肿瘤药物；所述诊断方法包括向患者或提取至患者的样本施加所述的抗IL13Rα2抗体，和/或所述的抗肿瘤药物。提取至患者的样本例如为患者的血液。

为了方便起见，本发明的抗体可以在试剂盒中提供，即预定量试剂和诊断实验说明的组合。如果使用酶标记的抗体，试剂盒将包括酶所需的底物和辅因子(例如，提供可检测发色团或荧光团的底物前体)。此外，可以包括其他添加剂，例如稳定剂、缓冲剂(例如，封闭缓冲剂或裂解缓冲剂)等。各种试剂的相对量可以广泛改变，以便提供溶液中试剂的浓度，从而充分优化实验的灵敏度。具体而言，这些试剂可以以干燥粉末的形式提供，通常是冻干的，这包括在溶解时提供适当浓度的试剂溶液的方法。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

实施例1IL13Rα2抗原质粒的构建及表达

IL13Rα2用嵌合型引物正向(SEQ ID NO.14)和反向(SEQ ID NO.15)从pCDNA3.1(SEQID NO.1)进行PCR反应扩增。在正反向引物侧翼区域含有载体pMAL序列，因此，最终聚合酶链反应产物末端与载体pMAL的区域重叠。将载体和插入片段混合、变性并退火(IL13Rα2antigen clone in pMAL如SEQ ID NO.2)。随后，杂交的片段通过Phusion DNA聚合酶(Toyobo，Japan)进行延伸，聚合酶将以载体为模板，延伸至插入片段的5’末端。经过20个PCR循环后，产物中形成有两个缺口的新质粒(每条链上有一个缺口)。将模板质粒用DpnI酶切，利用重叠延伸PCR产生的新质粒IL13Rα2/pMAL转化大肠杆菌感受态细胞。将转化细胞涂布在添加有氨苄青霉素的LB琼脂平板上。挑取培养皿上形成的菌落进行质粒小抽，测序和基于His-tag的蛋白纯化。IL13Rα2抗原经sepharose Ni-NTA树脂(GE Healthcare)纯化，并对小鼠进行免疫，见图1。

实施例2小鼠免疫及杂交瘤的选择与鉴定

用弗氏佐剂乳化抗原溶液，制备注射用抗原IL13Rα2。每隔2-3周对小鼠进行免疫。每次加强免疫7天后，采集小鼠血液，监测血清中抗体水平。当抗体效价达到1:10000时，选择小鼠进行杂交瘤融合。使用含有8-azaguanine的培养基培养骨髓瘤细胞，以确保细胞融合后其对使用的HAT选择培养基的敏感性。新鲜收获的脾脏细胞和骨髓瘤细胞通过离心共沉淀，并向沉淀中加入聚乙二醇溶液(PEG)促进两种细胞的融合。再次离心，慢慢加入培养基以稀释PEG溶液。将融合细胞离心，重悬于选择培养基中，并等分于96孔板中。将杂交瘤培养至融合度为10-50％时，检测抗原特异性抗体的产生。将克隆的杂交瘤稀释至0.8个细胞/孔。根据泊松分布统计，这种稀释方法会可使得36％的单孔中含有单个细胞。当培养物融合度为10-50％时，用ELISA法检测抗体，进行两个或更多的克隆程序，直至90％的孔可产生单克隆抗体。

实施例3单克隆抗体15D8的生产和鉴定

A.收集杂交瘤细胞培养基

使用RPMI-1640培养基(含10％牛血清和1％抗生素)连续培养细胞3天，使细胞的数量保持在80％，并确保细胞处于对数生长期，用PBS洗涤细胞，将培养基更换为无血清培养基RPMI-1640，继续培养48h，收集上清。

B.从腹水中纯化单克隆抗体

按照Pierce Protein G琼脂糖说明书(20399)使用Protein-G免疫亲和层析纯化抗体。流程如下：从4℃取出柱料和所有试剂；放置于室温下使其平衡至室温；将柱料轻轻混合，将2ml 50％柱料悬液装入柱中，注意避免起泡；加入5ml结合缓冲液平衡柱子。首先通过0.45μm滤膜过滤去除杂质，然后用结合缓冲液稀释样品，稀释比例为“结合缓冲液:样品”为1:9，使得样品的盐浓度和pH值符合结合的要求。将稀释后的样品加入柱中，当总样品负荷低于最大结合能力的80％时(5mg小鼠IgG/ml柱材料)，达到最大结合能力，否则洗脱液将含有抗体；用5ml洗脱缓冲液洗脱目标抗体，并以1ml/管收集，收集前在EP管中加入100μl 1M磷酸或Tris中和缓冲液；用考马斯蓝G-250测定各管蛋白浓度。将高蛋白浓度的样品混合，用1×PBS(磷酸盐缓冲生理盐水)透析改变溶液体系，用12ml洗脱缓冲液再生柱子。最后通过SDS-PAGE检测纯化后的抗体，结果见图5。(对照组mAb18A4采用的是公开号CN101519649专利中的靶向AGR2单克隆抗体)

实施例4单克隆抗体效价测定

使用ELISA测定抗体效价的流程如下：酶联免疫吸附板以100μl/孔进行包被(包被所需抗原浓度为3μg/ml)，4℃孵育过夜或37℃孵育2h；倒出溶液，板子倒置，以除去液体。封闭：每个孔中加入200μl封闭液，4℃封闭过夜或37℃封闭2h，倒出溶液，板子倒置，以除去液体。每个空中加入100μl测定样品(样品稀释倍数为：10¹，10²，10⁴，10⁶，10⁸，10¹⁰，阳性对照和阴性对照稀释1000倍)，4℃孵育过夜或37℃孵育2h，倒出溶液，板子倒置，以除去液体。板子用洗涤缓冲液洗涤3×3min，然后倒干。加入二抗：二抗用封闭缓冲液稀释1000倍后，每孔加入100μl，37℃静置20min后，板子用洗涤缓冲液洗涤3×3min，然后倒干。显色：每孔中加入100μl底物，使颜色显色至足够深的程度。终止：加入100μl终止液，450nm下测定吸光值。图2为单克隆抗体效价测定平板照片，表明抗体的效价达到10⁴以上。

实施例5单克隆抗体的特异性

A.免疫印迹检测

为鉴定mAb15D8对IL13Rα2结合能力，以mAb15D8作为一抗，对带有His tag的抗原IL13Rα2-HIS及不带His tag的抗原IL13Rα2-W/O-HIS进行免疫印迹检测。蛋白质分离使用12％SDS-PAGE凝胶电泳，电压80-120V，时间2h。在300mA电流下，电转移45min，将蛋白质电转移至硝化纤维膜上，用5％牛血清蛋白在室温条件下封闭1h。将蛋白与一抗在室温下杂交，用1×PBST洗涤3×10min。一抗以及稀释方法：兔抗IL13Rα2抗体,稀释比例为1:1000。将蛋白与二抗在室温下杂交1h,1×PBST洗涤3×10min，曝光、显色、扫描后得到结果。检测结果如图3A所示，表明mAb15D8可以特异性结合抗原IL13Rα2。此外，进行细胞及组织IL13Rα2表达检测。用1×PBS洗涤细胞2次，加入10ml PBS后刮除细胞。1000rpm离心5min后，弃上清，加入5倍体积的NP40裂解缓冲液(加入蛋白酶抑制剂)，充分混匀裂解20min。将脾脏组织与5倍体积的NP40裂解液(加入蛋白酶抑制剂)充分混合，裂解20min，4℃，15000rpm离心后，回收上清，定量蛋白质(上述操作均在冰上进行)；沉淀悬浮于5×PAGE蛋白上样缓冲液中(确定已加入β-巯基乙醇)，95℃加热5min；然后进行免疫印迹检测。结果表明，该单克隆抗体在脾脏组织裂解液中检测到IL13Rα2表达，而在Jurkat细胞中未检测到IL13Rα2表达，见图3B。

B.免疫荧光检测

将圆形盖玻片放入24孔板中，用1×PBS冲洗一次。再用相应的培养基浸润，吸干培养基。将3T3、H460、SKOV3、A549细胞胰酶消化后移入24孔板。细胞贴壁后，吸掉培养基，用1×PBS清洗一次，随后用4％多聚甲醛在室温下固定10至20min，用1×PBS清洗一次。0.5％Triton X–100，0.3％羊血清在室温洗40min。加入一抗，4℃孵育过夜，用1×PBS洗涤3×5min。加入荧光二抗体，室温静止30min，用1×PBS清洗3×5min。DAPI染色后5min，用1×PBS洗2×5min，用荧光显微镜在密封的载玻片上进行观察。结果表明，该单克隆抗体在肺癌A549和H460细胞中原位检测到IL13Rα2的表达，见图7。

C.通过斑点印迹(Dot blot)检测抗体特异性

通过斑点印迹方法检测纯化的anti-IL13Rα2mAb15D8与IL13Rα2抗原结合特异性，在斑点印迹装置装备中调整硝化纤维膜位置，在平板每孔中加入2μl(0.5μg)抗原，干燥5min，将膜在封闭缓冲液中封闭60min，用洗涤缓冲液洗3×3min。再次根据抗原点调整装置，用不同稀释浓度的mAb15D8孵育1h，每孔抗体用量100μl。商品化兔抗IL13Rα2多克隆抗体(Abcam)与第二膜孵育作为对照，用洗涤缓冲液洗涤3×3min，用山羊抗小鼠二抗孵育45min，用洗涤缓冲液洗涤3×3min，随后扫膜。结果表明，不同稀释浓度的mAb15D8均具有特异性结合，见图4。

D.抗体亚型检测

单克隆抗体15D8亚型采用用于检测小鼠单克隆抗体亚型的Roche IsoStrip试剂盒进行，流程按照试剂盒附带的说明书进行。结果表明，mAb15D8重链为IgG1亚型，轻链为kappa亚型。而阳性对照组mAb18A4重链为IgG2b亚型，轻链为kappa亚型，见图6。

实施例6体外抑制肿瘤细胞生长实验

MTT实验如下：3T3和H460细胞株用相应的细胞培养液传代至对数生长期(至少传代两代，每代达到融合度80％)，使用1×Trypsin-EDTA溶液进行消化，最后将细胞浓度调整至5×103/ml，接种于96孔板中，每孔200μl，检查每孔细胞是否均匀分布。细胞贴壁后，分别在每孔中加入不含任何抗体、含有本发明抗体20μg/ml或对照抗体IgG 20μg/ml的培养基。24、48、72h后，每孔加5mg/ml的MTT溶液20μl。再孵育4h后，吸去96孔板中每孔的原溶液，向每孔中加入150μl DMSO溶解formazan沉淀。室温下放置0.5h后，在摇床上摇10min，用酶标仪测定各孔在590nm处吸光度。结果表明，该单克隆抗体抑制H460细胞的生长，而3T3细胞作为对照，受影响较小，见图8。

实施例7体外抑制肿瘤细胞迁移实验

划痕实验步骤如下：将皮肤癌细胞B16F10、卵巢癌细胞SKOV3、肺癌细胞A549分别铺于6孔板(细胞融合70％)。细胞融合后，用狭窄的细胞刮板刮去中间的细胞，1×PBS冲洗2次，将刮掉的细胞洗去，标记培养板并进行拍照。加入含有本发明的抗体20μg/ml或对照抗体IgG 20μg/ml的培养基，开始计时，在24、48h拍照(注意，拍照位置应与标记区域相同)。结果表明，该单克隆抗体能抑制B16F10、SKOV3和A549细胞的体外迁移，见图9。

实施例8 TUNEL法测定共培养实验中的细胞凋亡

末端脱氧核苷酸转移酶dUTP标记末端标记(TUNEL)是一种通过标记凋亡过程中产生的DNA双链断裂的3'-羟基末端检测DNA片段的方法。Jurkat T细胞用PMA(PHORBOL12-MYRISTATE 13-ACETATE)和IONOMYCIN处理(各1μg/ml)处理，在37℃含有CO2(5％)培养箱中孵育过夜，以激活Jurkat T细胞。然后与肺癌H460细胞共培养，以IgG作为对照。在IgG对照和mAb15D8(20μg/ml和50μg/ml)孵育24h后，mAb15D8抗体显著增强Jurkat T细胞和肺癌H460细胞颗粒酶和穿孔素的分泌，见图10。

实施例9与抗体相关的抗原结合表位的确定

该部分主要确定单克隆抗体15D8与抗原IL13Rα2表位相关的氨基酸序列(见图11-14，表1)。流程如下：构建真核表达质粒pMAL-IL13Rα2(SEQ ID NO.2)；逐个删除2个纤连蛋白Ⅲ结构域，构建IL13Rα2缺失突变体(Mutant-D1、Mutant-D2、Mutant-D3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、4、5所示)。结构域1、2、3缺失突变的上下游引物见SEQ ID NO.18-23。通过特异性设计引物，每隔34个氨基酸进一步删除一个结构域(SEQ ID NO.24-29)。通过特异性设计引物(SEQ ID NO.30-37)，删除15个氨基酸(SEQ ID NO.9-12)，构建IL13α2突变体，该突变导致表位“LSLDHFKECTVEYEL”的缺失。Western blot检测发现，单克隆抗体不再与突变的IL13Rα2蛋白的D1-1c(SEQ ID NO.11)结合，从而确定抗体与IL13Rα2结合的表位氨基酸序列，见图14A、B。该单克隆抗体与突变蛋白的结合明显减弱。经鉴定，该单克隆抗体15D8特异性结合于表位“LSLDHFKECTVEYEL”(SEQ ID NO.13)，阻断57-71氨基酸区域，该区域删除后可能抑制转移活性。此外，还进行了甘氨酸扫描，以确定特定阻断区域的氨基酸序列，即从57-71区域中，每3个氨基酸被替换为甘氨酸，并命名为EP1、EP2、EP3、EP4和EP5。其中EP1、EP2、EP3突变体未与抗体结合，最终确定该单克隆抗体特异性结合于从57-65的表位“LSLDHFKEC”(SEQ ID NO.38)，且抗体可能抑制IL13Rα2的抑活性，见图15和图16。

表1.通过缺失突变得到的用于抗原表位测定的IL13Rα2抗原突变体

实施例10抗体动物体内实验

对数期的B16F10细胞的重悬浮于1×PBS中，静脉注射(2×10⁵/只动物)至6周龄C57BL/6小鼠(18-22g)。将注射细胞的小鼠随机分为两组(每组8只)：IgG组和mAb15D8组。细胞注射后3天，以20mg/kg腹腔给药，以同样用量的IgG作为对照。每周给药两次。经过16天的药物治疗，结束实验。收集各组肺标本，用放大镜对肿瘤结节进行计数。结果表明，该单克隆抗体在体内抑制肿瘤生长，见图17。

实施例11动物体内实验测定小鼠存活时间

取对数生长期B16F10细胞重悬于1×PBS中，静脉注射(2×10⁵/只动物)至6周龄C57BL/6小鼠(18-22g)，观察肺黑色素瘤转移模型动物的存活率。将注射细胞的小鼠随机分为三组(每组9只)：IgG组和mAb15D8组。细胞注射后3天，以20mg/kg腹腔给药，以同样用量的IgG作为对照。在治疗过程中及时观察小鼠状态。结果显示，使用mAb15D8治疗存活时间为28天，显著高于对照组的小鼠，对照组小鼠的存活时间为22天，见图18。

实施例12动物体内实验建立B16F10黑素瘤模型最短时间探究

取对数生长期B16F10细胞重悬于1×PBS中，静脉注射(2×10⁵/只动物)至6周龄C57BL/6小鼠(18-22g)，探究建立B16F10黑素瘤肿瘤动物模型的所需的最短时间。将注射细胞的小鼠随机分为两组(每组6只)：IgG组和mAb15D8组。细胞注射3天后开始腹腔给药mAb15D8，用量为20mg/kg，同样剂量的IgG作为对照。细胞注射8、10、12天后，各组处死2只小鼠，取肺并计数结节。结果显示，注射B16F10细胞后10天，肺内形成肿瘤，见图19。

实施例13抗体药物动力学研究

6周龄C57BL/6小鼠单次静脉注射抗IL13a2的抗体mAb15D8，用量为20mg/kg。在单剂量药代动力学研究中，在指定的时间点收集血清，用ELISA法测定血清中抗体的浓度。20mg/kg mAb15D8的曲线下面积(AUC)为897.295土154.12μg*hr/ml，测量的平均最大浓度(C_max)为14.9166土1.24μg/ml。血清中抗体的平均半衰期在3天以上。参见图20以及表2、表3所示。

表2 mAb15D8的药物动力学数据

Cmax(μg/ml)	14.9166±1.24
		Tmax(h)	0.5±0
Half-life(h)	77.53±6.54
		AUC(0-168)	897.295±154.12

表3不同时间点小鼠血清中mAb15D8的浓度

Hours	Conc.(μg/ml)
		0.5	14.9166
2	10.3099
		6	8.18544
24	7.48724
		48	5.67828
72	5.01556
		120	4.45652
168	3.32214

实施例14抗体毒理学研究

在毒理学研究中，小鼠静脉注射mAb15D8，剂量为20mg/kg，每周2次，共5周。对照组给予IgG治疗。实验结束后，取器官进行组织学分析。图21显示，实验组小鼠和对照组小鼠的心、肾、肺、脾、胸腺、脑、胰腺、结肠、肠等主要器官均未见毒性或组织学异常。

实施例15抗克隆抗体可变区序列的测定

单克隆抗体抗原结合位点的基因序列测定流程如下：从杂交瘤细胞中提取RNA，采用5′RACE PCR特异性引物(Andrew Bradbury，DOI 10.1007/978-3642-01144-32，15-20，2015)对VL和VH进行PCR扩增，并根据Marksetal(Marks，J.D.etal.，J.Mol.Biol.222：589-597，1991)确定其基因序列。轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.49，CDRs为SEQ IDNO.50-52。实验中扩增轻链使用的引物为SEQ ID NO.54和55。重链可变区氨基酸序列为SEQID NO.57，CDRs为SEQ ID NO.58-60。扩增重链用的引物为SEQ ID NO.62和63。

实施例16单克隆抗体15D8的重组表达

以杂交瘤细胞的cDNA为模板，使用KOD one DNA聚合酶(Toyobo，Japan)，通过PCR扩增编码单克隆抗体mAb15D8轻链和重链的cDNA；扩增轻链cDNA用的引物序列如SEQ IDNO.67和SEQ ID NO.68所示。轻链cDNA序列如SEQ ID NO.56所示；扩增重链cDNA用引物的序列如SEQ ID NO.71和SEQ ID NO.72所示，重链cDNA序列如SEQ ID NO.64所示；使用引物(引物序列如SEQ ID NO.69和SEQ ID NO.70所示)扩增序列如SEQ ID NO.74所示的IRES元件；将其克隆至哺乳动物细胞表达载体(核苷酸序列如SEQ ID NO.73所示)，表达载体使用序列如SEQ ID NO.65和SEQ ID NO.66所示的引物扩增，得到表达质粒p15D8MusE。将p15D8MusE瞬时转染293F细胞，进行单克隆抗体mAb15D8的重组表达。Western blot检测结果表明，瞬时转染p15D8MusE质粒的293F细胞成功表达出鼠源重组抗体，且该重组表达抗体的轻链和重链大小分别与单克隆抗体mAb15D8的相一致(图23)。同时，重组表达抗体可特异性结合IL13Rα2(图24)。重组表达抗体与IL13Rα2抗原表位结合研究表明，重组表达抗体与杂交瘤细胞产生的单克隆抗体mAb15D8的结合特性高度一致(图25，图26)，表明重组表达抗体与单克隆抗体mAB15D8的抗原结合表位相同。综上可知，本申请提供的抗体轻链和重链氨基酸序列所形成的重组抗体具有与单克隆抗体mAb15D8相同的生物学活性。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

序列表

<110> 深圳华柏生物科技有限公司

上海交通大学

<120> 一种抗IL13Rα2抗体及其制备方法和用途

<150> 2020113835283

<151> 2020-12-01

<160> 74

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 380

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Phe Val Cys Leu Ala Ile Gly Cys Leu Tyr Thr Phe Leu Ile

1 5 10 15

Ser Thr Thr Phe Gly Cys Thr Ser Ser Ser Asp Thr Glu Ile Lys Val

20 25 30

Asn Pro Pro Gln Asp Phe Glu Ile Val Asp Pro Gly Tyr Leu Gly Tyr

35 40 45

Leu Tyr Leu Gln Trp Gln Pro Pro Leu Ser Leu Asp His Phe Lys Glu

50 55 60

Cys Thr Val Glu Tyr Glu Leu Lys Tyr Arg Asn Ile Gly Ser Glu Thr

65 70 75 80

Trp Lys Thr Ile Ile Thr Lys Asn Leu His Tyr Lys Asp Gly Phe Asp

85 90 95

Leu Asn Lys Gly Ile Glu Ala Lys Ile His Thr Leu Leu Pro Trp Gln

100 105 110

Cys Thr Asn Gly Ser Glu Val Gln Ser Ser Trp Ala Glu Thr Thr Tyr

115 120 125

Trp Ile Ser Pro Gln Gly Ile Pro Glu Thr Lys Val Gln Asp Met Asp

130 135 140

Cys Val Tyr Tyr Asn Trp Gln Tyr Leu Leu Cys Ser Trp Lys Pro Gly

145 150 155 160

Ile Gly Val Leu Leu Asp Thr Asn Tyr Asn Leu Phe Tyr Trp Tyr Glu

165 170 175

Gly Leu Asp His Ala Leu Gln Cys Val Asp Tyr Ile Lys Ala Asp Gly

180 185 190

Gln Asn Ile Gly Cys Arg Phe Pro Tyr Leu Glu Ala Ser Asp Tyr Lys

195 200 205

Asp Phe Tyr Ile Cys Val Asn Gly Ser Ser Glu Asn Lys Pro Ile Arg

210 215 220

Ser Ser Tyr Phe Thr Phe Gln Leu Gln Asn Ile Val Lys Pro Leu Pro

225 230 235 240

Pro Val Tyr Leu Thr Phe Thr Arg Glu Ser Ser Cys Glu Ile Lys Leu

245 250 255

Lys Trp Ser Ile Pro Leu Gly Pro Ile Pro Ala Arg Cys Phe Asp Tyr

260 265 270

Glu Ile Glu Ile Arg Glu Asp Asp Thr Thr Leu Val Thr Ala Thr Val

275 280 285

Glu Asn Glu Thr Tyr Thr Leu Lys Thr Thr Asn Glu Thr Arg Gln Leu

290 295 300

Cys Phe Val Val Arg Ser Lys Val Asn Ile Tyr Cys Ser Asp Asp Gly

305 310 315 320

Ile Trp Ser Glu Trp Ser Asp Lys Gln Cys Trp Glu Gly Glu Asp Leu

325 330 335

Ser Lys Lys Thr Leu Leu Arg Phe Trp Leu Pro Phe Gly Phe Ile Leu

340 345 350

Ile Leu Val Ile Phe Val Thr Gly Leu Leu Leu Arg Lys Pro Asn Thr

355 360 365

Tyr Pro Lys Met Ile Pro Glu Phe Phe Cys Asp Thr

370 375 380

<210> 2

<211> 324

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met His His His His His His Asp Thr Glu Ile Lys Val Asn Pro Pro

1 5 10 15

Gln Asp Phe Glu Ile Val Asp Pro Gly Tyr Leu Gly Tyr Leu Tyr Leu

20 25 30

Gln Trp Gln Pro Pro Leu Ser Leu Asp His Phe Lys Glu Cys Thr Val

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180 185 190

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Thr Leu Lys Thr Thr Asn Glu Thr Arg Gln Leu Cys Phe Val Val Arg

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165 170 175

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180 185 190

Ser Tyr Phe Thr Phe Gln Leu Gln Asn Ile Val Lys Pro Leu Pro Pro

195 200 205

Val Tyr Leu Thr Phe Thr Arg Glu Ser Ser Cys Glu Ile Lys Leu Lys

210 215 220

Trp Ser Ile Pro Leu Gly Pro Ile Pro Ala Arg Cys Phe Asp Tyr Glu

225 230 235 240

Ile Glu Ile Arg Glu Asp Asp Thr Thr Leu Val Thr Ala Thr Val Glu

245 250 255

Asn Glu Thr Tyr Thr Leu Lys Thr Thr Asn Glu Thr Arg Gln Leu Cys

260 265 270

Phe Val Val Arg Ser Lys Val Asn Ile Tyr Cys Ser Asp Asp Gly Ile

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<211> 28

<212> DNA

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cagtctatct tacttttact cgggagag 28

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<211> 31

<212> DNA

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gtggtggtgg tggtggtgca t 21

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ctgtctctgg atcattttaa ggaatgc 27

<210> 33

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

cactatctca aaatcctgag gaggg 25

<210> 34

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

ctaaaatacc gaaacattgg tagtgaaaca tgg 33

<210> 35

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

tgggggttgc cattgcaaat agag 24

<210> 36

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

actaagaatc tacattacaa agatgggttt g 31

<210> 37

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

ttcatattcc actgtgcatt ccttaaaatg 30

<210> 38

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

Leu Ser Leu Asp His Phe Lys Glu Cys

1 5

<210> 39

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

caatggcaac ccccaggcgg tggtgatcat tttaaggaat gcacagtg 48

<210> 40

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

cactgtgcat tccttaaaat gatcaccacc gcctgggggt tgccattg 48

<210> 41

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

caacccccac tgtctctggg cggtggtaag gaatgcacag tggaatatg 49

<210> 42

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

catattccac tgtgcattcc ttaccaccgc ccagagacag tgggggttg 49

<210> 43

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

ccactgtctc tggatcattt tggcggtggt acagtggaat atgaac 46

<210> 44

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

gttcatattc cactgtacca ccgccaaaat gatccagaga cagtgg 46

<210> 45

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

ctggatcatt ttaaggaatg cggcggtggt tatgaactaa aataccg 47

<210> 46

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

cggtatttta gttcataacc accgccgcat tccttaaaat gatccag 47

<210> 47

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

caatgtttcg gtatttacca ccgccttcca ctgtgcattc cttaaaatg 49

<210> 52

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

caatgtttcg gtatttacca ccgccttcca ctgtgcattc cttaaaatg 49

<210> 48

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala

20 25 30

Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser

35 40 45

Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Glu Ser

65 70 75 80

Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys

100 105 110

Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu

115 120 125

Glu Ile

130

<210> 49

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe

1 5 10

<210> 50

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

Arg Thr Ser

1

<210> 51

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Phe Thr

1 5

<210> 53

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala

20 25 30

Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser

35 40 45

Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Glu Ser

65 70 75 80

Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys

100 105 110

Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu

115 120 125

Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro

130 135 140

Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu

145 150 155 160

Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly

165 170 175

Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser

180 185 190

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp

195 200 205

Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr

210 215 220

Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

225 230 235

<210> 54

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

ctcattcctg ttgaagctct tgacaat 27

<210> 55

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

ccatcctaat acgactcact atagggc 27

<210> 56

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ttccacaggt 60

gacattgtgt tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 120

atttcctgca gagccagtga aagtgttgat agttatggca atagttttat gcactggtac 180

cagcagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc gtacatccaa cctagaatct 240

gggatccctg ccaggttcag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caccattaat 300

cctgtggagg ctgatgatgt tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccattc 360

acgttcggct cggggacaaa gttagaaata aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420

atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 480

aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 540

aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 600

agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 660

actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgttag 717

<210> 57

<211> 139

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

Met Asp Arg Leu Thr Ser Ser Leu Leu Leu Leu Ile Val Pro Ala Tyr

1 5 10 15

Val Leu Ser Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln

20 25 30

Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu

35 40 45

Ser Pro Ser Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Leu Tyr

65 70 75 80

Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser

85 90 95

Asn Gln Val Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala

100 105 110

Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Leu Arg Leu Arg Ala Met Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

130 135

<210> 58

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

Gly Phe Ser Leu Ser Pro Ser Gly Met Gly

1 5 10

<210> 59

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 60

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

Ala Arg Arg

1

<210> 61

<211> 463

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

Met Asp Arg Leu Thr Ser Ser Leu Leu Leu Leu Ile Val Pro Ala Tyr

1 5 10 15

Val Leu Ser Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln

20 25 30

Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu

35 40 45

Ser Pro Ser Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Leu Tyr

65 70 75 80

Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser

85 90 95

Asn Gln Val Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala

100 105 110

Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Leu Arg Leu Arg Ala Met Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro

130 135 140

Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser

145 150 155 160

Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val

165 170 175

Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe

180 185 190

Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr

195 200 205

Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala

210 215 220

His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp

225 230 235 240

Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val

245 250 255

Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr

260 265 270

Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu

275 280 285

Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln

290 295 300

Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser

305 310 315 320

Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys

325 330 335

Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

340 345 350

Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro

355 360 365

Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met

370 375 380

Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn

385 390 395 400

Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr

405 410 415

Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn

420 425 430

Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu

435 440 445

His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

450 455 460

<210> 62

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

cactataggg ctcgagcggc cgc 23

<210> 63

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

gttccaggtc actgtcactg gctcag 26

<210> 64

<211> 1392

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

atggacaggc ttacttcctc attgctgctg ctgattgtcc ctgcatatgt cctgtcccag 60

gttactctga aagagtcggg ccctgggata ttgcagccct cccagaccct cagtctgact 120

tgttctttct ctgggttttc actgagccct tctggtatgg gtgtgagctg gattcgtcag 180

ccttcaggaa agggtctgga gtggctggca cacatttact gggatgatga caagctctat 240

aacccatccc tgaagagccg gctcacaatc tccaaggata cctccagtaa ccaggtattc 300

ctcaagatca ccagtgtgga cactgcagat actgccacat actactgtgc tcgaagagga 360

ctacggctac gtgctatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctcagcc 420

aaaacgacac ccccatctgt ctatccactg gcccctggat ctgctgccca aactaactcc 480

atggtgaccc tgggatgcct ggtcaagggc tatttccctg agccagtgac agtgacctgg 540

aactctggat ccctgtccag cggtgtgcac accttcccag ctgtcctgca gtctgacctc 600

tacactctga gcagctcagt gactgtcccc tccagcacct ggcccagcga gaccgtcacc 660

tgcaacgttg cccacccggc cagcagcacc aaggtggaca agaaaattgt gcccagggat 720

tgtggttgta agccttgcat atgtacagtc ccagaagtat catctgtctt catcttcccc 780

ccaaagccca aggatgtgct caccattact ctgactccta aggtcacgtg tgttgtggta 840

gacatcagca aggatgatcc cgaggtccag ttcagctggt ttgtagatga tgtggaggtg 900

cacacagctc agacgcaacc ccgggaggag cagttcaaca gcactttccg ctcagtcagt 960

gaacttccca tcatgcacca ggactggctc aatggcaagg agttcaaatg cagggtcaac 1020

agtgcagctt tccctgcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg cagaccgaag 1080

gctccacagg tgtacaccat tccacctccc aaggagcaga tggccaagga taaagtcagt 1140

ctgacctgca tgataacaga cttcttccct gaagacatta ctgtggagtg gcagtggaat 1200

gggcagccag cggagaacta caagaacact cagcccatca tggacacaga tggctcttac 1260

ttcgtctaca gcaagctcaa tgtgcagaag agcaactggg aggcaggaaa tactttcacc 1320

tgctctgtgt tacatgaggg cctgcacaac caccatactg agaagagcct ctcccactct 1380

cctggtaaat ga 1392

<210> 65

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 65

aaacgatatc gggagggatc tctagagaat tcc 33

<210> 66

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 66

aacgctcttc ctcatcacgg gagat 25

<210> 67

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 67

agatccctcc cgatatcgtt tatggagaca gacacactcc tgc 43

<210> 68

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 68

ggggagggag aggggcggat ccctactaac actcattcct gttgaagctc ttgacaat 58

<210> 69

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 69

tagggatccg cccctctccc tcccc 25

<210> 70

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 70

ggttgtggcc atattatcat cgtg 24

<210> 71

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 71

atgataatat ggccacaacc atggacaggc ttacttcctc attgctgctg ctgat 55

<210> 72

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 72

atctcccgtg atgaggaaga gcgtttcatt taccaggaga gtgggagagg 50

<210> 73

<211> 7646

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 73

aacgctcttc ctcatcacgg gagatcagcc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct 60

gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt 120

tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg 180

ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag gattgggaag acaatagcag gcatgctggg 240

gatgcggtgg gctctatggc ttctgaggcg gaaagaactc gcgatgtacg ggccagatat 300

acgcgttgac attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt 360

catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga 420

ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca 480

atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gactatttac ggtaaactgc ccacttggca 540

gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg 600

cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc 660

tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt 720

ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt 780

ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg 840

acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc tctctggcta 900

actagagaac ccactgctta ctggcttatc gaaccatggt gagcaagggc gaggagctgt 960

tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca 1020

gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct 1080

gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg 1140

tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca 1200

tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga 1260

cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca 1320

tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc 1380

acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc 1440

gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca 1500

tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag tccgccctga 1560

gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg 1620

ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agggaggatc tggaggagga tctggaatga 1680

ccgagtacaa gcccacggtg cgcctcgcca cccgcgacga cgtccccagg gccgtacgca 1740

ccctcgccgc cgcgttcgcc gactaccccg ccacgcgcca caccgtcgat ccggaccgcc 1800

acatcgagcg ggtcaccgag ctgcaagaac tcttcctcac gcgcgtcggg ctcgacatcg 1860

gcaaggtgtg ggtcgcggac gacggcgccg cggtggcggt ctggaccacg ccggagagcg 1920

tcgaagcggg ggcggtgttc gccgagatcg gcccgcgcat ggccgagttg agcggttccc 1980

ggctggccgc gcagcaacag atggaaggcc tcctggcgcc gcaccggccc aaggagcccg 2040

cgtggttcct ggccaccgtc ggcgtctcgc ccgaccacca gggcaagggt ctgggcagcg 2100

ccgtcgtgct ccccggagtg gaggcggccg agcgcgccgg ggtgcccgcc ttcctggaga 2160

cctccgcgcc ccgcaacctc cccttctacg agcggctcgg cttcaccgtc accgccgacg 2220

tcgaggtgcc cgaaggaccg cgcacctggt gcatgacccg caagcccggt gcctgaataa 2280

cttcgtatag catacattat acgaagttat gatatctaaa gcggccgcga ctctagagtg 2340

agggtcccca cctgggaccc ttgagagtat caggtctccc acgtgggaga caagaaatcc 2400

ctgtttaata tttaaacagc agtgttcccc atctgggtcc ttgcacccct cactctggcc 2460

tcagccgact gcacagcggc ccctgcatcc ccttggctgt gaggcccctg gacaagcaga 2520

ggtggccaga gctgggaggc atggccctgg ggtcccacga atttgctggg gaatctcgtt 2580

tttcttctta agacttttgg gacatggttt gactcccgaa catcaccgac gcgtctcctg 2640

tttttctggg tggcctcggg acacctgccc tgcccccacg agggtcagga ctgtgactct 2700

ttttagggcc aggcaggtgc ctggacattt gccttgctgg acggggactg gggatgtggg 2760

agggagcaga caggaggaat catgtcaggc ctgtgtgtga aaggaagctc cactgtcacc 2820

ctccacctct tcacccccca ctcaccagtg tcccctccac tgtcacattg taactgaact 2880

tcaggataat aaagtgtttg cctccaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2940

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaagaatt 3000

cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc 3060

gccttgcagc acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc 3120

gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatggcg cctgatgcgg tattttctcc 3180

ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tacgtcaaag caaccatagt acgcgccctg 3240

tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc 3300

cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg 3360

ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg 3420

gcacctcgac cccaaaaaac ttgatttggg tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg 3480

atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt 3540

ccaaactgga acaacactca accctatctc gggctattct tttgatttat aagggatttt 3600

gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt 3660

taacaaaata ttaacgttta caattttatg gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc 3720

cgcatagtta agccagcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg 3780

tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca 3840

gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gagacgaaag ggcctcgtga tacgcctatt 3900

tttataggtt aatgtcatga taataatggt ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg 3960

aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct 4020

catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat 4080

tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc 4140

tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg 4200

ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg 4260

ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga 4320

cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta 4380

ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc 4440

tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc 4500

gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg 4560

ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc 4620

aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca 4680

acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct 4740

tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat 4800

cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg 4860

gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat 4920

taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact 4980

tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat 5040

cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc 5100

ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct 5160

accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg 5220

cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca 5280

cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc 5340

tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga 5400

taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac 5460

gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga 5520

agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag 5580

ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg 5640

acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag 5700

caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc 5760

tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc 5820

tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcca tatgagcgcc 5880

caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca 5940

ggtttcccga ctggaaagcg ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt tagctcactc 6000

attaggcacc ccaggcttta cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga 6060

gcggataaca atttcacaca ggaaacagct atgaccatga ttacgccaag cttccaggct 6120

ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc atagtcccgc 6180

ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg 6240

gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc ctcggcctct gagctattcc 6300

agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg caaaaagctt tgcaaagatg 6360

gataaagttt taaacagaga ggaatctttg cagctaatgg accttctagg tcttgaaagg 6420

agtgggaatt ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga 6480

gaagttgggg ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa 6540

ctgggaaagt gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta 6600

tataagtgca gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca 6660

ggtaagtgcc gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt 6720

gccttgaatt acttccacgc ccctggctgc agtacgtgat tcttgatccc gagcttcggg 6780

ttggaagtgg gtgggagagt tcgaggcctt gcgcttaagg agccccttcg cctcgtgctt 6840

gagttgaggc ctggcctggg cgctggggcc gccgcgtgcg aatctggtgg caccttcgcg 6900

cctgtctcgc tgctttcgat aagtctctag ccatttaaaa tttttgatga cctgctgcga 6960

cgcttttttt ctggcaagat agtcttgtaa atgcgggcca agatctgcac actggtattt 7020

cggtttttgg ggccgcgggc ggcgacgggg cccgtgcgtc ccagcgcaca tgttcggcga 7080

ggcggggcct gcgagcgcgg ccaccgagaa tcggacgggg gtagtctcaa gctggccggc 7140

ctgctctggt gcctggcctc gcgccgccgt gtatcgcccc gccctgggcg gcaaggctgg 7200

cccggtcggc accagttgcg tgagcggaaa gatggccgct tcccggccct gctgcaggga 7260

gctcaaaatg gaggacgcgg cgctcgggag agcgggcggg tgagtcaccc acacaaagga 7320

aaagggcctt tccgtcctca gccgtcgctt catgtgactc cacggagtac cgggcgccgt 7380

ccaggcacct cgattagttc tcgagctttt ggagtacgtc gtctttaggt tggggggagg 7440

ggttttatgc gatggagttt ccccacactg agtgggtgga gactgaagtt aggccagctt 7500

ggcacttgat gtaattctcc ttggaatttg ccctttttga gtttggatct tggttcattc 7560

tcaagcctca gacagtggtt caaagttttt ttcttccatt tcaggtgtcg tgaggaattc 7620

tctagagatc cctcccgata tcgttt 7646

<210> 74

<211> 587

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 74

cccctctccc tccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg 60

tgcgtttgtc tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg 120

gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg 180

aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca 240

aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct 300

ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca 360

cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg tattcaacaa 420

ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggta 480

cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt aaaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg 540

ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacgatg ataatatggc cacaacc 587

Claims

1.一种抗IL13Rα2抗体，所述抗IL13Rα2抗体包括重链可变区和轻链可变区，其特征在于，所述抗IL13Rα2抗体具有如下技术特征：

<1> 重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.58所示的CDR-H1；

<2> 重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.59所示的CDR-H2；

<3> 重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.60所示的CDR-H3；

<4> 轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.50所示的CDR-L1；

<5> 轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.51所示的CDR-L2；

<6> 轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No.52所示的CDR-L3。

2.根据权利要求1所述的抗IL13Rα2抗体，其特征在于，所述抗IL13Rα2抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.57所示；和，所述抗IL13Rα2抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No. 49所示。

3.根据权利要求1所述的抗IL13Rα2抗体，其特征在于，所述抗IL13Rα2抗体选自完整抗体、单链抗体或抗体片段。

4.根据权利要求3所述的抗IL13Rα2抗体，其特征在于，所述完整抗体的恒定区选自天然序列的恒定区。

5.根据权利要求1所述的抗IL13Rα2抗体，其特征在于，所述抗IL13Rα2抗体轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.56所示；和，所述抗IL13Rα2抗体重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.64所示。

6.根据权利要求1所述的抗IL13Rα2抗体，其特征在于，所述抗IL13Rα2抗体结合IL13Rα2的表位，该表位包含SEQ ID NO.13序列。

7.一种多核苷酸，其特征在于，编码如权利要求1-6任一权利要求所述的抗IL13Rα2抗体的重链可变区和轻链可变区或全长氨基酸。

8.一种构建体，其特征在于，含有如权利要求7所述的多核苷酸。

9.一种抗体的表达系统，其特征在于，所述表达系统含有如权利要求8所述的构建体或基因组中整合有外源的如权利要求7所述的多核苷酸。

10.如权利要求1-6任一权利要求所述的抗IL13Rα2抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：在适合表达所述IL13Rα2抗体的条件下，培养如权利要求9所述的抗体的表达系统，从而表达出所述IL13Rα2抗体，纯化分离出所述IL13Rα2抗体。

11.如权利要求1-6任一权利要求所述的抗IL13Rα2抗体在制备治疗抗肿瘤药物或制备诊断抗肿瘤药物中的用途，所述肿瘤选自肺癌、皮肤癌或卵巢癌。

12.一种抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤药物的药效成分包括权利要求1-6任一所述的IL13Rα2抗体，肿瘤选自肺癌、皮肤癌或卵巢癌。

13.一种肿瘤诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒包含如权利要求1-6任一权利要求所述的抗IL13Rα2抗体和/或其免疫偶联物，所述肿瘤选自肺癌、皮肤癌或卵巢癌。